Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.

Summary

Cítrica Greening é uma doença particularmente destrutiva afetando culturas cítricas globalmente. Apresentado aqui é um método simples usando PCR e extração de DNA genômica de tecido foliar de citrinos para a identificação precisa e exacta do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp.

Abstract

Cítrica greening, também conhecida como Greening, é uma doença de citrino destrutiva devastando fazendas cítricas globalmente. Esta doença causa manchas assimétrica folha amarela, veia amarelamento, desfolha, cárie de raiz e, finalmente, a morte da planta cítrica. Quando infectadas, as plantas cítricas têm atrofiado crescimento e produzem flores fora de época. Estas flores raramente produzem frutos, e aqueles que produzem frutas cítricas pequenas, amargas, de forma irregular que não são desejáveis. Esta doença é transmitida pelos asiáticos citrinos psilídeos, Diaphorina citri e o enxerto de tecido infectado de citrino. O patógeno tem um período de incubação longo e variável dentro da planta de citros — às vezes anos, antes que os sintomas apareçam. Tentativas de cultura esse patógeno em vitro foram infrutíferas, possivelmente devido a baixa e desigual concentração do patógeno dentro infectado tecido cítrico, ou porque é difícil replicar o ambiental condições favorável para o crescimento de o patógeno. É muito difícil identificar a doença antes que ela se espalhou, devido ao seu longo período de incubação e a incapacidade dos investigadores à cultura do patógeno. Como resultado, a doença só se torna aparente depois de repente destruindo todo rendimento do agricultor um citrino. Apresentado aqui é um método para a deteção de precisa e específica do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp. usando um kit de extração de DNA genômico e PCR. Este método é simples, eficiente, rentável e adaptável para análise quantitativa. Esse método pode ser adaptado para uso em qualquer tecido de citrino; no entanto, potencialmente é limitada pela quantidade de patógenos presentes no tecido. No entanto, esse método permitirá citros agricultores identificar plantas cítricas infectadas anteriormente e conter a disseminação desta doença destrutiva antes de ele pode espalhar ainda mais.

Introduction

Cítrica greening, também conhecida como Greening, causou uma perda significativa de árvores de citrinos. Um caso representativo é Flórida, onde a doença está prevista para causar uma redução de 70% na produção de caixas de laranja Florida de 244 milhões de caixas na temporada 1997-1998 para 70 milhões de caixas a partir da temporada de 2016-2017¹. Mais de 90% das árvores cítricas na Flórida são infectadas², e estima-se que a indústria de citros Florida perde cerca de 1 bilhão de dólares cada ano devido a doenças cítricas, onde cítrica greening desempenha um papel importante³. Cítrica greening é espalhada principalmente pelos psilídeos cítricos asiáticos invasivo Diaphorina citri, mas também pode ser transmitida por enxertia de tecido infectado. A doença causa amarelecimento das veias, manchas assimétrica folha amarela, desfolha prematura, dieback do galho, cárie de raiz e morte da planta. Importante, a doença causa a planta cítrica produzir flores fora de época, que raramente produzem frutos. A fruta que é produzida por plantas cítricas infectadas é imaturos, verde e amargo sabor⁴.

A finalidade desse método é exatamente e precisamente identificar a bactéria motile Candidatus liberibacter spp., o agente causador da cítrica greening, vivendo dentro do floema de árvores cítricas infectados⁵. DNA genômico é extraído do tecido da folha inteira, que contém a bactéria viva. Este DNA genômico extraído é usado como um modelo para o PCR convencional, onde oligonucleotídeos complementares a sequência de rDNA 16S da bactéria são utilizados para amplificar esta sequência. Oligonucleotídeos complementares a um gene de caixa cítrico são usados como um controle interno de amplificação. Nós escolhemos usar esse método, porque provou ser bem sucedido na anterior pesquisa⁶.

Este método tem a vantagem de ser simples, relativamente barato e capaz de ser realizado em qualquer laboratório de bioquímica normalmente equipado. Além disso, PCR continua a ser o método mais exato e preciso para detectar este patógeno, devido à dificuldade de cultivo deste patógeno⁷e capacidade do patógeno sobreviver e reproduzir-se durante anos dentro de um hospedeiro assintomático⁸. Muitos ensaios PCR de especialidade diferentes foram usados para detectar com sucesso este patógeno; no entanto, PCR convencional permanece o ensaio mais simples para a deteção de preciso e específico, especialmente dentro de hospedeiros assintomáticos⁸.

Protocol

1. isolar o DNA genômico de tecidos vegetais, usando um Kit de extração de genômica

1. Obter o tecido foliar cítricas cortando uma toda nova folha de uma árvore citros usando a tesoura limpa e coloque a folha em um saco plástico limpo.
   Nota: A bolsa contendo o tecido foliar deve ser colocada em um frigorífico de 4 ° C ou em gelo em um recipiente isolado logo que possível após a coleta para evitar a deterioração.
2. Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido para acalmar um almofariz e um pilão. Enquanto eles são de arrepiar, use uma tesoura para cortar um pequeno pedaço de tecido foliar, aproximadamente 1 polegada quadrada em tamanho. Coloque o tecido cortado o almofariz congelá-lo instantaneamente. Adicione mais nitrogênio líquido, se necessário.
   Nota: Luvas isoladas devem ser sempre usadas durante a manipulação de nitrogênio líquido.
3. Triture rapidamente o tecido de planta em um pó fino, usando a argamassa. Continue a moagem até o nitrogênio líquido evapora-se completamente, e continua a ser um pó fino de verde.
4. Brevemente relaxar uma espátula de metal em nitrogênio líquido para 10-15 s e, em seguida, colher o tecido do chão dentro a argamassa em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, utilizando a espátula.
5. Adicione 600 µ l de solução de lise de núcleos (consulte Tabela de materiais) usando um 1000 µ l Pipetar e vortex a amostra para 1-3 s, então incubar em banho de água de 65 ° C por 15 min.
6. Adicionar 3 µ l de solução de RNase o lisado usando uma pipeta de 10 µ l, inverta o tubo 2 - 5 vezes para misturar e incubar a 37 ° C numa incubadora do armário por 15 min.
   Nota: Deixe a mistura arrefecer à temperatura ambiente antes de prosseguir.
7. Adicione 200 µ l de solução de precipitação de proteínas, vórtice em alta velocidade por 20 s e, em seguida, centrifugar por 3 min a 13.000 x g, para formar uma bolinha firme. Enquanto a amostra está sendo centrifugada, adicione 600 µ l de isopropanol de temperatura para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
8. Utilizando uma pipeta de µ l 1000, remova cuidadosamente o sobrenadante da amostra centrifugada, transferindo-o para o tubo de microcentrifugadora fresca 1,5 mL contendo isopropanol. A pelota agora pode ser descartada.
   Nota: Não poluir o sobrenadante com proteína, deixando uma quantidade minúscula de sobrenadante acima a pelota.
9. Inverter o tubo, até que o DNA torna-se visível como uma massa de fios como fio e, em seguida, centrifugar a 13.000 x g por 1 min à temperatura ambiente.
10. Decante o sobrenadante, adicionar 600 µ l de etanol 70% para a pelota, inverta o tubo várias vezes para lavar o DNA e centrifugar a 13.000 x g por 1 min.
11. Cuidadosamente Aspire o etanol, deixando o pellet de DNA solta, em seguida, abra e inverter o tubo, descansando sobre papel absorvente. Ar seco à temperatura ambiente por 15 min.
12. Adicionar 100 µ l de solução de reidratação de DNA ao pellet de DNA secas e, em seguida, incubar o DNA em um banho de água de 65 ° C durante 1 h, enquanto mistura periodicamente tocando o tubo.
13. Coloque 1 µ l de água filtrada em uma microcuvette e inseri-lo em um espectrofotômetro para ser usado como um espaço em branco. Calcule a concentração de DNA presente colocando 1 µ l de amostra sobre o microcuvette, e inserindo o Espectrofotômetro. Concentração de DNA (ng / µ l) pode ser calculado como (₂₆₀- um₃₂₀) × diluição fator × 50 ng / µ l.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra pode ser armazenada a 4 ° C.

2. realizar PCR em amostras de DNA genômico

1. Combine 10 µ l 2 x PCR Master Mix (ver tabela de materiais), 1 µ l para a frente da primeira demão (pM 10 / µ l), 1 µ l reverso da primeira demão (pM 10 / µ l) (ver tabela 2 para sequências da primeira demão), 100 ng de DNA genômico extraído da amostra e purificado de água (volume final de até 20 µ l) em um 50 µ l do PCR tubo, filme para misturar e brevemente centrífuga.
2. Insira o tubo de PCR o thermocycler e executar em conformidade (ver tabela 1).
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Se necessário, armazene amostra a 4 ° C, após a reação é completa.

3. electrophorese o DNA amplificado em um Gel de Agarose

1. Pesar 0,4 g de pó de agarose e adicioná-lo juntamente com 1 buffer de x TAE a um limpo 200 mL frasco de Erlenmeyer, enchendo até 50 mL.
2. Microondas em alta por 1,5 min, agitando a cada 30 s, até agarose é totalmente dissolvido.
   Nota: Luvas isoladas devem ser usadas durante a manipulação de agarose líquido para evitar queimaduras.
3. Adicionar 2,5 µ l de brometo de etídio 10mg/mL para o líquido do agarose e agitar a mistura e, em seguida, despeje o gel de agarose líquido em um molde de gel de nível. Inserir rapidamente pentes padrão 12-dente gel depois de derramar.
4. Permitir que o gel para esfriar por 20 min em temperatura ambiente e, em seguida, remover o gel de pentes e colocar o gel em uma caixa de gel nível preenchida com 1 x TAE buffer.
5. Utilizando uma micropipeta, carrega as amostras de DNA amplificadas totais em poços. Adicione 5 µ l de DNA da escada (ver Tabela de materiais) em um poço separado de suas amostras.
6. Electrophorese as amostras por 35 min em uma constante de 90 V, retire o gel e coloque em um transiluminador UV.
7. Fotografar e analisar o gel de borda padrão enquanto estiver usando transiluminação UV no 302 nm.

Representative Results

Um resultado positivo produz uma banda distinta correspondentes a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Lss/Las606⁶, e/ou uma banda distinta, correspondente a 700 bp para Laa2/Laj5, inserida a β ribosomal 16S operon⁹. A banda de controle interno de amplificação também deve aparecer em 400 bp. Esta banda corresponde a amplificação do gene cítricas caixa ¹⁰e deve aparecer para um resultado a ser considerado válido (Figura 1 e Figura 2). Falta de ambos 500 bp e 700 bandas bp enquanto uma banda bp 400 está presente representa um resultado negativo. Realização de PCR em amostras saudáveis pode render alguns padrões de bandas não-específica ao redor 700 bp e 400 bp; no entanto, apenas uma única banda bold (realce) correspondente a esses pesos molecular indica um resultado positivo (Figura 1).

Operação	Temp.	Tempo	Ciclos de
Desnaturação inicial	95 ° C	3 - 5 min	1
Desnaturação	95 ° C	30 seg	35
Recozimento	55 ° C	30 seg
Alongamento	72 ° C	40 seg
Alongamento final	72 ° C	10 min	1

Tabela 1. Thermocycler configurações usadas para amplificar o alvo 16S rDNA genes e caixa de citrino.

Nome de Primer	Sequência de		Referência
LAA2_F	5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC MORDAÇA TTT-3'		Hocquellet, et al., 1999
LAJ5_R	5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3'		Hocquellet, et al., 1999
FBOX_F	5'-TTG GAA ATO CTT TCG CCA CT-3'		Este ensaio
FBOX_R	5'-AGC AGA CCT GGC TAT TAT ACG ATO G-3'		Este ensaio
LSS_F	5'-GGA MORDAÇA GTG AGT GGA ATT CCG A-3'		Fujikawa, et al., 2012
LSS_R	5'-ACC CAA GATO CTA GGT AAA AAC C-3'		Fujikawa, et al., 2012

Tabela 2. Nome de primers, sua sequência de DNA e referência.

Figura 1. Análise de PCR convencional resulta de quatro amostras de tecido infectado folhas cítricas e duas amostras de vegetação rasteira, usadas como controles negativos. 'gDNA' indica uma amostra de DNA genômica extraído de tecido foliar de citrinos. Amostras gDNA 1 e gDNA 4 são de amostras de folhas cítricas não infectados; gDNA 2, 3, 5 e 6 são Candidatus liberibacter asiaticum (Clas) infectado amostras. DNA foi extraído, como está escrito no protocolo. PCR foi realizado utilizando o DNA genômico extraído como um modelo, por protocolo (ver tabela 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS e caixa referem-se aos conjuntos de primer usados (ver tabela 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Fotografia de gel completo das três amostras gDNA amplificado. Amostra 1 é tecido saudável de citrino; as amostras 2 e 3 são amostras de tecido infectado de Clas. Esses exemplos correspondem a gDNA 1, 2 e 3, como visto na Figura 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

É fundamental que todos os passos são seguidos exatamente para alcançar as melhores condições experimentais. Tecido de folha inteira foi usado durante esta demonstração; no entanto, o protocolo pode ser modificado para incluir teoricamente qualquer tipo de tecido de planta. Anteriormente, investigadores extraído DNA genômico de tecido de veia foliar, ao invés de tecido foliar inteira e alcançado semelhantes resultados¹¹. Se a banda correspondente ao gene de citrinos caixa não comparecer, o resultado é inválido, e pode haver um ou mais dos vários erros técnicos no procedimento operacional. Erros comuns incluem: usando água contaminada ou inadequadamente esterilizada, pontas de micropipeta ou microcentrifuge tubos; Falha ao adicionar um ou mais componentes necessários na mistura do PCR ou durante a extração de DNA genômica; falhando em manter as condições de thermocycler adequada; utilizando reagentes ou outros ingredientes que são sua data de validade; Falha ao adicionar ethidium brometo ou outro DNA mancha para o gel de agarose; electrophoresing o DNA amplificado a uma tensão muito alta ou muito tempo; e usando velho ou impropriamente misto TAE buffer, ou simplesmente usando água em vez de tampão TAE para preencher a caixa de gel.

As primeiras demão LAA2_F e LAJ5_R foram escolhidos a partir de pesquisas anteriores devido ao seu sucesso na identificação de africanum e Candidatus Liberibacter asiaticum. Estas primeiras demão amplifica o subunit ribosomal genes rplA e rplJ, rendendo um fragmento amplificado de bp 669 do C. l. africanum ou um fragmento de bp 703 de C. l. asiaticum⁹. Cartilhas, LSS_F e LSS_R foram escolhidas para este ensaio da pesquisa anterior, devido à sua especificidade, precisão e estabelecida baixa taxa de falsos negativa para C. l. asiaticum. O conjunto de primeira demão LSS amplifica uma sequência de bp 500 em todos os três 16S rDNA genes presentes em C. l. asiaticum⁶. Os iniciadores de caixa foram construídos para uso como um controle interno de amplificação e amplificam uma sequência de bp 400 encontrados em plantas cítricas. Pesquisas anteriores mostram que caixa é expressa estàvel em plantas cítricas e faria um grande candidato para uso como um gene de referência quando adaptar este ensaio para RT-qPCR¹⁰.

Este ensaio pode ser adaptado para ser usado para qualquer tipo de tecido de citrino e pode ser modificado para uso com ensaios de PCR-based adicionais, tais como RT-qPCR. As limitações deste teste são poucos, e a maioria é inerente ao PCR convencional. Estes fatores limitantes incluem: a presença de etanol ou outros produtos químicos inibitórios na mistura de PCR, a falta de quantificação sem executar um ensaio mais avançado, a necessidade de um thermocycler em laboratórios menores e a presença de contaminação de DNA.

Enquanto a especificidade deste teste não foi diretamente comparada com os métodos mais específicos, RT-qPCR, este teste é útil para os cientistas realizando pesquisas em Candidatus liberibacter e agricultores, buscando diagnosticar potencialmente infectado citrino árvores em suas áreas, especialmente se os métodos mais específicos não estão disponíveis ou rentável. Com efeito, é concebível que um único produtor de citros ou pesquisador pode rapidamente e barata do ensaio várias centenas de amostras em poucos dias, usando pipetas multicanais combinadas com várias placas de 96 poços, sem comprar um caro thermocycler RT-qPCR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen	Air Products	N/A
Mastercycler pro with control panel	Eppendorf	6321000019
1250 W Microwave	Panasonic	N/A
5424 table top centrifuge	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 digital water bath	Fisher scientific	15-462-15Q
Metal spatula	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortar and pestle	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Sterile 10 μL tips	TipOne	1161-3730
Sterile 200 μL tips	TipOne	1163-1730
Sterile 1250 μL tips	TipOne	1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit	VWR	75788-460
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acetic acid	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Stackable casting tray and combs	Carolina	213655
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectrometer basic	Eppendorf	6135000009
0.2 mL PCR tubes	Fisher scientific	AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Water, PCR grade	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018