Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben

Summary

Citrus Greening ist eine besonders destruktive Erkrankung Zitrusfrüchte Kulturen weltweit. Hier ist eine einfache Methode PCR und genomische DNA-Extraktion von Zitrusfrüchten Blattgewebe für die genaue und präzise Identifikation des Erregers citrus Greening, Verbindung Liberibacter spp. verwenden

Abstract

Citrus Greening, auch bekannt als Huanglongbing, ist eine zerstörerische Zitrus Krankheit verwüsten Zitrusfrucht Betriebe weltweit. Diese Krankheit verursacht asymmetrische gelbes Blatt Marmorierung, Vene Vergilbung, entblätterung, Wurzel Verfall und letztlich der Tod der Zitrusfrüchte Pflanze. Wenn infiziert, die Zitruspflanzen haben Wachstumsstörungen und Blumen außerhalb der Saison zu produzieren. Diese Blumen bringen selten Obst, und diejenigen, die kleine, bitter, unregelmäßig geformte Zitrusfrüchte, die nachgeben sind nicht erwünscht. Diese Krankheit ist durch die asiatische citrus Psyllid Diaphorina Citri, und durch die Pfropfung von infizierten Zitrusfrüchten Gewebe verteilt. Der Erreger hat eine lange und Variable Inkubationszeit innerhalb der Zitrusfrüchte Pflanze – manchmal Jahre, bevor Symptome auftreten. Versuche, dieses Erregers in Vitro Kultur unterlegen, möglicherweise aufgrund der geringen und unebenen Konzentration des Erregers innerhalb von Zitrusfrüchten Gewebe infiziert, oder weil es schwierig ist, die Umwelt zu replizieren Bedingungen förderlich für Wachstum der der Erreger. Es ist sehr schwierig, die Krankheit zu identifizieren, bevor es sich ausgebreitet hat, aufgrund seiner langen Inkubationszeit und Forscher Unfähigkeit zur Kultur des Erregers. Dadurch zeigt sich die Krankheit erst nach der Zerstörung plötzlich ein Zitrus Bauer gesamte Ausbeute. Hier ist eine Methode für die genaue und spezifische Erkennung des Erregers citrus Greening, Verbindung Liberibacter spp. mit einem genomische DNA-Extraktion Kit und PCR. Diese Methode ist einfach, effizient, kostengünstig und flexibel für die Quantitative Analyse. Diese Methode kann für den Einsatz auf jedem Zitrus Gewebe angepasst werden; jedoch wird es möglicherweise durch die Menge der Erreger im Gewebe vorhanden begrenzt. Allerdings wird diese Methode zulassen, dass Zitrusfrüchte Landwirte infizierten Zitruspflanzen früher zu identifizieren und die Ausbreitung dieser zerstörerischen Krankheit einzudämmen, bevor sie weiter verbreiten kann.

Introduction

Citrus Greening, auch bekannt als Huanglongbing, hat einen bedeutenden Verlust von Zitrusbäumen verursacht. Ein repräsentativer Fall ist Florida, wo die Krankheit voraussichtlich eine Ermäßigung von 70 % in der Produktion von Florida orange-Boxen von 244 Millionen Kisten in der Saison 1997-1998 70 Millionen Kisten ab 2016-2017 Staffel¹zufügen. Über 90 % der Zitrusbäume in Florida sind infizierte², und es wird geschätzt, dass der Zitrusindustrie Florida etwa 1 Milliarde Dollar pro Jahr wegen Zitrusfrüchten Krankheiten verliert wobei citrus Greening eine wichtige Rolle-^{3 spielt}. Citrus Greening wird in erster Linie durch die invasive asiatische citrus Psyllid Diaphorina Citri, verbreitet aber auch durch Pfropfung des infizierten Gewebes. verteilt werden können Die Krankheit verursacht Gelbfärbung der Venen, asymmetrische gelbes Blatt Marmorierung, vorzeitige entblätterung, Zweig absterben, Wurzel Verfall und Tod der Pflanze. Wichtig ist, verursacht die Krankheit die Zitrusfrüchte Pflanze Blumen in der Nebensaison zu produzieren, die nur selten Früchte zu produzieren. Die Frucht, die durch infizierte Zitruspflanzen entsteht sind unreif, grün und bitter schmecken⁴.

Der Zweck dieser Methode ist es, genau und bewegliche Bakterium Verbindung Liberibacter spp., dem Erreger der citrus Greening, Leben in das Phloem von infizierten Zitrusbäume⁵genau zu bestimmen. Genomischer DNA entzogen ganze Blattgewebe, die Leben Bakterien enthält. Diese extrahierte genomische DNA dient als Vorlage für konventionelle PCR wo Oligonukleotide ergänzen das Bakterium 16 s rDNA Sequenz verwendet werden, um diese Sequenz zu verstärken. Oligonukleotide, die komplementär zu einem Zitrus FBOX gen dienen als eine interne Amplifikationskontrolle. Wir haben diese Methode verwenden, weil es nachweislich um in der bisherigen Forschung⁶erfolgreich zu sein.

Diese Methode hat den klaren Vorteil, einfach, kostengünstig und in der Lage, in jedem normal ausgestatteten Biochemie Labor durchgeführt werden. Darüber hinaus bleibt die PCR die genaue und präzise Methode zur Erkennung von dieser Erreger, wegen der Schwierigkeit der Kultivierung dieser Erreger-⁷und der Erreger Fähigkeit zu überleben und sich fortzupflanzen, seit Jahren im Rahmen einer asymptomatischen Host-⁸. Viele andere Spezialität-PCR-Assays wurden verwendet, um erfolgreich diese Erreger erkennen; konventionelle PCR bleibt jedoch der einfachste Test für präzise und spezifische Erkennung, vor allem innerhalb von asymptomatischen Gastgeber⁸.

Protocol

(1) Isolierung genomischen DNA aus pflanzlichem Gewebe mit einem genomischen Extraction Kit

1. Erhalten Sie Zitrus Blattgewebe schneiden ein ganzer frischen Blatt von einem Zitrusfrüchte Baum mit einer sauberen Schere, und legen Sie das Blatt in einen sauberen Plastikbeutel.
   Hinweis: Die Tasche mit dem Blattgewebe sollte im Kühlschrank 4 ° C oder auf Eis in einem isolierten Behälter so bald wie möglich nach der Entnahme zu sparsam zu sein platziert werden.
2. Fügen Sie eine kleine Menge von flüssigem Stickstoff in einem Mörser und Stößel chill. Während sie entspannen, sind, mit einer Schere schneiden Sie ein kleines Stück Blattgewebe, ca. 1 Quadratzoll in der Größe. Platzieren Sie das geschnittene Gewebe im Mörser, sofort es einzufrieren. Mehr flüssigen Stickstoff, bei Bedarf hinzugefügt werden.
   Hinweis: Isolierte Handschuhe sollten immer getragen werden, beim Umgang mit flüssigem Stickstoff.
3. Mahlen Sie schnell das Pflanzengewebe zu einem feinen Pulver mit dem Mörtel. Schleifen der flüssige Stickstoff vollständig verdampft, bis ein feines grünes Pulver bleibt weiter.
4. Kurz entspannen Sie eine Spachtel aus Metall in flüssigem Stickstoff für 10-15 s, dann schöpfen Sie das Boden-Gewebe im Inneren des Mörtels zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, mit dem Spatel.
5. Fügen Sie 600 µL Kerne Lyse Lösung (siehe Tabelle der Materialien) mit einem 1000 µL pipette und Wirbel der Probe für 1-3 s, dann im Wasserbad 65 ° C für 15 min inkubieren.
6. Fügen Sie 3 µL RNase-Lösung hinzu, die lysate mit einer Pipette 10µL, Invertieren Sie die Röhre 2 - 5 Mal zu mischen, und bei 37 ° C in einem Schrank Inkubator für 15 min inkubieren.
   Hinweis: Lassen Sie die Mischung abkühlen auf Raumtemperatur bevor Sie fortfahren.
7. Fügen Sie 200 µL Niederschlag Proteinlösung, Vortex: bei Hochgeschwindigkeit, 20 s, dann Zentrifuge für 3 min bei 13.000 x g eine feste Kugel zu bilden. Während die Probe zentrifugiert wird, ist fügen Sie 600 µL Raumtemperatur Isopropanol einen frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch hinzu.
8. Mit einer 1000 µL Pipette, vorsichtig aus der zentrifugiert Probe, Übertragung auf den frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit Isopropanol überstand. Die Pellets kann nun verworfen werden.
   Hinweis: Vermeidung einer Kontamination des Überstands mit Protein durch eine winzige Menge überstand über die Pellets verlassen.
9. Invertieren Sie das Rohr, bis die DNA als eine Masse von fadenförmige Stränge sichtbar wird, dann Zentrifugieren bei 13.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur.
10. Dekantieren des Überstands, das Pellet 600 µL 70 % Ethanol hinzu, Invertieren Sie das Rohr mehrmals zu waschen die DNA, und 13.000 x g für 1 min zentrifugieren.
11. Vorsichtig Aspirieren das Ethanol, verlassen das lose DNA-Pellet dann öffnen und invertieren der Röhre, ruht auf saugfähigem Papier. An der Luft trocknen bei Raumtemperatur 15 Minuten.
12. Das getrocknete DNA-Pellet fügen Sie 100 µL DNA Rehydratationslösung hinzu, dann Brüten Sie die DNA im Wasserbad 65 ° C für 1 h, beim Mischen in regelmäßigen Abständen durch Tippen auf das Rohr.
13. Eine Küvette setzen Sie 1 µL gereinigtes Wasser auf, und legen Sie sie in einem Spektralphotometer als Leerzeichen verwendet werden. Berechnen Sie die Konzentration von DNA vorhanden, indem 1 µL Probe auf der Küvette und Einfügen in das Spektrophotometer. DNA-Konzentration (ng/µL) kann (ein₂₆₀- A₃₂₀) berechnete × Verdünnung Faktor × 50 ng/µL.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Probe kann bei 4 ° c gelagert werden

2. führen Sie PCR genomischer DNA-Proben

1. Kombinieren Sie 10 µL 2 (siehe Tabelle der Materialien), X PCR Master Mix 1 µL forward Primer (10 Uhr/µL), 1 µL reverse Primer (10 Uhr/µL) (siehe Tabelle 2 für Primer-Sequenzen), 100 ng von genomischer DNA aus der Probe extrahiert und gereinigtes Wasser (bis zu 20 µL Endvolumen) in ein 50 µL PCR-Röhrchen, Flick, mischen und kurz Zentrifuge.
2. Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler und entsprechend ausführen (siehe Tabelle 1).
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Gegebenenfalls speichern Sie Sample bei 4 ° C nachdem die Reaktion abgeschlossen ist.

3. die Amplifizierte DNA in ein Agarose-Gel electrophorese

1. Wiegen Sie 0,4 g Agarose Pulver und fügen Sie es zusammen mit 1 X TAE-Puffer auf eine saubere 200 mL Erlenmeyerkolben, Füllung bis zu 50 mL.
2. Mikrowelle auf hoch für 1,5 min schütteln alle 30 s, bis Agarose vollständig aufgelöst ist.
   Hinweis: Isolierte Handschuhe sollte getragen werden, beim Umgang mit flüssigen Agarose um Verbrennungen zu vermeiden.
3. Fügen Sie 2,5 µL 10 mg/mL Interkalation Bromid flüssige Agarose und schütteln zu mischen, dann Gießen Sie das flüssige Agarosegel in eine Ebene Gel-Form. Fügen Sie schnell standard 12-Zahn-Gel Kämme nach Gießen.
4. Lassen Sie das Gel für 20 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen, dann entfernen Gel Kämme, und legen Sie das Gel in eine Ebene Gel Box gefüllt mit 1 X TAE-Puffer.
5. Mit einer Mikropipette, laden Sie die insgesamt amplifizierten DNA-Proben in Brunnen. Fügen Sie 5 µL DNA ladder (siehe Tabelle der Materialien) in einem separaten gut aus Ihren Proben.
6. Electrophorese die Proben 35 min bei konstanter 90 V, dann das Gel zu entfernen und in einem UV-Transilluminator.
7. Fotografieren und analysieren das Gel Streifen Muster bei der Verwendung von UV-Durchleuchtung bei 302 nm.

Representative Results

Ein positives Ergebnis ergibt sich eine deutliche Band entspricht 500 bp für Verbindung Liberibacter Asiaticus Las606/Lss⁶, und/oder eine ausgeprägte Band entspricht 700 bp für Laa2/Laj5, Beilage in der 16 s ribosomalen β Operon⁹. Die interne Verstärkung kontrollbande muss auch immer am 400 bp. Diese Band Verstärkung der Zitrusfrüchte FBOX gen¹⁰entspricht, und müssen für ein Ergebnis als gültig betrachtet werden angezeigt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Mangel an beiden 500 bp und 700 bp Bands während einer 400 bp Band vorhanden ist stellt ein negatives Ergebnis. Durchführung der PCR auf gesunde Proben kann dies einige unspezifische Streifenbildung Muster rund 700 bp und 400 bp; Allerdings zeigt nur ein einziges Fett Band entspricht diese Molekulargewichte ein positives Ergebnis (Abbildung 1).

Betrieb	Temp.	Zeit	Zyklen
Anfängliche Denaturierung	95 ° C	3 - 5 min.	1
Denaturierung	95 ° C	30 Sek.	35
Glühen	55 ° C	30 Sek.
Dehnung	72 ° C	40 Sek.
Endgültige Dehnung	72 ° C	10 min	1

Tabelle 1. Thermocycler Einstellungen verwendet, um 16 s rDNA Zielgene und Zitrusfrüchten FBOX verstärken.

Name des Primers	Sequenz		Referenz
LAA2_F	5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC GAG TTT-3 "		Hocquellet, Et Al., 1999
LAJ5_R	5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3 "		Hocquellet, Et Al., 1999
FBOX_F	5'-TTG GAA ACT CTT TCG CCA CT-3 "		Dieser assay
FBOX_R	5'-AGC AGA CCT GGC TAT TAT ACG AKT G-3 "		Dieser assay
LSS_F	5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT CCG A-3 "		Fujikawa, Et Al., 2012
LSS_R	C-5'-ACC CAA KATZE CTA GGT AAA AAC 3 "		Fujikawa, Et Al., 2012

Tabelle 2: Name der Zündkapseln, ihrer DNA-Sequenz und Referenz.

Abbildung 1: Analyse der konventionellen PCR resultiert aus vier infizierten Zitrusfrüchten Blatt Gewebeproben und zwei heathy Proben als Negativkontrollen verwendet. "gDNA" zeigt eine genomische DNA-Probe extrahiert aus Zitrusfrüchten Blattgewebe. Proben 1 gDNA und gDNA 4 sind von nicht infizierten Zitrusfrüchten Blattproben; gDNA 2, 3, 5 und 6 sind Verbindung Liberibacter Asiaticum (Clas) infizierten Proben. DNA extrahiert wurde, wie in das Protokoll geschrieben. PCR erfolgte mittels der extrahierten genomischen DNA als Vorlage, pro Protokoll (siehe Tabelle 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS und FBOX beziehen sich auf die Grundierung Sets verwendet (siehe Tabelle 2). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Komplette Gel-Foto von drei verstärkte gDNA Proben. Beispiel 1 ist gesund Zitrusfrüchte Gewebe; Muster 2 und 3 sind Gewebeproben Clas infiziert. Diese Beispiele entsprechen gDNA 1, 2 und 3, wie in Abbildung 1zu sehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Es ist wichtig, dass alle Schritte befolgt werden, genau um optimale Versuchsbedingungen zu erreichen. Ganze Blattgewebe diente während dieser Demonstration; das Protokoll kann theoretisch jede Art von Pflanzengewebe enthalten angepasst werden. Bisher haben Forscher Vene Blattgewebe, anstatt ganze Blattgewebe genomischen DNA entzogen und ähnliche Ergebnisse¹¹erreicht. Wenn die Band das citrus FBOX -gen entsprechend nicht angezeigt wird, das Ergebnis ist ungültig, und möglicherweise eine oder mehrere der mehrere technische Fehler in der Prozedur. Häufige Fehler sind unter anderem: Verwendung von kontaminierten oder unsachgemäß sterilisierten Wasser, mikropipette Tipps oder Mikrozentrifugenröhrchen; Hinzufügen einer oder mehrerer Komponenten notwendig in der PCR Mischung oder während der genomischen DNA Extraktion fehlschlägt; nicht die richtige Thermocycler-Konditionen pflegen; Verwendung von Reagenzien oder anderen Zutaten, die nach dem Verfallsdatum; Nichtbeachtung Interkalation Hinzufügen Fleck Bromid oder eine andere DNA um die Agarosegel; electrophoresing der amplifizierten DNS bei zu hoher Spannung oder zu lang; und mit alten oder nicht ordnungsgemäß gemischt TAE Puffer, oder einfach mit Wasser statt TAE Puffer, um die Gel-Box zu füllen.

Aus früheren Untersuchungen durch ihren Erfolg auf die Identifizierung von Verbindung Liberibacter Asiaticum und Africanum wurden Primer LAA2_F und LAJ5_R ausgewählt. Diese Primer ribosomalen Untereinheit Gene RplA und RplJ, eine verstärkte 669 bp Fragment von C. nachgeben zu verstärken l. Africanum oder 703 bp Fragment von C. l. Asiaticum⁹. Primer LSS_F und LSS_R wurden für diese Probe aus der bisherigen Forschung aufgrund ihrer etablierten niedrigen falsch-negativ-Rate, Genauigkeit und Spezifität für C. gewählt. l. Asiaticum. Das LSS Grundierung Set verstärkt eine 500 bp-Sequenz in alle drei 16 s rDNA Gene c. l. Asiaticum⁶. Die FBOX-Primer wurden für den Einsatz als eine interne Amplifikationskontrolle gebaut und eine 400 bp-Sequenz gefunden in Zitruspflanzen zu verstärken. Bisherige Untersuchungen zeigen, dass FBOX wird stabil in Zitruspflanzen ausgedrückt, und einen guter Kandidat für die Verwendung als Referenz-gen machen wäre, wenn dieser Assay für RT-qPCR¹⁰Anpassung.

Dieser Test lässt sich für jede Art von Zitrusfrüchten Gewebe verwendet werden und kann für die Verwendung mit zusätzliche PCR-basierten Tests wie RT-qPCR geändert werden. Die Grenzen des Assays sind nur wenige, und die meisten sind konventionelle PCR inhärent. Diese limitierenden Faktoren sind: die Anwesenheit von Ethanol oder andere hemmenden Chemikalien in der PCR-Gemisch, das Fehlen der Quantifizierung ohne eine erweiterte Assay, die Notwendigkeit einer Thermocycler in kleineren Laboren und das Vorhandensein von DNA-Kontaminationen.

Während die Spezifität des Assays, die spezifischeren RT-qPCR-Methoden nicht direkt verglichen worden, dieser Assay eignet sich für die Forschung auf Verbindung Liberibacter Wissenschaftler und Landwirte zur diagnose von potenziell infiziert Zitrusfrüchte Bäume in ihren Bereichen, vor allem, wenn spezifischere Methoden nicht verfügbar oder kostengünstig sind. Es ist durchaus denkbar, dass einzelne Zitrus Züchter oder Forscher schnell und kostengünstig mehrere hundert Proben in ein paar Tagen assay konnte mithilfe von Mehrkanal-Pipetten mit mehreren 96-Well-Platten, ohne den Kauf einer teuren RT-qPCR Thermocycler kombiniert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen	Air Products	N/A
Mastercycler pro with control panel	Eppendorf	6321000019
1250 W Microwave	Panasonic	N/A
5424 table top centrifuge	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 digital water bath	Fisher scientific	15-462-15Q
Metal spatula	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortar and pestle	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Sterile 10 μL tips	TipOne	1161-3730
Sterile 200 μL tips	TipOne	1163-1730
Sterile 1250 μL tips	TipOne	1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit	VWR	75788-460
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acetic acid	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Stackable casting tray and combs	Carolina	213655
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectrometer basic	Eppendorf	6135000009
0.2 mL PCR tubes	Fisher scientific	AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Water, PCR grade	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018