Summary
カンキツグリーニングは柑橘類の作物に影響を与える世界的に特に破壊的な病気です。ここで紹介は単純なメソッドを使用して PCR およびカンキツ葉組織のゲノム DNA 抽出カンキツグリーニング病原体、カンキツグリーニング病病原細菌属の正確かつ正確な同定のため
Abstract
カンキツグリーニング、カンキツグリーニング病として知られているは、世界的に柑橘類の農場を荒らす破壊的な柑橘類疾患です。この病気には、非対称の黄色葉の斑点、葉脈黄、摘葉、根面齲蝕、最終的には、柑橘類の植物の死が発生します。感染、柑橘類の植物は成長の発育を妨げているし、季節はずれの花を作り出します。これらの花はほとんど果物をもたらすし、小さく、苦い、不規則な形の柑橘系の果物を降伏行うことが望ましい。この病気は、感染したカンキツ組織からの移植、ミカンキジラミ、ミカンキジラミ、広がっています。病原体は柑橘類の植物の中で長いと変数の潜伏期間-時々 年、症状が現れる前に。この病原体の in vitro培養の試みが成功すると、可能性が低いのためにされている、内の病原体の凹凸濃度感染カンキツ組織や環境を複製することは困難だから条件の成長を助長病原体。前にそれが広がっており、その長い潜伏期間と、病原体を培養する研究者の無力のために病気を識別する非常に困難です。その結果、病気のみ明らかになります突然柑橘類の農夫の全体収穫を破壊した後。ここに提示のカンキツグリーニング病原体、ゲノム DNA 抽出キットや PCR を用いたカンキツグリーニング病病原細菌属の正確かつ具体的検出法です。このメソッドは、シンプルで効率的、費用対効果、かつ定量化するための適応です。このメソッドは、カンキツ組織で使用するために合わせることができます。しかし、それは可能性のある病原体の組織内に存在の量によって制限されます。それにもかかわらず、このメソッドは以前、感染した柑橘系植物を識別するために柑橘農家を許可し、それがさらに広がることができる前に、この破壊的な病気の広がりを抑制します。
Introduction
カンキツグリーニング、カンキツグリーニング病とも呼ばれる、柑橘類の木々 の重要な損失を引き起こした。1 つの代表格は、フロリダ州 2016-2017 シーズン1現在 7000 万箱に 2 億 4400 万ボックスから 1997-1998 年シーズンのフロリダ オレンジ ボックスの生産の 70% 削減を引き起こす病気を予想する場所です。以上フロリダの柑橘類の木の 90% が感染した2、およびフロリダの柑橘類工業は、前記カンキツグリーニングは3主要な役割を果たしている柑橘類の病気が毎年約 10 億ドルを失うこと推定されています。カンキツグリーニング、侵襲ミカンキジラミミカンキジラミ、によって主に広がる、.の感染組織の接木によって広げることができるも病気の静脈、非対称的な黄化斑点、早期落葉、枝枯れ、根面齲蝕、植物の死の黄変が発生します。重要なことは、疾患の原因となりフルーツ、ほとんど、季節外れの花を作り出す柑橘類の植物。プロデュースは感染したカンキツ果実が未熟な緑、および4の味が苦いです。
このメソッドの目的は、正確し、運動性細菌カンキツグリーニング病病原細菌の属、感染したカンキツ5の師部内に生きてカンキツグリーニング病原を正確に識別。ゲノム DNA は生きている細菌を含む全体の葉組織から抽出されます。この抽出したゲノム DNA は細菌の 16S rdna に相補的なオリゴヌクレオチドは、このシーケンスを増幅するため、従来の PCR のテンプレートとして使用されます。シトラスFBOX遺伝子相補的なオリゴヌクレオチドは、内部増幅制御として使用されます。以前の研究6で成功するために実証されているため、このメソッドを使用にしました。
この方法には、簡単な比較的安価な任意の通常の整った生化学のラボで実施することができるの明確な利点があります。さらに、PCR のままこの病原体の7と病原体の能力を生き残るため、無症候性ホスト8年の再現を養殖の難しさのため、この病原体を検出するため最も正確かつ正確な方法。多くの異なる専門 PCR の試金はこの病原体; を正常に検出に使用されています。しかし、従来の PCR は、無症候性ホスト8の内で特に、正確かつ特定の検出のための最も簡単なアッセイを残ります。
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Protocol
1. ゲノム抽出キットを使用して植物組織からのゲノム DNA を分離します。
- 切り出して全体の新鮮なきれいなはさみを使用して柑橘類の木から葉し、葉がきれいなプラスチック サンドイッチ バッグ、柑橘類の葉の組織を取得します。
注記: 葉のティッシュの入った袋を配置する 4 ° C の冷却装置でまたは断熱容器で氷の腐敗を防ぐため、コレクション後できるだけ早く。 - 乳鉢と乳棒を寒さに液体窒素の少量を追加します。彼らが冷やしている間葉組織、サイズ約 1 平方インチの小片をカットするはさみを使用します。それを瞬時に凍結するモルタルに切断組織を配置します。必要な場合より多くの液体窒素を追加します。
注: 絶縁手袋は、液体窒素を処理しながら常に着用する必要があります。 - すぐに、モルタルを用いた微粉末に植物組織を粉砕します。液体窒素が完全に蒸発して緑の粉のままなるまで研削を続けます。
- 簡単に、ヘラを使って 1.5 mL 遠心チューブにモルタル内部地組織をスクープして 10-15 s、液体窒素中での金属のヘラを冷やします。
- 核溶解液の 600 μ L を追加 (材料の表を参照) を使用して 1000 μ L ピペットと渦 1-3 s のサンプルは、15 分の 65 ° C の水浴中孵化させなさい。
- 逆転管 2 - 5 回、それを混合し、37 ° c 15 分間キャビネット インキュベーターで孵化して、ライセート 10µL ピペットを使用する RNase 溶液 3 μ L を追加します。
注: 続行する前に室温に冷却する混合物を許可します。 - しっかりしたペレットを形成する 13,000 x g でタンパク質沈殿物溶液、20 秒の高速、3 分間遠心する渦の 200 μ L を追加します。サンプルを遠心分離されているが、新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに室温イソプロパノールの 600 μ L を追加します。
- 1000 μ L ピペットを使用して、慎重にイソプロパノールを含む新鮮な 1.5 mL 遠心管に移し、遠心サンプルから上澄みを取り外します。ペレットを破棄今可能性があります。
注: を使用すること、ペレット上清の非常に小さい量を残すことによって蛋白質の上澄みが汚れない。 - DNA が糸状の繊維の塊として目に見えるようになるまで、チューブを反転し、室温で 1 分 13,000 × g で遠心分離します。
- 上清をデカント、ペレットを 70% のエタノールの 600 μ L を追加、DNA を洗浄し、1 分間 13,000 × g で遠心チューブを数回反転します。
- 慎重に緩やかな DNA の餌を残して、エタノールを吸引し、開き、吸収紙の上に休んで、チューブを反転します。15 分間室温で乾燥した空気。
- 乾燥 DNA の餌に DNA 補水液 100 μ L を追加し、チューブをタップして定期的に混合しながら、1 時間 65 ° C の水浴の DNA を孵化させなさい。
- 精製水 1 μ L を microcuvette に置き、空白として使用する分光光度計に挿入します。Microcuvette に 1 μ L のサンプルを配置し、分光光度計を挿入して、現在の DNA の濃度を計算します。DNA 濃度 (ng/μ L) (260-320) として計算される × 希釈係数 × 50 ng/μ L をすることができます。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは 4 ° C で保存できます。
2. ゲノム DNA のサンプルの PCR を実行します。
- 結合 10 μ L 2 x PCR マスター ミックス (材料の表を参照)、1 μ L 前方プライマー (10 pM/μ L)、1 μ L 逆プライマー (10 pM/μ L) (プライマー シーケンスについて表 2を参照)、100 ng の DNA のサンプルから抽出され、精製水 (最大 20 μ L 最終巻) で50 μ L の PCR チューブ、ミックス、フリックで簡単に遠心分離機。
- たちに PCR チューブを挿入し、それに応じて実行 (表 1参照)。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。必要に応じて、反応が完了した後、4 ° C でサンプルを格納します。
3. Agarose のゲルに増幅された DNA を electrophorese します。
- アガロース パウダー 0.4 g の重量を量る、きれいな 200 mL 三角フラスコ、50 mL を充填する 1 x TAE バッファーと共にそれを追加します。
- マイクロ波高 1.5 分、すべての 30 の揺れの s、アガロースは完全に溶解するまで。
注: 火傷を防ぐために液体のアガロースを処理しながら絶縁手袋を着用ください。 - 液体アガロースとミックスする手ふれに臭化エチジウム 10 mg/mL の 2.5 μ L を追加し、レベル ゲル鋳型に液体 agarose ゲルを注ぎなさい。注入後標準 12 歯ゲル櫛をすばやく挿入します。
- ゲルを許可、室温で 20 分間冷却し、ゲルの櫛を削除して、ジェルを 1 x TAE バッファーでいっぱいレベル ジェル ボックスに。
- ピペットを使用すると、増幅された DNA サンプルの合計を井戸に読み込みます。あなたのサンプルから別のよく 5 μ L の DNA の梯子 (材料の表を参照) を追加します。
- 定数 90 V、35 分間のサンプルを electrophorese し、ゲルを取り外し、UV transilluminator に置きます。
- 写真し、302 の紫外線透過を使用しながらパターンをバンディング ゲル分析 nm。
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Representative Results
肯定的な結果が 500 に対応する明瞭なバンドを得られる bpカンキツグリーニング病病原細菌うわさの花姫Las606/Lss6,および/または 700 に対応する異なるバンドのLaa2/Laj5、 16S リボソーム β への挿入のための bpオペロン9。内部増幅制御帯域 400 に現れる場合も bp。このバンドは柑橘類FBOX遺伝子の10では、増幅に対応し、有効と見なされる結果に表示する必要があります (図 1および図 2)。両方 500 の欠如 bp と 700 bp バンド 400 bp のバンドが存在する間は、否定的な結果を表します。約 700 のいくつかの非固有のバンド パターンをもたらす可能性があります健康なサンプルの PCR を行う bp、400 bp;しかし、これらの分子量に対応する単一の大胆なバンドだけは肯定的な結果 (図 1) を示します。
| 操作 | Temp。 | 時間 | サイクル |
| 初期変性 | 95 ° C | 3-5 分 | 1 |
| 変性 | 95 ° C | 30 秒 | 35 |
| アニール | 55 ° C | 30 秒 | |
| 伸長 | 72 ° C | 40 秒 | |
| 最終伸長 | 72 ° C | 10 分 | 1 |
表 1。たち設定ターゲット 16S rDNA 遺伝子そして柑橘類 FBOX を増幅するために使用します。
| プライマーの名前 | シーケンス | 参照 | |
| LAA2_F | 5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC ギャグ TTT-3' | Hocquellet, et al., 1999 | |
| LAJ5_R | 5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3' | Hocquellet, et al., 1999 | |
| FBOX_F | 5'-TTG GAA 法 CTT TCG CCA CT-3' | この試金 | |
| FBOX_R | 5'-AGC AGA CCT GGC TAT タット ACG 法 G-3' | この試金 | |
| LSS_F | 5'-GGA ギャグ GTG AGT GGA ATT CCG A-3' | 藤川、 et al., 2012 | |
| LSS_R | 5'-ACC CAA 猫 CTA GGT AAA AAC C-3' | 藤川、 et al., 2012 | |
表 2。プライマー、dna 塩基配列および参照の名前。
図 1。従来の PCR の分析は 4 つの感染したカンキツ葉組織サンプルとネガティブ コントロールとして使用される 2 つのヒースイー サンプルから結果します。'gDNA' がカンキツ葉組織から抽出したゲノム DNA のサンプルを示します。GDNA 1 と gDNA をサンプル 4 は、感染していない柑橘類葉サンプルからgDNA 2、3、5、および 6 は、カンキツグリーニング病病原細菌世代 (Clas) 感染したサンプルです。DNA はプロトコルで記述として抽出しました。(表 1参照) プロトコルごとのテンプレートとして抽出したゲノム DNA を使用して PCR を行った。LAA2/LAJ5、LAS606/LSS 、 FBOXのプライマー セットを使用 (表 2を参照してください) を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。3 つの増幅された gDNA サンプルの完全なゲル写真。サンプル 1 は柑橘類の健康な組織;サンプル 2 と 3 は、Clas 感染組織サンプルです。これらのサンプルは、図 1に見られるように、gDNA 1、2、および 3 に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
まさに最適な実験条件を達成するためにすべての手順が続いていることが重要です。全体の葉の組織がこのデモ中に使用されました。しかし、理論的には植物組織の任意の種類を含めるにプロトコルを変更できます。以前は、研究者は葉静脈の組織ではなく、全体の葉組織からのゲノム DNA を抽出して同様の結果11を達成しました。シトラスFBOX遺伝子に対応するバンドが表示されない場合、結果は有効でないし、動作の手順でいくつかの技術的なエラーの 1 つ以上可能性があります。一般的なエラー: 汚染または不適切な滅菌水、マイクロ ピペットのヒント、またはマイクロ遠心チューブ用を使用してPCR ミックスやゲノム DNA の抽出の間に必要な 1 つまたは複数のコンポーネントを追加する失敗適切なたちの条件を維持するために失敗しています。試薬またはその有効期限を過ぎている他の食材を使用してください。agarose のゲルに臭化物または別の DNA 染色エチジウムを追加に失敗高すぎる電圧または余りに長くのための増幅された DNA を electrophoresing古いまたは不適切な混合の TAE バッファーを使用してや、単に TAE バッファーの代わりに水を使用して、ジェル ボックスに入力します。
プライマー LAA2_F と LAJ5_R は、カンキツグリーニング病病原細菌の世代とアフリカナム識別での成功により先行研究から選ばれました。これらのプライマー増幅リボソームのサブユニット遺伝子rplA rplJ、 Cから増幅 669 の bp のフラグメントを降伏l. アフリカナムまたはCから 703 の bp のフラグメントl. 世代9。プライマー LSS_F と LSS_R 確立された低偽陰性率、正確性、特異性などこれまでの研究から、 Cのこの試金のために選ばれました。l. 世代。LSS のプライマー セットすべて 3 16S rDNA 遺伝子Cの存在で 500 bp シーケンスを増幅します。l. 世代6。FBOX プライマー内部増幅制御として使用するために建設された、柑橘系の植物に見られる 400 bp シーケンスを増幅します。前の研究は、 FBOX柑橘系植物で表現される安定 Rt-qpcr10このアッセイを適用するとき参照の遺伝子として使用するために偉大な候補になることを示しています。
この試金はカンキツ組織からのすべてのタイプに使用するのに適応することができ、Rt-qpcr などの PCR ベースのアッセイを追加で使用するため変更することができます。この試金の制限が少なく、ほとんど、従来の PCR に固有です。これらの制限の要因を含める: エタノールまたは PCR 混合物抑制農薬より高度な分析、小さい所でたちと DNA 汚染の存在のための必要性を実行することがなく定量の欠如の存在。
このアッセイの特異性がより具体的な RT qPCR 方法に直接比較されていないこの試金はカンキツグリーニング病病原細菌の研究を行う科学者にとって役に立つ、可能性のある診断を求めて農家に柑橘類が感染しています。特に場合より具体的な方法が利用可能なまたは費用対効果では、それぞれの分野での木。確かに、それはこと単一の柑橘類栽培者や研究者がすぐにそして安くアッセイ百サンプルがいくつか数日後に高価な RT qPCR たちを購入することがなくいくつかの 96 ウェル プレートと組み合わせてマルチ チャンネル ピペットを使用して考えられる。
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Disclosures
還陳、イアン ・ アーサー ・ パーマー、Jian 陳、明チャン、スティーブン ・ トンプソン、Fengquan リュー、そして鄭清 Fu 利害の対立を宣言しません。
Acknowledgments
概念化、h. c. および Z. Q. F;Z. Q. F ・ j ・ C、h. c. 調査リソース、Z. Q. F.;書く - 原案、I. A. P.;ライティング-レビューと編集、Z. Q. F.;、s. l. t. h. c. j. c. i. a. p.可視化, H. C.;監督、Z. Q. F.;資金獲得、Z. Q. F と f. q. l.
サウスカロライナ改善先生品質高等教育国家助成金タイトルによるプロジェクト、強化中間等級科学教師の工場プロセスの知識、構造、および植物科学研究 (工場の機能を通じて婚約科学)
ユナイテッド立ち会える教育学科 (CFDA 番号 84.367B) 資金
著者らはゲノム DNA のサンプルを提供するためにフロリダ大学の博士インディアン王を感謝したいから感染シトラスシネンシスバレンシア。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
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