Summary
このプロトコルは、そのまま神経回路内で選択的な遺伝子の発現低下と特にシナプス研究を刺激するために光遺伝学と人工のマイクロ Rna を介した RNA 干渉を結合する方法のワークフローを提供します。
Abstract
このプロトコルの目的は、そのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子の打撃の効果を特徴付けるためです。我々 は人工マイクロ Rna (ミール) を結合する方法のワークフローを記述する-急性脳スライスの操作シナプス ボタンの選択的刺激を達成するために研究と RNA 干渉を介する。実験的アプローチは、単一のウイルス構造と光プローブとシナプス前遺伝子に対して人工 miR(s) の両方の式を運転する単一ニューロン固有プロモーターの使用を含みます。興味の脳の領域に注入改良ときに、表現の構成要素、捜査遺伝子の発現低下と神経細胞のみを光で刺激することが可能になります。この戦略は、開発と遺伝子組み換えマウスのメンテナンスが必要ないと原則的に適用できる他の生物と選択のすべての神経の遺伝子。最近シナプス前 P/Q 型電位依存性カルシウム チャネル (VGCCs) の代替スプライス アイソ フォームのノックダウンが CA1 急性海馬スライスにおける興奮性シナプスに CA3 で短期的なシナプス可塑性を調節する方法を調査することを行った。同様のアプローチは、操作し、プローブのin vivo神経回路にも使用できます。
Introduction
このプロトコルでは、遺伝子の打撃がそのまま神経回路内でのシナプス前機能に及ぼす影響を評価する新しいアプローチについて説明します。そのまま神経回路のシナプス前機能の調査多くのシナプス前のボタンが小さすぎるのでと遠く離れた複合分子と電気生理学的介入を許可する相馬からは困難です。RNA 干渉をノックダウン シナプス蛋白質1の強力で柔軟な手段が用意されています、このアプローチは、従来の打撃の効果を検出することは困難だからシナプス前機能を調査するため多用されていた区別しない電気刺激の操作と素朴なシナプス ボタン2。ここでは、人工マイクロ Rna (ミール) を結合する方法について説明-急性脳スライスの操作シナプス ボタンの選択的刺激を達成するために最近開発された光遺伝学的技術と RNA 干渉を介する。
電気生理学との組み合わせで条件付きノックアウト マウスは、シナプス蛋白質3,4の機能を調査するも使用できますが、我々 の戦略は不要開発と保守の遺伝子マウスの行を変更し、遺伝子の特定のアイソ フォームをノックダウンするも簡単に採用することができます。一般的に相対的な使用される短いヘアピン Rna (Shrna) ここを用いて、人工のミールはニューロンの打撃の主な利点を提供しています。Shrna とは異なり、彼らはポリメラーゼ II のプロモーター1の制御の下で表現できます。したがって、単一プロモーターは、ミールの蛍光レポーターと一緒にの光遺伝学的プローブ式をドライブに使用できます。このように、組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV、図 1 a) の包装範囲内で構造体のサイズを維持できます。また、単一の構造と単一のプロモーターを使用はミール、光遺伝学的プローブ、固定比率で蛍光レポーターの発現できるので実験的変動を低減します。
我々 は最近5海馬におけるシナプス前性カルシウム チャネルの交互スプライシング アイソ フォームの役割を調べるにこの技術を適用されます。このような戦略は、一般的に関心の任意の脳回路他ンエに表現された蛋白質の生理学的な関連性を勉強に適用されます。
Protocol
すべての実験コミュニティ欧州 (ディレクティブ 2010年/63/2014 年 3 月 4 日の)、EU 理事会によって確立されたガイドラインに従って実施された、イタリアの保健省によって承認されました。
1 RNA 干渉と異種発現システムの効率性評価のためのマイクロ Rna のデザイン
注: このプロトコル確立以下の知識が必要です: 分子クローニング、DNA 塩基配列、細胞株、リン酸カルシウム トランスフェクション ・量的な実質のメンテナンス時間 PCR (qRT PCR)、細胞からのセル lysates の準備西部にしみが付くこと.
- 興味の遺伝子が選択的スプライシングを受けるかどうかを決定します。遺伝子の一般的なノックダウン、専ら構成エクソン; を選択します。特定の交互スプライシング アイソ フォームのノックダウン、関連する交互スプライシング エクソンを選択します。
- 専用ソフトウェア (例えばhttps://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) を使用すると、興味のシーケンスに対する RNA 干渉のため人工 miRs をデザインします。
注: 同じ種の内で可能なオフ目標を確認する基本的なローカル配置検索ツール (爆発) を使用することが重要です。 - 目的遺伝子のトップ 3 位 miRs を選択します。
- 適した会社から選択した miRs の上部と下部の鎖を注文します。ネガティブ コントロール用スクランブル バージョンのいずれか選択した miRs または、ミール予測実験で使用される種のすべての知られていた遺伝子をターゲット (e.g。 脊椎動物の遺伝子、ミール pcDNA6.2 GW/EmGFP ミール neg に存在)。
- 選択した miRs のそれぞれの上部と下部のストランドをアニールし、miRs (例えばpcDNA6.2 ・ GW/EmGFP-ミール) 標準的なクローン作成戦略を使用しての表現のために設計されたプラスミドにそれらをクローンします。
注: 目的並ぶ領域を使用して、5' ミール、選択したミール シーケンスおよび 3' ミール並ぶ領域から 3' UTR RNA ポリメラーゼ タイプ II のプロモーターの制御下でレポーターの遺伝子の表現できるから成る miR 式カセットを作成することです。 - DNA の配列を使用して、選択した miRs の正しい挿入を検証します。
- (37 ° C、5% CO2) 加湿細胞文化のインキュベーターで HEK293 細胞を成長 DMEM を使用培地添加 10% 牛胎児血清 1 mM NaPyruvate 10 mM HEPES (pH 739万) と 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)。
- HEK293 細胞は ~ 70% 合流、ミールの表現のベクトルの DNA の 1:1 比率リン酸カルシウム法6を使用する目標とされた遺伝子を表現するベクトルそれぞれに transfect それら共同。次のコントロールが含まれます: (i) 融合細胞、DNA (例えばpBluescript II SK(+)) または (iii) ミール コントロール会社のいずれかと一緒に目標とされた遺伝子を表現するベクトルをトランスフェクトした細胞 (ii)。
注: (i) ターゲット遺伝子発現、miRs の設計方向の同じ種からなければなりません、miRs で対象とするシーケンスが確実に 2 種間の塩基配列レベルで保存されています。(ii) 細胞 HEK293 以外は使用できます。(iii) 遺伝子導入、エレクトロポレーションやリポソーム法などの方法を使用できます。 -
トランスフェクション後、48 h、細胞を溶解、タンパク質のゲルをラン、西部のしみを実行、タンパク質標的タンパク質を認識する抗体とコンテンツを分析します。ノックダウン効率: 50% を目指してください。
メモ: ノックダウン効率または、することができます、さらに、(i) elisa 法による、(ii) 該当する場合、ターゲット蛋白質の活性を測定することによって評価される (例えばイオン チャンネル電流密度) または (iii) 適切な場合の mRNA レベルでの qRT PCR抗体が利用できない (プロトコル手順 3)。- 氷の上の培養皿を置き、冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で一度セルを洗浄します。
- 氷冷 RIPA バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.4 では、150 mM の NaCl、2 ミリメートルの EDTA、1 %np40、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤を含む; Ø 100 mm、Ø 60 mm ディッシュ用 0.5 mL の皿のための 1 mL) を追加し、PBS を吸引します。
- 付着性のセルをこすり細胞スクレーパーを使用して皿と優しく予冷遠心チューブに細胞懸濁液を移します。
- 4 ° C で 15 分間 15,000 × g でチューブを遠心分離機、新しい事前冷却遠心チューブに上清を転送し、ペレットを破棄します。
- BCA タンパク質アッセイ キットやその他の適切な方法 (例:ブラッドフォードの試金) を用いたタンパク質濃度を決定します。
注: サンプルが-20 ° C または後で使用するため-80 ° C で凍結したり、すぐに処理します。 - カードをマイクロ遠心チューブ用に転送、溶解液の適切なボリュームをすべてサンプル蛋白質濃度が同じ、同じボリュームにすべての lysates を作るに十分な冷たい換散バッファーを追加します。
注: 全蛋白質の 30 に 50 μ g は蛋白質のほとんどのために十分にする必要がありますが、ロードする適切な量興味の蛋白質の豊かさに応じて決定してください。 - 2 x Laemmli バッファーの適切な量を追加 (4 %sds、10 %2-メルカプトエタノール、20% グリセロール、0.004% ブロモフェノール ブルー、0.125 M トリス-HCl、pH 6.8) と 95 ° C、5 分でサンプルを沸騰します。
- 分子量マーカーと一緒にアクリルアミドのゲルのサンプルを読み込みます。100 V に 1-2 時間でゲルを実行します。
注: ゲルの割合は、興味の蛋白質のサイズによって異なります。 - 転送サンドイッチを組み立てるし、100 V 2 の h の膜にゲルからタンパク質を転送します。硝酸セルロースまたは PVDF 膜ができます。1 分のメタノール PVDF をアクティブにし、転送バッファーとスタックを準備する前に洗い流してください。
- ブロック ブロック バッファーを利用して常温で 1 h の膜 (pbst; 5% ミルク (PBS + 0.1% Tween 20))、ブロック バッファーで希釈した一次抗体と 4 ° C で一晩膜を孵化します。
- 3 回 PBST で 10 分間膜を洗浄し、室温で 1 時間ブロッキング バッファーに HRP 標識二次抗体とインキュベートします。
- PBS で 10 分間膜を洗浄する 4 回し、化学発光基質を膜に適用し、CCD カメラを用いた撮像を用いた化学発光信号をキャプチャします。
- ノックダウン効率を定量化するのに画像解析ソフトを使用します。
- 2 つの最も効率的な miRs ターゲットにさらに機能試金のための非重複のシーケンスを選択します。
注: ターゲットを離れて効果決して完全排除できる任意のミールの。ただし、2 つの独立した miRs ある同様の効果は、非常に考えにくい同じターゲットをノックダウンのためであります。 - 選択した miRs のノックダウン効率が不十分かどうか (< 50%)、その他 miRs の画面。また、エクスプレスでタンデム、つまり最も効率的な miR(s) でそれらを表現ノックダウン効率7可能性があります同じ式カセットから複数のコピー。
2. 光の式プローブを組み合わせるとマイクロ Rna の遺伝子組換えアデノ随伴ベクトルの建設
注: このプロトコル確立以下の知識が必要です: 分子クローニング、DNA シーケンシングおよび下さい rAAV 生産。
- 3' UTR 組換え rAAVs の生産と興奮性の光の表現のために設計された構造の最も効率的なミール式カセットの各クローン ・ プローブ、pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (図 1 a) のような場所、神経特異 synapsin プロモーター駆動式超高速チャネルロドプシン ケータの赤い蛍光レポーター、TdTomato、miR(s) NheI、EcoRI サイト5の間に挿入します。
注: (i) まらない、rAAVs の包装制限 (図 1 a, オレンジ) ITR ITR (倒立ターミナル繰り返し) からの長さで約 4.7 Kb であります。(ii) miR 式カセットは停止コドンと WPRE (ウッド チャック肝炎のウイルスの転写で規制要素の間に挿入する必要があります。図 1 a)。(iii) TdTomato などの蛍光タンパク質を含めることはローカリゼーションと感染症 (プロトコル手順 4) の強度を容易に監視できるので非常に便利。 - DNA の配列を使用して、ミール カセットの正しい挿入を確認します。
- 農産物と力価 rAAV1/2 以前に公開されたプロトコル8によると、各選択したミールの 1 つ rAAV1/2。1 つの遺伝子のノックダウンのための 1 つの典型的な実験には、同じ遺伝子と 1 つのミール コントロールに対して 2 つの独立した miRs が含まれます。≥109ウイルス ゲノム (英領バージン諸島) のウイルス抗体価を目指して/μ L。
注意: rAAVs は、バイオ セーフティ レベル 1 (BSL-1) の施設で処理する必要があります。詳細については制度バイオ セーフティ委員会にご確認ください。
注: ウイルスの施設を持たない研究所ウイルス抗体価が不十分な場合や、下さい rAAV 生産を委託することができます。たとえば、https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ または https://vcf.charite.de/en/metas/ を参照してください。
3. qRT PCR によるミール内在性遺伝子のノックダウン効率の評価のための一次神経文化からの RNA の抽出
注: (i) このプロトコル確立以下の知識が必要です: 準備および一次神経文化および qRT PCR のメンテナンス。(ii)、少なくとも 3 回のノックダウン効率 (ステップ 3.1-3.14) の定量化を繰り返します (生物レプリケートします)。(qRT PCR による mRNA レベルでノックダウン効率の推定 iii) は、アイソ フォーム、特定の抗体がない利用可能な5スプライスまたはノックダウン時など、タンパク質含有量の分析を排除するに適しています。
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興味の脳の領域からの一次神経文化を準備します。以前文書9、次の変更と皮質の文化のためのプロトコルに従ってください。
- ウェルあたり 500,000 ニューロンの密度で 6 ウェル プレート プレート ニューロン。2.5 mL/ウェル添付ファイル中、3.3 mL の/メンテナンス中のもを使用します。
- アストロ サイトの増殖を観察すると、3-4 日の in vitro (DIV) で 0.5 mL/メンテナンス培シトシン β-D-アラビノ (最終濃度 1 μ M) のための 7.5 μ m の井戸を追加します。
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5 でミール (技術的なレプリケートします) につき 3 つの井戸に感染-6 部使用最低の感染用量ニューロンの ≥99% に感染されます。
- 各ウェルから培地 2 mL を削除し、50 mL の隼のチューブで収集します。
- ニューロンに直接ウイルスを追加、穏やかに混合し、37 ° C でインキュベーターでバック プレートを配置
- インキュベーター収集媒体に格納します。ガスの平衡を許可するファルコン チューブのキャップを緩めます。
- 24 h 後各 (まあ 1.9 mL/) で削除されたミディアム バックを追加します。
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で 17-18 部、RNA の抽出、細胞を溶解させます。
注意: 溶解試薬とクロロホルムは、猛毒です。化学のフードの下で動作し、防具を着用あなたの国および教育機関のガイドラインによると廃棄物の処分します。
メモ: 手順については 3.3-3.13、RNAse フリーの条件であります。手袋を着用し、RNAse フリーのガラス製品、使い捨て容器を使用します。ハンドル RNA について全般的な注意事項を参照してくださいたとえば RNeasy マイクロ ハンドブック 』 の「付録 A オンライン。- ガラス パスツール ピペット 180 ° C のオーブンで一晩インキュベートします。
- プレートを傾けるし、よくパスツール ピペットを真空ポンプに接続されているガラスを使用して各から完全に培地を吸引します。
- すぐに各ウェルに溶解試薬の 700 μ L を追加します。
- 慎重に、手で簡単にプレートを揺することを揺動によってソリューションを均等に します。
- ピペット ソリューションの上下に 4 ~ 5 回または均一な懸濁液が得られるまで。
- 別 1.5 mL エッペン チューブに各ウェルからソリューションを転送します。
注: セル lysates できます-80 ° C で保存またはすぐに処理します。
- 必要に応じて、セル、RT の lysates を解凍し、すぐに 3.5 の手順に進みます。
- 140 μ L のクロロホルムをセル lysates の各サンプルに追加します。
注: クロロホルムは揮発性およびピペット、エッペン チューブをできるだけ早く終了することは困難です。 - 15 は積極的にエッペン チューブを振る s またはサンプルが完全に混ざるまで。
- 1-2 分間または液相分離し始めるまで、RT でサンプルを保管します。
- 遠心分離機の 4 ° C で 15 分間、12,000 × g でサンプル
- 新しいエッペン チューブに RNA を含む上部水性相 (~ 320 μ L) を転送し、残りの液体を破棄します。
注:、下のピンクの有機相またはピペットの先端で 2 つのフェーズの間に白いリングを触れないでください。 - 水性相を 100% エタノール (480 μ L) の 1.5 のボリュームを追加し、ミックスに 3 回上下にゆっくりとソリューションをピペットします。
- 小さなサンプルからの RNA の浄化用に設計された市販のキットを使用して RNA を浄化します。
- 分光光度計と RNA 濃度とサンプル純度を定量化します。
注: (i) 期待収量 ≥3.5 μ g/ウェル;260/280 と 260/230 比タンパク質や有機物で純度をする必要があります両方のように ≥1.9。(ii) の RNA のサンプルは-80 ° C で保存またはすぐに処理できます。 - 市販のキットで RNA の Retrotranscribe 250、500 または 1000 ng。
- QRT PCR による興味の内因性遺伝子のノックダウン効率を定量化します。詳細なプロトコル参照10を参照してください。≥60% (図 2) のノックダウン効率を目指してください。≥2 ハウスキーピング遺伝子 (e.gデータを正規化します。GAPDH ACTB、TUBB3、PPIA)複数の内部制御遺伝子法11を使用してください。
メモ: ラットでの作業、ハウスキーピング遺伝子に次の PCR プライマーを使用: GAPDH fwd: 5' 3' GGTGCTGAGTATGTCGTGGA と GAPDH rev: 5' GATGATGACCCTTTTGGC 3';ACTB fwd: 5' 3' CATCACTATCGGCAATGAGC と ACTB rev: 5' TCATGGATGCCACAGGATT 3';TUBB3-fwd: 5' 3' GCCTTTGGACACCTATTCAG と TUBB3 rev: 5' TCACATTCTTTCCTCACGAC 3';PPIA-fwd: 5 ' 3' CACTGGGGAGAAAGGATTTG と PPIA rev 5' CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3'。
4. オプトジェネティクスをノックダウン ニューロンのターゲット刺激によってそのまま神経回路のシナプス蛋白質の役割の評価
注: 次のプロトコル急性脳スライスにおける電気生理学的セットアップへのアクセス記録と経験が必要です。
- 定位脳以前の文書12に詳細なプロトコルを次に rAAV1/2 を挿入します。マウス13またはラットの脳のための14の定位のアトラスを使用して興味の脳領域での定位座標を決定します。
- マイクロ ピペットの引き手を使用して Ø の長いシャンク付き注入マイクロ ピペット 7-9 μ m。ハサミで、シャンクに注入マイクロ ピペットをクリップします。注入用マイクロ ピペット各 2 mm の調整マークを置く細いマーカーおよび方眼紙を使用します。
- イソフルランと動物を麻酔し、定位装置でそれを修正します。
- 37 ° C に設定されて加熱パッドで操作中暖かい動物を保持します。
- 眼の潤滑剤で目を保護します。
- 電気カミソリで頭の毛を剃る。
- 綿棒を使用して坊主頭にポビドン ヨードを広めます。
- 解剖顕微鏡の下で正中切開を行います。
- 前とラムダを表示するように、綿棒と頭蓋骨表面をきれいにします。
- その所有者にインジェクション ピペットを配置します。定位の腕にホルダーを取り付けます。
- X と y を決定前やラムダを基準にして注射部位の座標。
- ドリルを使用して、ターゲット領域に頭蓋骨を薄くします。
注: は、穏やかな円形の動きを使用し、これは脳の表面を損傷、頭蓋骨をドリルを避けます。 - そこは出血している場合は、タオル ペーパーで過剰な血液を吸収します。
注: 血液の過剰なる z 座標が正しく決定することは困難。 - インジェクション ピペットに毛管作用によってウイルスの 2 μ L を読み込みます。
- X と y にインジェクション ピペットをもたらす注射部位の座標。
- 硬膜から z 座標を計算し、脳の中にピペットをゆっくりと下げます。
- Z 座標に達したとき、組織調整できるように 3 分を待ちます。
- インジェクション ピペットの背面にフレキシブル チューブを介して接続 1 mL 注射器を用いた低正圧を適用します。視覚的に解剖顕微鏡と参照点として校正記号を使用してを介してインジェクション ピペットからウイルスの排出速度を監視します。
注意: ウイルスは遅い速度で注入する必要があります (< 100 nL/min) 組織の損傷を避けるために。 - 注入が完了したら、5 分待って、0.2 mm インジェクション ピペットを撤回、ウイルスの逆流を避けるために、別の 5 分間待ちます。
- 撤回するインジェクション ピペットゆっくりと完全に脳から dispose それの漂白剤を入れた容器に。
- 生理学的なソリューションと頭蓋骨をウェットし、3-4 針で皮膚を縫合します。
- ゲンタマイシン軟膏を傷に適用されます。
- シングル家食物と一緒にきれいなケージで動物のペレットし、それまでの熱ランプの下で完全に回復します。
- ≥15 日は、投与後、深いイソフルラン麻酔下の動物の首をはねます。
- Vibratome 使用して毒ガス (95% O2, 5% CO2) 関心の脳の領域の急性脳スライスを準備 (mM) 入っている冷たいアプライド ソリューション: 123 NaCl、1.25 KCl、1.25 KH2PO4、1.5 MgCl2, 1 CaCl2、25NaHCO3、2 NaPyruvate、18 グルコース (調整 300 mOsm 浸透圧)。たとえば、CA3 から CA1 錐体ニューロンへのシナプス伝達を分析する目的の場合は、海馬 (350 μ m 厚) の矢状のスライスを準備します。
注: この手順以降から環境光による光プローブの活性化を避けるために低光の条件の下で働きます。 - スライス脳スライスを保持するために設計されたチャンバー内で同じアプライドで 37 ° C で 30 分の回復をしましょう。記録まで室温で同じ脳スライス商工会議所で、スライスを維持します。
注: これらの条件を使用して、スライスは 6-8 h までの健康維持できます。 - 転送は 1.5 ミリメートル CaCl2と補われるリカバリに使用される同じアプライドの 2 mL/min とそれを水中録音室および superfuse へスライス (Ca2 +の合計: 2.5 mM)、NaPyruvate なし。
メモ: スライスに準備、Ca2 + (1 mM) の毒性を最小限に抑えるための低濃度で維持されます。録音は、2.5 mM Ca2 +小胞の放出に賛成するで実行されます。 - 簡潔に表現された蛍光レポーター (e.gの信号を確認します。TdTomato;図 3 b)ローカリゼーションと感染の強さを確認。
- (MM) で含まれている細胞内のソリューションとパッチ電極を埋める: グルコン酸 K 110-22 KCl 塩化ナトリウム 5、0.5 グリコールエーテルジアミン四酢酸、3 MgCl2, 4 Mg ATP, 0.5 Na3GTP、20 K2-クレアチンリン酸、10 HEPES 島 (ペーハー 7.28, 290 mΩ)。
注: は、ピペット抵抗値 5-6 mΩ のパッチ電極を使用します。 - 赤外線照明下で感染したニューロンからのシナプス入力を受けるニューロンからタイトなシール全体セル構成に到達します。たとえば、CA3 錐体細胞が感染していた場合は、CA1 領域 (図 3) の内側の管に近位の錐体細胞をパッチします。
注: 直列抵抗残すことができる、非補償が定数と低 (引時間: 20 MΩ) する必要があります。 - 薬理学を使用して調査中シナプス電流を分離します。たとえば、興奮性シナプス伝達を調査する目的の場合は、10 μ M ビククリンにより、抑制性のシナプス伝達をブロックします。
- たとえば、興奮性シナプス電流 (工) (e.g感染した神経細胞の突起に配置されている光ファイバー (Ø ≤250 μ m) と結合した 473 nm 青色レーザを用いたシナプス電流を呼び起こします。CA3 錐体細胞)。
- 光パルスごとの 1 つ以上の活動電位を想起させる可能性を減らすため、最小限に刺激の長さを調整します。ケータを使用している場合は、2 ms15に設定します。
- 小さいがはっきり検出性シナプス電流を生成するレーザーの刺激強度を調整 (工の ≤50 pA ピーク振幅記録保持性は-70 mV CA3 と CA1 錐体ニューロンの間図 3 D)。直径ケータと 250 μ m の光ファイバーを使用して、刺激繊維で 1-3 mW の強みを終了が適切なする必要があります。
注: レーザー強度を規制できない場合は、中性密度フィルターを使用します。 - その軸索ではなく感染した神経細胞の突起には、473 nm のレーザー光を照らします。たとえば、CA3 突起と軸索の直接脱分極を避けるために、シャファー担保から光を当てます。
- テトロドトキシン (TTX; 0.5 μ M) を適用、チャネルを確認するためにサンプルのナトリウム チャネルのブロッカーは活動電位駆動。
- 別の録音でシナプス電流刺激が選択を確認するための調査の下に選択的なブロッカーを適用します。
注: たとえば、適用 NBQX (10 μ M) に AMPA 型グルタミン酸受容体を介した工。 - 反復刺激 (引時間: 20 Hz で刺激 ≥2) への応答で同じ急性脳スライスの光学的および電気的誘発性シナプス電流を比較します。刺激の 2 つのタイプが同じような細胞メカニズムをアクティブことを示唆コントロール ミールを使用する場合の電気・光学的刺激間シナプス促通やうつ病の類似度を守らなければなりません。
注: 上記の手順は、光の刺激により、シナプス伝達のいくつかのメカニズムをバイパス、シナプス前の研究の直接脱分極を誘発しないことを確認する必要。
- シナプス伝達制御ミールと miRs 捜査シナプス蛋白質の間のシングル、反復的な刺激 (引時間: 20 Hz で刺激 ≥2) への応答と比較します。
Representative Results
上記の手順は、どのようにシナプス伝達を評価する手法は、シナプス前ニューロンにおけるシナプス蛋白質の打撃によって影響を受けるを提供します。代替のノックダウン スプライスのシナプス前 Cav2.1 のアイソ フォームの代表的な結果 (P/q) VGCCs 例として下記の通り興奮性シナプス CA1 に CA3 で短期的なシナプス可塑性を調節します。
Cav2.1 (P/q) チャネルは、中枢神経系で最も速いシナプスで優勢なシナプス前 VGCCs。相互に排他的エクソンのスプライシング代替 37a と Cav2.1 (α1 a) の細孔形成 α1サブユニットの 37b 生成 2 つの主要な変形、Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb]16,17 、18。かどうか Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] 差動を調節するシナプス伝達とラット海馬錐体ニューロンのシナプス可塑性を決定する開発したノックダウンするアイソ フォーム特異 miRs 選択的に Cav2.1 [EFa] または Cav2.1 [EFb]5。ショート サイズにもかかわらず (97 bp) とエクソン間類似性が高い (塩基配列レベルで id 61.86%) に対して 3 つのミール シーケンスを設計できるか 37b 37a、ラットの Cav2.1 [EFa] (ミール EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; ミール EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG;ミール EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) および 2 Cav2.1 [EFb] ラットに対して (ミール EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; ミール EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) 予測高ノックダウン効率。否定的な制御 (ミール コントロール) として、知られている脊椎動物の遺伝子をターゲットにしないシーケンスを含む pcDNA6.2 GW/EmGFP ミール neg プラスミドを使用しました。HEK 293 細胞異種チャンネルの最初の画面を基に、ミール EFa1、ミール EFa3 と EFb2 を選択しに 3' UTR の rAAVs の生産のために設計されている pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X のベクトルの式カセットを複製と場所、synapsin プロモーター ドライブ式超高速チャネルロドプシン ケータ、赤の蛍光タンパク質 TdTomato と挿入されたミール (図 1)。我々 はまた、ミール EFb2 このミールのノックダウン効率を高めるための発現カセットを複製しました。
次に、上記の 4 つの構造の rAAV1/2 を作製し、ノックダウン効率化及びアイソ フォーム特異 qRT PCR を用いたラット初代神経文化における選択性を定量化しました。ミール EFa1 とミール EFa3 ネイティブ カリフォルニア州v2.1 [EFa] 〜 70% の mRNA はなく、Cav2.1 [EFb] ながら減少ミール EFb 減少ネイティブ カリフォルニア州v2.1 [EFb] ~ 60% の mRNA はなく、Cav2.1 [EFa] (図 2)。
我々、改良 4 rAAV1/2 のそれぞれに注入 (図 3 a-c)、P18 ラットの海馬の CA3 領域 (A ・ P/M L/D-V 前から) −2.6 の座標を持つ/± 2.9/−2.9。15 から 24 日後注入 rAAV1/2 注入ラット急性海馬スライスを作製し、TdTomato 蛍光式 (図 3 b) rAAVs の局在を確認するために使用します。[EFb] Cav2.1 [EFa] または Cav2.1 のシナプス前の打撃に CA1 シナプスに CA3 における短期的なシナプスの可塑性が影響を受けるかどうか調べるために、我々 は簡単な 473 nm レーザー光パルス (2 ms 間で選択的に感染の ca3 錐体細胞を刺激;図 3) と CA1 領域 (図 3) の内側の管に近位の錐体細胞のパッチによって結果の工を記録。Cav2.1 スプライス アイソ フォームのノックダウンに反対の方向で対パルス刺激に対する応答が影響を受けることが分かった: Cav2.1 のノックダウン [EFa] (ミール EFa1 またはミール EFa3) に対しペアパルス円滑化 (PPF) を後押しした Ca のノックダウンv2.1 [EFb] (ミール EFb2) はそれ (図 3 DE) を廃止しました。
図 1: 超高速光プローブ ケータとアイソ フォーム特異 miRs Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] に対して組み合わせ式の構造の方式です。(A) 、下さい rAAV の地図作成 pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X、synapsin プロモーター (Syn) を含む、超高速チャネルロドプシン ケータ融合 TdTomato し、近位 3' UTR、Cav2.1 スプライス ・ アイソ フォーム特異ミールで。表示の制限の酵素は、シングル カッターです。(B)式カセットのトップ、方式です。Synapsin のプロモーターは、ケータ TdTomato のアイソ フォーム特異 miR 式をドライブします。下、ミールのカセットの部分を形成する 21 ヌクレオチド ターゲット シーケンスの逆の補数。ミール EFb2 2 つの同一のミール カセットだった他の後タンデム 1 つで表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。ノックダウン効率と Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] のアイソ フォーム特異 miRs の選択性の評価します。MiRs Cav2.1 [EFa] (ミール EFa1 とミール EFa3) をターゲットを表現する rAAVs 6 DIV で感染 17 18 DIV 初代培養から分離された RNA のアイソ フォーム特異 qRT PCR 解析または Cav2.1 [EFb] (ミール EFb2)。データは、ネガティブ コントロール (ミール コントロール) に正規化されます。ミール EFa1 とミール EFa3 大幅にし、選択的に減らす [EFa] Cav2.1 の mRNA (n 8 と 7 の文化をそれぞれ =)、ミール EFb 大幅にし、選択的に減少 [EFb] Cav2.1 の mRNA (n = 4 文化; * * * p < 0.001; 一方向の解析分散テスト テューキー Kramer の事後テストが続く)。± SEM. を意味するようにデータが表示されます。この図は、Thalhammer、A.らから適応されています。5.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。オプトジェネティクスをノックダウン ニューロンの刺激をターゲットの役割評価 Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] ネイティブ海馬。(A) 生体内で感染に使用下さい rAAV 構造の発現カセット法(B)その TdTomato 蛍光性を示す海馬のセクションは、CA3 領域とその予測に限定されます。(C)実験的構成: レーザービームが CA3 突起に指示された, CA1 錐体細胞からパッチ クランプ録音を行った。(D) 2 ms ロング ブルー (473 nm) レーザー光パルス 20 Hz で輝いていた呼び起こす工が PPF は miRs Cav2.1 [EFa] をターゲットにより増加し、ミール Cav2.1 [EFb] によって廃止されます。ミール コントロールする相対的なミール、EFb2 の減少とミール EFa3 ミール EFa1 PPF の増加を示すペアパルス比率 (D) のように実験のための(E)概要 (n = 9-11 録音; * p = 0.02; * * p = 0.01; * * * p < 0.0004; 共分散分析)。± SEM. を意味するようにデータが表示されます。この図は、Thalhammer、A.らから適応されています。5.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
光プローブおよび興味のシナプス前遺伝子に対してミールの共発現遺伝子ノックダウンがそのまま神経回路内でのシナプス前機能に及ぼす影響を特徴付けるための強力なアプローチを提供しています。この実験の方法識別し非常に効率的なネイティブ システムの興味の遺伝子をノックダウンで選択 miRs を特徴付ける重要です。可能であれば、関心の同じ mRNA に対する 2 つ以上の独立した miRs は最終的なオフターゲット効果のコントロールに使用ください。レスキュー実験、ミール耐性遺伝子は、システムの再導入は、特異性のコントロールとして使用できます。
同じ構成要素を使用して、光を表現するプローブと、ミールは、光学的に操作されているシナプス前ニューロンのみを刺激するためできます。ために混合し、希釈の結果を起こす感染および非感染のニューロンを区別しないので、これは電気刺激で可能ではありません。光の刺激は、複数の活動電位15を引き起こすことができる、ので拡大パレット15,の19,20,21の中で、最速の光遺伝学的プローブのみを選択することが重要です。また、光刺激はシナプス前の研究の直接脱分極を誘導せず、シナプス伝達の手順の一部をバイパスするを避けるために 1 つは22を調査したいことを確保するため不可欠です。
ここで、述べたい実験的アプローチでは、並行限られた期間 (4 〜 6 ヶ月) 内の興味の複数のシナプス前遺伝子の生理学的な関連性を評価可能です。ただし、ノックダウンほとんど 100% に達することを留意することが重要です。さらに、rAAVs は初期の発達過程を調査するときに時間の制約を表す場合があります光プローブの最大のノックダウンと表現を可能にするのには、少なくとも 2 週間の表現する必要があります。シナプス前ニューロンに限るより多くの時間がかかり、条件付きのノックアウト マウスは通常結果が興味の遺伝子の削除を完了し、有効な相補的なアプローチを提供するため。
ミールの技術の特定の利点は、複数の miRs 同じプロモーターから発現できます。このプロパティは、同じミールまたは同じターゲット遺伝子に対する異なる miRs の複数のコピーを挿入することによってノックダウン効率化に主に使用されています。ただし、によってまた使用されるノックダウンする複数の遺伝子別のターゲット遺伝子7,23に対して miRs を表現します。このプロパティは、シナプス前のシグナル伝達経路を分析する複数のシナプス蛋白質の沈黙にされる可能性があります。
ここでは、我々 は急性海馬スライスにおけるシナプス前機能遺伝子の打撃の効果を特徴付ける人工 miRs で光遺伝学を組み合わせています。同様のアプローチは、操作し、プローブの体内の神経回路にも使用できます。さらに、人工 miRs と chemogenetic を組み合わせてアプローチにより、尋問の長い時間スケールの神経回路に 1 つ。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
デモで助けるため支援・ カルメラ ・ ヴィターレ ・ f ・ Benfenati (Istituto イタリアーノ ・ ディ ・技術、情報技術学院) をありがちましょう。この作品は、IIT とアラコエリ サン ・ パオロ (LAC にグラント号 9734) によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution | Toxic |
| Animal Temperature Controller with heat pad | WPI | ATC2000 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit | ThermoFisher Scientific | K4936-00 | |
| Brain slices Prechamber | Harvard Apparatus | BSC-PC | |
| CCD camera-based imager | Bio-Rad | ChemiDoc™ MP | |
| Cell Culture reagents | Life Technologies | ||
| Chemiluminescent substrate | GE Helthcare | ECL Western Blotting Reagents, RPN2106 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Toxic |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma | C6645 | |
| Drill | Foredom | K.1030 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gentamicin ointment | Local pharmacy | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Hepes | Sigma | 54459 | |
| Injection micropipettes | Narishige | GD1 | |
| Inorganic salts & detergents | Sigma | ||
| K2-creatine phosphate | Calbiochem | 237911 | |
| KGluconate | Fluka | 60245 | |
| Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-GFM-00100-03 | |
| Membrane | Amersham | Protran™ 0.2 µm NC | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| Micropipette holder | Narishige | IM-H1 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-100 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaPyruvate | Sigma | P5280 | |
| Ocular lubricant | Local pharmacy | Lacrigel | |
| Phosphate inhibitors | Sigma | P0044, P5726 | |
| Protease inhibitors | Sigma | cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | |
| Protein gel electrophoresis and blotting devices | Bio-Rad | Mini-Protean III Cell | |
| Providone iodine | Local pharmacy | Betadine | |
| Qiazol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Toxic |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit |
Qiagen | 205311 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Stereotactic apparatus | WPI | ||
| Tetrodotoxin | Tocris | 1069 | Toxic |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).
- Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Maejima, T., et al. Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice. J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).
- Mark, M. D., et al. Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations. J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).
- Thalhammer, A., et al. Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity. Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Chung, K. H., et al. Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Cingolani, L. A., et al. Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins. Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).
- Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition. J Vis Exp. (92), e51845 (2014).
- Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), (2002).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
- Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Bourinet, E., et al. Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).
- Chaudhuri, D., et al. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).
- Soong, T. W., et al. Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation. J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi. Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).
