Summary
Denne protokollen gir en arbeidsflyt på hvordan kombinere kunstig microRNA-mediert RNA-interferens med optogenetics å stimulere spesielt presynaptic boutons med redusert uttrykk for selektiv gene(s) innen intakt nevrale kretser.
Abstract
Formålet med denne protokollen er å beskrive effekten av genet knockdown på presynaptic funksjonen i intakt nevrale kretser. Vi beskriver en arbeidsflyt på hvordan kombinere kunstig microRNA (miR)-mediert RNA-interferens med optogenetics å oppnå selektiv stimulering av manipulert presynaptic boutons i akutt hjernen skiver. Den eksperimentelle tilnærmingen innebærer bruk av en enkelt viral konstruksjon og en enkelt Nevron-spesifikke promoter kjøre uttrykk for en optogenetic sonde og kunstig miR(s) mot presynaptic gene(s). Når stereotactically injiseres i hjernen regionen rundt, gjør uttrykte Konstruer det mulig å stimulere med lys utelukkende neurons med redusert uttrykk for gene(s) under etterforskning. Denne strategien krever ikke utvikling og vedlikehold av genmodifiserte musen linjer og kan i prinsippet brukes andre organismer og noen neuronal genet valgfrihet. Vi har nylig brukt for å undersøke hvordan knockdown av alternative skjøte isoformene presynaptic P/Q-type spenning-gated kalsium kanaler (VGCCs) regulerer kortsiktige synaptiske plastisitet på CA3 til CA1 eksitatoriske synapser i akutt hippocampus skiver. En lignende tilnærming kan også brukes til å manipulere og sonde nevrale kretser i vivo.
Introduction
Denne protokollen beskriver en ny tilnærming for å beskrive effekten av genet knockdown på presynaptic funksjonen i intakt nevrale kretser. Undersøker presynaptic funksjonen i intakt nevrale kretser er utfordrende fordi mange presynaptic boutons er for liten, og langt fra soma tillate kombinert molekylære og elektrofysiologiske tiltak. Selv om RNA-interferens tilbyr en kraftig og fleksibel måte å pusse synaptic proteiner1, er denne tilnærmingen brukt med måte å undersøke presynaptic funksjon fordi det er vanskelig å oppdage effekten av knockdown med tradisjonelle elektriske stimulations, som ikke skiller mellom manipulert og naiv presynaptic boutons2. Her beskriver vi hvordan kombinere kunstig microRNA (miR)-mediert RNA-interferens med nylig utviklede optogenetic teknologi for å oppnå selektiv stimulering av manipulert presynaptic boutons i akutt hjernen skiver.
Mens betinget knockout mus i kombinasjon med elektrofysiologi kan også brukes til å undersøke funksjonen presynaptic proteiner3,4, krever vår strategi ikke utvikling og vedlikehold av genetisk endret musen linjer og kan også brukes på lett å slå ned bestemte isoformene med et. Forhold til ofte brukte kort hårnål RNAs (shRNAs), kunstig miRs, som vi bruker her, tilbyr viktige fordeler for knockdown i neurons. I motsetning til shRNAs, kan de uttrykkes under kontroll av polymerase II promoter1. En enkelt promoter kan dermed brukes til å kjøre uttrykk for både miR og en optogenetic-sonde, sammen med fluorescerende reporter. På denne måten, kan størrelsen på Konstruer holdes innenfor emballasje av rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV, figur 1A). Bruk av en enkel konstruksjon og en enkelt promoter reduserer også, eksperimentell variasjoner fordi det gir uttrykk for miR, optogenetic sonden og fluorescerende reporter i et fast forhold.
Vi har nylig brukt denne teknologien for å undersøke rollen av alternativt skjøtes isoformene presynaptic kalsium kanaler i hippocampus5. En slik strategi er generelt gjelder studere fysiologiske relevansen av andre presynaptically uttrykt proteiner i noen hjernen krets av interesse.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i samsvar med retningslinjene som er fastlagt av det europeiske fellesskap råd (direktiv 2010/63/EU 4 mars 2014), og ble godkjent av italiensk Helsedepartementet.
1. tegning av microRNAs for RNA-interferens og evaluering av effektiviteten i Heterologous uttrykk
Merk: Denne protokollen krever kunnskap om veletablerte metodene: molekylære kloning, DNA sekvensering, vedlikehold av linjer, kalsium fosfat transfection, kvantitativ real tid PCR (qRT-PCR), utarbeidelse av celle lysates fra linjer og vestlige blotting.
- Avgjøre om genet av interesse er underlagt alternativ skjøting. For en generell knockdown av genet, Velg utelukkende grunnleggende exons; for en knockdown av et bestemt alternativt skjøtes isoformen, velger du den relevante alternativt skjøtes exon.
- Bruk dedikert programvare (f.eks https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) å utforme kunstig miRs for RNA-interferens mot sekvensen av interesse.
Merk: Det er viktig å bruke en grunnleggende lokale justering Søk verktøyet (BLAST) for å se etter mulige av mål innenfor samme art. - Velg de øverste tre rangert miRs for målet genet.
- Bestill de øverste og nederste trådene de valgte miRs fra et egnet selskap. Hvis negativ kontroll, bruker du en kryptert versjon av de valgte miRs eller en miR spådd ikke for å målrette alle kjente genet av arten brukes i eksperimentet (f.eks. for virveldyrenes gener, miR i pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg).
- Anneal de respektive topp- og trådene av de valgte miRs og klone dem i en plasmider designet for uttrykk for miRs (f.eks pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) standard kloning strategier.
Merk: Målet er å opprette en miR uttrykk kassett bestående av en 5' miR flankemanøveren region, valgte miR sekvensen og en 3 miR flankemanøveren region som kan uttrykkes fra den 3-' UTR i med et reporter under kontroll av en RNA polymerase type II promoter. - Bruk DNA sekvensering for å validere riktig innsetting av de valgte miRs.
- Vokse HEK293 celler i en fuktet celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) bruker DMEM medium supplert med 10% fosterets bovin serum, 1 mM NaPyruvate, 10 mM HEPES (pH 7.39) og 1 x penicillin/streptomycin (penn/Strep).
- Når HEK293 celler er ~ 70% confluent, co transfect dem med hver av miR uttrykk vektorer og en vektor uttrykke målrettet genet i 1:1 DNA forholdet bruker kalsium fosfat metode6. Inkluderer følgende kontroller: (i) untransfected celler, (ii) celler transfekterte med vektoren uttrykke målrettet genet sammen med enten bærer DNA (f.eks pBluescript II SK(+)) eller (iii) miR kontroll.
Merk: (i) uttrykte målrettet genet må være fra samme art mot miRs ble utformet, med mindre sekvenser målrettet av miRs er helt bevart på nukleotid nivå mellom de to artene. (ii) cellelinjer enn HEK293 kan brukes. (iii) alternative metoder for hva, for eksempel electroporation eller liposome-baserte metoder, kan brukes. -
48 timer etter transfection, lyse cellene, kjøre protein gel, utføre Western blot og analysere protein innhold med et antistoff gjenkjenne mål protein. Mål for en knockdown effektivitet på ≥50%.
Merk: Knockdown effektivitet kan alternativt eller i tillegg evalueres (i) ved ELISA analyse, (ii) ved å måle aktiviteten til målet protein eventuelt (f.eks gjeldende tettheter for ionekanaler) eller (iii) ved qRT PCR på mRNA nivå hvis egnet Antistoffene er ikke tilgjengelig (protokollen trinn 3).- Plasser kultur rettene på is og vaske cellene gang med iskald fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Sug opp PBS Legg iskald RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40, 0,1% natrium dodecyl sulfate (SDS), som inneholder protease og fosfatase hemmere, 1 mL for et fat av Ø 100 mm, 0,5 mL for et fat av Ø 60 mm).
- Skrape tilhenger celler av fatet med cellen skraper og overføre forsiktig celle suspensjon i en pre-avkjølt microcentrifuge tube.
- Sentrifuge røret på 15.000 x g i 15 min på 4 ° C, overføre nedbryting i en ny pre-avkjølt microcentrifuge tube og kast pellet.
- Bestemme protein konsentrasjonen BCA Protein analysen kit eller andre egnet metode (f.eks Bradford analysen).
Merk: Utvalg kan enten frosset ved 20 ° C eller-80 ° C for senere bruk, eller behandlet umiddelbart. - Overføre en passende mengde lysates til microcentrifuge rør slik at alle har samme protein konsentrasjonen og legge tilstrekkelig iskald lyseringsbuffer utgjør alle lysates til samme volum.
Merk: 30 til 50 µg totale protein burde være nok for de fleste av proteiner, men riktig mengde lastes bør fastsettes etter overflod av protein av interesse. - Legge til en passende mengde 2 x Laemmli buffer (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glyserol, 0.004% bromophenol blå 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8) og kok prøvene ved 95 ° C i 5 minutter.
- Last eksemplene på en akrylamid gel med merketråd molekylvekt. Kjøre gel på 100 V for 1-2 h.
Merk: Ønsket gel, avhenger av størrelsen på protein av interesse. - Montere overføring sandwich og overfører proteiner fra gel på en membran 100 V 2 h. Membranen kan være nitrocellulose eller PVDF. Aktivere PVDF med metanol for 1 min, og skyll den med overføring buffer før forberede stakken.
- Blokkere membranen 1t ved romtemperatur bruker blokkerer buffer (5% melk i PBST (PBS + 0,1% Tween-20)), deretter ruge membranen overnatting på 4 ° C med primære antistoff fortynnet i blokkering buffer.
- Vask membranen i 10 min i PBST tre ganger og ruge det med HRP-konjugerte sekundære antistoff blokkerer buffer 1t ved romtemperatur.
- Vask membranen i 10 min i PBS fire ganger, deretter bruke chemiluminescent underlaget membranen og ta chemiluminescent signalene med en CCD kamera-baserte imager.
- Bruk image analyseprogramvare for å kvantifisere knockdown effektiviteten.
- Velg de to mest effektive miRs rettet mot ikke-overlappende sekvenser for ytterligere funksjonelle analyser.
Merk: Av mål effekter kan aldri være helt utelukket for noen miR. Men hvis to uavhengige miRs har en lignende effekt, er det svært usannsynlig at dette skyldes en samme off-målet knockdown. - Hvis pusse effektiviteten av de valgte miRs ikke er tilfredsstillende (< 50%), skjermen for andre miRs. Alternativt uttrykke uttrykke de mest effektive miR(s) i tandem, dvs dem i flere kopier av samme uttrykket kassetten, som kan resultere i økt knockdown effektivitet7.
2. bygging av rekombinant Adeno-assosiert vektorer for kombinert uttrykk av sonder Optogenetic og microRNAs
Merk: Denne protokollen krever kunnskap om veletablerte metodene: molekylære kloning, DNA sekvensering og rAAV produksjon.
- Klone av mest effektive miR uttrykk kassettene inn den 3-' UTR i av konstruksjoner utviklet for produksjon av rekombinant rAAVs og uttrykk for eksitatoriske optogenetic sonder, som pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (figur 1A), hvor den Nevron-spesifikke synapsin promoter stasjoner uttrykk for den lynraske channelrhodopsin ChETA, røde fluorescerende reporter TdTomato og miR(s) settes inn mellom NheI og EcoRI områder5.
Merk: (i) ikke overstige emballasje grensen på rAAVs, som er omtrent 4,7 Kb i lengde fra ITR (invertert terminal gjenta) til ITR (figur 1A, oransje). (ii) miR uttrykk kassett må settes mellom stopp codon og WPRE (hakkespett hepatitt Virus Posttranscriptional regulatorisk Element; Figur 1A). (iii) inkludering av en fluorescerende protein, som TdTomato, er svært nyttig fordi det gir lett overvåking lokalisering og intensiteten av infeksjon (protokollen trinn 4). - Bruk DNA sekvensering for å validere riktig innsetting av miR kassettene.
- Produsere og titer rAAV1/2 etter de tidligere publiserte protokoll8, en rAAV1/2 for hver valgte miR. En typisk eksperiment for knockdown av genet omfatter to uavhengige miRs mot det samme genet og en miR kontroll. Mål for en virus titer av ≥109 viral genomer (vg) / µL.
Advarsel: rAAVs må håndteres i biosikkerhet nivå 1 (BSL-1) anlegg. Ta kontakt med institusjonelle Biosafety utvalget for detaljert informasjon.
Merk: Hvis laboratoriet ikke har en viral anlegget eller hvis viral titers ikke er tilfredsstillende, rAAV produksjon kan bli outsourcet. Gå for eksempel https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ eller https://vcf.charite.de/en/metas/.
3. utvinning av RNA fra primære Neuronal kulturer for evaluering av miR Knockdown effektiviteten av endogene gener av qRT PCR
Merk: (i) denne protokollen krever kunnskap om veletablerte metodene: forberedelse og vedlikehold av primære neuronal kulturer og qRT PCR. (ii) gjenta kvantifiseringen knockdown effektivitet (trinn 3.1-3.14) minst 3 ganger (biologiske gjentak). (iii) estimering av knockdown effektivitet på mRNA nivå av qRT PCR er egnet når en analyse av proteininnholdet er utelukket, for eksempel når banket ned alternativt skjøtes isoformene som spesifikke antistoffer ikke er tilgjengelig5.
-
Forberede primære neuronal kulturer fra hjernen regionen rundt. Følg protokollen for kortikale kulturer i forrige publikasjonen9, med følgende endringer:
- Plate nerveceller i 6 bra plater på en tetthet av 500.000 neurons per brønn. Bruk 2,5 mL/vel vedlegg medium og 3.3 mL/vel av vedlikehold medium.
- Hvis astrocytter overvekst er observert, legge 0,5 mL/godt vedlikehold medium med 7,5 µM av cytosine β-D-arabinofuranoside (for en siste konsentrasjon på 1 µM) på 3-4 dager i vitro (DIV).
-
Infisere tre brønner per miR (teknisk gjentak) på 5-6 DIV. Bruk den laveste smittsomme dosen som vil infisere ≥99% av neurons.
- Fjerne 2 mL medium fra hver brønn og samle den i en 50 mL falcon rør.
- Legge til virus direkte neurons, bland forsiktig og plassere plater tilbake i inkubator på 37 ° C.
- Lagre samlet mediet i inkubator. Løs hetten falcon røret å tillate gass balanse.
- Etter 24 h, Legg den fjernet medium ryggen i hver brønn (1,9 mL/vel).
-
På 17-18 DIV, lyse neurons for RNA utvinning.
Advarsel: Lysis reagens og kloroform er svært giftig. Arbeid under kjemiske hette og Bruk verneutstyr; Kast avfall i henhold din nasjonale og institu-retningslinjer.
Merk: Hva 3.3-3,13, fungerer i RNAse-gratis forhold. Bruk hansker og bruk RNAse-free glass og disponibel plasticware. For generelle forholdsregler om hvordan å håndtere RNA, se for eksempel tillegg A i RNeasy mikro håndboken tilgjengelig online.- Inkuber glass Pasteur Pipetter over natten i en ovn ved 180 ° C.
- Tilt platene og Sug opp mediet helt hver godt med et glass Pasteur pipette koblet til en vakuumpumpe.
- Straks legge 700 µL av Lysis reagensen i hver brønn.
- Jevnt løsningen ved rock og riste platen nøye og kort for hånd.
- Pipetter løsningen opp og ned 4-5 ganger eller til en homogen suspensjon er oppnådd.
- Overføre løsningen fra hver brønn i en separat 1,5 mL Eppendorf tube.
Merk: Cellen lysates kan lagres ved-80 ° C eller behandlet umiddelbart.
- Hvis nødvendig, avise celle lysates på RT og videre umiddelbart til trinn 3.5.
- Legge til 140 µL av kloroform hvert utvalg fra celle lysates.
Merk: Kloroform er flyktig og vanskelig å Pipetter, nær Eppendorf rør så snart som mulig. - Riste Eppendorf rør godt i 15 s eller til prøvene er fullt emulgert.
- Holde prøven på RT i 1-2 min eller til flytende fasene begynner å skille.
- Sentrifuge prøvene 12.000 x g i 15 min på 4 ° C.
- Overføre den øvre vandige fasen (~ 320 µL) inneholder RNA til en ny Eppendorf tube, og forkaste gjenværende væsken.
Merk: Ikke berør den lavere rosa organiske fasen eller hvit ringen mellom de to fasene med spissen av pipette. - Legge til 1,5 mengder 100% etanol (480 µL) i den vandige fasen og Pipetter løsningen langsomt opp og ned 3 ganger å blande.
- Rense RNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit utviklet for rensing av RNA fra små prøver.
- Kvantifisere RNA konsentrasjon og prøve renhet med et spektrofotometer.
Merk: (i) forventer gir ≥3.5 µg/godt; 260/280 og 260/230 prosenter for renhet over proteiner og organiske forbindelser bør være ≥1.9. (ii) RNA prøver kan lagres ved-80 ° C eller behandlet umiddelbart. - Retrotranscribe 250 500 og 1000 ng av en kommersielt tilgjengelig Kit.
- Kvantifisere knockdown effektiviteten for endogene genet av interesse av qRT PCR. For en detaljert protokoll, kan du se referanse10. Mål for en knockdown effektiviteten til ≥60% (figur 2). Normalisere dataene ≥2 housekeeping gener (f.eks. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) bruke flere internkontroll genet metode11.
Merk: Hvis arbeider i rotte, bruk de følgende PCR primerne for housekeeping gener: GAPDH-fwd: 5' GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3 og GAPDH-rev: 5' GATGATGACCCTTTTGGC 3'; ACTB-fwd: 5' CATCACTATCGGCAATGAGC 3 og ACTB-rev: 5' TCATGGATGCCACAGGATT 3'; TUBB3-fwd: 5' GCCTTTGGACACCTATTCAG 3 og TUBB3-rev: 5' TCACATTCTTTCCTCACGAC 3'; PPIA-fwd: 5' CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3 og PPIA-rev 5' CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3.
4. vurdere rollen Presynaptic proteiner i intakt nevrale kretser av målrettet stimulering av banket-ned Neurons med Optogenetics
Merk: Følgende protokollen krever tidligere erfaring med elektrofysiologiske innspillinger i akutt hjernen skiver og tilgang til en elektrofysiologiske oppsett.
- Stereotactically injisere rAAV1/2 i hjernen etter en detaljert protokoll i forrige publikasjonen12. Bestemme stereotactic koordinatene for hjernen regionen rundt med stereotactic Atlas for musen13 eller rotte hjernen14.
- Bruk en brønnene avtrekker for å trekke injeksjon Mikropipetter med lang shanks av Ø 7 – 9 µm; klipp injeksjon Mikropipetter på marrowbones med saks. Bruk en tynn markør og millimeterpapir plassere kalibrere merker på injeksjon Mikropipetter hver 2 mm.
- Bedøve dyret med isoflurane og fikse det i stereotactic apparatet.
- Holde dyr varme hele operasjonen med en varmeputen satt på 37 ° C.
- Beskytte øynene med okulær smøremiddel.
- Barbere pelsen på hodet med en elektrisk barberhøvel.
- Spre povidon jod på barberte hodet med en bomullspinne.
- Under dissecting mikroskop, gjør en midtlinjen snitt.
- Flaten skallen med en bomullspinne, for å gjøre bregma og lambda synlig.
- Plass injeksjon brønnene i eieren. Koble holderen til stereotactic armen.
- Angi x- og y-koordinatene til injeksjonsstedet i forhold til bregma og/eller lambda.
- Bruk en drill for å tynne skallen over målområdet.
Merk: Bruk forsiktige sirkelbevegelser og unngå boring gjennom skallen da dette vil skade overflaten av hjernen. - Hvis det er blødning, absorbere overdreven blod med håndkle papir.
Merk: Overdreven blod vil gjøre det vanskelig å fastslå riktig z koordinater. - Legg ≤2 µL av virus i injeksjon brønnene kapillær handling.
- Bringe injeksjon brønnene til x- og y-koordinatene til injeksjonsstedet.
- Beregne den z-koordinaten fra dura og lavere pipette sakte inn i hjernen.
- Når den z-koordinaten vente 3 min å tillate vev justering.
- Bruk lav positive trykk bruker en 1 mL sprøyte koblet via en fleksibel slange til baksiden av injeksjon brønnene. Visuelt overvåke hastigheten på utstøting av viruset fra injeksjon brønnene gjennom disseksjon mikroskopet og bruker kalibrere merkene som referansepunkt.
Merk: Virus må være injisert med treg hastighet (< 100 nL/min) å unngå skade på vev. - Når injeksjon er fullført, vent 5 min, trekke injeksjon brønnene av 0.2 mm, vente på en annen 5 min, å unngå tilbakestrømming av viruset.
- Trekke injeksjon brønnene sakte og helt fra hjernen og kast i en container fylt med blekemiddel.
- Våt skallen med fysiologiske løsning og Sutur i huden med 3-4 masker.
- Gentamicin salve gjelde såret.
- Single-huset dyr i et rent bur med mat pellets og under en varmelampe til det gjenoppretter fullt.
- ≥15 dager etter injeksjon, halshugge dyr under dyp isoflurane anestesi.
- Forberede akutt hjernen skiver av hjernen regionen rundt med en Vibratome med gasset (95% O2, 5% CO2) iskalde aCSF løsning, som inneholder (i mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPyruvate og 18 glukose (osmolaritet justert til 300 mOsm). For eksempel hvis målet er å analysere synaptic overføring fra CA3 til CA1 pyramidale nevroner, forberede sagittal skiver av hippocampus dannelse (350 µm tykk).
Merk: Dette trinnet og utover fungere under dårlige lysforhold å unngå aktivering av optogenetic sonden av lys i miljøet. - La sektorer Gjenopprett i 30 min på 37 ° C i den samme aCSF i et kammer utformet for å holde hjernen skiver. Holde skiver i samme hjernen stykke kammeret ved romtemperatur før opptak.
Merk: Bruker disse forholdene, kan skiver vedlikeholdes sunt for opptil 6-8 h. - Overføre en skive neddykket opptak kammer og superfuse den med 2 mL/min av den samme aCSF brukes til gjenoppretting med 1,5 mM CaCl2 (totalt Ca2 +: 2,5) og uten NaPyruvate.
Merk: Skiver er forberedt og vedlikeholdes i lav konsentrasjon av Ca2 + (1 mM) å minimere toksisitet. Opptak utføres 2,5 Ca2 + å favorisere vesicle utgivelsen. - Sjekk kort signal om uttrykt fluorescerende reporteren (f.eks. TdTomato; Figur 3B) å fastslå lokalisering og intensiteten av infeksjon.
- Fylle en patch elektrode med en intracellulær løsning som inneholder (i mM): 110 K-gluconate, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 EGTA, 3 MgCl2, 4 Mg-ATP, 0,5 Na3-GTP, 20 K2-kreatin fosfat, 10 HEPES-KOH (pH 7.28, 290 mΩ).
Merk: Bruk oppdateringen elektrode med en pipette motstand av 5 – 6 mΩ. - Under infrarød belysning, nå tett hele celle konfigurasjon fra en Nevron mottar synaptic innganger fra infiserte neurons. For eksempel hvis CA3 pyramidale nevroner var infisert, patch pyramidale nevroner i den proksimale til mediale skrift i regionen CA1 (Figur 3 c).
Merk: Serien motstand kan stå uncompensated, men det bør være konstant og lav (≤20 MΩ). - Bruk farmakologi isolere synaptic strøm under etterforskning. For eksempel hvis målet er å undersøke eksitatoriske synaptic overføring, blokkere hemmende synaptic overføring med 10 µM bicuculline.
- Fremkalle synaptic strøm, for eksempel eksitatoriske postsynaptic strøm (EPSCs), bruke en 473 nm blå laser koplet til en optisk fiber (Ø ≤250 µm) plassert på somata av de infiserte nervecellene (f.eks. CA3 pyramidale nevroner).
- Justere stimulering lengde til et minimum, for å redusere muligheten for fremkaller flere handling potensial per lys pulsen. Hvis bruker ChETA, sett den til 2 ms15.
- Justere stimulering styrken på laser til liten, men tydelig synlig synaptic strøm (≤50 pA peak amplitude for EPSCs spilt inn på en holde potensialet i-70 mV mellom CA3 og CA1 pyramidale nevroner; Figur 3D). Hvis bruker ChETA og en optisk fiber på 250 µm i diameter, være stimulering styrkene i 1-3 mW fiber avslutte egnet.
Merk: Hvis laser styrke ikke kan reguleres, bruke neutral density filter. - Skinne 473 nm laserlys somata av de infiserte nervecellene, men ikke på deres axons. For eksempel skinne lyset på CA3 somata og fra Schaffer materiell, å unngå direkte depolarization av axons.
- Bruke tetrodotoxin (TTX, 0,5 µM), en blokkering av natrium kanaler, prøve å bekrefte kanalene handling potensial-drevet.
- I forskjellige innspillinger, bruke en selektiv blokkering i synaptic gjeldende under etterforskning å bekrefte stimulering er selektive.
Merk: For eksempel bruke NBQX (10 µM) til AMPA-type glutamat reseptor-mediert EPSCs. - Sammenligne optisk og elektrisk vakte synaptic strømmer i samme akutt hjernen stykke svar på gjentatte stimulering (≥2 stimuli ved ≤20 Hz). En tilsvarende grad av synaptic tilrettelegging eller depresjon praktiseres mellom elektriske og optisk stimulering når du bruker en kontroll miR, dermed antyder at lignende cellulære mekanismer aktiveres av de to typene stimulations.
Merk: Punktene ovenfor er nødvendig for å sikre at optisk stimulering ikke induserer en direkte depolarization av presynaptic boutons, således omgåelsen noen mekanismer for synaptic overføring.
- Sammenligne synaptic overføring svar på enkel og repeterende stimulations (≥2 stimuli ved ≤20 Hz) mellom en kontroll miR og miRs rettet mot presynaptic proteiner under etterforskning.
Representative Results
Prosedyrene som er beskrevet ovenfor gir en robust metode for å vurdere hvordan synaptic overføring påvirkes av knockdown synaptic proteiner i presynaptic neurons. Representant resultater på hvordan knockdown av alternative skjøte isoformene presynaptic Cav2.1 (P/Q-type) VGCCs regulerer kortsiktige synaptiske plastisitet på CA3 til CA1 eksitatoriske synapser er gitt nedenfor som et eksempel.
Cav2.1 (P/Q-type) kanaler er de dominerende presynaptic VGCCs på mest fast synapser i sentralnervesystemet. Alternativ skjøting av gjensidig utelukkende exons 37a og 37b av pore-forming α1 delenhet Cav2.1 (α1A) gir to store varianter, Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. For å fastslå om Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb] ulikt regulere synaptic overføring og plastisitet i rotte hippocampus pyramidale nevroner, vi først utviklet isoformen-spesifikke miRs til knockdown selektivt Cav 2.1 [EFa] eller Cav2.1 [EFb]5. Til tross for kort størrelsen (97 bp) og høy likheten (61.86% identitet på nukleotid nivå) mellom exons 37a og 37b, kunne vi utforme tre miR sekvenser mot rotte Cav2.1 [EFa] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG, miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) og to mot rotte Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT, miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) med forventet høy knockdown effektivitet. Som negativ kontroll (miR kontroll) brukte vi pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg plasmider som inneholder en sekvens som ikke mot alle kjente virveldyr genet. Basert på en første skjermbildet i HEK 293 celler mot heterologous kanaler, vi valgte miR EFa1, miR EFa3 og miR EFb2 og klonet deres uttrykk kassetter til den 3-' UTR i av vektoren pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, som er designet for produksjon av rAAVs og hvor den synapsin Selskapet driver uttrykk for den lynraske channelrhodopsin ChETA, røde fluorescerende protein TdTomato og den innsatte miR (figur 1). Vi likeledes duplikert uttrykk kassetten av miR EFb2 å pusse effektivisere denne miR.
Neste, vi forberedt rAAV1/2 over fire konstruksjoner og kvantifisert deres knockdown effektivitet og selektivitet i primære rotte neuronal kulturer bruker isoformen-spesifikke qRT PCR. miR EFa1 og miR EFa3 redusert mRNA innfødt Cav2.1 [EFa] med ~ 70%, men ikke det Cav2.1 [EFb], mens miR EFb redusert mRNA innfødt Cav2.1 [EFb] med ~ 60%, men ikke det Cav2.1 [EFa] (figur 2).
Vi deretter stereotactically injiseres hver av de fire rAAV1/2 CA3 området hippocampus P18 rotter (figur 3A-C), med koordinater for (en-P/M-L/D-V fra Bregma) −2.6 / ± 2.9 / −2.9. Femten å tyve-fire dager etter injeksjon, vi forberedt akutt hippocampus skiver fra rAAV1/2-injisert rotter og brukt TdTomato fluorescens for å bekrefte uttrykk og lokalisering av rAAVs (figur 3B). For å undersøke om presynaptic knockdown Cav2.1 [EFa] eller Cav2.1 [EFb] påvirket kortsiktige synaptiske plastisitet på CA3 til CA1 synapser, stimulert vi selektivt infiserte CA3 neurons med kort 473 nm laser lyspulser (2 ms lang ; Figur 3 c), og de resulterende EPSCs ved patching pyramidale nevroner i den proksimale til mediale skrift i regionen CA1 (Figur 3 c). Vi fant at knockdown av Cav2.1 skjøte isoformene påvirket svar til sammen-puls stimulering i motsatt retning: knockdown Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 eller miR EFa3) økte sammen-puls tilrettelegging (PPF) mens knockdown ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) opphevet det (figur 3D, E).
Figur 1: Sammenhengen konstruksjoner for kombinert uttrykk for den lynraske optogenetic sonde ChETA og isoformen-spesifikke miRs mot Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]. (A) kart over rAAV bygge pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, som inneholder en synapsin promoter (Syn), den lynraske channelrhodopsin ChETA smeltet TdTomato og, i den proksimale 3' UTR, en Cav2.1 skjøte isoformen-spesifikke miR. Begrensning enzymer vist er enkelt kniver. (B) øverst, ordningen med uttrykket kassetten. Synapsin Selskapet driver uttrykk for både ChETA-TdTomato og en isoformen-spesifikke miR. Bunnen, omvendt bemanning av 21-nukleotid mål-sekvenser, som en del av miR kassetten. For miR EFb2 ble to identiske miR kassetter uttrykt i tandem en etter en. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Evaluering av knockdown effektivitet og selektivitet av isoformen-spesifikke miRs for Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]. Isoformen-spesifikke qRT PCR analyse på RNA isolert fra 17-18 DIV primære kulturer infisert på 6 DIV rAAVs uttrykke miRs rettet mot enten Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 og miR EFa3) eller Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Dataene er normalisert negative kontrollen (miR kontroll). miR EFa1 og miR EFa3 betydelig og selektivt redusere mRNA Cav2.1 [EFa] (n = 8 og 7 kulturer, henholdsvis), mens miR EFb betydelig og selektivt reduserer mRNA Cav2.1 [EFb] (n = 4 kulturer; *** p < 0,001; enveis analyse av varians test etterfulgt av Tukey-Kramer post-test). Dataene presenteres som betyr ± SEM. Dette tallet er tilpasset fra Thalhammer, A. et al. 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Vurdere rollen til Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb] innfødt prefiks av målrettet stimulering av banket-ned neurons med optogenetics. (A) ordningen med uttrykket kassetten av rAAV sammensetningene brukes i vivo infisert. (B) hippocampus delen viser at TdTomato fluorescens er begrenset til regionen CA3 og sine anslag. (C) eksperimentelle konfigurasjon: laserstrålen var rettet på CA3 somata og patch klemme innspillinger ble utført fra CA1 pyramidale nevroner. (D) 2 ms lang blå (473 nm) laser lyspulser skinte på 20 Hz fremkalle EPSCs som PPF er økt med miRs målretting Cav2.1 [EFa] og avskaffet av miR Cav2.1 [EFb]. (E) Sammendrag av sammen-puls forhold for eksperimenter i (D), viser en økning i PPF for miR EFa1, miR EFa3 og nedgangen miR EFb2, forhold til miR kontroll (n = 9-11 innspillinger; * p = 0,02; ** p = 0.01; *** p < 0,0004; analyse av kovarians). Dataene presenteres som betyr ± SEM. Dette tallet er tilpasset fra Thalhammer, A. et al. 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Co uttrykk for en optogenetic sonde og en miR mot en presynaptic genet av interesse tilbyr en effektiv tilnærming betegner effekten av genet knockdown på presynaptic funksjonen i intakt nevrale kretser. For denne eksperimentelle tilnærming er det viktig å identifisere og beskrive miRs som er svært effektiv og selektiv i banket ned genet av interesse i native systemer. Hvis mulig, bør to eller flere uavhengige miRs mot den samme mRNA rundt brukes til kontroll for eventuell off-målet effekter. Redning eksperimenter, som en miR-resistente genet er gjeninnføres i systemet, kan brukes som en kontroll for spesifisitet.
Hvis du bruker samme konstruere for å uttrykke en optogenetic kan sonde og en miR for å stimulere optisk bare presynaptic neurons som har blitt manipulert. Dette er ikke mulig med elektrisk stimulations fordi de ikke skiller mellom smittede og uten neurons, dermed produsere blandet og utvannet. Fordi optiske stimulations kan indusere flere handling potensialer15, er det viktig å velge bare de raskeste optogenetic sonder, blant en voksende palett15,19,20,21. I tillegg er det viktig å sikre at optisk stimulering ikke få en direkte depolarization av presynaptic boutons, for å unngå hoppe over noen av trinnene i synaptic overføring man ønsker å undersøke22.
Eksperimentell tilnærming som beskrives her, gjør det mulig å evaluere parallelt fysiologiske relevansen av flere presynaptic gener rundt i en begrenset tidsperiode (4-6 måneder). Det er imidlertid viktig å huske på at bokseren sjelden nå 100%. Videre må rAAVs uttrykkes i minst to uker å tillate maksimal knockdown og full uttrykk for optogenetic proben, som kan representere en tidsbegrensning når undersøker tidlig utviklingsprosesser. Om mer tidkrevende, betinget knockout mus begrenset til presynaptic neurons, vanligvis føre til fullstendig fjerning av genet av interesse og tilbyr derfor en gyldig komplementære tilnærming.
En bestemt fordel av miR teknologi er at det muliggjør uttrykk for flere miRs fra samme Promotøren. Denne egenskapen er hovedsakelig brukt til å øke knockdown effektiviteten ved å sette inn flere kopier av samme miR eller annen miRs mot det samme mål genet. Det kan imidlertid være brukes også til knockdown flere gener ved å uttrykke miRs mot ulike gener7,23. Denne egenskapen kan brukes til å stille flere presynaptic proteiner å analysere presynaptic signalveier.
Her har vi kombinert optogenetics med kunstig miRs å karakterisere effekten av genet knockdown på presynaptic funksjon i akutte hippocampus skiver. En lignende tilnærming kan også brukes til å manipulere og sonde nevrale kretser i vivo. I tillegg ville kombinerer kunstig miRs med chemogenetic tilnærminger gjøre en å forhøre nevrale kretser på lengre tidsskala.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) for støtte og Carmela Vitale for å hjelpe med demonstrasjon. Dette arbeidet ble finansiert av IIT og Compagnia San Paolo (grant nr. 9734 Lac).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution | Toxic |
| Animal Temperature Controller with heat pad | WPI | ATC2000 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit | ThermoFisher Scientific | K4936-00 | |
| Brain slices Prechamber | Harvard Apparatus | BSC-PC | |
| CCD camera-based imager | Bio-Rad | ChemiDoc™ MP | |
| Cell Culture reagents | Life Technologies | ||
| Chemiluminescent substrate | GE Helthcare | ECL Western Blotting Reagents, RPN2106 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Toxic |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma | C6645 | |
| Drill | Foredom | K.1030 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gentamicin ointment | Local pharmacy | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Hepes | Sigma | 54459 | |
| Injection micropipettes | Narishige | GD1 | |
| Inorganic salts & detergents | Sigma | ||
| K2-creatine phosphate | Calbiochem | 237911 | |
| KGluconate | Fluka | 60245 | |
| Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-GFM-00100-03 | |
| Membrane | Amersham | Protran™ 0.2 µm NC | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| Micropipette holder | Narishige | IM-H1 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-100 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaPyruvate | Sigma | P5280 | |
| Ocular lubricant | Local pharmacy | Lacrigel | |
| Phosphate inhibitors | Sigma | P0044, P5726 | |
| Protease inhibitors | Sigma | cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | |
| Protein gel electrophoresis and blotting devices | Bio-Rad | Mini-Protean III Cell | |
| Providone iodine | Local pharmacy | Betadine | |
| Qiazol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Toxic |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit |
Qiagen | 205311 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Stereotactic apparatus | WPI | ||
| Tetrodotoxin | Tocris | 1069 | Toxic |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).
- Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Maejima, T., et al. Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice. J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).
- Mark, M. D., et al. Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations. J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).
- Thalhammer, A., et al. Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity. Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Chung, K. H., et al. Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Cingolani, L. A., et al. Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins. Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).
- Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition. J Vis Exp. (92), e51845 (2014).
- Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), (2002).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
- Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Bourinet, E., et al. Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).
- Chaudhuri, D., et al. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).
- Soong, T. W., et al. Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation. J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi. Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).
