Summary
Sitrus Greening er en spesielt ødeleggende sykdom som påvirker sitrus avlinger globalt. Presenteres her er en enkel metode bruker PCR og genomisk DNA utvinning av sitrus blad vev for nøyaktig og presis identifikasjon av sitrus greening patogen, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Sitrus greening, også kjent som huanglongbing, er en destruktiv sitrus sykdom herjer sitrus gårder globalt. Denne sykdommen fører asymmetrisk gult blad mottling blodåre gulfarging, den høye saltholdigheten, rot forfall og til slutt død av sitrus anlegget. Når infisert, sitrus plantene har forkrøplet vekst og produsere blomster utenfor sesongen. Disse blomstene gi sjelden frukt, og de som gi små, bitter, uregelmessig formet sitrus frukt som er ikke ønskelig. Denne sykdommen spres ved den asiatisk sitrus psyllid, Diaphorina citri, og pode av infiserte sitrus vev. Patogen har en lang og variabel inkubasjonstid innen sitrus anlegget, noen ganger år, tidligere tegn komme. Forsøk på å kultur denne patogen i vitro har vært mislykket, muligens på grunn av lav og ujevn konsentrasjon av patogen innen infisert sitrus vev, eller fordi det er vanskelig å gjenskape den miljømessige forholdene til rette for vekst patogen. Det er svært vanskelig å identifisere sykdommen før den har spredt, på grunn av sin lange inkubasjonstiden og forskere manglende evne å kultur patogen. Resultatet blir sykdommen bare tydelig etter plutselig ødelegge sitrus bonde hele avkastning. Presenteres her er en metode for nøyaktig og bestemt påvisning av sitrus greening patogen, Candidatus liberibacter spp. bruker genomisk DNA utvinning kit og PCR. Denne metoden er enkel, effektiv, kostnadseffektiv og tilpasses kvantitativ analyse. Denne metoden kan tilpasses for bruk på alle sitrus vev; men er det potensielt begrenset av mengden patogen i vevet. Denne metoden vil likevel tillate sitrus bønder å identifisere infiserte sitrus planter tidligere og dempe spredningen av denne ødeleggende sykdommen før det kan videre spres.
Introduction
Sitrus greening, også kjent som huanglongbing, har forårsaket betydelig tap av sitrus trær. En representant saken er Florida, der sykdommen er forecasted for å føre en 70% reduksjon i produksjonen av Florida oransje bokser fra 244 millioner bokser i 1997-1998-sesongen å 70 millioner bokser i 2016-2017 sesong1. 90% av sitrus trær i Florida er over infisert2, og det er anslått at Florida sitrus næringen taper ca en milliard dollar hvert år på grunn av sitrus sykdommer, der sitrus greening spiller en viktig rolle3. Sitrus greening spres hovedsakelig av invasiv asiatisk sitrus psyllid Diaphorina citri, men kan også spres ved pode av infiserte vev. Sykdommen forårsaker gulfarging av årer, asymmetrisk gult blad mottling, tidlig den høye saltholdigheten, kvist dieback, rot forfall og død av anlegget. Viktigere, fører sykdommen sitrus anlegget å produsere blomster av sesongen, som sjelden produserer frukt. Frukt som produseres av infiserte sitrus planter er umoden grønne og bitre smaker4.
Formålet med denne metoden er å nøyaktig og identifisere nøyaktig motile bakterie Candidatus liberibacter spp., den utløsende agenten for sitrus greening, bor i phloem av infiserte sitrustrær5. Genomic DNA er Hentet fra hele blad vev, som inneholder live bakterier. Dette utdraget genomisk DNA brukes som mal for konvensjonelle PCR, hvor oligonucleotides utfyllende til bakteriens 16S rDNA sekvens brukes til å forsterke denne sekvensen. Oligonucleotides komplementær til en sitrus FBOX genet brukes som en intern forsterkning kontroll. Vi valgte å bruke denne metoden, fordi det har vist seg for å være vellykket i tidligere forskning6.
Denne metoden har klar fordel av å være enkel, relativt billig og kan utføres i alle normalt utstyrt biokjemi lab. I tillegg fortsatt PCR mest nøyaktig og presis metoden for å oppdage denne patogen, på grunn av vanskelighetene med dyrking denne patogen7og den patogene evne til å overleve og reprodusere i år i en asymptomatisk vert8. Mange forskjellige spesialitet PCR analyser har blitt brukt til å oppdage denne patogen; konvensjonelle PCR imidlertid enkleste analysen for nøyaktig og bestemt deteksjon, spesielt innen asymptomatisk verter8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isoler genomisk DNA fra anlegget Tissue benytter en genomisk utvinning Kit
- Få sitrus blad vev ved å kutte en hel frisk blad fra en sitrus treet med ren saks, og plassere bladet i en ren plast sandwich pose.
Merk: Posen som inneholder blad vevet plasseres i 4 ° C kjøleskap eller på isen i en isolert beholder så snart som mulig etter samling å unngå kvalitetsforringende. - Legge en liten mengde flytende nitrogen til chill en morter. Mens de er chilling, bruk saks til å kutte ut en liten del av blad, ca 1 kvadrat tommen inne størrelse. Plass klippe vevet i mørtelen umiddelbart fryse det. Legge til flere flytende nitrogen, hvis nødvendig.
Merk: Isolert hansker skal alltid bæres under behandling av flytende nitrogen. - Raskt grind anlegget vevet til et fint pulver bruker mørtelen. Fortsette sliping til flytende nitrogen fordamper helt, og en grønn pulver forblir.
- Kort chill metall spatula i flytende nitrogen for 10-15 s og scoop bakken vev inni mørtelen i en 1,5 mL microcentrifuge tube, bruker spatula.
- Legge til 600 µL av kjerner Lysis løsning (se Tabell for materiale) bruker en 1000 µL Pipetter og vortex utvalget for 1-3 s, deretter ruge i et vannbad 65 ° C i 15 min.
- Legge til 3 µL RNase løsning i lysate ved hjelp av en 10µL pipette, invertere røret 2 - 5 ganger bland det og ruge på 37 ° C i en regjering inkubator i 15 min.
Merk: Tillat blandingen til å avkjøles til romtemperatur før du fortsetter. - Legge til 200 µL av Protein nedbør løsning, vortex på høy hastighet for 20 s og sentrifuge for 3 min 13 000 x g til fast pellets. Mens prøven er blir sentrifugeres, legge 600 µL av romtemperatur isopropanol slik frisk 1,5 mL microcentrifuge.
- Bruker en 1000 µL pipette, nøye fjerne nedbryting fra centrifuged prøven, overføre den til frisk 1,5 mL microcentrifuge røret som inneholder isopropanol. Pellet kan nå bli forkastet.
Merk: Unngå forurensende nedbryting med protein ved å la en miniscule mengden nedbryting over pellet. - Invertere røret til DNA blir synlig som en masse tråd-lignende tråder, så sentrifuge 13.000 x g i 1 min i romtemperatur.
- Dekanter nedbryting, legge til 600 µL av 70% etanol pellet, invertere røret flere ganger å vaske DNA, og sentrifuge 13.000 x g for 1 min.
- Nøye Sug opp etanol, forlater løs DNA pellets, og åpne og invertere røret, hviler på absorberende papir. Lufttørke ved romtemperatur i 15 min.
- Legg 100 µL av DNA rehydrering løsning til den tørket DNA pellet, så ruge DNA i en 65 ° C vannbad 1t, mens regelmessig ved å trykke på røret.
- Sted 1 µL av renset vann på en microcuvette, og sette den inn i et spektrofotometer som en tom. Beregn konsentrasjonen av DNA stede ved å plassere 1 µL av prøve på microcuvette, og sette inn spektrofotometeret. DNA konsentrasjonen (ng/µL) kan være beregnet som (en260-320) × fortynning faktor × 50 ng/µL.
Merk: Protokollen kan pauses her. Prøven kan lagres på 4 ° C.
2. Utfør PCR på genomisk DNA-prøver
- Kombinere 10 µL 2 x PCR Master Mix (se tabell av materialer), 1 µL frem primer (10 pM/µL), 1 µL reversere primer (10 pM/µL) (se tabell 2 for primer sekvenser), 100 ng genomisk DNA Hentet fra utvalget, og renset vann (opptil 20 µL siste volum) i en 50 µL PCR tube flick å blande og kort sentrifuge.
- PCR-rør inn i thermocycler og kjør deretter (se tabell 1).
Merk: Protokollen kan pauses her. Eventuelt lagre eksempel på 4 ° C etter reaksjonen er fullført.
3. electrophorese forsterket DNA i en Agarose Gel
- Veie 0,4 g agarose pulver og legger den sammen med 1 x TAE buffer til en ren 200 mL Erlenmeyer kolbe, fylle opp til 50 mL.
- Mikrobølgeovn på høy for 1,5 min, rister hver 30 s, til agarose er fullstendig oppløst.
Merk: Isolert hansker bør brukes ved håndtering flytende agarose for å unngå brannskader. - Legg til 2,5 µL av 10 mg/mL ethidium bromide flytende agarose og riste å blande, og hell væsken agarose gel i nivå gel mold. Raskt sette inn standard 12-tann gel kammer etter pouring.
- Tillate gel å kjøle for 20 min i romtemperatur, fjerner gel kammer, og plassere gel i en nivå gel boks fylt med 1 x TAE buffer.
- Bruker brønnene, laste de totale forsterket DNA-prøvene i brønner. Legge til 5 µL av DNA stigen (se Tabell for materiale) i en separat godt fra prøver.
- Electrophorese prøvene for 35 min på konstant 90 V, så fjern gel og plasser i en UV-transilluminator.
- Fotografere og analysere gel striper mønster mens du bruker UV transillumination på 302 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et positivt resultat gir en tydelig band tilsvarer 500 bp Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, og/eller en distinkt band tilsvarer 700 bp for Laa2/Laj5, 16S ribosomal β bilag operon9. Intern forsterkning kontroll bandet må vises på 400 bp. Dette bandet tilsvarer forsterkning av sitrus FBOX gene10, og det må vises resultatet skal være gyldig (figur 1 og figur 2). Mangel på begge 500 bp og 700 bp band mens et 400 bp band finnes representerer et negativt resultat. Utføre PCR på sunn prøver kan gi noen uspesifisert striper mønstre rundt 700 bp og 400 bp; bare en enkelt fet band tilsvarer disse molekylvekt angir imidlertid et positivt resultat (figur 1).
| Operasjon | Temp. | Tid | Sykluser |
| Første rødsprit | 95 ° C | 3 - 5 minutter | 1 |
| Rødsprit | 95 ° C | 30 sek | 35 |
| Avspenning | 55 ° C | 30 sek | |
| Forlengelse | 72 ° C | 40 sek | |
| Siste forlengelse | 72 ° C | 10 min | 1 |
Tabell 1. Thermocycler innstillinger som brukes til å forsterke målet 16S rDNA gener og sitrus FBOX.
| Navnet på Primer | Sekvens | Referanse | |
| LAA2_F | 5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC GAG TTT-3 " | Hocquellet, et al., 1999 | |
| LAJ5_R | 5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3' | Hocquellet, et al., 1999 | |
| FBOX_F | 5'-TTG GAA ACT CTT TCG CCA CT-3 " | Denne analysen | |
| FBOX_R | 5'-AGC AGA CCT GGC TAT TAT ACG ACT G-3' | Denne analysen | |
| LSS_F | 5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT CCG A-3' | Fujikawa, et al., 2012 | |
| LSS_R | 5'-ACC CAA KATTEN CTA GGT AAA AAC C-3' | Fujikawa, et al., 2012 | |
Tabell 2. Navnet på primere, DNA sekvensen og referanse.
Figur 1. Analyse av konvensjonelle PCR resultater fra fire infiserte sitrus blad vevsprøver og to heathy eksempler brukes som negative kontroller. 'gDNA' angir en genomisk DNA-prøve Hentet fra sitrus blad vev. Eksempler gDNA 1 og gDNA 4 er fra infisert sitrus blad prøver; gDNA 2, 3, 5 og 6 er Candidatus liberibacter asiaticum (CLA) infisert prøver. DNA ble trukket ut som skrevet i protokollen. PCR ble utført med utdraget genomisk DNA som en mal, per protokollen (se tabell 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS, og FBOX refererer til primer sett brukes (se tabell 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Komplett gel fotografi av tre forsterket gDNA prøver. Eksempel 1 er frisk sitrus vev; prøvene 2 og 3 er Clas infisert vevsprøver. Disse prøvene tilsvarer gDNA 1, 2 og 3, som vist i figur 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er viktig at alle trinnene blir fulgt nøyaktig for å oppnå optimal eksperimentelle forhold. Hele blad vev ble brukt under denne demonstrasjonen; protokollen kan imidlertid endres teoretisk med alle typer anlegg vev. Tidligere har forskere Hentet genomisk DNA fra blad blodåre vev, i stedet for hele blad vev, og oppnådde lignende resultater11. Hvis bandet tilsvarer sitrus FBOX genet ikke vises, resultatet er ugyldig, og det kan være ett eller flere av flere tekniske feil i drift prosedyren. Vanlige feil omfatter: bruke forurenset eller feil sterilisert, brønnene tips eller microcentrifuge rør; sviktende å legge til én eller flere komponenter som er nødvendige i PCR blanding eller under genomisk DNA utvinning; sviktende å opprettholde riktig thermocycler betingelsene; reagenser eller andre ingredienser som er utløpt på dato; sviktende å legge ethidium flekken bromide eller en annen DNA til agarose gel; electrophoresing forsterket DNA for høy spenning eller for lenge; og bruke gamle eller feil blandet TAE-bufferen, eller bare bruk av vann istedenfor TAE buffer fylle boksen gel.
Primere LAA2_F og LAJ5_R ble valgt ut fra tidligere forskning på grunn av deres suksess på å identifisere Candidatus Liberibacter asiaticum og africanum. Disse veiledningene forsterke ribosomal delenhet gener rplA og rplJ, gir et forsterket 669 bp fragment c. l. africanum eller et 703 bp fragment c. l. asiaticum9. Primere LSS_F og LSS_R ble valgt for denne analysen fra tidligere forskning på grunn av deres etablerte lav falsk negativt rate, nøyaktighet og spesifisitet for C. l. asiaticum. Den LSS primer settet forsterker en 500 bp sekvens alle tre 16S rDNA gener i C. l. asiaticum6. FBOX primerne ble bygget som en intern forsterkning kontroll og forsterke en 400 bp sekvens i sitrus planter. Tidligere forskning viser at FBOX er stabilt uttrykt i sitrus planter, og ville gjøre en flott kandidat for bruk som et gen som referanse når tilpasse denne analysen for RT-qPCR10.
Denne analysen kan tilpasses som skal brukes for alle typer sitrus vev, og kan bli endret for bruk med ekstra PCR-baserte analyser, for eksempel RT-qPCR. Begrensningene for denne analysen er noen, og de fleste er iboende til konvensjonelle PCR. Disse Begrensende faktorer inkluderer: tilstedeværelsen av etanol eller andre hemmende kjemikalier i PCR blandingen, mangel på kvantifisering uten å utføre en mer avansert analysen, behovet for en thermocycler i mindre labs, og tilstedeværelsen av DNA forurensning.
Mens spesifisiteten av denne analysen ikke har direkte forhold til mer spesifikke RT-qPCR metoder, denne analysen er nyttig for forskere utfører forskning på Candidatus liberibacter, og bønder å diagnostisere potensielt infisert sitrus trær i sine felt, spesielt hvis mer spesifikke metoder ikke er tilgjengelig eller kostnadseffektiv. Faktisk er det tenkelig at en enkelt sitrus dyrker eller forsker kunne raskt og billig analysen flere hundre prøver i noen dager, ved hjelp av flerkanals Pipetter kombinert med flere 96-brønns plater, uten å kjøpe en dyr RT-qPCR-thermocycler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu og Zheng Qing Fu erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Conceptualization, H.C. og Z. Q. F.; Etterforskningen, H. C., J. C og Z. Q. F; Ressurser, Z. Q. F.; Skrive - opprinnelige utkastet, I. A. P.; Skrive-gjennomgang og redigering, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. og Z. Q. F.; Visualisering, H. C.; Tilsyn, Z. Q. F.; Finansiering oppkjøpet, Z. Q. F og F. Q. L.
Prosjekt støttet av en South Carolina forbedre lærer kvalitet høyere utdanning statlig bevilgning tittelen, styrke midt karakterer Science Teachers' kunnskap av anlegget prosesser, strukturer og funksjoner gjennom engasjement i anlegget Sciences Research (anlegg Science)
Midler tildelt av United Sates Institutt for utdanning (CFDA nummer 84.367B)
Forfatterne gjerne takke Dr. Nian Wang av University of Florida for å gi genomisk DNA-prøver fra infisert Citrus sinensis Valencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
- UICEP. Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
