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利用常规 PCR 技术对柑桔叶片组织样品Candidatus liberibacter的特异和准确检测

doi: 10.3791/57240 Published: June 29, 2018
* These authors contributed equally

Summary

柑橘类绿化是影响全球柑橘作物的一种特殊破坏性疾病。本文介绍了一种利用 PCR 和基因组 DNA 提取柑桔叶组织的简便方法, 对柑桔绿化病原体、 Candidatus liberibacter 进行准确、准确的鉴定。

Abstract

柑橘类绿化, 又称黄龙, 是一种破坏性的柑橘病, 在全球范围内肆虐柑橘养殖场。这种疾病导致不对称的黄叶斑驳, 静脉变黄, 落叶, 根腐, 最终死亡的柑橘植株。在感染时, 柑橘类植物生长发育迟缓, 并在季节内产生花朵。这些花很少产生果实, 而那些产生小的, 苦涩的, 不规则形状的柑橘类水果是不可取的。这种疾病是由亚洲柑橘木虱、 Diaphorina 桔和被感染的柑橘组织嫁接而传播的。病原体在柑橘植株内有长而多变的潜伏期--有时在症状出现前数年。在体外培养这种病菌的尝试是不成功的, 可能是由于感染的柑橘组织中的病原体浓度低和不均匀, 或者因为很难复制有利于生长的环境条件。病原体。由于其潜伏期长, 研究人员无法培养病原体, 很难在病毒传播前发现疾病。因此, 这种疾病只在突然破坏柑橘农民的全部产量之后才变得明显。本文介绍了一种准确、特异地检测柑桔绿化病原体、 Candidatus liberibacter 的方法. 使用基因组 DNA 提取试剂盒和 PCR 技术。该方法简单、高效、成本效益高, 适用于定量分析。该方法可用于任何柑橘组织;然而, 它有可能受组织中的病原体数量的限制。然而, 这种方法将使柑橘养殖者能够及早识别受感染的柑橘类植物, 并遏制这种破坏性疾病的蔓延, 然后才能进一步扩散。

Introduction

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柑橘的绿化, 也被称为黄龙, 已经造成了大量的柑橘树的损失。一个典型的案例是佛罗里达州, 预计该疾病将导致佛罗里达州橙色盒的生产减少 70%, 从1997至1998季的2亿4400万箱, 7000万盒 2016 2017 赛季1。佛罗里达州90% 以上的柑橘类植物感染了2, 据估计, 由于柑橘类疾病, 佛罗里达柑橘业每年损失约10亿美元, 其中柑橘绿化在3起主要作用。柑橘的绿化主要由侵袭性的亚洲柑橘木虱Diaphorina 桔传播,但也可以通过嫁接感染的组织传播.该病引起静脉发黄, 黄叶斑驳不对称, 过早落叶, 枝复生, 根腐, 植物死亡。重要的是, 这种疾病使柑橘类植物生产出的季节开花, 很少产生水果。被感染的柑橘类植物生产的水果是不成熟的, 绿色的和苦涩的品尝4

该方法的目的是准确和准确地识别Candidatus liberibacter 菌的运动细菌, 其致病剂为柑橘的绿化, 生活在被感染的柑桔树的韧皮部内5。基因组 DNA 从整个叶组织中提取, 其中含有活细菌。这种提取的基因组 DNA 被用来作为常规 PCR 的模板, 其中寡核苷酸补充细菌的 16S rDNA 序列被用来放大这个序列。寡核苷酸互补的柑橘FBOX基因作为内部放大控制。我们选择使用这个方法, 因为它已经被证明是成功的在以前的研究6

这种方法有明显的优势, 简单, 相对便宜, 并能够在任何设备正常的生物化学实验室进行。此外, PCR 仍然是最准确和最精确的方法, 以检测这种病原体, 由于难以培养这个病原体7, 和病原体生存和繁殖的能力在无症状的主机8年。许多不同的特异性 PCR 检测方法已经成功地发现了这种病原体;然而, 常规 PCR 仍然是最简单的检测, 特别是在无症状宿主8

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Protocol

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1. 使用基因组提取试剂盒分离植物组织中的基因组 DNA

  1. 用干净的剪刀从柑橘树上切下一整片新鲜的叶子, 将叶子放在干净的塑料三明治袋中, 获得柑橘叶组织。
    注: 在收集后应尽快将含有叶组织的包放在4摄氏度冰箱或保温容器中的冰上, 以避免变质。
  2. 加入少量液氮冷却砂浆和杵。当它们冷却时, 用剪刀剪下一小片叶子组织, 大小大约1平方英寸。将切割组织放在砂浆中立即将其冻结。如果需要, 添加更多的液氮。
    注: 在处理液氮时, 应始终佩戴绝缘手套。
  3. 用砂浆将植物组织快速研磨成细粉。继续研磨直至液氮完全蒸发, 并保持良好的绿色粉末。
  4. 在 10-十五年代, 在液态氮气中短暂冷却金属铲, 然后用刮刀将砂浆内的地面组织舀入1.5 毫升的离心管中。
  5. 添加600µL 核溶解溶液 (见材料表) 使用1000µL 吸管和涡流样品 1-3 s, 然后孵化在65°c 水浴15分钟。
  6. 添加3µL RNase 溶液的裂解液使用10µL 吸管, 反转管 2-5 倍, 以混合, 并孵化37°c 在一个橱柜孵化器为15分钟。
    注: 允许混合物冷却到室温, 然后再继续。
  7. 添加200µL 的蛋白质沉淀溶液, 在二十年代高速涡旋, 然后离心机3分钟在 1.3万 x g 形成一个坚实的颗粒。当样品被离心, 添加600µL 室温异丙醇到一个新鲜的1.5 毫升离心管。
  8. 使用1000µL 吸管, 小心地从离心样品中取出上清, 将其转移到含有异丙醇的新鲜1.5 毫升离心管。颗粒现在可能被丢弃。
    注意: 避免用蛋白质污染上清液, 在颗粒上方留下少量的上清液。
  9. 反转管直到 DNA 变为可见的一大类线程状股, 然后离心机在 1.3万 x g 1 分钟室温。
  10. 醒酒上清液, 将70% 乙醇的600µL 添加到颗粒中, 多次反转管以清洗 DNA, 离心机在 1.3万 x g 处进行1分钟。
  11. 小心地吸干乙醇, 留下松散的 DNA 颗粒, 然后打开并倒置管子, 搁在吸水性纸上。室温空气干燥15分钟。
  12. 将100µL dna 补液溶液添加到干 dna 颗粒中, 然后在65摄氏度的水浴中孵化出1小时的 dna, 同时通过轻敲管进行混合。
  13. 将1µL 的纯净水放在 microcuvette 上, 并将其插入分光光度计中用作空白。通过在 microcuvette 上放置1µL 样品, 并插入分光光度计, 计算出目前 DNA 的浓度。DNA 浓度 (ng/µL) 可以计算为 (260-320) x 稀释因子 x 50 ng/µL。
    注意: 协议可以在这里暂停。样品可以储存在4摄氏度。

2. 对基因组 DNA 样品进行 PCR 处理

  1. 结合10µL 2x PCR 大师组合 (参见材料表), 1 µL 前底漆 (下午10点/µL), 1 µL 反向底漆 (下午10点/µL) (见表 2为底漆序列), 100 ng 的基因组 DNA 提取的样本, 和纯净水 (最多20µL 最终体积) 在50µL PCR 管, 轻弹混合, 并简要离心机。
  2. 将 PCR 管插入 thermocycler 并相应运行 (见表 1)。
    注意: 协议可以在这里暂停。如有必要, 在反应完成后, 将样品贮存在4摄氏度。

3. Electrophorese 琼脂糖凝胶中扩增的 DNA

  1. 重0.4 克琼脂糖粉, 并添加它连同1x 泰的缓冲器到一个干净的200毫升锥形瓶, 填补多达50毫升。
  2. 微波在高为1.5 分钟, 摇晃每三十年代, 直到琼脂糖完全地被溶化。
    注: 在处理液体琼脂糖时应佩戴绝缘手套以防止烫伤。
  3. 添加2.5 µL 10 毫克/毫升溴溴化液琼脂糖和摇动混合, 然后倒入液琼脂糖凝胶成水平凝胶模具。快速插入标准的12牙凝胶梳后浇。
  4. 允许凝胶在室温下冷却20分钟, 然后去除凝胶梳, 并将凝胶放入一个充满1x 泰缓冲器的水平凝胶盒中。
  5. 使用微, 将总扩增的 DNA 样本加载到水井中。添加5µL 的 DNA 阶梯 (见材料表) 在一个单独的井从你的样品。
  6. Electrophorese 样品35分钟在恒定的 90 V, 然后去除胶凝体和地方在紫外 transilluminator。
  7. 在302纳米紫外线透视的情况下, 对凝胶条纹图案进行照相和分析。

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Representative Results

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一个正面结果产生一个不同的波段对应于 500 bp 为Candidatus Liberibacter 胭脂Las606/Lss6和/或一个独特的带对应于 700 bp 为Laa2/Laj5,插入在16S 核糖体β操纵9。内部放大控制带也必须出现在 400 bp。这个波段对应于柑橘FBOX基因10的放大, 并且必须出现一个结果被认为是有效的 (图 1 图 2)。500 bp 和 700 bp 波段的缺乏, 而 400 bp 波段存在代表一个负面的结果。在健康样品上进行 PCR 可产生约 700 bp 和 400 bp 的非特异带型;然而, 只有一个与这些分子量对应的加粗带表明了一个积极的结果 (图 1)。

操作 临时。 时间 周期
初始变性 95°c 3-5 分钟 1
变性 95°c 30秒 35
退火 55°c 30秒
伸长 72°c 40秒
最终伸长率 72°c 10分钟 1

表1。Thermocycler 设置用于放大目标 16S rDNA 基因和柑橘 FBOX。

底漆名称 序列 参考
LAA2_F 5 '-达 AAA GGT TGA CCT TTT-3 ' Hocquellet, et, 1999
LAJ5_R 5 '-aca AAA 级 GAA ATA A-3 ' Hocquellet, et, 1999
FBOX_F 5 '-GAA 行动铁通 TCG 共同国家评估 CT-3 ' 这种化验
FBOX_R 5 '-AGC GGC 达达动漫法案 G-3 ' 这种化验
LSS_F 5 '-GGA GTG AGT GGA CCG A-3 ' Fujikawa, et, 2012
LSS_R 5 '-ACC 民航局 GGT AAA 瑞声 C-3 ' Fujikawa, et, 2012

表2。引物的名称, 他们的 DNA 序列, 和参考

Figure 1
图1。四例感染柑桔叶组织样品和两种健康样本作为阴性对照的常规 PCR 结果分析。"gDNA" 表示从柑橘叶组织提取的基因组 DNA 样本。样品 gDNA 1 和 gDNA 4 是来自未感染的柑橘叶片样本;gDNA 2、3、5和6是Candidatus liberibacter asiaticum (课室) 感染的样本。DNA 是按照协议中的文字提取的。PCR 是使用提取的基因组 DNA 作为模板, 根据协议 (见表 1)。LAA2/LAJ5、LAS606/LSSFBOX是指使用的底漆集 (见表 2)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。完整的凝胶照片三放大 gDNA 样品.样品1是健康的柑橘组织;样本2和3是被感染的组织样本。这些示例对应于 gDNA 1、2和 3, 如图 1所示。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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至关重要的是, 所有的步骤都是完全遵循, 以达到最佳的实验条件。全叶组织在本示范期间使用;然而, 该协议可以修改为理论上包括任何类型的植物组织。此前, 研究人员从叶静脉组织中提取基因组 DNA, 而不是全叶组织, 并取得了类似的结果11。如果与柑橘FBOX基因相对应的带不出现, 结果无效, 在操作过程中可能存在一个或多个技术错误。常见的错误包括: 使用受污染或不适当灭菌的水、微小贴士或离心管;在 PCR 组合或基因组 DNA 提取过程中不添加一个或多个必要的成分;未能保持适当的 thermocycler 条件;使用超过其有效期的试剂或其它成分; 或未在琼脂糖凝胶中添加溴溴或另一种 DNA 染色;electrophoresing 放大的 DNA 在太高的电压或太长;使用旧的或不适当的混合泰缓冲器, 或简单地使用水代替泰的缓冲填充凝胶盒。

引物 LAA2_F 和 LAJ5_R 是从以前的研究中选择的, 因为他们成功地确定Candidatus Liberibacter asiaticum 和 africanum。这些引物放大核糖体亚基基因rplArplJ,产生一个放大 669 bp 片段从C.l. africanum 或 703 bp 片段从C.l. asiaticum9。本文从前人的研究中选择了引物 LSS_F 和 LSS_R, 其结果为C 的低假阴性率、准确度和特异性。asiaticum 湖LSS 底漆集在 C 中所有三 16S rDNA 基因中放大了500的 bp 序列.l. asiaticum6。FBOX 引物被构造为用作内部放大控制, 并放大400在柑橘植株中发现的 bp 序列。以往的研究表明, FBOX是稳定的表达在柑橘植物, 并将成为一个伟大的候选者作为参考基因, 当适应这一检测为 RT-qPCR10

这种检测可用于任何类型的柑橘组织, 并可修改为使用其他 PCR 检测, 如 qPCR。这种方法的局限性很少, 大多数是常规 PCR 所固有的。这些限制因素包括: 在 PCR 混合物中存在乙醇或其他抑制性化学物质, 缺乏定量而不执行更先进的化验, 需要在较小的实验室 thermocycler, 以及存在 DNA 污染。

虽然这一检测的特异性并没有直接与更具体的 qPCR 方法进行比较, 但这一分析对于从事Candidatus liberibacter 研究的科学家和寻求诊断可能感染柑橘的农民是有用的。树在他们的领域, 特别是如果更具体的方法是不可用或成本效益。的确, 一个柑橘种植者或研究人员可以在几天内快速、廉价地测定数个样品, 方法是使用多通道吸管和几个96井板, 而不购买昂贵的 RT qPCR thermocycler。

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Disclosures

丰泉、伊恩?帕默、建安、明昌、斯蒂芬·汤普森、刘和郑庆府宣告没有利益冲突。

Acknowledgments

概念化、H.C. 和 z.q.f.;调查, h.c., J, 和 z.q. F;资源, z.q.f.;文字原件草稿, i.a.p.;写作-审阅 & 编辑, i.a.p., h.c., s.l.t. 和 z.q.f.;可视化, h.c.;监督、z.q.f.;资金购置、z.q. F 和 f.q.l。

南卡罗来纳州支持的项目提高教师素质高等教育国家补助金标题,通过参与植物科学研究提高中级理科教师对植物过程、结构和功能的认识 (植物科学)

美国教育部颁发的资金 (CFDA 号 84.367B)

作者要感谢佛罗里达大学的年王博士提供来自受感染的柑橘的瓦伦西亚的基因组 DNA 样本。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen Air Products N/A
Mastercycler pro with control panel Eppendorf 6321000019
1250 W Microwave Panasonic N/A
5424 table top centrifuge Eppendorf 05-403-93
Isotemp 215 digital water bath Fisher scientific 15-462-15Q
Metal spatula Sigma-Aldrich Z283274
Mortar and pestle Sigma-Aldrich Z247464
LSE Vortex Mixer Corning 6775
2-propanol Sigma-Aldrich I9516
Sterile 10 μL tips TipOne 1161-3730
Sterile 200 μL tips TipOne 1163-1730
Sterile 1250 μL tips TipOne 1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit VWR 75788-460
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510
Agarose IBI Scientific IB70041
EDTA Thermo Fisher Scientific 17892
Acetic acid Fisher Chemical A38-212
Tris base Sigma-Aldrich 10708976001
μcuvette Eppendorf 6138000018
Stackable casting tray and combs Carolina 213655
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Mini-Sub Cell GT System Bio-Rad 1704487EDU
Biospectrometer basic Eppendorf 6135000009
0.2 mL PCR tubes Fisher scientific AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3439
2X Taq Green PCR Master Mix Promega M7122
Forward Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Reverse Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Water, PCR grade Sigma-Aldrich 3315953001
Gel Doc XR+ Bio-Rad 1708195
1 KB+ DNA ladder Thermo Fisher Scientific 10787018

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References

  1. Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. EDIS (FE983) (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. University of Florida. (2012).
  4. UICEP. Pathology. (2013).
  5. Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44, (3), 379-386 (1994).
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  8. Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). (2015).
  9. Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13, (5), 373-379 (1999).
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利用常规 PCR 技术对柑桔叶片组织样品<em>Candidatus liberibacter</em>的特异和准确检测
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Cite this Article

Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J., Chang, M., Thompson, S. L., Liu, F., Fu, Z. Q. Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples. J. Vis. Exp. (136), e57240, doi:10.3791/57240 (2018).More

Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J., Chang, M., Thompson, S. L., Liu, F., Fu, Z. Q. Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples. J. Vis. Exp. (136), e57240, doi:10.3791/57240 (2018).

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