Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En kanin modell av hållbara transgenens uttryck i halsvenen till gemensamma halspulsådern Interposition grafter

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/57231
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Medicine, University of Washington School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denna metod beskriver placeringen av interposition ven ympkvistar i kaniner, transduktion av hudtransplantat och uppnåendet av hållbara transgenens uttryck. Detta tillåter utredningen av fysiologiska och patologiska roller av transgener och proteinprodukter i ympade vener och testning av genterapi för ven graft sjukdom.

Abstract

Ven bypass kirurgi är en vanlig behandling för ocklusiv arteriell sjukdom; långsiktig framgång är dock begränsad av transplantatsvikt på grund av trombos, intimans hyperplasi och åderförkalkning. Målet med denna artikel är att visa en metod för att placera bilaterala venös interposition ympkvistar i en kanin, då transducing grafterna med en vektor av gen-överföring som uppnår hållbara transgenens uttryck. Metoden tillåter utredningen av gener och deras proteinprodukter biologiska roller i normal ven transplantat homeostas. Det gör också att testning av transgener för de aktiviteter som kunde förhindra ven transplantatsvikt, t.ex., om uttrycket av en transgen förhindrar neointimal tillväxten, minskar vaskulär inflammation eller minskar åderförkalkning hos kaniner utfodras med en fettrik kost. Under en inledande överlevnad kirurgi, är segment av höger och vänster yttre halsvenen censurerade och placering bilateralt återförda slut-till-sida gemensamma halspulsådern interposition ympkvistar. Under en andra överlevnad kirurgi, utförs 28 dagar senare, grafterna var isolerade från cirkulationen med vaskulär clips och lumina är fyllda (via en arteriotomin) med en lösning innehållande en helper-beroende adenovirala (HDAd) vektor. Efter en 20-minuters inkubation, vektor lösningen är aspirerade, arteriotomin repareras och flödet är återställd. Venerna skördas vid tidpunkter som dikteras av enskilda experimentella protokoll. Den 28-dagars fördröjningen mellan graft placeringen och transduktion är nödvändigt att säkerställa en anpassning av ven graften till den arteriella cirkulationen. Denna anpassning undviker snabb förlust av transgenens uttryck som förekommer i ven ympkvistar sensorik före eller omedelbart efter ympning. Metoden är unik i sin förmåga att uppnå hållbara, stabila transgenens uttryck i ympade vener. Jämfört med andra stora djur ven transplantat modeller, har kaniner fördelarna med låg kostnad och enkel hantering. Jämfört med gnagare ven transplantat modeller, har kaniner större och lättare-till-manipulera blodkärl som ger riklig vävnad för analys.

Introduction

Åderförkalkning är en kronisk inflammatorisk sjukdom där lipid ackumulering och inflammation i blodkärl väggen leder till förträngning av fartyget lumen, hjärtinfarkt, stroke och förlust av lemmar1,2. Perkutan intervention (t.ex., ballongvidgning och stentning) och medicinsk behandling (t.ex., statiner och trombocythämmande medel) är användbara behandlingar för åderförkalkning; men är de ofta ineffektiva vid behandling av svår obstruktiv sjukdom både hos de koronara och perifera cirkulationerna. Bypass ympning, använder autogen ven segment, förblir ett gemensamt förfarande för behandling av patienter med svår, diffusa koronara och perifera kärlsjukdomar3,4. Dock ven ympkvistar placeras i båda koronara och perifera cirkulationer har dålig patency långräntor. I koronar cirkulationen, är cirka 10-20% av ven ympkvistar är ockluderas på 1 år och 50% ockluderas av 10 år5,6. I den perifera cirkulationen är ven transplantat felfrekvens 30-50% på 5 år7.

Genterapi är en attraktiv metod för förebyggande av ven transplantatsvikt eftersom det kan leverera en terapeutisk genprodukten just på platsen för sjukdomen. Ett flertal prekliniska studier har därför testat ven transplantat gen behandling8,9. Dock har i huvudsak alla dessa studier undersökt effekten på tidig tid punkter (2-12 veckor)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. vi känner till inga bevis att genterapi interventioner kan ge varaktiga (år) skydd mot slutet ven transplantatsvikt som vanligtvis resulterar från neointimal hyperplasi och åderförkalkning4. Vi utvecklat en metod som gör hållbara transgenens uttryck i ympade vener, och därmed tillåter testning av genterapi interventioner sent samt tidig tidpunkter. För att uppnå hållbara transgenens uttryck, innehåller metoden HDAd vektorer och en fördröjd transduktion strategi. HDAd vektorer ge långvarig transgenens uttryck eftersom de saknar virala gener, hindrar de erkännande och förkastande av sensorik celler av immunsystemet18,19,20, 21. fördröjd transduction (utförs 28 dagar efter transplantat placering) förhindrar förlust av sensorik celler under den arterialization process som uppstår tidigt efter ympning22.

Andra metoder att uppnår terapeutiska transgenens uttryck i ven transplantat väggen förlita sig på transduktion av ven transplantat vid tidpunkten för transplantat placering10,11,12,15,16 ,17. När mätte seriellt, minskar transgenens uttryck använder denna metod snabbt efter transduktion22,23. Studier med hjälp av denna metod har följaktligen inte undersökte effekten längre än 12 veckor efter den ven ympning, mest inte bedöma effekten längre än 4 veckor. Däremot vår metod uppnår ven transplantat transgenens uttryck som kvarstår stabilt i minst 24 veckor och-baserat på liknande studier utförda i artärer-sannolikt fortsätter långt längre22,24. Vi känner till inga andra ven transplantat gen musikterapi ingripande som uppnår stabil transgenens uttryck för denna varaktighet.

Använde vi en kanin för att utveckla vår metod. Andra har använt gnagare, kaniner, eller större djur att testa ven transplantat gen terapi10,11,12,15,16,17,25, 26. Jämfört med gnagare modeller, kaniner är dyrare och är föremål för strängare myndighetskrav. Men jämfört med större djur (t.ex., grisar och hundar), kaniner är betydligt billigare att köpa och hus och mycket lättare att hantera. Dessutom kanin fartyg likna mänsklig fartyg fysiologiskt27, de är tillräckligt stora att de kan användas för att testa perkutan interventioner28,29, och de ger tillräcklig vävnad som flera slutpunkter (t.ex., histologi, protein, RNA) kan undersökas med hjälp av en enda blodkärl exemplaret22,30. Dessutom när kaninerna med ven ympkvistar matas med en fettrik kost, utvecklar de ven transplantat åderförkalkning31,32, vilket är en vanlig orsak till koronar bypass ven transplantat misslyckande4,5 . Dessa aterosklerotiska kanin ven grafter kan fungera som ett substrat för att testa genterapi interventioner levereras med denna metod. Det medföljande protokollet kan hjälpa undersökare att behärska de tekniska färdigheter som krävs för att uppnå hållbara transgenens uttryck i kanin ven ympkvistar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur protokoll och studier godkändes av University of Washington Office av djurskydd.

1. före operationen (för alla operationer)

  1. Söva kaninen med 30 mg/kg ketamin och 1,5 mg/kg xylazin genom intramuskulär injektion (I.M.) i paraspinous musklerna.
    Obs: Mat och vatten begränsas inte före operationen.
  2. Väntan på tillräckligt djup av anestesi, ställa in tabellerna i beredningslokalen och operationssalen (OR).
    1. Förbereda beredningslokalen raklödder i kaninens nacke och placeringen av intravenös (IV) hamnen i örat (överlevnad kirurgi endast). Placera den oftalmologiska salva, fentanyl plåster (överlevnad kirurgi), hårklippningsmaskiner, alkohol prep pad, 24-G x ¾ ”katetern, injektionsporten och kirurgisk tejp på tabellen förberedelse.
    2. I eller ställa in utrustningen och tillhörande sonder (elektrokardiogram (EKG), pulsoximetri (SpO2) och temperatur). Förbereda IV pumpen med en 100 mL koksaltlösning IV väska med en 18- eller 19-G nål och ställa in flödet som 10 mL/h/kg (endast överlevnad kirurgi). Ställa in syre och isofluran utrustningen med en noskon (ven ympning eller skörden operationer).
      1. För att säkra noskon till kaninen, slinga en gasbinda remsa runt röret som levererar gas till noskon. Denna slinga ska omge röret där det fäster noskon. De fria ändarna av gasväv remsan bör båda vara ca 45 cm lång. Placera noskon (med bifogade gasväv) på huvudändan av bordet.
    3. Slå på det cirkulerande vattnet eller tvingas luft uppvärmningen filt på tabellen OR. På den värmande filten, positionera en rullade handduk som ett nackstöd och placera diatermi dispersiva elektroden plattan.
    4. Som en lokal smärtstillande, kombinera i en spruta 1 mL 2% lidokain HCl och 1 mL bupivakain 0,5% HCl. Späd viruset till önskad koncentration (här, Använd 2 x 1011 viral partiklar/mL för HDAd) i steril DMEM och hålla på is (endast kirurgi med gen-överföring).
    5. Efter en adekvat smärtlindring djup nås, förbereda kaninen för kirurgi.
      Obs: Testet för avsaknaden av en pedal tillbakadragande reflexen att säkerställa adekvat smärtlindring djup. Fortsätta att övervaka pedal reflexen under hela operationen.
      1. Tillämpa oftalmologiska salva till kaninens ögon.
      2. För att möjliggöra placering av en rektal temperatursond, tryck med behandskade fingrar precis ovanför ändtarmen och flytta fingrarna mot anus att ta bort stooling från kaninens ändtarmen.
      3. Raka kanin från sternala skåran till kanten av underkäken. Raka ett öra för IV placering och motsatta örat för fentanyl plåster administration (överlevnad kirurgi endast). Raka vänster bakre mellersta tårna för placering av SpO2 sonden.
    6. För vektor infusion kirurgi, intubation kaninen. Använd en 4 mm O.D./3 mm I.D. man endotrakealtub, gängade över ett artroskop. Placera kaninen i sternala koordinationsrubbning och hyper-utöka halsen. Håll kaninens mun vidöppen och använder artroskop att visualisera glottis och larynx veck. Under inspiration, försiktigt in endotrakealtub genom struphuvudet och luftstrupen.
    7. För överlevnad operationer, placera och säkra en 24-G IV kateter i kaninens vänster öra ven och råga med en injektionsport. Applicera en 25 µg/h fentanyl plåster till kaninens högra öra.
      Obs: Protokollet är för en kirurg som placerad på kaninens högra sida. Om kirurgen kommer att kaninens vänster, omvänd sidorna i det här steget att hålla trådarna och IV mittemot av kirurgen. Växla sidorna i framtida åtgärder som behövs.
    8. För venen administrera ympning och skörd operationer, narkos med en noskon; för vektor infusion operationen, administrera narkos via en endotrakealtub.
      Obs: Intubation kan användas för alla operationer.  Vår erfarenhet dock kan riskerna för komplikationer från luftrör och larynx trauma under intubation uppväger fördelarna med intubation.  Operationen som innehåller genöverföring till ett transplantat (bestämt i kolesterol-matade kaniner) är den enda operationen i vilken intubation verkar ge en nettovinst.
    9. Bära kaninen in eller. Placera kaninen i ryggläge på operationsbordet med hals stöd handduken placerad strax under kaninens huvud. Försiktigt förlänga kaninens nacke tills den är rak och ca horisontella.
    10. Placera noskon till kaninen (ven ympning och skörd operationer) eller Anslut endotrakealtub (vector infusion kirurgi) med O2 på 1 L/min och starta isofluran. Om du använder en noskon, säkra den med omslag ändarna av bifogade gasväv remsorna runt kaninens nacke stöd handduk. Justera isofluran koncentration som behövs (vanligen 1-2%) för att upprätthålla en kirurgisk anestesi.
    11. Center diatermi dispersiva elektroden plattan under kaninens rygg. Sätt in sonden rektaltemperatur och tillämpa SpO2 sond och EKG leder till kaninen.
    12. Anslut saltlösning IV linjen till katetern porten i kaninens vänster öra och starta pumpen IV infusion på 10 mL/h/kg. Efter 1 h, minska saltlösning infusionshastigheten till 5 mL/h/kg.
    13. Löst slips kaninens frambenen till operationsbordet som ett tvång.
      Obs: Alternativt ett litet plast bord kan placeras över kaninen att förhindra kirurgen från att trycka på kaninens bröst/mage, och potentiellt orsakar gastroesofageal reflux och aspiration.
    14. Injicera lidokain/bupivakain (2 mL, 50/50 blandning, steg 1.2.4) subkutant (SQ) i halsen längs den planera snitt linjen, för lokalbedövning.
    15. Har assistenten desinficera den kirurgiska webbplats med 3 omväxlande scrubs av klorhexidinglukonat och isopropanol och sedan spraya webbplatsen med povidonjod. Har kirurgen scrub, klänning och handske, följande aseptiska principer.
      1. Utföra överlevnad operationer under aseptiska förhållanden. Har assistent hantera icke-steril objekt, och aseptiskt passera sterila material till kirurgen eller aseptiskt placera dem på tabellen draperad instrument.
      2. Har kirurgen använda sterila handdukar att aseptiskt manipulera icke-steril utrustning såsom mikroskopet. Har kirurgen bära 2 x kirurgiska luppar medan du utför den första halvan av operationen.

2. ven by-pass-kirurgi (överlevnad)

  1. Förbereda de instrument och sterila fältet.
    1. Har assistenten öppna sterila förpackningar (en tabell drapera, ett papper draperi och 6 handdukar) och aseptiskt överföra innehållet till kirurgen.
    2. Drapera tabellen instrument. Placera papper drapera och sterila handdukar till tabellen draperad instrument. Med 4 handdukar, drapera kaninen, lämnar bara operationsområdet på nacken utsatt. Lägg papper drapera över kaninen. En handduk ska användas senare, och den sista är en säkerhetskopia.
    3. Har assistenten öppna den steriliserade instrument Packet och aseptiskt passera instrument facket till kirurgen. Ordna instrument i tabellen instrument.
    4. Har assistenten öppna följande utrustning och aseptiskt antingen vidarebefordra den till kirurgen eller placera den på tabellen instrument: en 1 mL spruta, en 3-mL spruta, en 20 mL spruta, en 21 G nål, 3-0 polyglycolic syra (PGA) sutur, 5-0 PGA sutur , 7-0 polypropylen suturen och en 24 G IV kateter.
    5. Säkra diatermi kabeln till drapera täcker kaninen, använder en 7,25 ”Kantrowitz pincett. Släpp den sätt i änden av kabeln över kanten på operationsbordet vara ansluten till elektrokirurgiska enheten och tänder på assistenten.
    6. Fyll en 20 mL spruta med steril saltlösning från en saltlösning väska eller injektionsflaskan innehas av assistenten. Använda denna saltlösning som behövs för att förhindra uttorkning av exponerade vävnaden under operationen.
    7. Förbereda 5 mL hepariniserad fysiologisk saltlösning genom att tillsätta 0,1 mL av heparin 5000 IE/mL till 5 mL koksaltlösning, dvs., 100 IE heparin/mL, i en liten kirurgisk skål. Använd denna lösning för att spola carotid artär och ven graften regelbundet under förfarandet för ympning.
    8. Skär ett hål i papper drapera över operationsområdet på kaninens nacke. Använd handduk klämmor att klämma hörnen av hålet för att de underliggande handdukarna.
  2. Vaskulär dissektion
    Obs: Använd 2 x kirurgiska luppar med denna del av operationen.
    1. Skär huden med diatermi längs mittlinjen mellan sternala skåran och underkäken (ca 7-9 cm i längd) och klämma kaninens nacke huden att handdukar med handduk klämmorna. I kaudala slutet, göra ett kort laterala snitt genom fascian med diatermi. Rakt på sak dissekera under fascian längs hela mittlinjen med stor sax. Skär genom det dissekerade fascian lagret längs mittlinjen med diatermi.
    2. Börja på höger sida. Dissekera mellan den sternohyoid muskler överliggande luftstrupen och V-formade sternocephalic muskeln, att exponera den gemensamma halspulsådern.
    3. Noggrant dissekera en 4-5 cm segment av den gemensamma halspulsådern och dess större grenar (vanligtvis 1-2 per sida) fria från omgivande vävnader. Förlänga dissektion från basen av halsen proximalt till passage av faryngeal nerven distalt. Använd kirurgisk kisel loopar till stöd i indragning av halspulsådern under dissektion. Ligera de största grenarna av den gemensamma halspulsådern med 5-0 silk suturer innan du skär varje gren distalt.
      Obs: Var noga med att inte störa vagusnerven som paralleller den gemensamma halspulsådern, eller mindre nerver som passerar över artären.
    4. Upprepa dissektion på vänster sida (steg 2.2.3).
    5. Använd vävnad-anläggning pincett att tillfälligt stänga av subkutan vävnad skiktet. Dissekera den ytliga fascian från huden till höger tills den yttre halsvenen är utsatt. Dissekera en 4-5 cm segment av yttre halsvenen och gratis dess grenar från den omgivande vävnaden, ligating små grenar med 5-0 silk suturer innan du skär grenen.
    6. Upprepa dissektion på vänster sida (steg 2.2.5).
    7. Injicera heparin (150 IE/kg) i IV katetern och spola med 10 mL koksaltlösning.
    8. Mäta ett 3 cm segment av yttre halsvenen på höger sida och ligera kaudala slutet av segmentet med 5-0 silk sutur. Tillåter den ven att fylla med blod, då ligera kraniala slutet av segmentet ven. Dela kraniala slutet av segmentet yttre halsvenen, spola noggrant fartyget med hepariniserad fysiologisk koksaltlösning (100 U/mL) med en 3-mL spruta bifogas en 24-G IV-kateter. Dela upp segmentet ven dess stjärtfena slutet. Placera segmentet ven i en standardiserad position, där stjärtfenan och kraniala ändarna är otvetydigt identifierbar.
  3. Ven ympning
    1. Låt assistenten bort de kirurgiska luppar från kirurgen och flytta det kirurgiska mikroskopet (25 X) i position.
      Obs: Kirurgen bör drapera en steril handduk över mikroskopet. Detta tillåter kirurgen att manipulera mikroskopet bibehållen sterilitet.
    2. Spänn fast den just gemensamma halspulsådern i varje ände av segmentet isolerade med mini-klämmor, placera den kraniala klämman först till möjliggöra artär fyllning, sedan placera den kaudala klämman.
    3. Skär en 1 × 2 cm bit styvt papper (tillgänglig från steril suturen förpackningar) och placera den under den gemensamma halspulsådern, att förbättra exponeringen.
    4. Utföra en arteriotomin bara kraniala till stjärtfenan klämman (den kaudala arteriotomin). Arteriotomin längd bör vara lika med diametern av kraniala slutet av segmentet ven. Infoga sprutan med IV katetern genom den kaudala arteriotomin och spola halspulsådern lumen med hepariniserad fysiologisk koksaltlösning.
    5. Sutur kraniala slutet av venen till den kaudala arteriotomin, med 7-0 polypropylen sutur med enstaka stygn (figur 1).
      1. Placera den första sömmen för att suturera kaudala slutet av den kaudala arteriotomin till kraniala slutet av segmentet ven. Placera den andra stygnet 180° från den första maskan, att suturera kraniala slutet av den kaudala arteriotomin till kraniala slutet av segmentet ven.
      2. Plats den tredje maskan på en punkt som är lika långt från de första två stygn, på den laterala sidan av anastomos. Placera den fjärde maskan på den mediala sidan av anastomos, lika långt från de två första stygn och mittemot den tredje maskan. Plats 4 ytterligare stygn (5-8 stygn) mellan varje stygn 1-4.
      3. Utföra den kraniala arteriotomin på stjärtfenan sida av kraniala klippet. Avståndet mellan kraniala slutet av de kraniala arteriotomin och stjärtfenan ände den kaudala arteriotomin bör vara densamma som längden på segmentet ven. Längden på den kraniala arteriotomin är lika med diametern av stjärtfenan slutet av segmentet ven.
    6. Förlänga venen cranially från anastomos, lägga den ovanpå halspulsådern, utan att införa några vändningar. Spola halspulsådern och ven med hepariniserad fysiologisk koksaltlösning via den kraniala arteriotomin. Saltlösning kommer att flöda genom artären, in i venen via kaudala anastomos och kommer att avsluta från gratis och unsutured slutet av venen. Flushing venen också förhindrar vridning.
    7. Sutur kaudala slutet av venen till den kraniala arteriotomin (figur 1).
      1. Placera en första sömmen för att suturera kaudala slutet av de kraniala arteriotomin till stjärtfenan slutet av segmentet ven. Placera en andra stygn för att suturera kraniala slutet av de kraniala arteriotomin till stjärtfenan slutet av segmentet ven. Komplett anastomos som beskrivs i steg 2.3.5.2. Precis innan sista knuten är knuten på den kraniala anastomos, kort öppna klämman på kraniala slutet av dissekerade gemensamma halspulsådern segmentet, att tillåta tillbaka-blödning som tvättar ut luften i halspulsådern och ympade ven. Dra sedan åt sista knuten.
    8. Släpp den kraniala klämman för att möjliggöra ven transplantat fyllning med blod och sedan släppa den kaudala klämman. Rask pulsationer bör ses i ven graften. Applicera lätt tryck med torr gasbinda stoppa eventuella blödningar på anastomoser.
    9. Ligera båda ändarna av den gemensamma halspulsådern segment som förbinder anastomoser med en 3-0 silk sutur och dela halspulsådern halvvägs mellan ligaturer (figur 1). Gälla halspulsådern intill varje anastomos flera droppar av papaverin (3,5 mg/mL).
    10. Injicera heparin (75 IE/kg) i örat IV katetern och spola med 10 mL koksaltlösning. Vid denna tid, injicera buprenorfin (SQ, 0,02 mg/kg) för att ge postoperativ analgesi tills fentanyl plåstret har lämnat smärtstillande plasmanivåerna av fentanyl.
      Obs: En ytterligare buprenorfin injektion (SQ, 0,02 mg/kg) kan vara nödvändiga 6 h efter den första injektionen att upprätthålla analgesi tills plasma fentanyl når en terapeutisk koncentration.
    11. Upprepa ympning på vänster sida (steg 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
    12. Stäng den subkutana vävnaden med 5-0 PGA sutur med hjälp av en kontinuerlig mönster. Nära huden med 3-0 PGA sutur med ett intrakutant mönster. Begrava knutar i båda ändarna.
  4. Postoperativ återhämtning, rengöring och vård
    Obs: Låt kaninen att återhämta sig från anestesi i en lugn och tyst miljö. Övervaka kaninen kontinuerligt för rätt syresättning och kropp temperatur tills det har återhämtat sig helt.
    1. Stäng av isofluran och syre och koppla anestesi maskinen från kaninen. Koppla bort IV vätska slangen från kaninen, men lämna IV hamn i örat venen för framväxande tillgång.
    2. Transportera en återhämtning bur kaninen och placera den på sin sida. Termiska stödja med ett varmt vatten filt (eller Tvingad-luft uppvärmningen). Ge O2 av noskon tills SpO2 är stabil.
    3. Tills kaninen kan sitta upp och ambulate i sin bur, flip kaninen att dess andra sida varje 15 min. Sedan bort örat IV kanylen och återgå kaninen till sin bur. Återgå kanin till sällskap av andra djur förrän det är helt återhämtat sig från anestesi.
    4. Avyttra någon avfall följande lämpligt protokoll för biohazard och sharps avfall.
    5. Postoperativt, kontrollera kaninens hälsa och kirurgiska såret varje dag. Administrera buprenorfin som behöver för smärta inte hanteras av fentanyl plåstret. Ta bort fentanyl plåstret på postoperativ dag 3.

3. bestämning av transkutant ultraljud

  1. För att bedöma transplantat patency, utföra ultraljud examen på icke-sövd kanin 5-7 dagar efter ven-kirurgi och genöverföring kirurgi.
    1. Wrap icke-sövd kaninen säkert i en filt och placera kaninen liggande i en veterinär V-botten med dess hals extended. Raka halsen, eller om det behövs, ta bort håret med en hårborttagningsprodukter agent. Tillämpa ultraljud gel till halsen och utföra ultraljud examen.
      Obs: Ett ultraljud prov utförs också på sövda kaniner vid tidpunkten för både genen överföring operationen och den terminal skörd kirurgin att undersöka transplantat patency och mäta transplantat lumen diameter. Tentamen sker strax innan den hals skrubbning och utförs på ett liknande sätt som för icke-sövd kaninerna.

4. genöverföring kirurgi utförs ~ 28 dagar efter Graft placering (överlevnad kirurgi)

  1. Förbereda instrument och det sterila fältet.
    1. Följ steg 2.1.1-2.1.3. i ven by-pass-kirurgi.
    2. Låt assistenten öppna följande utrustning och antingen aseptiskt passera den till kirurgen eller placera den på tabellen instrument: sex 1 mL sprutor (med nål), en 3-mL spruta, en 20 mL spruta, en 21 G nål, en 19-G nål, 3-0 PGA sutur , 5-0 PGA sutur, 7-0 polypropylen sutur, två 24 G IV katetrar och en steril blod flöde sond.
    3. Följ steg 2.1.5-2.1.6. i ven by-pass-kirurgi.
    4. Förbereda en 1 mL spruta med 1 mL DMEM för tvätt artär och ven transplantat och förbereda två 1-mL-sprutor med virus lösning (~ 0,5-0,7 mL virus lösning/ven graft). Låt assistenten Tina viruset och späd det i DMEM. Förbered en 3-mL spruta med 0,5 mL lidokain/bupivakain (50/50 blandning, steg 1.2.4).
    5. Följ steg 2.1.8 i ven by-pass-kirurgi.
  2. Isolering av ven grafter och intilliggande halspulsåder
    Obs: 2 x kirurgiska luppar bör användas för denna del.
    1. Skär huden med diatermi längs mittlinjen mellan sternala skåran och underkäken (ca 7-9 cm i längd) och klämma den hud öppen med handduk klämmor. Gälla den subkutana vävnaden 0,5 mL lidokain/bupivakain (50/50 blandning, steg 1.2.4).
    2. I kaudala slutet, göra ett kort laterala snitt genom fascian med diatermi. Rakt på sak dissekera under fascian längs hela mittlinjen. Med diatermi, skär genom dissekerade fascian längs mittlinjen.
    3. Börja på höger sida. Dissekera mellan den sternohyoid muskler överliggande luftstrupen och V-formade sternocephalic muskeln, att exponera ven graften. Noggrant isolera ven transplantat och 1,5-2,0 cm av halspulsådern intill transplantat på båda kraniala och stjärtfenan sidorna.
    4. Upprepa dissektion på vänster sida efter steg 4.2.3.
  3. Mäta blodflödet i ven grafterna.
    1. Fyll det kirurgiska sår hålet på höger sida med fysiologisk koksaltlösning att möjliggöra överföring av ljudvågor. Fördjupa en 2 mm perivaskulär flöde sond (ansluten till en volym-flödesmätare) i saltlösning i såret hålighet och flödet måste nollställas.
    2. Placera sonden flödet runt halspulsådern stjärtfenan eller kraniala till ven graften. Registrera data från flödet probe med ett elektroniskt system för datainsamling.
    3. Upprepa flödesmätning på vänster sida efter steg 4.3.2.
    4. Beräkna den infusionsprotokoll baserat på peak systoliskt flöde, lägsta diastoliskt flödeshastighet och genomsnittliga flödeshastigheten. Även beräkna laminar skjuvspänning, baserat på flödet och lumen diameter (mätt med transkutan ultraljud).
  4. Ingjuta vektor lösning i ven grafterna
    Obs: Kirurgiska Mikroskop (16 X) används som behövs för att punktera, infusion och reparation av halspulsådern.
    1. Har assistent ta bort kirurgens kirurgiska luppar och flytta det kirurgiska mikroskopet till position. Har kirurgen drapera en steril handduk över mikroskopet. Sterila handduken tillåter kirurgen att manipulera mikroskopet bibehållen sterilitet.
    2. Har assistenten injicera heparin (150 IE/kg) i IV katetern och spola med koksaltlösning.
    3. Använd en stor nål förare för att böja 21 G nålen till ca 80° ovanför avfasningen (böj inte avfasningen; Figur 2A).
    4. Klämma den gemensamma halspulsådern i varje ände av ven graften med mini-klämmor, placera den kraniala klämman först till möjliggöra artär fyllning, sedan placera kaudala klippet. Placera det kaudala klippet ca 10 mm kaudalt till anastomos, att lämna lite utrymme för arteriotomin.
    5. Sätt två siden band runt artär bara stjärtfenan att transplantatet och knyta en enkel överhandsknop på varje - utan skärpa dessa.
    6. Punktera halspulsådern stjärtfenan att transplantatet med böjda 21 G nålen bara kraniala av stjärtfenan vaskulär klippet. Var noga med att inte punktera rygg eller sida väggarna. Avancera nålen in i lumen och tillbaka två gånger för att säkerställa att lumen är klar och sedan försiktigt dra ut injektionsnålen.
      Anteckningar: Vanliga halspulsådern punktering kan vara hjälpt av greppa arteriell adventitia med fin pincett och försiktigt lyfta den främre väggen medan du för in spetsen på nålen bara stjärtfenan till lyftpunkt (figur 2A). Detta minskar risken för att slå den baksida väggen med nålen.
    7. Med flera ovikt gasväv pads, skapa en boet för att placera sprutan används för infusioner. Placera detta gasväv näste stjärtfenan till operationsområdet.
    8. Sätta en 24 G IV-kateter på sprutan med DMEM-bara och dra katetern på sprutan precis tillräckligt för att förhindra läckage (sprutan tas bort senare i denna operation) och böja katetern ~ 4 mm från spets så att böjen håller på ca 75° efter det släpps.
    9. Infoga IV katetern i den gemensamma halspulsådern arteriotomin fram till krök och tvätta ven transplantat lumen två gånger med 0,5 mL av DMEM. För varje repetition, Fyll ven graften med DMEM. Ta sedan bort DMEM från transplantatet genom att trycka lätt med en handskar finger i kraniala slutet av graften. Noggrant Skjut fingret mot kaudala slutet av graften att spola luminala innehållet ut via arteriotomin.
    10. Ta bort DMEM sprutan från katetern, lämnar katetern i fartyget. Anslut sprutan innehållande virus lösningen, att se till att ingen luft kommer in katetern. Flytta den löst knutna siden band ner artären tills de är runt kateterspetsen, men dra inte åt dem.
    11. Ingjuta 0,03 mL virus lösning att driva den återstående DMEM ur katetern. Ta bort all vätska från ven transplantat lumen med ett finger, att trycka försiktigt från kraniala till stjärtfenan.
    12. Dra åt de två band runt artär och katetern spetsen att försegla lumen. Ingjuta virus lösningen tills venen är utspänd. Lägg försiktigt sprutan i boet av gasväv.
      Obs: Det är viktigt att ven graften expanderar till dess pre transduktion kaliber och förblir uppblåsta under virus infusionen. Om så inte är fallet, mängden genöverföring minskas avsevärt.
    13. Lämna den virus-innehållande lösningen i ven transplantat lumen i 20 min och sedan ersätta de virusinnehållande spruta bifogas katetern med en tom spruta. Aspirera försiktigt virusinnehållande lösningen från graften tills kärlet kollapsar. Ta bort sprutan, lämnar katetern på plats. Skär och knyta upp suturerna som silke och ta ut katetern från fartyget. Ta bort katetern från den halspulsådern noggrant för att undvika att skada endotel.
    14. Med hjälp av det kirurgiska mikroskopet, nära arteriotomin med 7-0 polypropylen sutur med hjälp av en X-mönster (figur 2B).
      1. Förstå suturen med nål-hållare, ange fartyget längst ned till höger i arteriotomin och avsluta fartyget längst ned till vänster. Korsa öppnandet utanför fartyget och göra det andra passet från övre högra till längst upp till vänster.
      2. Innan åtdragning suturen, kort släpp kraniala vaskulär klippet för att spola luft och kvarstående virus från ven transplantat och artär. Blod rinner ut ur arteriotomin när klämman är släppt.
      3. Nära arteriotomin genom att försiktigt dra suturen slutar och knyt dem tillsammans med 2 kvadrat knop.
        Anmärkning: Dra suturen alltför tätt kommer att orsaka högar av vävnad som kommer att störa flödet ökar risken för trombos och eventuellt införa okontrollerad variabler.
    15. Släppa kraniala vaskulär klippet, då kaudala klippet. Stoppa eventuella blödningar med gasväv för att applicera ett lätt tryck.
    16. Runt denna tid injicera buprenorfin (SQ, 0,02 mg/kg) för att ge postoperativ analgesi tills fentanyl plåstret har lämnat smärtlindrande fentanyl plasmanivåer.
      Obs: En ytterligare buprenorfin injektion (SQ, 0,02 mg/kg) kan vara nödvändiga 6 h efter den första injektionen att upprätthålla analgesi tills plasma fentanyl når en terapeutisk koncentration.
    17. Upprepa protokollet virus infusion på vänster sida, följande steg 4.4.5-4.4.15.
  5. Sårslutning
    1. Stäng den subkutana vävnaden med 5-0 PGA sutur, med hjälp av en kontinuerlig mönster. Nära huden med 3-0 PGA sutur med ett intrakutant mönster. Begrava knutar i båda ändarna.
  6. Postoperativ återhämtning, rengöring och vård
    1. Följ steg 2,4.

5. skörden kirurgi (Terminal)

  1. Förbereda instrument och operationsområdet.
    1. Följ steg 2.1.1-2.1.3 i ven by-pass-kirurgi.
    2. Låt assistenten öppna och aseptiskt placera på tabellen instrumentet (eller passera till kirurgen): en 20 mL spruta, en 21G nål, 3-0 silk suturen och en steril blod flöde sond.
    3. Följ steg 2.1.5-2.1.6 och 2.1.8 ven kirurgi.
  2. Isolering av gemensamma halspulsåder och ven grafter
    1. Skär huden med diatermi längs mittlinjen mellan sternala skåran och underkäken (ca 7-9 cm i längd) och klämma kaninens nacke huden att handdukar med handduk klämmor.
    2. I kaudala slutet, göra ett kort laterala snitt genom fascian med diatermi. Rakt på sak dissekera under fascian längs hela mittlinjen. Skär genom dissekerade fascian längs mittlinjen med diatermi.
    3. Börja på höger sida. Dissekera mellan den sternohyoid muskler överliggande luftstrupen och de V-formade sternocephalic musklerna att exponera det gemensamma halspulsådern och ven transplantatet.
    4. Dissekera den högra ven transplantat och gemensamma halspulsådern fria från omgivande vävnader. Använda kirurgiska kisel loopar för indragning av artär och ven ympkvisten under dissektion.
    5. Upprepa dissektion på vänster sida efter steg 5.2.3-5.2.4.
  3. Gör flöde mätningar efter steg 4.3.1-4.3.3 i gen överföring kirurgi.
  4. Skörden av ven grafterna
    1. Med 3-0 silk sutur, ligera just gemensamma halspulsådern kraniala att transplantatet. Sedan ligera halspulsådern stjärtfenan att transplantatet.
    2. Punktskatt rätt ven transplantatet genom att dividera den intilliggande halspulsådern mellan var och en av nering och intilliggande anastomos. Ta bort ven transplantat från kaninen och spola lumen med saltlösning.
    3. Trimma halspulsådern och anastomoser från båda ändarna av ven graften. Trimma bort överflödig adventitial vävnad från ven transplantat och skär transplantat i segment som behövs för en annan endpoint analyser.
    4. Skörda vänster ven transplantatet genom att upprepa steg 5.4.1-5.4.3.
  5. Injicera 1 mL av fenytoin/pentobarbital IV att avliva kaninen.
  6. Avyttra någon avfall följande lämpligt protokoll för biohazard och sharps avfall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det tekniska kunnande som en ny aktör måste valideras innan operatören kan använda denna metod för att generera experimentella data. Den första milstolpen som en ny operatör måste uppnå är konsekvent ven transplantat patency efter både inledande ven-ympning operationen och den efterföljande försenad-signaltransduktion-kirurgin. Över 90% patency efter alla operationer är önskvärt och genomförbart. Patency kan bedömas icke-invasivt med transkutan ultraljudsundersökning, som vi utför vanligtvis postoperativa dag 5-7. I kaniner med patent vener, kommer att ultraljud tentan avslöja ett stort blodkärl med Rask caudal-till-kranial blodflödet på båda sidor av främre halsen (figur 3A). Om någon av ven grafterna är ockluderas, blir det inga detekterbara caudal-till-kranial blodflödet på sidorna med ockluderad graften. Kranial-till-kaudala blodflödet kommer dock fortfarande upptäckas i den inre halsvenen (figur 3B).

Den andra milstolpen som en ny operatör måste uppnå är effektiv transduktion av ven-graft endotelceller. Här används en adenovirala vektor som uttrycker β-galaktosidas att utvärdera effektiviteten av endothelial genöverföring. En ny aktör i vårt labb sensorik ven grafter med ett adenovirus som uttrycker β-galaktosidas (AdnLacZ) med hjälp av de metoder som beskrivs. Grafterna var avverkat 3 dagar efter transduktion och skuren i segment. Vissa segment var målat med 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). En face avbildning av luminala ytan visade ven grafter med effektiv transduction (figur 4A) och dålig transduction (figur 4B). För att ytterligare utvärdera kunskaper av en ny operatör, mäts β-galaktosidas mRNA i extrakt av sensorik ven graften också med kvantitativ omvänt transkriptas-medierad PCR och normalisera signalen till glyceraldehyd fosfatnivån dehydrogenas (GAPDH) mRNA mätt i samma ven grafterna.

Nivåerna av β-galaktosidas mRNA i ven ympkvistar sensorik av operatorn new var inte signifikant från nivåerna av β-galaktosidas mRNA i ven ympkvistar sensorik av en erfaren operatör (figur 5). Om mRNA prover från ven grafterna sensorik av en erfaren operatör inte är tillgängliga för jämförelse, grafter negativ kontroll ven transplantat mRNA kan genereras av transducing ven med en icke-uttryckande kontroll vektor (AdNull). Vi har funnit att de genomsnittliga nivåerna av β-galaktosidas mRNA i ven ympkvistar sensorik av en erfaren operatör är cirka 1.000-faldig högre än bakgrunden PCR-signalen för β-galaktosidas mRNA mätt i AdNull-sensorik transplantat (figur 5) .

Figure 1
Figur 1 . Placeringen av en omvänd höger yttre halsvenen till höger gemensamma halspulsådern transplantat med slut-till-sida anastomoser. Ven transplantat (blå) sys till den gemensamma halspulsådern (röd) på två anastomoser. På varje anastomos, stygn (vitt x) numreras i den ordning i vilken de placeras. För båda anastomoser, sy 1 suturer kaudala slutet av arteriotomin till den yttre halsvenen. Sy 2 suturer kraniala slutet av arteriotomin till den yttre halsvenen. Stitch 3 placeras på den laterala sidan av anastomos vid en punkt som är lika långt från de första två stygn. Stitch 4 placeras på den mediala sidan av anastomos, lika långt från de två första stygn och mittemot stitch 3. Fyra ytterligare stygn (5-8 stygn) placeras mitt emellan fyra befintliga stygnen. Segmentet halspulsådern mellan anastomoser är sammanskrivna i båda ändar med 3-0 silk suturer (pilar) och delat (streckad linje) halvvägs mellan ligaturer. Vänstersidig ympkvistar utförs på ett liknande sätt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Skapande och stängningen av en halspulsådern arteriotomin. (A), den gemensamma halspulsådern adventitia är förstått nära ven graften med fin pincett och uppåtgående dragkraft appliceras på kärlväggen. Detta skapar en vertikal yta, vilket gör att den böjd 21 G nål ska infogas ungefär parallellt med fartygets lumen, minskar risken för punktering den baksida väggen i artären. (B) arteriotomin sys med 7-0 polypropylen i en X-mönster. Den första sutur passeringen in artär lumen på nere till höger om arteriotomin (plats 1) och avslutar lumen nere till vänster (plats 2). Suturen korsar sedan arteriotomin. Nästa pass in lumen överst till höger (plats 3) och avslutas lumen överst till vänster (plats 4). Mild dragkraft på ändarna av suturen (ändarna avfart från plats 1 och plats 4) stänger arteriotomin. Sutur ändarna knyts med 2 kvadrat knop. De heldragna blå cirklarna visar de platser där suturen tränger igenom kärlväggen. De heldragna blå linjerna visar där suturen passerar utanför kärlväggen; Prickig blå linjer visar att suturen är placerad i lumen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Transkutan ultraljudsbilder av kanin halsar, utvärdera ven transplantat patency 5-7 dagar efter ympning. (A) Patent ven transplantat (röd) med blodflödet i kaudala-till-kranial riktning är visas (pil). (B) Occluded ven transplantat. Ingen caudal-till-kranial blodflödet (vilket skulle visas i rött) upptäcks. Den inre halsvenen (blå) med blodflödet i kranial-till-kaudala riktning indikeras (asterisk). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Beta-galaktosidas transgenens uttryck i ven ympkvistar. 28 dagar efter ympning, var kanin ven ympkvistar sensorik av en 20-minuters inkubation av adenovirala vektorer uttrycker β-galaktosidas inom lumina kirurgiskt isolerade ven ympkvistar. Ven ympkvistar var avverkat 3 dagar efter transduktion och målat med 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) En face bild av luminala ytan av en ven segment visar effektiv transduktion. (B) En face bild av luminala ytan av en ven segment visar dålig transduktion. Skalstapeln = 1,0 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Uttryck för beta-galaktosidas (β-gal) transgenens mRNA i ven transplantat segment. 28 dagar efter placering av halsvenen interposition ympkvistar i kanin halspulsådern, var grafterna sensorik antingen med en adenovirala vektor uttrycker beta-galaktosidas (AdnLacZ) eller med en kontroll adenovirala vektor som inte uttrycker ett transgenens (AdNull ). Operationer utfördes av en erfaren operatör (kirurg 1) eller en ny operatör (kirurg 2). Ven ympkvistar sensorik med AdnLacZ var alla skördade 3 dagar efter transduktion. RNA extraherade från ympkvistar sensorik med AdNull och skördade 14 dagar efter transduktion analyserades också, som en negativ kontroll. Uttrycket av beta-galaktosidas mRNA kvantifierades genom kvantitativ omvänt transkriptas-medierad PCR, med värden som normaliserad till glyceraldehyd fosfatdehydrogenas mRNA mätt i samma extrakt och uttryckt som godtyckliga enheter (AU). Staplarna visar medelvärden; p -värden är från rank sum test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg i detta protokoll är förvaltningen av anestesi, antikoagulation, kirurgisk manipulation av artär/ympade ven och hemodynamiska mätningar av ympade venen. Korrekt hantering av anestesi är kritisk i detta flera överlevnad kirurgi modell som inkluderar två relativt långa operationer (vanligtvis 3-3,5 h för bilaterala ven ympning och 1,5-2,5 h för bilaterala transplantat transduktion). Vi har administrerat anestesi både via en noskon och av endotrakeal intubering och fann att intubation förbättrad överlevnad efter by-pass-kirurgi i transduktion, möjligen eftersom ventilation med positivt tryck förhindrar atelektas och associerade andningssvikt. Kaniner är en utmaning för att intubation och intubation-relaterade luftvägarna trauma kan orsaka postoperativ stridor. De utmaningar och komplikationer av intubation är dock ett litet pris att betala till förmån för att eliminera de flesta av perioperativ sjuklighet och dödlighet associerade med ven ympning operationen.

Antikoagulation är nödvändig för att förhindra blodpropp ympade vener, vilket kan inträffa efter antingen av de överlevnad operationerna. Trombos verkar vara en tidig postoperativ händelse, eftersom ven grafterna som är patent på transkutan ultraljudsundersökning 5-7 dagar postoperativt är nästan alltid patent vid skörd. Att förhindra blodpropp efter första operationen (dvs., ven ympning), IV heparin administreras före skörd första yttre halsvenen. Baserat på plasmahalveringstiden av heparin i kaniner (1-2 h), administreras ytterligare en halv dos av IV heparin före skörd den kontralaterala yttre halsvenen. Dessutom tills båda arteriovenös anastomoser av en enskild ven transplantat är komplett, spola vi lumina av halspulsådern och ven ympkvisten ca varje 8 min med hepariniserad fysiologisk koksaltlösning. För att undvika transplantat trombos, försiktighet bör iakttas att inte skada venen graft-särskilt endotel-under skörd och ympning. Detta inkluderar skonsam hantering av ven med kirurgiska instrument och lämnar ett tunt lager av adventitial fettvävnad som bifogas venen. Vi förvaltar också en engångsdos av aktuell papaverin ympade halspulsådern, att förhindra eller omvänd vasospasm, som kan bidra till Trombos.

Under venen ympning kirurgi krävs noggrann uppmärksamhet på kirurgisk teknik. För att undvika blödning vid anastomoser, transplantat trombos och införandet av okontrollerad hemodynamiska variabler, måste de två arteriotomies vara av rätt längd. Om en arteriotomin är för kort, blir ven transplantat ostial väggen överflödig på platsen för anastomos, skapa gör blödning. Om arteriotomin är för lång, stretching venen för att täcka arteriotomin tar venen transplantat väggar i närheten, vilket gör det svårt för kirurgen att undvika suturering den motsättande ven transplantat väggar grupp (i huvudsak garanterar postoperativ trombos). Dessutom om ven transplantat lumen är smalare eftersom venen var sträckt för att täcka en överdrivet långa arteriotomin, skapas en stenos som ökar skjuvspänning, predisposes trombos33och eventuellt förändrar resultatet variabler såsom neointimal tillväxt och vaskulär remodellering34,35. Dessutom är det viktigt att undvika att införa vändningar i ven transplantat, vilket kan resultera i lumen förträngning eller onormal flöde. För att undvika vridning av graften, vi alltid justera segmentet ven längs ventrala ytan av den gemensamma halspulsådern och säkerställa att det finns inga vändningar i venen. På grund av risken för variabel kirurgisk teknik ändra ven transplantat hemodynamik, och eftersom förändrad hemodynamik kan påverka resultatet variabler oberoende av behandling, vi mäta rutinmässigt blod flöde och transplantat diameter före vektor infusion och vid tidpunkten för skörd. Vi använder dessa värden för att beräkna skjuvspänningen och infusionsprotokoll. Ven grafter med hemodynamiska mätningar utanför förutbestämda intervall kan uteslutas objektivt från ytterligare analys, minskar experimentella variabilitet och ökande statistiska makt.

Som vi utvecklat denna metod, gjorde vi flera ändringar. Inledningsvis försökte vi ven transplantat genöverföring under åtgärden ympning. Under dessa omständigheter var transgenens uttryck nästan helt förlorade dock med 3 dagar efter genen överföring22. Transgenens uttryck var snabbt förlorat om segmentet ven var sensorik i situ , och sedan ympats eller om venen var ympade först, och sedan sensorik. Endast genom att fördröja transduktion tills efter ven graften hade anpassat till den arteriella cirkulationen (vi väntade tills 28 dagar efter ympning för att utföra genöverföring, även om en kortare fördröjning kan vara möjligt), var den snabb förlusten av transgenens uttryck undvikit22 . Vi också omvandlas från noskon-levererade anestesi till endotracheal tube-levererade anestesi för den andra (genöverföring) operationen efter att ha upplevt intraoperativ och postoperativ dödsfall. Dessutom efter möter uppenbart aspirationspneumoni i en postoperativ kanin, började vi att placera en liten plast bord över kaninens buk (under de sterila draperier). Tabellen var placerad för att förhindra att kirurgen oavsiktligt lutande på kaninens buk, potentiellt stimulera gastroesofageal reflux och aspiration. Vi hade inga fler aspiration händelser efter placering av tabellen. Men eftersom denna placering sammanföll med övergången till endotrakeal intubering, vara vi inte säkra som interventionsorgan ansvarar för att eliminera aspiration händelser.

Denna metod har också begränsningar. I USA nödvändiggör användning av kaniner i stället för gnagare överensstämmelse med kraven i laboratoriet djurskyddslagen i 1966. Följaktligen måste utredare med kaniner (eller andra djur som omfattas av denna lag) har välutrustade operationssalar och expert narkosläkare och ge en hög nivå av postoperativ övervakning och vård. Den andra begränsningen är att 2 operationer krävs för att säkerställa ihållande transgenens uttryck22. Andra operationen ökar kostnaderna för experiment och exponerar varje kanin till ytterligare en uppsättning potential avgörande och perioperativa komplikationer. Vi känner dock inte till varje annat gen överföring tillvägagångssätt som uppnår hållbara transgenens uttryck i ven ympkvistar. En tredje begränsning med denna metod är att den kräver expertis inom konstruktion av HDAd vektorer och beredning av hög-titer HDAd bestånd. Många laboratorier har expertis med första generationens adenovirala, lentiviral och adeno-associerade virala (AAV) vektorer, men relativt få grupper har erfarenhet av HDAd och vanligtvis skulle behöva upprätta ett samarbete för att få denna expertis. Kliniska tillämpligheten av metoden kan också begränsas. För människor, skulle en andra operation öka både kostnaden och komplikation risk. Dessutom har jämfört med mänsklig ytlig venerna (används för koronara och perifera bypass operationer), kanin externa jugular vener mycket tunna väggar. Det är möjligt att väggen förtjockning och ombyggnad som uppstår efter ympning en kanin yttre halsvenen i den arteriella cirkulationen skulle dämpas om ven graften redan har en tjockare vägg. Slutligen i experiment i denna modell som varar upp till 6 månader, utvecklat ingen av de ympade venerna en stenos22. Denna metod verkar därför inte modell alla biologiska processer som bidrar till att ven transplantatsvikt.

Sammanfattningsvis använder metoden en robust djurmodell av human vaskulär sjukdom (kaniner) för att generera ympade vener som transgener är stabilt uttryckta för längre tid (minst 6 månader)22. Stabilt uttryck av transgener i ven transplantat kommer att avslöja sina roller i normal ven ympa homeostas och kommer att klargöra deras potential för ven transplantat genterapi. Metoden kunde förbättras och göras mer kliniskt tillämpliga av utvecklingen av teknik som tillåter perkutan leverans av vektorer till ven transplantat, därmed undvika andra operationen. Dessa tekniker kan vara kateter-baserade36,37, eller de kunde införliva speciellt beredd vektorer som injiceras i en perifer ven och sedan riktade till ven transplantat väggen, till exempel genom magnetiska fält38. Metoden skulle också möjliggöra testning av vektorer än HDAd för ven-graft genterapi, inklusive lentiviral och AAV vektorer samt icke-virala vektorer. 39 , 40 , 41 , 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposables
3mL syringe with 24G needle Becton Dickinson 309571 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer  surgery
1 mL syringe with 27G needle Becton Dickinson 309623 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery
19G needle Becton Dickinson 305187 Gene transfer surgery
20 mL syringe, luer lock Nipro Medical Corp JD+20L
Catheters, 24Ga x 3/4” Terumo Medical Products SROX2419V
21G needle Becton Dickinson 305165 Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline
Gauze 4” x 4” Dynarex 3242 ~10-15 per surgery
3-0 silk suture Covidien Ltd. S-244
5-0 silk suture Covidien Ltd. S-182
7-0 polypropylene suture CP Medical 8703P Vein graft surgery
7-0 polypropylene suture CP Medical 8648P Gene transfer surgery
5-0 polyglycolic acid suture CP Medical 421A
3-0 polyglycolic acid suture CP Medical 398A
Alcohol swabs Covidien Ltd. 6818 For the placement of I.V. line
Catheter plug Vetoquinol 411498
Ketamine HCl, 100 mg/mL Vedco Inc. 5098916106
Xylazine, 100 mg/mL Akorn Inc. 4821
Lidocaine, 20 mg/mL Pfizer 409427702
Marcaine 0.5% Pfizer 409161050
Beuthanasia D-Special Intervet Inc. NDC 00061047305 Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL Patterson Veterinary 12496075705
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride Baxter 2B1309
Heparin  (5000 U/mL) APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10
Papaverine (3.5 mg/ml) American Reagent Inc. NDC 0517-4002-25 Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum
Fentanyl patch, 25 mcg/h Apotex Corp. NDC 60505-7006-2
Isoflurane Multiple vendors Catalog number not available
 Viral vector Gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight Roboz RS-7900
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt Roboz RS-6828
Needle holder /w suture scissors Miltex 8-14-IMC
Castroviejo scissors Roboz RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock Roboz RS-6412
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt Roboz RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs Roboz RS-6514 2x
Backhaus towel clamp 3.5" Roboz 4x
Micro clip setting forceps 4.75" Roboz RS-6496
Micro vascular clips, 11 mm Roboz
Surg-I-Loop Scanlan International 1001-81M 5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width Roboz RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm Roboz RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip Roboz RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3 mm tips Roboz RS-7110 2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips Roboz RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips Roboz RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips Roboz RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width Roboz RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width Fine Science Tools 11092-12 2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight Fine Science Tools 11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode MACAN Manufacturing HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump Multiple vendors Catalog number not available
Bair hugger warming unit 3M Model 505
IV infusion pump Heska Vet IV 2.2
Isoflurane vaporizer and scavenger Multiple vendors Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor Surgivet Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit MACAN Manufacturing MV-9
Surgical microscope D.F. Vasconcellos M900 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
  2. Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
  3. Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
  4. de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
  5. Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
  6. Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
  7. Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
  8. Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
  9. Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
  10. Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
  11. Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
  12. Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
  13. Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
  14. Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
  15. Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
  16. Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
  17. Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
  18. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
  19. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
  20. Chen, H. -H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
  21. Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
  22. Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
  23. Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
  24. Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
  25. George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 11 Suppl 135-142 (2011).
  26. Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
  27. Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
  28. Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
  29. Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
  30. Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
  31. Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
  32. Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
  33. Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
  34. Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
  35. Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
  36. Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
  37. Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
  38. Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
  39. Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
  40. Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
  41. Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
  42. Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).

Tags

Medicin fråga 139 djurmodeller av mänskliga sjukdomar åderförkalkning genterapi translationella studier kanin yttre halsvenen vanliga halspulsådern interposition ven transplantat kärlsjukdom adenovirus helper-beroende adenovirus.
En kanin modell av hållbara transgenens uttryck i halsvenen till gemensamma halspulsådern Interposition grafter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bi, L., Wacker, B. K., Dichek, D. A. … More

Bi, L., Wacker, B. K., Dichek, D. A. A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts. J. Vis. Exp. (139), e57231, doi:10.3791/57231 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter