Summary
Narenciye Greening narenciye bitkileri genel olarak etkileyen özellikle yıkıcı bir hastalıktır. Burada sunulan basit bir yöntem PCR ve narenciye yaprak doku genomik DNA ekstraksiyon narenciye greening patojen olan liberibacter spp. doğru ve kesin tanımlaması için kullanıyor
Abstract
Narenciye greening, olarak da bilinen huanglongbing, narenciye çiftlikleri küresel ravaging yıkıcı bir narenciye hastalıktır. Bu hastalık asimetrik sarı yaprak distrofileri, damar sararma, yapraksızlaşma, kök çürümesi ve sonuçta, narenciye bitkinin ölümüne neden olur. Ne zaman bulaştırmak, narenciye bitki büyüme bodur ve çiçek sezon dışı üretmek. Bu çiçekler, nadiren meyve verim ve bu da küçük, sert, düzensiz şekilli Narenciye meyve bu verim tercih edilmez. Bu hastalık Asya narenciye psyllid, Diaphorina citri ve virüslü narenciye dokusunun aşılama tarafından yayılır. Patojen narenciye bitki içinde bir uzun ve değişken kuluçka dönemi vardır — bazen belirtiler ortaya çıkmadan önce yıl. Bu patojen vitro kültür girişimlerini muhtemelen düşük nedeniyle başarısız oldu ve düzensiz konsantrasyon patojenin içinde narenciye doku enfekte veya çevre çoğaltmak zor olduğundan büyümesine elverişli koşullar patojen. Bu, onun uzun bir kuluçka dönemi ve araştırmacıların patojen kültür yetersizlik nedeniyle yayıldı önce hastalık tespit etmek çok zordur. Sonuç olarak, hastalık sadece aniden bir narenciye çiftçinin tüm verim yok sonra ortaya çıkıyor. Burada sunulan narenciye greening patojen olan liberibacter spp. genomik DNA ekstraksiyon kiti ve PCR kullanarak doğru ve belirli algılanması için bir yöntemdir. Bu yöntem basit, verimli, uygun maliyetli ve kantitatif analiz için uyarlanabilir. Bu yöntem narenciye herhangi bir doku kullanmak için adapte edilebilir; Ancak, bu potansiyel olarak patojen dokuda mevcut miktarı ile sınırlıdır. Yine de, bu yöntem daha önce virüslü narenciye bitki tanımlamak narenciye çiftçilerin izin ve daha da yayılabilir önce yıkıcı bu hastalığın yayılmasını engellemek.
Introduction
Narenciye greening, olarak da bilinen huanglongbing, narenciye ağaçları önemli bir kaybına neden oldu. Florida, bir % 70 azalma Florida portakal kutu üretiminde 244 milyon kutularından 1997-1998 sezonunda 70 milyon kutularına aynı derecede-in 2016-2017 sezon1neden olduğu hastalık nerede tahmini bir temsilcisi durumdur. Florida narenciye ağaçları % 90'ı enfekte2var ve bu Florida narenciye sanayi neyin narenciye greening3önemli rol oynar, narenciye hastalıklar nedeniyle her yıl yaklaşık bir milyar dolar kaybeder tahmin edilmektedir. Narenciye greening öncelikle invaziv Asya narenciye psyllid tarafından Diaphorina citri, yaymak ama da virüslü dokusunun. aşılama tarafından yayılır Damarlar, asimetrik sarı yaprak distrofileri, erken yapraksızlaşma, dal dieback, kök çürümesi ve ölüm bitki sarılık hastalığı neden olur. Önemlisi, hastalık nadiren meyve üreten çiçek Sezon dışında üretmek için narenciye bitki neden olur. Virüslü narenciye bitkiler tarafından üretilen meyve olgunlaşmamış, yeşil ve acı4tatma.
Bu yöntemin amacı doğru olduğunu ve tam olarak hareketli bakteri olan liberibacter spp., narenciye greening virüslü narenciye ağaçları5phloem içinde yaşayan, hastalığının tanımlar. Genomik DNA canlı bakteri içeren bütün yaprak dokudan elde edilir. Bu ayıklanan genomik DNA'yı nerede oligonucleotides bakteri'nın 16S rDNA dizisine tamamlayıcı bu dizi yükseltmek için kullanılan geleneksel PCR için şablon olarak kullanılır. Oligonucleotides bir narenciye FBOX gen için tamamlayıcı bir iç amplifikasyon denetimi olarak kullanılır. Bu yöntemi kullanmak seçtik çünkü önceki araştırma6' başarılı olmak için kanıtlanmış oldu.
Bu yöntem basit, nispeten ucuz ve herhangi bir normal donanımlı Biyokimya Laboratuarı'nda gerçekleştirilen mümkün olmanın avantaj vardır. Buna ek olarak, PCR Bu patojen7ve patojen'ın yeteneği hayatta kalmak ve yıl için asemptomatik ana bilgisayar8içinde yeniden zorluğu nedeniyle bu patojen tespit için en doğru ve kesin yöntem kalır. Birçok farklı uzmanlık PCR deneyleri başarılı bir şekilde bu patojen tespit etmek için kullanılmıştır; Ancak, geleneksel PCR basit tahlil için doğru ve belirli algılama, özellikle asemptomatik ana bilgisayarlar8içinde kalır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bitki doku genomik ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA izole
- Bütün taze temiz makas kullanarak bir narenciye ağaçtan yaprak ve yaprak temiz plastik sandviç torbaya koyun kesme narenciye yaprak dokusu elde.
Not: yaprak dokusu içeren torba 4 ° C buzdolabı veya buz izole edilmiş bir kap içinde bozulma önlemek için en kısa zamanda toplandıktan sonra yerleştirilmelidir. - Bir harç ve havaneli chill için sıvı azot az miktarda ekleyin. Onlar soğutma, yaprak dokusu, yaklaşık 1 kare inç boyutunda küçük bir parça kesmek için makas kullanın. Kesme doku anında dondurmak için havanda yerleştirin. Daha fazla sıvı azot, gerekirse ekleyin.
Not: İzoleli eldiven her zaman sıvı azot taşıma sırasında giyilmelidir. - Hızlı bitki doku harçla ince bir toz eziyet. Tamamen sıvı azot buharlaşır ve ince yeşil toz kalır kadar taşlama devam edin.
- Kısa bir süre için 10-15 s sıvı azot metal bir spatula chill sonra zemin dokusu içinde harç spatula kullanarak 1.5 mL microcentrifuge tüp kepçe.
- 600 µL çekirdeği lizis çözüm Ekle 1000 µL pipet (bakınız Tablo reçetesi) kullanarak ve girdap örnek için 1-3 s, daha sonra kuluçkaya 15dk için 65 ° C su banyosunda.
- 10µL pipet lysate kullanmaya RNase çözüm 3 µL ekleyin, tüp 2 - 5 kez karıştırın ve bir kabine kuluçka 15dk için 37 ° C'de kuluçkaya için ters çevir.
Not: devam etmeden önce oda sıcaklığında soğumaya karışım izin verin. - 200 µL Protein yağış çözüm, girdap 20 s için yüksek hızlı, sonra 3 dk santrifüj adlı bir firma Pelet oluşturmak için 13.000 x g de ekleyin. Örnek centrifuged iken, oda sıcaklığında isopropanol 600 µL taze 1.5 mL microcentrifuge tüp ekleyin.
- 1000 µL pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde süpernatant isopropanol içeren taze 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarma centrifuged örnekten çıkarın. Pelet şimdi atılabilir.
Not: süpernatant protein ile Pelet yukarıda süpernatant minik bir miktar terk ederek bulaşıcı kaçının. - DNA iplik benzeri lifler bir kitle görünür hale gelinceye kadar tüpü ters çevir, sonra oda sıcaklığında 1 dk. için 13.000 x g, santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant dikkatle boşaltmak, 600 µL % 70 etanol için Pelet eklemek, tüp birkaç kez DNA yıkama ve 13.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi için ters çevir.
- Dikkatli bir şekilde gevşek DNA Pelet bırakarak etanol, Aspire edin sonra açın ve emici kağıt üzerine istirahat Tüp, tersine çevirin. Hava kuru 15 dakika oda sıcaklığında.
- DNA rehidrasyon çözeltinin 100 µL kurutulmuş DNA Pelet ekleyin, sonra düzenli olarak tüp dokunarak karıştırma sırasında bir 65 ° C su banyosu için 1 h, DNA'da kuluçkaya.
- Arıtılmış su 1 µL bir microcuvette ve boş kullanılmak üzere bir spektrofotometre içine yerleştirin. Örnek 1 µL microcuvette koyup spektrofotometre ekleme DNA mevcut konsantrasyonu hesaplayın. DNA toplama (ng/µL) (bir260-320) olarak hesaplanan × seyreltme faktörü × 50 ng/µL olabilir.
Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnek 4 ° C'de depolanan
2. PCR genomik DNA örnekleri üzerinde gerçekleştirin
- Birleştirmek 10 µL 2 x PCR Master Mix ( malzemelerin tabloyabakın), 1 µL ileri astar (10 pM/µL), 1 µL ters astar (10 pM/µL) (bkz Tablo 2 . astar dizileri için) 100 ng genomik DNA örneğinden ayıklanmış ve arıtılmış su (ilâ 20 µL son hacim) bir 50 µL PCR Tüp, flick karıştırın ve kısaca santrifüj.
- PCR tüp thermocycler eklediğinizde ve buna göre (bkz. Tablo 1).
Not: Protokol burada duraklatılmış. Reaksiyon tamamlandıktan sonra gerekirse, örnek 4 ° C'de depolayın.
3. bir özel jel güçlendirilmiş DNA'da electrophorese
- 0.4 g özel toz tartmak ve temiz 200 mL Erlenmeyer flask, ilâ 50 mL dolum için 1 x TAE arabellek ile birlikte ekleyin.
- Mikrodalga 1,5 dk her 30 sallayarak, yüksek s, özel tamamen eriyene kadar.
Not: Yanık önlemek için sıvı özel taşıma sırasında İzoleli eldiven giyilmelidir. - 10 mg/mL arasında etidyum bromür 2.5 µL sıvı özel ve shake karıştırın ekleyin, sonra bir seviye jel kalıp içine sıvı özel jel dökmek. Hızlı bir şekilde standart 12-diş jeli tarak dökme sonra ekleyin.
- Oda sıcaklığında 20 dakika serin, daha sonra jel tarak kaldırmak jel izin ve jel ile 1 x TAE tampon dolu bir düzey jel kutusu içine yerleştirin.
- Bir micropipette kullanarak, toplam güçlendirilmiş DNA örnekleri kuyu yükleyin. 5 µL DNA örneklerini ayrı bir kuyudan içinde merdiven ( Tablo malzemelerigörmek) ekleyin.
- Örnekleri için bir sabit 90 V, 35 dk. electrophorese sonra jel çıkarın ve bir UV transilluminator yerleştirin.
- Fotoğrafını çekip 302 UV transillumination kullanırken deseni bantlama jel analiz nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
500'e karşılık gelen ayrı bir grup olumlu bir sonuç üretir olan Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, ve/veya 700 için karşılık gelen ayrı bir grup için bp bp Laa2/Laj5, 16S ribozomal β bir INSERT için operon9. İç amplifikasyon kontrol grubu da 400 görünmelidir bp. Bu grup narenciye FBOX gene10amplifikasyon için karşılık gelen ve bir sonuç geçerli kabul edilmesi görünmesi gerekir (resim 1 ve Şekil 2). Her iki 500 eksikliği bp ve 700 400 bp Wataha mevcut iken bp bantları negatif bir sonuç temsil eder. PCR sağlıklı örnekleri üzerinde performans yaklaşık 700 bazı non-spesifik bantlama desenler verim bp ve 400 bp; Ancak, yalnızca tek bir kalın bant Bu moleküler ağırlık karşılık gelen olumlu sonuç (Şekil 1) gösterir.
| İşlemi | Temp. | Zaman | Döngüleri |
| İlk denatürasyon | 95 ° C | 3 - 5 dk | 1 |
| Denatürasyon | 95 ° C | 30 sn | 35 |
| Tavlama | 55 ° C | 30 sn | |
| Kopma uzaması | 72 ° C | 40 sn | |
| Son uzama | 72 ° C | 10 dk | 1 |
Tablo 1. Hedef 16S rDNA genler ve narenciye FBOX yükseltmek için kullanılan Thermocycler ayarlar.
| Adı astar | Sıra | Başvuru | |
| LAA2_F | 5'-TAT AAA GGT TGA SKK TTC GAG TTT-3' | Hocquellet, ve ark., 1999 | |
| LAJ5_R | 5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3' | Hocquellet, ve ark., 1999 | |
| FBOX_F | 5'-TTG GAA YASASI CTT TCG CCA CT-3' | Bu tahlil | |
| FBOX_R | 5'-AGC AGA SKK GGC TAT TAT ACG YASASI G-3' | Bu tahlil | |
| LSS_F | 5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT MOLDOVA'DA A-3' | Fujikawa, ve ark., 2012 | |
| LSS_R | 5'-ACC CAA KEDİ CTA GGT AAA AAC C-3' | Fujikawa, ve ark., 2012 | |
Tablo 2. Astarlar, DNA dizisi ve başvuru adını.
Şekil 1. Geleneksel PCR analizini dört virüslü narenciye yaprak doku örnekleri ve iki heathy örnek negatif denetimleri kullanılan kaynaklanır. 'gDNA' genomik DNA örneği çıkarılan narenciye yaprak dokudan gösterir. Örnekleri gDNA 1 ve gDNA 4 olan bulaşmamış narenciye yaprak örnekleri; gDNA 2, 3, 5 ve 6 olan liberibacter asiaticum (Clas) enfekte örnekleri vardır. DNA iletişim kuralında yazılı olarak ayıklandı. PCR Protokolü (bakınız Tablo 1) başına bir şablon olarak ayıklanan genomik DNA'yı kullanarak gerçekleştirildi. LAA2/LAJ5, LAS606/LSS ve FBOX kullanılan astar kümeleri (bkz: Tablo 2) bakın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Üç güçlendirilmiş gDNA örnek tam jel fotoğrafı. 1 sağlıklı narenciye doku örneğidir; 2 ve 3 enfekte Clas doku örnekleri örneklerindendir. Bu örnekler gDNA 1, 2 ve 3, Şekil 1' de görüldüğü gibi karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm adımları tam olarak en iyi deneysel koşullar elde etmek için takip çok önemlidir. Bütün yaprak dokusu bu gösteri sırasında kullanılan; Ancak, protokol teorik olarak her türlü bitki doku eklemek için değiştirilebilir. Daha önce araştırmacılar, bütün yaprak doku yerine yaprak damar dokusu, genomik DNA elde ve benzer sonuçlar11elde. Narenciye FBOX gene ile karşılık gelen grup görünmesini başarısız olursa, sonuç geçersiz olur ve bir veya daha fazla çalışma yordamdaki bazı teknik hatalar olabilir. Yaygın hataları şunlardır: kontamine veya uygun olmayan şekilde steril su, micropipette ipuçları veya microcentrifuge tüpler; PCR karışımında veya genomik DNA ekstraksiyon sırasında gerekli bir veya daha fazla bileşen eklemek başarısız; uygun thermocycler koşulları korumak başarısız; reaktifler veya onların son kullanma tarihi diğer maddeler kullanarak; zayıflık-e doğru eklemek etidyum bromür ya da başka bir DNA leke özel jel; güçlendirilmiş DNA çok yüksek bir gerilim veya çok uzun süre electrophoresing; ve eski veya hatalı karma TAE arabellek ya da sadece su TAE tampon yerine jel kutusunu doldurmak için kullanarak.
Astar LAA2_F ve LAJ5_R olan Liberibacter asiaticum ve africanum belirlemekte onların başarısı nedeniyle önceki araştırmadan seçilmiştir. Bu astar ribozomal altbirimde genler rplA ve güçlendirilmiş bir 669 bp parçası C. verimli rplJ, yükseltmek l. africanum veya C. bir 703 bp parçası l. asiaticum9. Astar LSS_F ve LSS_R bu tahlil için kurulan yanlış negatif oranı düşük, doğruluk ve özgüllüğü nedeniyle önceki araştırmadan C. için seçilmiştir l. asiaticum. LSS astar küme tüm üç 16S rDNA genler C. içinde mevcut bir 500 bp sırayla güçlendirir l. asiaticum6. FBOX astar bir iç amplifikasyon kontrolü olarak kullanılmak üzere inşa edildi ve narenciye bitkilerde bulunan 400 bp sırası yükseltmek. Önceki araştırma FBOX stabil narenciye bitkilerde ifade edilir ve bu tahlil RT-qPCR10için adapte bir referans gen olarak kullanmak için mükemmel bir aday yapmak gösterir.
Bu tahlil narenciye doku herhangi bir türü için kullanılacak adapte edilebilir ve RT-qPCR gibi ek PCR tabanlı deneyleri kullanılmak üzere değiştirilebilir. Bu tahlil sınırlamaları az, ve en geleneksel PCR doğasında vardır. Bu sınırlayıcı faktörler şunlardır: etanol veya inhibitör diğer kimyasalların PCR karışımı, daha gelişmiş bir tahlil, bir thermocycler daha küçük laboratuvarlarında ve DNA kirlenme varlığı için ihtiyaç gerçekleştirmeden Nefelometri eksikliği varlığı.
Bu testin özgüllüğü doğrudan daha özel RT-qPCR Yöntemler göre yapılmış değil, bu tahlil bilim adamları olan liberibacter üzerinde araştırma yapmak için yararlıdır ve potansiyel olarak teşhis etmek isteyen çiftçiler narenciye enfekte ağaçlar kendi alanlarında, özellikle daha belirgin yöntemler kullanılabilir veya maliyet-etkin değilse. Gerçekten de, bu bir tek narenciye üretici veya araştırmacı hızlı ve ucuz birkaç yüz örnekleri birkaç gün içinde çok kanallı pipetler pahalı bir RT-qPCR thermocycler satın almadan birkaç 96-şey plakaları ile kombine kullanarak tahlil ki akla yatkın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu ve Zheng Qing Fu hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Kavramsallaştırma, HC ve Z. s. F.; Soruşturma, H. C., J. C ve Z. s. F; Kaynaklar, Z. s. F.; Yazma - orijinal taslak, ı. A. s.; Yazma-İnceleme ve düzenleme, ı. A. s., J. C., H. C., S. L. T. ve Z. s. F.; Görselleştirme, H. C.; Gözetim, Z. s. F.; Satın alma, Z. s. F ve F. s. L. finansman
Bir South Carolina iyileştirilmesi öğretmen kalitesi yüksek öğrenim durumu başlıklı Grant tarafından desteklenen proje, artırılması orta sınıflarda Bilim Öğretmenler bilgi bitki işlemleri, yapıları ve işlevleri ile nişan bitki Bilimleri Araştırma (bitki Bilim)
Birleşik Sates Department of Education tarafından (CFDA numarası 84.367B) ödül fonları
Yazarlar Dr Nian Wang Florida Üniversitesi genomik DNA örnekleri sunan için teşekkür etmek istiyorum Citrus sinensis Valencia bulaşmış.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
- UICEP. Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
