Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Specifikke og præcise påvisning af Citrus grønnere patogen blev liberibacter spp. ved hjælp af konventionelle PCR på Citrus blad vævsprøver

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57240
* These authors contributed equally

Summary

Citrus grønnere er en særligt ødelæggende sygdom, der påvirker citrus afgrøder globalt. Præsenteres her er en simpel metode ved hjælp af PCR og genomisk DNA-ekstraktion af citrus blad væv for en nøjagtig og præcis identifikation af citrus grønnere patogen, blev liberibacter spp.

Abstract

Citrus grønnere, også kendt som huanglongbing, er en destruktiv citrus sygdom hærger citrus gårde globalt. Denne sygdom forårsager asymmetrisk gule blade mottling, vene gulfarvning, bladtab, root forfald, og i sidste ende, død den citrusfrugt. Når smittet, citrus planter har hæmmet i deres vækst og producere blomster uden for sæsonen. Disse blomster give sjældent frugt, og dem, der giver lille, bitter, uregelmæssigt formet citrus frugter der er ikke ønskeligt. Denne sygdom spredes af den asiatiske citrus psyllid, Diaphorina citri, og ved podning af inficeret citrus væv. Patogenet har en lang og variable inkubationstid inden for den citrusfrugt — undertiden år, inden der optræder symptomer. Forsøg på at kultur dette patogen in vitro- har været forgæves, muligvis på grund af lave og ujævn koncentration af patogenet inden for inficeret citrus væv, eller fordi det er svært at kopiere de miljømæssige betingelser, der fremmer vækst af patogenet. Det er meget vanskeligt at identificere sygdommen, før den har spredt sig, på grund af dens lang inkubationstid og forskernes evne til at kultur patogenet. Som et resultat, bliver sygdommen kun tilsyneladende efter pludselig ødelægge en citrus landmand hele udbyttet. Præsenteres her er en metode til præcis og specifik påvisning af citrus grønnere patogen, blev liberibacter spp. ved hjælp af en genomisk DNA udvinding kit og PCR. Denne metode er enkle, effektive, omkostningseffektive og kan tilpasses til kvantitativ analyse. Denne metode kan tilpasses til brug på alle citrus væv; Men, det er potentielt begrænset af mængden af patogenet stede i vævet. Ikke desto mindre, denne metode vil tillade citrus landmænd til at identificere inficerede citrus planter tidligere, og bremse spredningen af denne ødelæggende sygdom, før det kan yderligere spredning.

Introduction

Citrus grønnere, også kendt som huanglongbing, har forårsaget betydelige tab af citrus træer. Et repræsentativt tilfælde er Florida, hvor sygdommen er budgetteret til at forårsage en 70% reduktion i produktionen af Florida orange kasser fra 244 millioner kasser i sæsonen 1997-1998 til 70 millioner kasser fra 2016-2017 sæson1. 90% af citrus træer i Florida er over inficerede2, og det anslås, at Florida citrus industrien mister omkring 1 milliard dollars hvert år på grund af citrus sygdomme, hvori citrus grønnere spiller en stor rolle3. Citrus grønnere spredes primært af de invasive asiatiske citrus psyllid Diaphorina citri, men kan også spredes ved podning af inficeret væv. Sygdommen forårsager gulfarvning af venerne, asymmetrisk gule blade mottling, tidlig bladtab, kvist dieback, root forfald og død af anlægget. Vigtigere, medfører sygdommen citrusfrugt at producere blomster uden for sæsonen, som sjældent producerer frugt. Den frugt, der er produceret af inficerede citrus planter er umodne, grønne og bitter smag4.

Formålet med denne metode er at nøjagtigt og at identificere præcist motile bakterien blev liberibacter spp., det agens af citrus grønnere, bor i phloem inficerede citrustræer5. Genomisk DNA er udvundet fra hele blade væv, som indeholder de levende bakterier. Denne udpakkede genomisk DNA bruges som skabelon for konventionelle PCR, hvor oligonukleotider supplerer den bakterie 16S rDNA sekvens er brugt til at forstærke denne sekvens. Oligonukleotider supplerer en citrus FBOX gen anvendes som en indre forstærkning kontrol. Vi har valgt at bruge denne metode, fordi det har vist sig for at være vellykket i tidligere forskning6.

Denne metode har den klare fordel, at enkel, relativt billig og kan udføres i et normalt udstyret biokemi laboratorium. Derudover forbliver PCR den mest nøjagtige og præcise metode til påvisning af dette patogen, på grund af vanskeligheden ved dyrkning af dette patogen7og patogenets evne til at overleve og reproducere i år inden for en asymptomatisk vært8. Mange forskellige speciale PCR assays har været vant til med succes afsløre dette patogen; konventionelle PCR forbliver dog den enkleste assay for præcis og specifik påvisning, især inden for asymptomatiske værter8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolér genomisk DNA fra plantevæv ved hjælp af en genomisk udvinding Kit

  1. Få citrus blad væv ved at skære en hel frisk blad fra et citrus træ ved hjælp af ren saks, og placere blade i en ren plast sandwich taske.
    Bemærk: Taske indeholdende blad væv bør placeres i køleskab 4 ° C eller på is i en isoleret container hurtigst muligt efter samling at undgå fordærv.
  2. Tilføje en lille mængde af flydende kvælstof til køling et morter og støder. Mens de er køling, bruge saks til at skære et lille stykke af blad væv, ca 1 kvadrattomme i størrelse. Sted den skære væv i mørtel at straks fryse den. Tilføje mere flydende kvælstof, hvis det er nødvendigt.
    Bemærk: Isolerede handsker skal altid bæres mens håndtering af flydende kvælstof.
  3. Hurtigt slibe plantevæv til et fint pulver ved hjælp af mørtel. Fortsætte slibning indtil den flydende nitrogen fordamper helt, og et fint grønt pulver fortsat.
  4. Kort chill en metal spatel i flydende nitrogen for 10-15 s, så scoop jorden væv inde i mørtlen ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør, ved hjælp af en spatel.
  5. Tilføje 600 µL af kerner Lysis løsning (Se Tabel af materialer) ved hjælp af en 1000 µL afpipetteres og vortex prøve for 1-3 s, derefter inkuberes i vandbad 65 ° C i 15 min.
  6. Tilføje 3 µL af RNase løsning til en lysate med en 10 µl pipette, invertere tube 2 - 5 gange til at blande det, og der inkuberes ved 37 ° C i et kabinet inkubator for 15 min.
    Bemærk: Lad blandingen afkøle til stuetemperatur, før du fortsætter.
  7. Tilføje 200 µL af Protein nedbør løsning, vortex på høj hastighed til 20 s, derefter centrifugeres i 3 min på 13.000 x g til at danne en fast pellet. Mens prøven der centrifugeres, tilføjes en frisk 1,5 mL microcentrifuge tube 600 µL stuetemperatur isopropanol.
  8. Ved hjælp af en 1000 µL pipette, Fjern forsigtigt supernatanten fra centrifugeret prøven, overføre den til den friske 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende isopropanol. Pellet kan nu blive kasseret.
    Bemærk: Undgå at forurene supernatanten med protein ved at efterlade en minimal mængde af supernatanten ovenfor pelleten.
  9. Vend røret indtil DNA bliver synlig som en masse af tråd-lignende tråde, derefter centrifugeres ved 13.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur.
  10. Den dekanteres, tilføje 600 µL af 70% ethanol til pellet, vend røret flere gange at vaske DNA, og der centrifugeres ved 13.000 x g i 1 minut.
  11. Omhyggeligt Aspirér ethanol, forlader løs DNA pellet, derefter åbne og vend røret, hvilende på absorberende papir. Air tørt ved stuetemperatur i 15 min.
  12. Tilføje 100 µL DNA rehydrering løsning til den tørrede DNA pellet, derefter inkuberes DNA i vandbad 65 ° C i 1 time, mens blanding med jævne mellemrum ved at trykke på røret.
  13. Placer 1 µL af renset vand på en microcuvette, og indsætte det i et spektrofotometer skal bruges som en tom. Beregne koncentrationen af DNA nuværende ved at placere 1 µL af prøven på microcuvette, og indsætte i spektrofotometret. DNA koncentration (ng/µL) kan blive beregnet som (en260- en320) × fortynding faktor × 50 ng/µL.
    Bemærk: Protokollen kan pause her. Prøven kan opbevares ved 4 ° C.

2. udføre PCR på genomisk DNA-prøver

  1. Kombiner 10 µL 2 x PCR Master Mix (Se tabel over materialer), 1 µL fremad primer (10 pM/µL), 1 µL reverse primer (10 pM/µL) (Se tabel 2 for primer sekvenser), 100 ng af genomisk DNA ekstraheret fra prøven, og renset vand (op til 20 µL endelige rumfang) i en 50 µL PCR rør, svirp til at blande og kortvarigt centrifuge.
  2. Sæt PCR-rør i thermocycler og løber i overensstemmelse hermed (Se tabel 1).
    Bemærk: Protokollen kan pause her. Hvis det er nødvendigt, gemme prøve ved 4 ° C efter reaktionen er færdig.

3. electrophorese det amplificerede DNA i en agarosegel

  1. Vejer 0,4 g Agarosen pulver og føje det sammen med 1 x TAE buffer til en ren 200 mL Erlenmeyerkolbe, fylde op til 50 mL.
  2. Mikrobølgeovn på high for 1,5 min, ryster hver 30 s, indtil Agarosen er fuldstændigt opløst.
    Bemærk: Isolerede handsker skal bæres under håndtering flydende Agarosen at undgå forbrændinger.
  3. Tilføje 2,5 µL af 10 mg/mL ethidiumbromid til flydende Agarosen og ryst til at blande, så hæld den flydende agarosegel i et niveau gel støber. Hurtigt indsætte standard 12-tand gel kamme efter at hælde.
  4. Tillad gel til at afkøle i 20 min. ved stuetemperatur, derefter fjerne gel kamme, og placere gelen i et niveau gel kasse fyldt med 1 x TAE buffer.
  5. Med en mikropipette, indlæse de samlede amplificerede DNA-prøver i brønde. Tilsæt 5 µL DNA stigen (Se Tabel af materialer) i et særskilt godt fra dine prøver.
  6. Electrophorese prøver for 35 min. ved en konstant 90 V, og derefter fjerne gel og placere i en UV transilluminator.
  7. Fotografere og analysere gel banding mønster mens du bruger UV ved gennemlysning på 302 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et positivt resultat giver et særskilt band svarende til 500 bp blev Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, og/eller et særskilt band svarende til 700 bp for Laa2/Laj5, et indstik i 16S ribosomale β operon9. Interne forstærkning kontrol band skal også vises på 400 bp. Dette bånd svarer til forstærkning af citrus FBOX gen10, og skal vises for et resultat skal anses for gyldigt (figur 1 og figur 2). Mangel på begge 500 bp og 700 bp bands mens en 400 bp band findes repræsenterer et negativt resultat. Udfører PCR på sund prøver kan give nogle uspecifikke banding mønstre omkring 700 bp og 400 bp; dog angiver kun et enkelt fed band svarende til disse Molekylær vægte et positivt resultat (figur 1).

Operation Temp. Tid Cykler
Indledende denaturering 95 ° C 3 - 5 min 1
Denaturering 95 ° C 30 sek 35
Udglødning 55 ° C 30 sek
Brudforlængelse 72 ° C 40 sek.
Endelige brudforlængelse 72 ° C 10 min 1

Tabel 1. Thermocycler indstillinger bruges til at forstærke target 16S rDNA gener og citrus FBOX.

Navnet på Primer Sekvens Reference
LAA2_F 5'-TAT AAA GGT TGA FTT TTC GAG TTT-3' Hocquellet, mfl., 1999
LAJ5_R 5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3' Hocquellet, mfl., 1999
FBOX_F 5'-TTG GAA ACT CTT TCG CCA CT-3' Denne analyse
FBOX_R 5'-AGC AGA FTT GGC TAT TAT ACG ACT G-3' Denne analyse
LSS_F 5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT CCG A-3' Fujikawa, mfl., 2012
LSS_R 5'-ACC CAA KAT CTA GGT AAA AAC C-3' Fujikawa, mfl., 2012

Tabel 2. Navnet på primere, deres DNA-sekvens og reference.

Figure 1
Figur 1. Analyse af konventionelle PCR resultater fra fire inficerede citrus blad vævsprøver og to heathy prøver anvendes som negative kontroller. 'gDNA' angiver en genomisk DNA-prøve ekstraheret fra citrus blad væv. Prøver gDNA 1 og gDNA 4 er fra ikke-inficerede citrus blad prøver; gDNA 2, 3, 5 og 6 er blev liberibacter asiaticum (Clas) inficeret prøver. DNA blev udtrukket som skrevet i protokollen. PCR blev udført ved hjælp af den udpakkede genomisk DNA som en skabelon, per protokol (Se tabel 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS, og FBOX henviser til primer sæt bruges (Se tabel 2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Komplet gel fotografi af tre prøver, forstærkede gDNA. Prøve 1 er sund citrus væv; prøver 2 og 3 er Clas inficeret vævsprøver. Prøverne modsvarer gDNA 1, 2 og 3, som det ses i figur 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er afgørende, at alle trin er fulgt nøjagtigt for at opnå optimal forsøgsbetingelser. Hele blade væv blev brugt under denne demonstration; protokollen kan dog ændres til teoretisk omfatter enhver form for plantevæv. Tidligere har forskere udvundet genomisk DNA fra blad vene væv, snarere end hele blade væv, og opnåede lignende resultater11. Hvis bandet svarende til citrus FBOX -genet udebliver, resultatet er ugyldig, og der kan være en eller flere af flere tekniske fejl i den operationelle fremgangsmåde. Almindelige fejl omfatter: ved hjælp af forurenet eller ukorrekt steriliseret vand, mikropipette tips eller microcentrifuge rør; ikke at tilføje en eller flere nødvendige komponenter i PCR-blandingen eller under genomisk DNA-ekstraktion; undlade at vedligeholde de korrekte thermocycler betingelser; ved hjælp af reagenser eller andre ingredienser, der er forbi deres udløbsdato; undlade at tilføje ethidium stain methylbromid eller en anden DNA at agarosegel; electrophoresing amplificerede DNA ved for høj en spænding eller for længe; og ved hjælp af gamle eller forkert blandet TAE buffer, eller blot bruge vand i stedet for TAE buffer til at udfylde boksen gel.

Primere LAA2_F og LAJ5_R blev valgt fra tidligere forskning på grund af deres succes ved at identificere blev Liberibacter asiaticum og africanum. Disse primere forstærke ribosomale subunit gener rplA og rplJ, giver en forstærket 669 bp fragment fra C. l. africanum eller en 703 bp fragment fra C. l. asiaticum9. Primere, LSS_F og LSS_R blev valgt til dette assay fra tidligere forskning på grund af deres etablerede lav falsk negativ sats, nøjagtigheden og specificitet for C. l. asiaticum. LSS primer sæt forstærker en 500 bp sekvens i alle tre 16S rDNA gener i C. l. asiaticum6. FBOX primere var konstrueret til brug som en indre forstærkning kontrol og forstærke en 400 bp sekvens findes i citrus planter. Tidligere forskning viser, at FBOX er stabilt udtrykt i citrus planter, og ville gøre en stor kandidat til brug som en reference gen når tilpasses dette assay for RT-qPCR10.

Denne analyse kan tilpasses til enhver type af citrus væv og kan blive modificeret til brug med yderligere PCR-baserede analyser, som RT-qPCR. Begrænsningerne i denne analyse er få, og de fleste er uløseligt forbundet med konventionelle PCR. Disse begrænsende faktorer omfatter: tilstedeværelsen af ethanol eller andre hæmmende kemikalier i PCR-blandingen, manglen på kvantitering uden at udføre en mere avanceret analyse, behovet for en thermocycler i mindre labs, og tilstedeværelsen af DNA forurening.

Mens specificiteten af denne analyse ikke er blevet direkte sammenlignet med de mere specifikke metoder, RT-qPCR, denne analyse er nyttig for forskere, der udfører forskning på blev liberibacter, og landmænd søger at diagnosticere potentielt inficeret citrus træer i deres områder, især hvis mere specifikke metoder ikke er tilgængelige eller omkostningseffektivt. Det er tænkeligt, at en enkelt citrus tobaksavleren eller forsker kan hurtigt og billigt assay adskillige hundrede prøver i et par dage, ved hjælp af multikanals pipetter kombineret med flere 96-brønd plader, uden at købe et dyrt RT-qPCR thermocycler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu og Zheng Qing Fu erklære nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Konceptualisering, H.C. og Z. Q. F.; Undersøgelsen, H. C., J. C og Z. Q. F; Ressourcer, Z. Q. F.; Skrive - oprindelige udkast, I. A. P.; Skrivning – revision & redigering, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. og Z. Q. F.; Visualisering, H. C.; Tilsyn, Z. Q. F.; Finansiering erhvervelse, Z. Q. F og F. Q. L.

Projektet støttes af South Carolina forbedre lærer kvalitet videregående uddannelse staten tilskud med titlen, øge midterste kvaliteter Science Teachers' viden af plante processer, strukturer og funktioner gennem Engagement i anlægget Sciences Research (Plant Videnskab)

Midlerne uddeles af den Forenede fratrak Department of Education (CFDA-nummer 84.367B)

Forfatterne vil gerne takke Dr. Nian Wang af University of Florida for at levere genomisk DNA-prøver fra inficeret Citrus sinensis Valencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen Air Products N/A
Mastercycler pro with control panel Eppendorf 6321000019
1250 W Microwave Panasonic N/A
5424 table top centrifuge Eppendorf 05-403-93
Isotemp 215 digital water bath Fisher scientific 15-462-15Q
Metal spatula Sigma-Aldrich Z283274
Mortar and pestle Sigma-Aldrich Z247464
LSE Vortex Mixer Corning 6775
2-propanol Sigma-Aldrich I9516
Sterile 10 μL tips TipOne 1161-3730
Sterile 200 μL tips TipOne 1163-1730
Sterile 1250 μL tips TipOne 1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit VWR 75788-460
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510
Agarose IBI Scientific IB70041
EDTA Thermo Fisher Scientific 17892
Acetic acid Fisher Chemical A38-212
Tris base Sigma-Aldrich 10708976001
μcuvette Eppendorf 6138000018
Stackable casting tray and combs Carolina 213655
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Mini-Sub Cell GT System Bio-Rad 1704487EDU
Biospectrometer basic Eppendorf 6135000009
0.2 mL PCR tubes Fisher scientific AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3439
2X Taq Green PCR Master Mix Promega M7122
Forward Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Reverse Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Water, PCR grade Sigma-Aldrich 3315953001
Gel Doc XR+ Bio-Rad 1708195
1 KB+ DNA ladder Thermo Fisher Scientific 10787018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
  4. UICEP. Pathology. , (2013).
  5. Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
  6. Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
  7. Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
  8. Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
  9. Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
  10. Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
  11. Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).

Tags

Miljøvidenskab sag 136 Citrus Citrus grønnere Huanglongbing blev liberibacter PCR Psyllid
Specifikke og præcise påvisning af Citrus grønnere patogen <em>blev liberibacter</em> spp. ved hjælp af konventionelle PCR på Citrus blad vævsprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J.,More

Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J., Chang, M., Thompson, S. L., Liu, F., Fu, Z. Q. Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples. J. Vis. Exp. (136), e57240, doi:10.3791/57240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter