Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp.

Summary

Citrus Greening est une maladie particulièrement destructeur qui affectent les cultures agrumes dans le monde. Présenté ici est une méthode simple à l’aide de PCR et l’extraction d’ADN génomique du tissu foliaire agrumes pour l’identification exacte et précise de l’agent pathogène citrus greening, Candidatus liberibacter spp.

Abstract

Citrus greening, également connu sous le nom de huanglongbing, est une maladie agrume destructeur ravage fermes agrumes dans le monde. Cette maladie provoque la feuille jaune asymétrique marbrures, jaunissement de la veine, défoliation, pourriture de la racine et en fin de compte, la mort de la plante agrume. Lorsque infecté, les agrumes ont un retard de croissance et produisent des fleurs hors saison. Ces fleurs donnent rarement des fruits, et ceux qui donneront agrumes petit, amer, de forme irrégulière qui ne sont pas souhaitables. Cette maladie se propage par le psylle agrume asiatique, Diaphorina citri et par la greffe de tissus agrumes infectés. L’agent pathogène a une incubation longue et variable au sein de l’usine agrume — parfois années, avant l’apparaissent des symptômes. Tentatives de culture ce pathogène in vitro n’ont pas réussis, peut-être en raison de la faible et inégale concentration de l’agent pathogène dans les infectés tissu agrume, ou parce qu’il est difficile de reproduire l’environnement conditions propice à la croissance de l’agent pathogène. Il est très difficile d’identifier la maladie avant elle s’est répandue, en raison de sa longue période d’incubation et l’incapacité des chercheurs à la culture de l’agent pathogène. En conséquence, la maladie ne devient apparente après avoir détruit soudainement rendement entier d’agrumes de l’agriculteur. Présenté ici est une méthode pour la détection précise et spécifique de l’agent pathogène citrus greening, Candidatus liberibacter spp., à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique et de la PCR. Cette méthode est simple, efficace, rentable et adaptable pour l’analyse quantitative. Cette méthode peut être adaptée pour une utilisation sur n’importe quel tissu agrume ; Toutefois, il est potentiellement limitée par la quantité d’agents pathogènes présents dans les tissus. Néanmoins, cette méthode permettra d’agrumes aux agriculteurs d’identifier plus tôt les agrumes infectés et freiner la propagation de cette maladie destructrice avant elle peut se propager plus loin.

Introduction

Citrus greening, également connu sous le nom de huanglongbing, a causé une perte importante de citronniers. Un cas représentatif est en Floride, où la maladie est prévue pour causer une réduction de 70 % dans la production de boîtes de Florida orange de 244 millions de boîtes dans la saison 1997-1998 à 70 millions de boîtes à partir de la saison 2016-2017¹. Plus de 90 % des agrumes en Floride sont infectés², et on estime que l’industrie des agrume Floride perd environ 1 milliard de dollars chaque année en raison de maladies agrumes, dans lequel les citrus greening joue un rôle de premier plan³. Citrus greening se propage principalement par l’envahissant psylle agrume asiatique Diaphorina citri, mais peut également se propager par la greffe de tissus infectés. La maladie provoque le jaunissement des nervures, feuille jaune asymétrique marbrures, défoliation prématurée, brindille dépérissement, pourriture de la racine et mort de la plante. Ce qui est important, la maladie provoque la plante agrume à produire des fleurs hors saison, qui produisent rarement des fruits. Le fruit qui est produit par les plantes agrumes infectés est immatures, vert et amer dégustation⁴.

Le but de cette méthode est à avec précision et identifier précisément la bactérie motile Candidatus liberibacter spp., l’agent causal de citrus greening, vivant dans le phloème d’arbres agrumes infectés⁵. L’ADN génomique est extraite des tissus des feuilles entières, qui contient des bactéries vivantes. Cet extrait d’ADN génomique est utilisé comme modèle pour la PCR classique, où des oligonucléotides complémentaires à la séquence de l’ADNr 16 s de la bactérie sont utilisées pour amplifier cette séquence. Des oligonucléotides complémentaires à un gène FBOX agrume sont utilisés comme un témoin d’amplification interne. Nous avons choisi d’utiliser cette méthode, car il a été prouvé pour réussir dans la recherche précédente⁶.

Cette méthode a l’avantage d’être simple, relativement peu coûteux et apte à être jouée dans n’importe quel laboratoire de biochimie normalement équipée. En outre, la PCR reste la méthode plus précise et exacte pour la détection de ce pathogène, en raison de la difficulté de cultiver ce pathogène⁷et la capacité de l’agent pathogène pour survivre et se reproduire pendant des années au sein d’un hôte asymptomatiques⁸. Nombreux essais PCR de spécialité différents ont été utilisés pour détecter avec succès ce pathogène ; Cependant, PCR classique reste le plus simple test pour la détection précise et spécifique, en particulier dans les hôtes asymptomatiques⁸.

Protocol

1. isoler l’ADN génomique du tissu végétal à l’aide d’un Kit d’Extraction génomique

1. Obtenir des tissus foliaires agrumes en coupant une toute nouvelle feuille d’un arbre d’agrume à l’aide de ciseaux propres et placer la feuille dans un sac à sandwich en plastique.
   Remarque : Le sac contenant les tissus foliaires doit être placé dans un réfrigérateur à 4 ° C ou sur la glace dans un contenant isotherme dès que possible après le prélèvement pour éviter la détérioration.
2. Ajouter une petite quantité d’azote liquide pour refroidir un mortier et un pilon. Alors qu’ils sont froid, utiliser des ciseaux pour découper un petit morceau de tissus foliaires, environ 1 pouce carré en taille. Placez le tissu coupé dans le mortier de le figer instantanément. Ajouter plus d’azote liquide, si nécessaire.
   Remarque : Des gants doivent toujours être portées lors de la manipulation de l’azote liquide.
3. Rectifier rapidement les tissus végétaux en une fine poudre à l’aide de mortier. Continuer de meulage jusqu'à ce que l’azote liquide s’évapore complètement, et reste une fine poudre verte.
4. Brièvement refroidir une spatule métallique dans l’azote liquide pour 10-15 s, puis verser le tissu fondamental dans le mortier dans un tube de microtubes de 1,5 mL, à l’aide de la spatule.
5. Ajouter 600 µL de Solution de lyse des noyaux (voir Table des matières) en utilisant un 1000 µL pipette et vortex l’échantillon pour 1-3 s, puis incuber dans un bain-marie à 65 ° C pendant 15 min.
6. Ajouter 3 µL de Solution de RNase au lysat en utilisant une pipette de 10µL, inverser le tube 2 - 5 fois pour mélanger et laisser incuber à 37 ° C dans une étuve armoire pendant 15 min.
   Remarque : Laissez le mélange refroidir à température ambiante avant de procéder.
7. Ajouter 200 µL de Solution de précipitation de protéine, vortex à haute vitesse pendant 20 s, puis centrifuger pendant 3 min à 13 000 x g pour former une boulette de la ferme. Alors que l’échantillon est être centrifugé, ajouter 600 µL d’isopropanol de température ambiante à un tube de microcentrifuge frais de 1,5 mL.
8. À l’aide d’une pipette de 1000 µL, retirer délicatement le surnageant de l’échantillon centrifugé, transférant dans le tube de microcentrifuge de frais 1,5 mL contenant l’isopropanol. Le plomb peut maintenant être jeté.
   NOTE : Éviter la contamination du surnageant avec protéines en laissant une quantité minuscule de surnageant au-dessus du culot.
9. Inverser le tube jusqu'à ce que l’ADN devient visible comme une masse de brins filiformes, puis centrifuger à 13 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
10. Décanter le liquide surnageant, ajouter 600 µL d’éthanol à 70 % au culot, inverser le tube plusieurs fois pour laver l’ADN et centrifuger à 13 000 x g pendant 1 min.
11. Aspirer l’éthanol, laissant le granule d’ADN lâche, puis ouvrir et inverser le tube, reposant sur du papier absorbant. Sécher à l’air à température ambiante pendant 15 min.
12. Ajouter 100 µL de Solution de réhydratation d’ADN au culot ADN séché, puis incuber l’ADN dans un bain d’eau de 65 ° C pendant 1 h, tout en mélangeant régulièrement, en tapant sur le tube.
13. Déposer sur une cuvette 1 µL d’eau purifiée et l’insérer dans un spectrophotomètre à utiliser comme un blanc. Calculer la concentration d’ADN présent en plaçant 1 µL de l’échantillon sur la cuvette et en insérant dans le spectrophotomètre. Concentration d’ADN (ng/µL) peut être calculé comme (un₂₆₀- un₃₂₀) × facteur de dilution × 50 ng/µL.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. L’échantillon peut être conservée à 4 ° C.

2. effectuer la PCR sur des échantillons d’ADN génomique

1. Combiner les 10 µL 2 x PCR Master Mix (voir Table des matières), 1 µL avant l’apprêt (10 pM/µL), 1 µL reverse primer (10 pM/µL) (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorces), 100 ng d’ADN génomique extrait de l’échantillon et purifié l’eau (volume final de jusqu'à 20 µL) dans un 50 µL PCR tube, flick pour mélanger et brièvement centrifugeuse.
2. Insérez le tube de la PCR dans le thermocycleur et dirigent en conséquence (voir tableau 1).
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Si nécessaire, stocker l’échantillon à 4 ° C après que la réaction est terminée.

3. electrophorese de l’amplification de l’ADN dans un Gel d’Agarose

1. Peser la poudre de 0,4 g d’agarose et ajoutez-le ainsi que 1 x TAE tampon dans un 200 mL fiole d’Erlenmeyer, remplissage à 50 mL.
2. Micro-ondes à température élevée pendant 1,5 min, secouant toutes les 30 s, jusqu'à ce que le gel d’agarose est entièrement dissous.
   NOTE : Des gants doivent être portés pendant la manutention des liquides d’agarose pour éviter les brûlures.
3. Ajouter 2,5 µL de bromure d’éthidium 10 mg/mL pour les liquides d’agarose et secouez pour mélanger, puis verser le gel d’agarose liquide dans un moule de gel de niveau. Insérer rapidement des peignes standard 12 dents gel après coulée.
4. Laisser le refroidir pendant 20 min à température ambiante, puis enlever le gel de peignes et placer le gel dans une boîte de gel niveau remplie avec 1 tampon x TAE.
5. À l’aide d’une micropipette, charger les échantillons d’ADN amplifiés totales dans le puits. Ajouter 5 µL de l’ADN d’échelle (voir Table des matières) dans un endroit bien distinct de vos échantillons.
6. ELECTROPHORESE des échantillons pour 35 min à une température constante de 90 V, puis retirer le gel et les placer dans un Transilluminateur UV.
7. Photographier et d’analyser le gel des bandes modèle tout en utilisant la transillumination UV à 302 nm.

Representative Results

Un résultat positif donne une bande distincte correspondant à 500 bp pour Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, et/ou une bande distincte correspondant à 700 bp pour Laa2/Laj5, un encart dans le β ribosomique 16 s opéron⁹. La bande de contrôle de l’amplification interne doit également apparaître à 400 bp. Cette bande correspond à l’amplification du gène FBOX agrumes¹⁰et doit apparaître pour un résultat soit considérée valide (Figure 1 et Figure 2). Manque les deux 500 bp et 700 bandes bp alors qu’une bande de bp 400 représente un résultat négatif. Effectuant des PCR sur des échantillons sains peut-être donner certains profils de bandes non spécifiques autour de 700 bp et 400 bp ; Cependant, qu’une seule bande "BOLD" correspondant à ces poids moléculaire indique un résultat positif (Figure 1).

Opération	Temp.	Temps	Cycles
Dénaturation initiale	95 ° C	3 - 5 min	1
Dénaturation	95 ° C	30sec	35
Recuit	55 ° C	30sec
Élongation	72 ° C	40sec
Élongation finale	72 ° C	10 min	1

Le tableau 1. Thermocycleur paramètres utilisés pour amplifier la cible 16 s rDNA gènes et FBOX agrume.

Nom d’apprêt	Séquence		Référence
LAA2_F	5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC GAG TTT-3'		Hocquellet, et al., 1999
LAJ5_R	5'-ACA AAA GAA GCA ATA GCA CGA ACA A-3'		Hocquellet, et al., 1999
FBOX_F	5'-TTG GAA LOI CTT TCG CCA CT-3'		Ce dosage
FBOX_R	5'-AGC AGA TDC GGC TAT TAT NOC LOI G-3'		Ce dosage
LSS_F	5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT GCC A-3'		Fujikawa, et al., 2012
LSS_R	5'-ACC CAA CAT CTA GGT AAA AAC C-3'		Fujikawa, et al., 2012

Le tableau 2. Nom des apprêts, leur séquence d’ADN et la référence.

Figure 1. Analyse de PCR classique résulte de quatre échantillons de tissus foliaires agrumes infectés et deux échantillons de heathy utilisés comme témoins négatifs. « gDNA » indique un échantillon d’ADN génomique extraite des tissus foliaires agrumes. Échantillons ADNg 1 et ADNg 4 proviennent les échantillons de feuilles agrumes infectés ; gDNA 2, 3, 5 et 6 sont Candidatus liberibacter asiaticum (Clas) infectés par échantillons. L’ADN est extrait comme écrit dans le protocole. PCR a été réalisée à l’aide de l’ADN génomique extrait comme un modèle, par le protocole (voir tableau 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS et FBOX désignent les amorces utilisées (voir tableau 2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Photographie de gel complet des trois échantillons ADNg amplifié. Échantillon 1 est des tissus sains agrumes ; exemples 2 et 3 sont Clas infectés des échantillons de tissus. Ces échantillons correspondent aux ADNg 1, 2 et 3, comme on le voit à la Figure 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Il est essentiel que toutes les étapes sont suivies exactement pour obtenir les meilleures conditions expérimentales. Feuilles entières a été utilisé au cours de cette manifestation ; Toutefois, le protocole peut être modifié pour inclure théoriquement n’importe quel type de tissus végétaux. Auparavant, les chercheurs ont extrait l’ADN génomique de veine les tissus foliaires, plutôt que des tissus de feuilles entières et obtenu des résultats similaires¹¹. Si la bande correspondant au gène FBOX agrume ne comparaît pas, le résultat n’est pas valide, et il peut y avoir un ou plusieurs de plusieurs erreurs techniques dans le mode opératoire. Les erreurs communes incluent : à l’aide de l’eau contaminée ou mal stérilisé, conseils de micropipette ou tubes de microcentrifuge ; ne pas ajouter un ou plusieurs composants nécessaires dans le mélange PCR ou au cours de l’extraction de l’ADN génomique ; avoir omis de maintenir les conditions thermocycleur appropriée ; à l’aide de réactifs ou autres ingrédients qui ont dépassé leur date de péremption ; ne pas ajouter d’éthidium bromure ou un autre ADN tache au gel d’agarose ; electrophoresing de l’ADN amplifié à une tension trop haute ou trop longtemps ; et à l’aide du tampon TAE vieux ou incorrectement mélangée, ou simplement l’eau au lieu de tampon TAE pour remplir la boîte de gel.

Amorces LAA2_F et LAJ5_R ont été choisis parmi des recherches antérieures en raison de leur succès à identifier africanum et Candidatus Liberibacter asiaticum. Ces amorces amplifient la sous-unité ribosomique gènes APIL et rplJ, ce qui donne un fragment amplifié de bp 669 C. l. africanum ou un fragment de bp 703 de C. l. asiaticum⁹. Amorces LSS_F et LSS_R ont été choisies pour ce dosage dans des recherches antérieures en raison de leur taux négatif faux établi à faible, la précision et la spécificité pour C. l. asiaticum. Les amorces LSS amplifie une séquence bp 500 dans les trois 16 s rDNA gènes présents dans C. l. asiaticum⁶. Les amorces FBOX ont été construits pour l’usage comme un témoin d’amplification interne et amplifient une séquence bp 400 présentes dans les plantes agrumes. Des recherches antérieures montrent que FBOX est stablement exprimée en agrumes et ferait un candidat idéal pour une utilisation comme un gène de référence lors de l’adaptation de ce dosage pour RT-qPCR¹⁰.

Ce dosage peut être adapté pour être utilisé pour n’importe quel type de tissu agrume et peut être modifié pour une utilisation avec des analyses basées sur la PCR supplémentaires, comme la RT-qPCR. Les limites de cet essai sont rares et la plupart sont inhérente à la PCR classique. Ces facteurs limitatifs comprennent : la présence d’éthanol ou autres produits chimiques inhibiteurs dans le mélange de la PCR, l’absence de quantification sans effectuer un dosage plus avancé, la nécessité d’un thermocycleur dans les laboratoires de la plus petites et la présence d’ADN contaminant.

Alors que la spécificité de ce test n’a pas été directement comparée à des méthodes plus spécifiques de la RT-qPCR, ce dosage est utile pour les chercheurs effectuant des recherches sur Candidatus liberibacter et agriculteurs cherchant à diagnostiquer potentiellement infecté agrumes arbres dans leurs domaines, en particulier si des méthodes plus spécifiques ne sont pas disponibles ou rentable. En effet, il est concevable qu’un seul producteur agrume / chercheur pourrait rapidement et à moindre coût d’analyse plusieurs centaines d’échantillons dans quelques jours, à l’aide de pipettes multicanaux combinées avec plusieurs plaques à 96 puits, sans acheter un thermocycleur RT-qPCR cher.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen	Air Products	N/A
Mastercycler pro with control panel	Eppendorf	6321000019
1250 W Microwave	Panasonic	N/A
5424 table top centrifuge	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 digital water bath	Fisher scientific	15-462-15Q
Metal spatula	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortar and pestle	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Sterile 10 μL tips	TipOne	1161-3730
Sterile 200 μL tips	TipOne	1163-1730
Sterile 1250 μL tips	TipOne	1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit	VWR	75788-460
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acetic acid	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Stackable casting tray and combs	Carolina	213655
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectrometer basic	Eppendorf	6135000009
0.2 mL PCR tubes	Fisher scientific	AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Water, PCR grade	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018