Summary
Detta protokoll ger ett arbetsflöde om hur du kombinerar artificiell mikroRNA-medierad RNA-interferens med optogenetik att stimulera särskilt presynaptiska knappar med minskat uttryck av selektiv gene(s) inom intakt neuronala kretsar.
Abstract
Syftet med detta protokoll är att karakterisera effekten av genen knockdown på presynaptiska funktion inom intakt neuronala kretsar. Vi beskriva ett arbetsflöde på hur man kombinerar artificiell mikroRNA (miR)-medierad RNA-interferens med optogenetik att uppnå selektiv stimulering av manipulerade presynaptiska knappar i akut hjärnskada skivor. Den experimentella metoden innebär användning av en enda viral konstruktion och en enda neuron-specifika promotorn att köra uttrycket av både konstgjorda miR(s) mot presynaptiska gene(s) och en optogenetic sond. När stereotactically injiceras i hjärnregionen av intresse, gör den uttryckta konstruktionen det möjligt att stimulera med ljus uteslutande nervceller med minskat uttryck av gene(s) under utredning. Denna strategi kräver inte utveckling och underhåll av genmodifierad mus linjer och kan i princip tillämpas för andra organismer och till någon neuronala genen av val. Vi har nyligen använt det för att undersöka hur Nedslagning av alternativa splice isoformer av presynaptiska P/Q-typ spänningskänsliga kalciumkanaler (VGCCs) reglerar kortsiktiga synaptisk plasticitet vid CA3 till CA1 retande synapser i akut Hippocampus skivor. Ett liknande tillvägagångssätt kan också användas för att manipulera och sond neuronala kretsar i vivo.
Introduction
Det här protokollet beskriver en ny strategi för att karakterisera effekten av genen knockdown på presynaptiska funktion inom intakt neuronala kretsar. Utreda presynaptiska funktion i intakt neuronala kretsar är utmanande eftersom många presynaptiska knappar är för små och långt från soma att tillåta kombinerade molekylär och elektrofysiologiska interventioner. Även om RNA-interferens erbjuder ett kraftfullt och flexibelt sätt att knockdown synaptic proteiner1, har detta tillvägagångssätt använts sparsamt att undersöka presynaptiska funktion eftersom det är svårt att upptäcka effekterna av knockdown använder traditionella elektriska stimuli, som inte skiljer mellan manipuleras och naiva presynaptiska knappar2. Här beskriver vi hur man kombinerar artificiell mikroRNA (miR)-medierad RNA-interferens med nyutvecklade optogenetic-teknik för att uppnå selektiv stimulering av manipulerade presynaptiska knappar i akut hjärnskada skivor.
Medan villkorlig knockoutmöss i kombination med elektrofysiologi kunde också användas för att undersöka funktionen av presynaptiska proteiner3,4, kräver vår strategi inte utveckling och underhåll av genetiskt modifierade mus linjer och kan också användas enkelt slå ner specifika isoformer av en gen. Förhållande till mer vanligt används kort hårnål RNAs (shRNAs), konstgjorda miRs, som vi använder här, erbjuder viktiga fördelar för knockdown i nervceller. Till skillnad från shRNAs, kan de uttryckas under kontroll av ett polymeras II arrangören1. Således kan en enda arrangören användas för att köra uttrycket av både miR och en optogenetic sond, tillsammans med en fluorescerande reporter. På detta sätt, kan storleken på konstruktionen hållas inom gränserna som förpackning av rekombinant adeno-associerade virus (rAAV, figur 1A). Användning av en enda konstruktion och en enda arrangören minskar också, experimentell variation eftersom det möjliggör för uttryck av miR, optogenetic sonden och fluorescerande reporter i ett fast förhållande.
Vi har nyligen tillämpat denna teknik för att undersöka rollen som alternativt skarvade isoformer av presynaptiska kalciumkanaler i hippocampus5. En sådan strategi gäller generellt att studera fysiologiska betydelsen av andra presynaptically uttryckta proteiner i någon hjärnan krets av intresse.
Protocol
Alla experiment genomfördes i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Europeiska gemenskaperna rådet (direktiv 2010/63/EU av den 4 mars, 2014), och godkändes av det italienska hälsoministeriet.
1. utformningen av mikroRNA för RNA-interferens och utvärdering av deras effektivitet i heterologa uttryck system
Obs: Detta protokoll kräver kunskap om följande väletablerade metoder: molekylär kloning, DNA-sekvensering, underhåll av cellinjer, kalciumfosfat transfection, kvantitativa real time PCR (qRT-PCR), förberedelse av cell lysates från cellinjer och Western blotting.
- Avgöra om genen av intresse är föremål för alternativa skarvning. För en allmän knockdown av genen, Välj uteslutande konstituerande exoner; för en knockdown av en specifik alternativt skarvade isoform, väljer du den relevanta alternativt skarvade exon.
- Använd särskild programvara (t.ex. https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) att utforma konstgjorda miRs för RNA-interferens mot sekvensen av intresse.
Obs: Det är viktigt att använda en grundläggande lokal justering Sök verktyg (viskning) för att kontrollera för möjliga off-mål inom samma art. - Välj de översta tre rankade miRs för målgenen.
- Beställ den övre och nedre delarna av de valda miRs från ett lämpligt företag. För negativ kontroll, Använd en äggröra version av en de valda miRs eller en miR förutspådde inte för att rikta några kända gen av den art som används i experimentet (t.ex. för ryggradsdjur gener, miR i pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg).
- Glödga den respektiva övre och nedre delarna av de valda miRs och klona dem in i en plasmid utformad för uttryck av miRs (t.ex. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) med hjälp av standard kloning strategier.
Obs: Syftet är att skapa en miR uttryck kassett som består av en 5' miR flankera region, sekvensen valda miR och en 3' miR flankera region som kan uttryckas från den 3' UTR av en reporter gen under kontroll av en RNA-polymeras typ II promotor. - Använda DNA sekvensering för att validera rätta införandet av de valda miRs.
- Odla HEK293 cellerna i en befuktade cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) använder DMEM medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 1 mM NaPyruvate, 10 mM HEPES (pH 7,39) och 1 x penicillin/streptomycin (penna/Strep).
- När HEK293 celler är ~ 70% konfluenta, Co transfect dem med var och en av miR uttryck vektorerna och en vektor som uttrycker riktade genen i förhållandet 1:1 DNA använder kalciumfosfat metod6. Inkludera följande kontroller: (i) untransfected celler, (ii) celler transfekterade med vektorn uttrycker riktade genen tillsammans med antingen flygbolaget DNA (t.ex. pBluescript II SK(+)) eller (iii) miR kontroll.
Obs: A uttryckt riktade gene måste vara från samma art som utformades miRs, såvida inte de sekvenser som måltavla för miRs bevaras helt på nucleotide nivå mellan de två arterna. (ii) cellinjer än HEK293 kan användas. (iii) alternativa metoder för transfection, såsom elektroporation eller Liposom-baserade metoder, kan användas. -
48 h efter transfection, lyse celler, kör protein gel, utföra Western blot och analysera proteinhalten som med en antikropp erkänner målproteinet. Målet för en knockdown verkningsgrad på ≥50%.
Obs: Knockdown effektivitet kan alternativt eller dessutom utvärderas (i) av ELISA analys, (ii) genom att mäta aktiviteten i målproteinet om tillämpligt (t.ex. strömtäthet för jonkanaler) eller (iii) genom qRT-PCR på mRNA-nivå om lämplig antikroppar är inte tillgängliga (protokoll steg 3).- Placera de kultur-rätterna på is och tvätta cellerna en gång med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Aspirera PBS, Lägg sedan till iskall RIPA bufferten (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40, 0,1% sodium dodecyl sulfate (SDS), innehåller proteas och fosfatas-hämmare; 1 mL för en maträtt av Ø 100 mm, 0.5 mL för en maträtt av Ø 60 mm).
- Skrapa vidhäftande celler bort skålen med en cell skrapa och försiktigt överför cellsuspensionen i ett nedkylda mikrocentrifug rör.
- Centrifugera röret vid 15 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C, överför supernatanten i en ny nedkylda mikrocentrifug rör och kassera pelleten.
- Bestämma proteinkoncentration med BCA Protein Assay kit eller annan lämplig metod (t.ex. Bradford assay).
Obs: Prover kan antingen vara fryst vid-20 ° C eller -80 ° C för senare användning eller behandlas omedelbart. - Över en lämplig volym av lysates till mikrocentrifugrör så att alla prover har samma proteinkoncentration och lägga till lämpliga iskall lyseringsbuffert gör upp alla lysates till samma volym.
Obs: 30 till 50 µg totalt protein bör räcka för de flesta av proteiner, men en lämplig mängd laddas bör bestämmas enligt överflödet av proteinet av intresse. - Tillsätt en lämplig mängd 2 x Laemmli buffert (4% SDS, 10% 2-merkaptoetanol, 20% glycerol, 0,004% bromofenolblått, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) och koka proverna vid 95 ° C i 5 min.
- Ladda proverna på en akrylamid gel tillsammans med en molekylvikt markör. Kör gelen vid 100 V för 1-2 h.
Obs: Gel procentsatsen beror på storleken på proteinet av intresse. - Montera överföring smörgås och överföra proteinerna från gelen på ett membran på 100 V för 2 h. Membranet kan vara antingen nitrocellulosa eller PVDF. Aktivera PVDF med metanol för 1 min och skölj den med överföring buffert innan du förbereder stacken.
- Blockera membranet för 1 h i rumstemperatur med blockerande buffert (5% mjölk i PBST (PBS + 0,1% Tween-20)), sedan Inkubera membranet övernattning på 4 ° C med primär antikropp utspätt i blockerande buffert.
- Tvätta membranet i 10 min i PBST tre gånger och inkubera det med HRP-konjugerad sekundär antikropp i blockerande buffert för 1 h i rumstemperatur.
- Tvätta membranet i 10 min i PBS fyra gånger, och sedan tillämpa Kemiluminiscens substratet till membranet och fånga Kemiluminiscens signalerna använder en CCD-camera-baserade imager.
- Använda bild analys programvara för att kvantifiera knockdown effektivitet.
- Välj de två mest effektiva miRs inriktning icke-överlappande sekvenser för ytterligare funktionella analyser.
Obs: Off-mål effekter kan aldrig helt uteslutas för någon miR. Dock om två oberoende miRs har en liknande effekt, är det ytterst osannolikt att detta är på grund av en samma off-target knockdown. - Om de valda miRs knockdown effektivitet inte är tillfredsställande (< 50%), skärm för andra miRs. Alternativt, uttrycka de effektivaste miR(s) i tandem, dvs uttrycka dem i flera kopior från samma uttryck kassett, vilket kan resultera i ökad knockdown effektivitet7.
2. konstruktion av rekombinant Adeno-associerade vektorer för kombinerade uttryck av sonder Optogenetic och mikroRNA
Obs: Detta protokoll kräver kunskap om följande väletablerade metoder: molekylär kloning, DNA-sekvensering och rAAV produktion.
- Klon varje av de mest effektiva miR uttryck kassetterna till den 3' UTR konstruktioner avsedda för produktion av rekombinant rAAVs och uttryck av excitatoriska optogenetic sonder, såsom i pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (figur 1A), där den neuron-specifika synapsin promotorn driver uttryck för den ultrasnabba channelrhodopsin ChETA, röd fluorescerande reporter TdTomato och miR(s) infogas mellan den NheI och Mina platser5.
Obs: (i) inte överträffa förpackning gränsen för rAAVs, vilket är ungefär 4,7 Kb i längd från ITR (inverterad terminal upprepa) till ITR (figur 1A, orange). (ii) miR uttryck kassett behöver införas mellan stop kodon och WPRE (murmeldjur hepatit Virus från föreskrivande Element; Figur 1A). (iii) införande av ett fluorescerande protein, såsom TdTomato, är mycket användbart eftersom det ger lätt övervakning av lokalisering och intensiteten av infektion (protokoll steg 4). - Använda DNA sekvensering för att validera rätta införandet av miR kassetter.
- Råvaror och antikroppnivåns rAAV1/2 enligt den tidigare publicerade protokoll8, en rAAV1/2 för varje vald miR. En typisk experiment för överväldigande av en gen skulle omfatta två oberoende miRs mot samma gen och en miR kontroll. Sikta på en virus titer av ≥109 virala arvsmassan (vg) / µL.
Varning: rAAVs behöver hanteras i en anläggning för biosäkerhet nivå 1 (BSL-1). Kontrollera med institutionella Biosäkerhetskommittén för detaljerad information.
Obs: Om laboratoriet inte har en viral anläggning eller om viral titrarna inte är tillfredsställande, kommer rAAV produktion kan outsourcas. Till exempel besöka https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ eller https://vcf.charite.de/en/metas/.
3. utvinning av RNA från primära neuronala kulturer för utvärdering av miR Knockdown effektivitet av endogena gener av qRT-PCR
Obs: (i) detta protokoll kräver kunskap om följande väletablerade metoder: förberedelser och underhåll av primära neuronala kulturer och qRT-PCR. (ii) Upprepa kvantifiering av knockdown effektivitet (steg 3,1 – 3.14) minst 3 gånger (biologiska replikat). (iii) uppskattning av knockdown effektivitet på mRNA-nivå med qRT-PCR är lämplig när en analys av proteininnehållet är utesluten, till exempel när knackar ner alternativt skarvas isoformer som specifika antikroppar inte är tillgängliga5.
-
Förbereda primära neuronala kulturer från hjärnregionen av intresse. Följ protokollet för kortikala kulturer i föregående publikation9, med följande ändringar:
- Plattan nervceller i 6 plattor med en täthet av 500.000 nervceller per brunn. Använda 2,5 mL per brunn av fastsättning medium och 3,3 mL/väl av underhåll medium.
- Om Astrocyten överväxt observeras, tillsätt 0,5 mL per brunn av underhåll medium kompletteras med 7,5 µM av cytosin β-D-arabinofuranoside (för en slutlig koncentration på 1 µM) på 3 – 4 dagar i vitro (DIV).
-
Infektera tre brunnar per miR (tekniska replikat) på 5–6 DIV. Använd lägsta infektiös dos som kommer infektera ≥99% av nervceller.
- Ta bort 2 mL medium från varje brunn och samla det i en 50 mL falconrör.
- Lägga till virus direkt till nervceller, blanda försiktigt och placera plåtarna tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C.
- Lagra de insamlade mediet i inkubatorn. Lossa locket på falcon röret att tillåta gas Jämviktstiden.
- Efter 24 h, lägga till den borttagna medium tillbaka i varje brunn (1,9 mL per brunn).
-
På 17–18 DIV, lyse nervceller för RNA-extraktion.
FÖRSIKTIGHET: Lysis reagens och kloroform är mycket giftiga. Arbeta under en kemisk huva och använda skyddsutrustning; bortskaffa avfall enligt din nationella och institutionella riktlinjer.
Obs: För steg 3.3 – 3.13, fungerar i RNAse-fria villkor. Använd handskar och använda RNAse-fri glasvaror och disponibla plasticware. Allmänna försiktighetsåtgärder på hur man ska hantera RNA, finns till exempel bilaga A i RNeasy Micro handboken tillgängliga online.- Inkubera glas Pasteur pipetter över natten i en ugn vid 180 ° C.
- Tilt plattorna och aspirera på medellång helt från varje brunn med ett glas Pasteur-pipett ansluten till en vakuumpump.
- Tillsätt omedelbart 700 µL Lysis reagensmedel till varje brunn.
- Jämnt lösningen av gunga och skaka plattan noggrant och kort för hand.
- Pipettera lösningen upp och ner 4 – 5 gånger eller tills en homogen suspension erhålls.
- Över lösningen från varje brunn till en separat 1,5 mL Eppendorf-rör.
Obs: Den cell lysates kan lagras vid-80 ° C eller bearbetas omedelbart.
- Om så krävs, Frosta cell lysates på RT och omedelbart gå vidare till steg 3.5.
- Lägga till 140 µL av kloroform i varje prov av cell lysates.
Obs: Kloroform är flyktiga och svårt att Pipettera, nära Eppendorf rören så snart som möjligt. - Skaka de Eppendorf-rör kraftigt i 15 s eller tills proven är fullt emulgerade.
- Hålla provet RT i 1 – 2 min eller tills de flytande faserna börjar att separera.
- Centrifugera proverna på 12 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Överföra övre vattenfasen (~ 320 µL) som innehåller RNA till en ny Eppendorf-rör, och kassera återstående vätskan.
Obs: Rör inte den lägsta rosa organiska fasen eller den vita ringen mellan de två faserna med spetsen på pipetten. - Tillsätt 1,5 volymer av 100% etanol (480 µL) till vattenfasen och Pipettera lösningen långsamt upp och ned 3 gånger för att blanda.
- Rena RNA med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kit designad för rening av RNA från små prover.
- Kvantifiera RNA koncentration och prov renhet med en spektrofotometer.
Obs: (i) förväntar sig avkastningen av ≥3.5 µg/väl; de 260/280 och 260/230 nyckeltal för renhet över proteiner och organiska föreningar bör både vara ≥1.9. (ii) RNA-prover kan lagras vid-80 ° C eller bearbetas omedelbart. - Retrotranscribe 250, 500 eller 1000 ng av RNA med en kommersiellt tillgänglig kit.
- Kvantifiera knockdown effektiviteten för den endogena gen av intresse av qRT-PCR. För en detaljerad protokollet, se referens10. Målet för en knockdown verkningsgrad på ≥ 60% (figur 2). Normalisera data till ≥2 städning gener (t.ex. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) använda flera internkontroll gen metod11.
Obs: Om arbetar i råtta, använda följande PCR primers för städning generna: GAPDH-fwd: 5' GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3' och GAPDH-rev: 5' GATGATGACCCTTTTGGC 3'; ACTB-fwd: 5' CATCACTATCGGCAATGAGC 3' och ACTB-rev: 5' TCATGGATGCCACAGGATT 3'; TUBB3-fwd: 5' GCCTTTGGACACCTATTCAG 3' och TUBB3-rev: 5' TCACATTCTTTCCTCACGAC 3'; PPIA-fwd: 5' CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3' och PPIA-rev 5' CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3'.
4. bedömning av rollen av presynaptiska proteiner i intakt neuronala kretsar genom riktad stimulering av bankat-ned nervceller med optogenetik
Obs: Följande protokoll kräver tidigare erfarenhet med elektrofysiologiska inspelningar i akut hjärnskada skivor och tillgång till en Elektrofysiologisk setup.
- Stereotactically injicera rAAV1/2 i hjärnan efter ett detaljerat protokoll i föregående publikation12. Bestämma de stereotaktiska koordinaterna för hjärnregionen av intresse med hjälp av stereotaktisk atlaser för mus13 eller råtta hjärnan14.
- Använd en mikropipett avdragare dra injektion Mikropipetter med långa skaft av Ø 7 – 9 µm; klipp de injektion Mikropipetter på Tringa med sax. Använda en tunn markör och rutat papper för att placera kalibrera märken på de injektion Mikropipetter varje 2 mm.
- Söva djuret med isofluran och fixa det i den stereotaktiska apparaten.
- Värma djuret under hela operationen med en värmedyna på 37 ° C.
- Skydda ögonen med okulär smörjmedel.
- Raka päls på huvudet med en rakapparat.
- Sprida povidon jod på rakade huvudet med hjälp av en bomullspinne.
- I dissekera Mikroskop, gör en mittlinjen snitt.
- Ren ytan skalle med en bomullstuss, så att synliggöra de bregma och lambda.
- Placera den injektion mikropipett i dess hållare. Fäst hållaren stereotaktisk armen.
- Bestämma x och y koordinaterna för injektionsstället i förhållande till bregma eller lambda.
- Använd en borr för att tunna skallen över målområdet.
Obs: Använd mjuka cirkulära rörelser och Undvik borrning genom skallen eftersom detta kan skada ytan av hjärnan. - Om det blöder, absorbera överdriven blod med handduk papper.
Obs: Överdriven blod gör det svårt att avgöra korrekt z koordinaten. - Ladda ≤2 µL av viruset till den injektion mikropipett av kapillärkraften.
- Föra den injektion mikropipett till x- och y-koordinaterna för injektionsstället.
- Beräkna den z-koordinaten från dura och lägre pipetten långsamt in i hjärnan.
- När z koordinaten nås, vänta 3 min att möjliggöra justering av vävnad.
- Tillämpa positiv lågtryck med en 1 mL spruta ansluten via en flexibel slang på baksidan av den injektion mikropipett. Visuellt övervaka hastigheten för utmatning av viruset från den injektion mikropipett genom mikroskopet dissektion och använda kalibrera märken som referenspunkter.
Obs: Virus måste injiceras i långsam takt (< 100 nL/min) att undvika vävnadsskada. - När injektionen är klar, vänta 5 min, återkalla den injektion mikropipett av 0,2 mm, vänta för en annan 5 min, att undvika återflödet av viruset.
- Dra upp den injektion mikropipett långsamt och fullständigt från hjärnan och kasta den i en behållare fylld med blekmedel.
- Blöt skallen med fysiologisk lösning och suturera huden med 3-4 maskor.
- Tillämpa gentamicin salva på såret.
- Singel-house djuret i en ren bur med mat pellets och under en värmelampa tills det återställer helt.
- ≥15 dagar efter injektion, halshugga djur under djupa isofluran anestesi.
- Förbereda akut hjärnskada skivor av hjärnregionen av intresse med ett Vibratome som använder gasade (95% O2, 5% CO2) iskall aCSF lösning, som innehåller (i mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPyruvate och 18 glukos (osmolaritet anpassas till 300 mOsm). Till exempel om syftet är att analysera synaptisk transmission från CA3 till CA1 pyramidala nervceller, förbereda sagittala skivor av hippocampus bildandet (350 µm tjock).
Obs: Från detta steg framåt arbeta under låg-ljus villkor att undvika aktivering av optogenetic sonden av miljömässiga ljus. - Låt skivorna återhämta sig under 30 minuter vid 37 ° C i den samma aCSF i en kammare som utformats för att hålla hjärnan skivor. Förvara skivor i samma hjärnan slice kammaren i rumstemperatur tills inspelningen.
Obs: Med hjälp av dessa villkor, kan skivor hållas friska för upp till 6 – 8 h. - Överföra en skiva till en nedsänkt inspelning kammare och superfuse det med 2 mL/min den samma aCSF använde för återställning kompletteras med 1,5 mM CaCl2 (totalt Ca2 +: 2,5 mM) och utan NaPyruvate.
Obs: Skivor bereds och underhålls i låg koncentration av Ca2 + (1 mM) att minimera toxicitet. Inspelningar görs i 2,5 mM Ca2 + att gynna vesikler release. - Kontrollera kort signalen av uttryckt fluorescerande reporter (t.ex. TdTomato; Figur 3B) att fastställa lokalisering och intensiteten av infektion.
- Fyll en patch elektrod med en intracellulär lösning innehållande (i mM): 110 K-glukonat, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 EGTA, 3 MgCl2, 4 Mg-ATP, 0,5 Na3-GTP, 20 K2-kreatinfosfat, 10 HEPES-KOH (pH 7,28, 290 mΩ).
Obs: Använd lapp elektrod med en pipett motståndet av 5 – 6 mΩ. - Under IR-belysning, nå tätt hela-cell konfiguration från en neuron som tar emot synaptic ingångar från infekterade nervceller. Till exempel om CA3 pyramidal nervceller var infekterade, patch pyramidal nervceller i den proximala mediala tarmkanalen av regionen CA1 (figur 3 c).
Obs: Serie motstånd kan lämnas okompenserad, men det bör vara konstant och låg (≤20 MΩ). - Använda farmakologi för att isolera synaptic strömmarna under utredning. Till exempel, om syftet är att undersöka excitatoriska synaptisk transmission, blockera hämmande synaptisk transmission med 10 µM bicucullin.
- Framkalla synaptic strömmar, till exempel excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs), använda en 473 nm blå laser kopplad till en optisk fiber (Ø ≤250 µm) placerad på somata av infekterade nervceller (t.ex. CA3 pyramidal nervceller).
- Justera stimulering längd till ett minimum, för att minska risken för att frammana mer än en aktionspotential per ljuspuls. Om du använder ChETA, sätta den till 2 ms15.
- Justera stimulering styrka av laser för att ge små men klart påvisbara synaptic strömmar (≤50 pA maximal amplitud för EPSCs registreras vid en anläggning potential -70 mV mellan CA3 och CA1 pyramidala nervceller; Figur 3D). Om använda ChETA och en optisk fiber 250 µm i diameter, bör stimulering styrkor 1 – 3 MW på fiber avsluta vara lämpliga.
Obs: om laser styrka inte kan regleras, använda neutrala täthetsfilter. - Shine 473 nm laserljuset på somata av infekterade nervceller, men inte på deras axoner. Till exempel skina ljuset på CA3 somata, och bort från de Schaffer säkerheter, att undvika direkta depolarisation av axoner.
- Applicera tetrodotoxin (TTX; 0,5 µM), en blockerare av natriumkanaler, med i urvalet att bekräfta kanalerna är aktionspotential-driven.
- I olika inspelningar, tillämpa en selektiv blockerare till synaptic aktuell under utredning bekräfta stimulering är selektiv.
Obs: gäller till exempel NBQX (10 µM) till AMPA-typ glutamat receptor-medierad EPSCs. - Jämföra optiskt och elektriskt evoked synaptic strömmar i samma akut hjärnan skiva som svar på repetitiv stimulering (≥2 stimuli vid ≤20 Hz). En liknande grad av synaptic underlättande eller depression bör observeras mellan elektriska och optiska stimulering när du använder en kontroll miR, vilket tyder på att liknande cellulära mekanismer som aktiveras av de två typerna av stimuli.
Obs: Ovanstående steg är nödvändiga för att säkerställa att optiska stimulering inte inducerar en direkt depolarisation av presynaptiska knappar, sätt kringgå vissa mekanismer av synaptisk transmission.
- Jämföra synaptisk transmission i svar på enstaka och upprepad stimuli (≥2 stimuli vid ≤20 Hz) mellan en kontroll miR och miRs inriktning de presynaptiska proteinerna under utredning.
Representative Results
De förfaranden som beskrivs ovan ger en robust metod att bedöma hur synaptisk transmission påverkas av överväldigande av synaptic proteiner i presynaptiska neuroner. Representativa resultat på hur knockdown av alternativa skarva isoformer av presynaptiska Cav2.1 (P/Q-typ) VGCCs reglerar kortsiktiga synaptisk plasticitet vid CA3 till CA1 retande synapser ges nedan som ett exempel.
Cav2.1 (P/Q-typ) kanaler är de dominerande presynaptiska VGCCs på mest snabb synapser i centrala nervsystemet. Alternativ splitsning av de utesluter exonerna 37a och 37b av den por-bilda α1 subuniten av Cav2.1 (α1A) producerar två stora varianter, Cav2.1 [EFa] och Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. För att avgöra huruvida Cav2.1 [EFa] och Cav2.1 [EFb] differentially reglera synaptisk transmission och plasticitet i råtta Hippocampus pyramidal nervceller, utvecklade vi först isoform-specifika miRs till knockdown selektivt Cav 2.1 [EFa] eller Cav2.1 [EFb]5. Trots den korta storleken (97 bp) och hög (61,86% identitet på nivån nukleotid) likheten exoner 37a och 37b, vi kunde designa tre miR sekvenser mot råtta Cav2.1 [EFa] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) och två mot råtta Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) med förväntad hög knockdown effektivitet. Som negativ kontroll (miR kontroll) använde vi pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg plasmiden som innehåller en sekvens som inte är inriktat på någon känd ryggradsdjur genen. Baserat på en första skärm i HEK 293 celler mot heterologa kanaler, vi valt miR EFa1, miR EFa3 och miR EFb2 och klonade deras uttryck kassetter in den 3' UTR vektorns pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, som är avsedd för produktion av rAAVs och där den synapsin arrangören driver uttryck av den ultrasnabba channelrhodopsin ChETA, röd fluorescerande proteinet TdTomato och infogade miR (figur 1). Vi dupliceras också uttryck kassetten Mir EFb2 att effektivisera denna miR knockdown.
Nästa, vi förberett rAAV1/2 för ovanstående fyra konstruktioner, och kvantifierade knockdown effektivitet och selektivitet i primära råtta neuronala kulturer med isoform-specifika qRT-PCR. miR EFa1 och miR EFa3 reducerad mRNA av infödda Cav2.1 [EFa] ~ 70% men inte som i Cav2.1 [EFb], medan miR EFb minskas mRNA av infödda Cav2.1 [EFb] ~ 60% men inte som i Cav2.1 [EFa] (figur 2).
Vi sedan stereotactically injiceras varje av de fyra rAAV1/2 i området CA3 i hippocampus P18 råttor (figur 3A-C), med koordinater (A-P/M-L/D-V från Bregma) −2.6 / ± 2,9 / −2.9. Femton till tjugo-fyra dagar efter injektion, vi förberett akut Hippocampus skivor från rAAV1/2-injiceras råttor och används TdTomato fluorescens för att bekräfta uttryck och lokalisering av rAAVs (figur 3B). För att undersöka huruvida presynaptiska knockdown antingen Cav2.1 [EFa] eller Cav2.1 [EFb] påverkas kortsiktigt synaptisk plasticitet vid CA3 till CA1 synapser, stimuleras vi selektivt infekterade CA3 nervceller med kort 473 nm laser ljuspulser (2 ms-lång ; Figur 3 c), och spelade in de resulterande EPSCs vid lapp pyramidal nervceller i den proximala mediala tarmkanalen av regionen CA1 (figur 3 c). Vi hittade att knockdown av Cav2.1 splice isoformer påverkas Svaren till parat-puls stimulering i motsatta riktningar: knockdown Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 eller miR EFa3) ökat Parade-pulse underlättande (PPF) medan knockdown för Ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) avskaffades det (figur 3D, E).
Figur 1: System av konstruktioner för kombinerade uttryck av ultrasnabba optogenetic sond ChETA och isoform-specifika miRs mot Cav2.1 [EFa] och Cav2.1 [EFb]. (A) karta över rAAV konstruera pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, innehållande en synapsin promotor (Syn), den ultrasnabba channelrhodopsin ChETA smält till TdTomato och i den proximala 3' UTR, en Cav2.1 splice isoform-specifika miR. Restriktionsenzym visas är enda fräsar. (B) övre, system av uttrycket kassetten. Synapsin arrangören driver uttryck för både ChETA-TdTomato och en isoform-specifika miR. Botten, omvänd komplement av 21-nukleotid mål sekvenser, som utgör del av miR kassett. För miR EFb2 uttrycktes två identiska miR kassetter i tandem en efter den andra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Utvärdering av knockdown effektivitet och selektivitet isoform-specifika miRs för Cav2.1 [EFa] och Cav2.1 [EFb]. Isoform-specifika qRT-PCR-analys på RNA isoleras från 17-18 DIV primära kulturer angripits på 6 DIV rAAVs uttrycker miRs inriktning antingen Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 och miR EFa3) eller Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Data är normaliserad till den negativa kontrollen (miR kontroll). miR EFa1 och miR EFa3 avsevärt och selektivt minska mRNA i Cav2.1 [EFa] (n = 8 och 7 kulturer, respektive), medan miR EFb betydligt och selektivt minskar mRNA i Cav2.1 [EFb] (n = 4 kulturer; *** p < 0,001; envägs analys av varians test följt av Tukey-Kramer efter testet). Data presenteras som menar ± SEM. Denna siffra har anpassats från Thalhammer, A. et al. 5. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Bedömningen av rollen som Cav2.1 [EFa] och Cav2.1 [EFb] i native hippocampus av riktad stimulering av bankat-ned nervceller med optogenetik. (A) systemet för uttryck kassett av rAAV konstruktioner används för in-vivo -infektion. (B) Hippocampus avsnitt visar att TdTomato fluorescens är begränsad till regionen CA3 och sina prognoser. (C) experimentella konfiguration: laserstråle riktades till CA3 somata och patch clamp inspelningar utfördes från CA1 pyramidala nervceller. (D) 2 ms lång blå (473 nm) laser ljuspulser lyste vid 20 Hz framkalla EPSCs vars PPF är ökade miRs inriktning Cav2.1 [EFa] och avskaffas genom miR för Cav2.1 [EFb]. (E) Sammanfattning av Parade-pulse förhållandet för experiment som i (D), visar en ökning i PPF för miR EFa1 och miR EFa3 och en minskning för miR EFb2, relativa till miR kontroll (n = 9-11 inspelningar; * p = 0,02; ** p = 0,01; *** p < 0.0004; kovariansanalys). Data presenteras som menar ± SEM. Denna siffra har anpassats från Thalhammer, A. et al. 5. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Samtidig uttryck för en optogenetic sond och en miR mot en presynaptiska gen av intresse erbjuder en kraftfull metod för att karakterisera effekten av genen knockdown på presynaptiska funktion inom intakt neuronala kretsar. För detta experimentella tillvägagångssätt är det viktigt att identifiera och karaktärisera miRs som är mycket effektiva och selektiv i att knacka ner gen av intresse för inbyggda system. Två eller fler oberoende miRs mot samma mRNA av intresse bör om möjligt användas till kontroll för eventuell off-target effekter. Rescue experiment, där en miR-resistent gen återinförs i systemet, kan användas som en kontroll för specificitet.
Använder samma konstruktion för att uttrycka en optogenetic möjliggör sond och en miR stimulerande optiskt endast de presynaptiska neuroner som manipulerats. Detta är inte möjligt med elektriska stimuli eftersom de inte skiljer mellan infekterade och icke-infekterade nervceller, sålunda producerande blandade och utspädda resultat. Eftersom optiska stimuli kan framkalla flera handlingspänningar15, är det viktigt att välja endast de snabbaste optogenetic sonderna, bland en växande palett15,19,20,21. Dessutom är det viktigt att säkerställa att optiska stimulering inte inducerar en direkt depolarisation av presynaptiska knappar, för att undvika förbi några av steg av synaptisk transmission man vill undersöka22.
Den experimentella metod som vi beskriver här, gör det möjligt att utvärdera parallellt den fysiologiska betydelsen av flera presynaptiska gener av intresse inom en begränsad tidsperiod (4 – 6 månader). Det är dock viktigt att komma ihåg att knockdowns når sällan 100%. Dessutom måste rAAVs uttryckas i minst två veckor för att möjliggöra maximal knockdown och fullständiga uttryck för den optogenetic probe som kan representera en tidsbegränsning när du undersöker tidiga utvecklingsprocesser. Men mer tidskrävande, villkorlig knockoutmöss begränsat till presynaptiska neuroner, resulterar allmänt i fullständigt avlägsnande av genen sevärdheter och erbjuder därför en giltig kompletterande strategi.
En särskild fördel av miR-tekniken är att det möjliggör uttryck av flera miRs från samma arrangören. Detta boende har främst använts för att öka knockdown effektivitet genom att infoga flera kopior av samma miR eller olika miRs mot samma målgenen. Det kan dock vara brukade också knockdown flera gener genom att uttrycka miRs mot olika mål gener7,23. Den här egenskapen kan användas att tysta flera presynaptiska proteiner för att dissekera presynaptiska signalvägar.
Här har vi kombinerat optogenetik med konstgjorda miRs att karakterisera effekterna av genen knockdown på presynaptiska funktion i akut Hippocampus skivor. Ett liknande tillvägagångssätt kan också användas för att manipulera och sond neuronala kretsar i vivo. Dessutom kombinerar artificiell miRs med chemogenetic tillvägagångssätt skulle göra det möjligt att förhöra neuronala kretsar på längre tidsskalor.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) för stöd och Carmela Vitale för att hjälpa till med demonstrationen. Detta arbete finansierades av IIT och den Compagnia San Paolo (grant nr 9734 till LAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution | Toxic |
| Animal Temperature Controller with heat pad | WPI | ATC2000 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit | ThermoFisher Scientific | K4936-00 | |
| Brain slices Prechamber | Harvard Apparatus | BSC-PC | |
| CCD camera-based imager | Bio-Rad | ChemiDoc™ MP | |
| Cell Culture reagents | Life Technologies | ||
| Chemiluminescent substrate | GE Helthcare | ECL Western Blotting Reagents, RPN2106 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Toxic |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma | C6645 | |
| Drill | Foredom | K.1030 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gentamicin ointment | Local pharmacy | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Hepes | Sigma | 54459 | |
| Injection micropipettes | Narishige | GD1 | |
| Inorganic salts & detergents | Sigma | ||
| K2-creatine phosphate | Calbiochem | 237911 | |
| KGluconate | Fluka | 60245 | |
| Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-GFM-00100-03 | |
| Membrane | Amersham | Protran™ 0.2 µm NC | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| Micropipette holder | Narishige | IM-H1 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-100 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaPyruvate | Sigma | P5280 | |
| Ocular lubricant | Local pharmacy | Lacrigel | |
| Phosphate inhibitors | Sigma | P0044, P5726 | |
| Protease inhibitors | Sigma | cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | |
| Protein gel electrophoresis and blotting devices | Bio-Rad | Mini-Protean III Cell | |
| Providone iodine | Local pharmacy | Betadine | |
| Qiazol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Toxic |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit |
Qiagen | 205311 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Stereotactic apparatus | WPI | ||
| Tetrodotoxin | Tocris | 1069 | Toxic |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).
- Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Maejima, T., et al. Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice. J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).
- Mark, M. D., et al. Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations. J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).
- Thalhammer, A., et al. Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity. Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Chung, K. H., et al. Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Cingolani, L. A., et al. Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins. Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).
- Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition. J Vis Exp. (92), e51845 (2014).
- Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), (2002).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
- Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Bourinet, E., et al. Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).
- Chaudhuri, D., et al. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).
- Soong, T. W., et al. Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation. J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi. Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).
