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नींबू के विशिष्ट और सटीक का पता लगाने हरियाली रोगज़नक़ कैंडिडेटस liberibacter एसपीपी. खट्टे पत्ती ऊतक के नमूनों पर पारंपरिक पीसीआर का प्रयोग

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57240
* These authors contributed equally

Summary

खट्टे हरियाली एक विशेष रूप से विनाशकारी खट्टे फसलों विश्व स्तर पर प्रभावित रोग है । यहां प्रस्तुत है एक सरल विधि का उपयोग कर पीसीआर और खट्टे पत्ती ऊतक के जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण खट्टे हरियाली रोगज़नक़, कैंडिडेटस liberibacter एसपीपी की सटीक और सटीक पहचान के लिए ।

Abstract

नींबू हरियाली, huanglongbing के रूप में भी जाना जाता है, एक विनाशकारी खट्टे खट्टे खेतों दुनिया भर में तबाह रोग है । इस रोग विषम पीले पत्ते mottling, नस तेजाब, पत्तियों, जड़ क्षय, और अंत में, खट्टे संयंत्र की मौत का कारण बनता है । जब संक्रमित, खट्टे पौधों विकास अवरुद्ध है और फूलों के मौसम से बाहर का उत्पादन । ये फूल शायद ही कभी फल उपज, और उन है कि छोटे, कड़वा, अनियमित आकार खट्टे फल है कि वांछनीय नहीं है उपज है । यह रोग एशियाई खट्टे psyllid, Diaphorina सिट्री, और संक्रमित खट्टे ऊतक के भ्रष्टाचार के द्वारा फैला हुआ है । रोगज़नक़ खट्टे संयंत्र के भीतर एक लंबी और परिवर्तनशील गर्मी की अवधि है-कभी साल, इससे पहले कि लक्षण दिखाई देते हैं । संस्कृति के लिए प्रयास इन विट्रो में इस रोगज़नक़ असफल हो गया है, संभवतः संक्रमित खट्टे ऊतक के भीतर रोगज़नक़ की कम और असमान एकाग्रता के कारण, या क्योंकि यह पर्यावरण की वृद्धि के लिए अनुकूल परिस्थितियों को दोहराने के लिए मुश्किल है रोगज़नक़ । यह बहुत ही बीमारी की पहचान करने से पहले यह फैल गया है मुश्किल है, अपनी लंबी गर्मी की अवधि के कारण और ' शोधकर्ताओं ने संस्कृति के लिए अक्षमता रोगज़नक़ । एक परिणाम के रूप में, रोग ही स्पष्ट हो जाता है के बाद अचानक एक खट्टे किसान पूरी उपज को नष्ट । यहां प्रस्तुत खट्टे हरियाली रोगज़नक़ का सही और विशिष्ट पता लगाने के लिए एक विधि है, कैंडिडेटस liberibacter एसपीपी. एक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट और पीसीआर का उपयोग करना । इस विधि सरल, कुशल लागत प्रभावी है, और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय । इस विधि किसी भी खट्टे ऊतक पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता; हालांकि, यह संभवतः ऊतक में मौजूद रोगज़नक़ की मात्रा तक सीमित है । फिर भी, इस विधि खट्टे किसानों को पहले संक्रमित खट्टे पौधों की पहचान करने की अनुमति होगी, और इस विनाशकारी रोग के प्रसार पर अंकुश लगाने से पहले यह आगे फैल सकता है ।

Introduction

नींबू हरियाली, huanglongbing के रूप में भी जाना जाता है, खट्टे पेड़ों की एक महत्वपूर्ण नुकसान हुआ है । एक प्रतिनिधि प्रकरण फ्लोरिडा, जहां रोग के लिए २४४,०००,००० बक्से से फ्लोरिडा ऑरेंज बक्से के उत्पादन में ७०% की कमी के कारण पूर्वानुमानित है १९९७-१९९८ सीजन में ७०,०००,००० बक्से के रूप में २०१६-२०१७ सीजन1। फ्लोरिडा में खट्टे पेड़ों की ९०% से अधिक2संक्रमित हैं, और यह अनुमान है कि फ्लोरिडा खट्टे उद्योग के बारे में १,०००,०००,००० डॉलर हर साल खट्टे रोगों के कारण खो देता है, जिसमें खट्टे हरियाली एक प्रमुख भूमिका निभाता है3। नींबू हरियाली आक्रामक एशियाई खट्टे psyllid Diaphorina सिट्री द्वारा मुख्य रूप से फैला है, लेकिन यह भी संक्रमित ऊतक के भ्रष्टाचार के द्वारा फैलता जा सकता है रोग नसों के तेजाब का कारण बनता है, विषम पीले पत्ते mottling, समय से पहले पत्तियों, टहनी शीर्षारंभी क्षय, जड़ क्षय, और पौधों की मृत्यु । महत्वपूर्ण बात, रोग खट्टे संयंत्र मौसम, जो शायद ही कभी फल का उत्पादन से बाहर फूलों का उत्पादन करने का कारण बनता है । फल है कि संक्रमित खट्टे पौधों द्वारा उत्पादित है अपरिपक्व, हरे, और कड़वा चखने4हैं ।

इस विधि का उद्देश्य सही है और ठीक करने के लिए गतिशील जीवाणु कैंडिडेटस liberibacter एसपीपी., खट्टे हरियाली के प्रेरणा का एजेंट, संक्रमित खट्टे पेड़5के फ्लोएम के भीतर रहने की पहचान है । जीनोमिक डीएनए पूरी पत्ती ऊतक है, जो जीवित बैक्टीरिया शामिल से निकाला जाता है । इस निकाली जीनोमिक डीएनए पारंपरिक पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है, जहां oligonucleotides जीवाणु 16S rDNA अनुक्रम के पूरक इस अनुक्रम बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है. Oligonucleotides एक खट्टे FBOX जीन के पूरक एक आंतरिक प्रवर्धन नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । हम इस पद्धति का उपयोग करें, क्योंकि यह पिछले अनुसंधान6में सफल साबित किया गया है चुना है ।

इस विधि सरल, अपेक्षाकृत सस्ती होने का स्पष्ट लाभ है, और किसी भी सामांय रूप से सुसज्जित जैव रसायन प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा करने में सक्षम । इसके अलावा, पीसीआर इस रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सबसे सटीक और सटीक तरीका है, इस रोगज़नक़ संवर्धन की कठिनाई के कारण7, और रोगज़नक़ की क्षमता जीवित है और एक स्पर्शोन्मुख मेजबान8के भीतर साल के लिए पुन: पेश करने के लिए । कई अलग विशेषता पीसीआर परख सफलतापूर्वक इस रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, पारंपरिक पीसीआर सटीक और विशिष्ट का पता लगाने के लिए सरल परख रहता है, विशेष रूप से स्पर्शोन्मुख8मेजबान के भीतर ।

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Protocol

1. अलग संयंत्र ऊतक से जीनोमिक डीएनए एक जीनोमिक निष्कर्षण किट का उपयोग

  1. साफ कैंची का उपयोग कर एक खट्टे पेड़ से एक पूरी ताजा पत्ती काटने से खट्टे पत्ती ऊतक प्राप्त करें, और एक साफ प्लास्टिक सैंडविच बैग में पत्ती जगह है ।
    नोट: पत्ती ऊतक युक्त बैग एक 4 ° c रेफ्रिजरेटर में या बर्फ पर एक अछूता कंटेनर में रखा जाना चाहिए के रूप में जल्दी से संग्रह के बाद के लिए खराबी से बचने के लिए ।
  2. तरल नाइट्रोजन की एक छोटी राशि के लिए एक मोर्टार और मूसल ठंडा जोड़ें । जब वे द्रुतशीतन हैं, का उपयोग करने के लिए बाहर पत्ती ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा काट कैंची, आकार में लगभग 1 वर्ग इंच । तुरंत इसे फ्रीज करने के लिए मोर्टार में कटौती ऊतक प्लेस । अधिक तरल नाइट्रोजन जोड़ें, अगर जरूरत है ।
    नोट: अछूता दस्ताने हमेशा जबकि तरल नाइट्रोजन हैंडलिंग पहना जाना चाहिए ।
  3. जल्दी से एक महीन पाउडर में संयंत्र ऊतक पीस मोर्टार का उपयोग कर । जब तक तरल नाइट्रोजन पूरी तरह से लुप्त हो जाता है पीसने जारी रखें, और एक ठीक हरी पाउडर रहता है ।
  4. संक्षेप में 10-15 एस के लिए तरल नाइट्रोजन में एक धातु रंग ठंडा, तो एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में मोर्टार के अंदर जमीन ऊतक स्कूप, रंग का उपयोग कर ।
  5. नाभिक Lysis समाधान के ६०० µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) एक १००० µ l पिपेट और भंवर 1-3 एस के लिए नमूना का उपयोग कर, तो 15 मिनट के लिए एक ६५ ° c पानी स्नान में मशीन ।
  6. एक 10 µ एल पिपेट का उपयोग कर lysate के लिए RNase समाधान के 3 µ एल जोड़ें, ट्यूब पलटना 2-5 बार यह मिश्रण करने के लिए, और 15 मिनट के लिए एक कैबिनेट मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    नोट: आगे बढ़ने से पहले मिश्रण कमरे के तापमान को शांत करने की अनुमति दें ।
  7. जोड़ें २०० µ एल प्रोटीन वर्षा समाधान, भंवर के 20 एस के लिए उच्च गति पर, तो 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक १३,००० एक्स जी में एक फर्म गोली फार्म । जबकि नमूना केंद्रापसारक जा रहा है, एक ताजा १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए कमरे के तापमान isopropanol के ६०० µ एल जोड़ें ।
  8. एक १००० µ एल पिपेट का प्रयोग, ध्यान से केंद्रापसारक नमूना से supernatant हटाने, यह ताजा १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब युक्त isopropanol को स्थानांतरित । गोली अब खारिज हो सकती है ।
    नोट: गोली के ऊपर supernatant की एक miniscule राशि छोड़ने के द्वारा प्रोटीन के साथ supernatant दूषित से बचें ।
  9. ट्यूब उल्टे जब तक डीएनए धागे की तरह एक बड़े पैमाने पर के रूप में दिखाई देता है-किस्में, तो १३,००० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  10. supernatant खिचड़ी भाषा, गोली को ७०% इथेनॉल के ६०० µ एल जोड़ने के लिए, ट्यूब कई बार उलटा डीएनए धोने के लिए, और 1 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  11. ध्यान से इथेनॉल महाप्राण, ढीला डीएनए गोली जा रहा है, तो खुला और ट्यूब पलटना, शोषक कागज पर टिकी । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क हवा ।
  12. डीएनए निर्जलीकरण के लिए सूखे डीएनए गोली समाधान के १०० µ एल जोड़ें, तो एक ६५ के लिए 1 ज ° c पानी स्नान में डीएनए मशीन, जबकि समय-वक्त पर ट्यूब दोहन द्वारा मिश्रण ।
  13. एक microcuvette पर शुद्ध पानी के 1 µ एल प्लेस, और यह एक spectrophotometer में डालने के लिए एक खाली के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा । microcuvette पर नमूना के 1 µ एल रखकर मौजूद डीएनए की एकाग्रता की गणना, और spectrophotometer में डालने. डीएनए एकाग्रता (एनजी/µ एल) (एक२६०-एक३२०) × कमजोर पड़ने कारक × ५० एनजी/µ एल के रूप में गणना की जा सकती है
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

2. जीनोमिक डीएनए नमूने पर पीसीआर का प्रदर्शन

  1. मिश्रण 10 µ एल 2x पीसीआर मास्टर मिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें), 1 µ एल फॉरवर्ड प्राइमर (10 pM/µ l), 1 µ एल रिवर्स प्राइमर (10 pM/µ एल) (प्राइमर दृश्यों के लिए तालिका 2 देखें), १०० जीनोमिक डीएनए के एनजी नमूने से निकाले, और शुद्ध पानी (अप करने के लिए 20 µ एल अंतिम मात्रा) में एक ५० µ एल पीसीआर ट्यूब, झटका मिश्रण करने के लिए, और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
  2. thermocycler में पीसीआर ट्यूब डालें और तदनुसार चलाने के लिए ( 1 तालिकादेखें) ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । यदि आवश्यक हो, तो प्रतिक्रिया पूर्ण होने के बाद 4 ° c पर नमूना संग्रहीत करें ।

3. एक Agarose जेल में प्रवर्धित डीएनए Electrophorese

  1. वजन ०.४ ग्राम agarose पाउडर और यह 1x ताे बफर के साथ एक साफ २०० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी, ५० मिलीलीटर के लिए भरने के साथ जोड़ें ।
  2. १.५ मिनट के लिए उच्च पर माइक्रोवेव, हर 30 एस मिलाते हुए, जब तक agarose पूरी तरह से भंग है ।
    नोट: अछूता दस्ताने जबकि तरल agarose हैंडलिंग जलता को रोकने के लिए पहना जाना चाहिए ।
  3. जोड़ें २.५ µ एल के 10 मिलीग्राम/एमएल ethidium ब्रोमाइड तरल agarose के लिए और मिश्रण करने के लिए हिला, तो एक स्तर जेल मोल्ड में तरल agarose जेल डालो । जल्दी डालने के बाद मानक 12-टूथ जेल कंघी डालने ।
  4. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए शांत करने के लिए जेल की अनुमति दें, तो जेल कंघी हटाने, और एक स्तर जेल 1x ताे बफर से भरा बॉक्स में जेल जगह है ।
  5. एक micropipette का प्रयोग, कुओं में कुल प्रवर्धित डीएनए नमूने लोड । डीएनए सीढ़ी के 5 µ एल जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) अपने नमूनों से अच्छी तरह से एक अलग में ।
  6. Electrophorese ३५ मिनट के लिए एक स्थिर ९० वी में नमूने, तो जेल और एक यूवी transilluminator में जगह हटा दें ।
  7. फोटोग्राफ और ३०२ एनएम पर यूवी transillumination का उपयोग करते हुए जेल बैंडिंग पैटर्न का विश्लेषण ।

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Representative Results

एक सकारात्मक परिणाम एक अलग बैंड इसी के लिए ५०० bp कैंडिडेटस Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, और/या Laa2 के लिए ७०० bp के लिए इसी के अनुरूप एक विशिष्ट बैंड पैदावार Laj5 के लिए 16S राइबोसोमल β ऑपरोन9. आंतरिक प्रवर्धन नियंत्रण बैंड भी ४०० बीपी पर दिखाई देना चाहिए । इस बैंड खट्टे FBOX 10जीन के प्रवर्धन से मेल खाती है, और एक परिणाम के लिए प्रकट करने के लिए मांय माना जाना चाहिए (1 चित्रा और 2 चित्रा) । दोनों ५०० बीपी और ७०० बीपी बैंड की कमी है जबकि एक ४०० बीपी बैंड मौजूद है एक नकारात्मक परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है । स्वस्थ नमूनों पर पीसीआर प्रदर्शन ७०० बीपी और ४०० बीपी के आसपास कुछ गैर विशिष्ट बैंडिंग पैटर्न उपज सकता है; हालांकि, केवल एक ही बोल्ड इन आणविक भार के अनुरूप बैंड एक सकारात्मक परिणाम इंगित करता है (चित्रा 1) ।

कार्रवाई Temp. समय चक्र
प्रारंभिक विकार ९५ ° c 3-5 मिनट 1
विकार ९५ ° c 30 सेकंड ३५
एनीलिंग ५५ ° c 30 सेकंड
बढ़ाव ७२ ° c ४० sec
अंतिम बढ़ाव ७२ ° c 10 min 1

तालिका 1. Thermocycler सेटिंग्स rDNA जीन और खट्टे FBOX 16S लक्ष्य बढ़ाना करते थे.

प्राइमरी का नाम अनुक्रम संदर्भ
LAA2_F 5 '-ताट एएए GGT TGA CCT टीटीसी ढकोसला TTT-3 ' Hocquellet, एट अल., १९९९
LAJ5_R ५ '-ऐका एएए जीसीए गाा अता जीसीए CGA ऐका ए-३ ' Hocquellet, एट अल., १९९९
FBOX_F 5 '-TTG गाा ACT CTT TCG सीसीएल सीटी-3 ' इस परख
FBOX_R ५ '-AGC आगा CCT GGC ताट ताट ACG कृत्य जी-३ ' इस परख
LSS_F 5 '-GGA ढकोसला GTG AGT GGA ATT CCG ए-3 ' Fujikawa, एट अल., २०१२
LSS_R 5 '-एसीसी CAA कैट CTA GGT एएए AAC सी-3 ' Fujikawa, एट अल., २०१२

तालिका 2. प्राइमरों के नाम, उनके डीएनए अनुक्रम, और संदर्भ

Figure 1
चित्र 1. चार संक्रमित खट्टे पत्ती ऊतक के नमूनों और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल दो हीथ नमूनों से पारंपरिक पीसीआर परिणाम का विश्लेषण । ' gDNA ' एक जीनोमिक डीएनए नमूने खट्टे पत्ती ऊतक से निकाले इंगित करता है । नमूने gDNA 1 और gDNA 4 संक्रमित खट्टे पत्ते के नमूनों से हैं; gDNA 2, 3, 5, और 6 कैंडिडेटस liberibacter asiaticum (Clas) संक्रमित नमूने हैं । डीएनए प्रोटोकॉल में लिखा के रूप में निकाला गया था । पीसीआर एक टेम्पलेट के रूप में निकाले जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, प्रोटोकॉल के अनुसार ( 1 तालिकादेखें). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS, और FBOX का उल्लेख प्राइमर सेट का इस्तेमाल किया ( 2 तालिकादेखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. तीन प्रवर्धित gDNA नमूनों की जेल फोटोग्राफ पूरा करें । नमूना 1 स्वस्थ खट्टे ऊतक है; नमूने 2 और 3 Clas संक्रमित ऊतक के नमूने हैं । ये नमूने gDNA 1, 2, और 3, के रूप में चित्र 1में देखा के अनुरूप हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह महत्वपूर्ण है कि सभी चरणों का पालन कर रहे है बिल्कुल इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों को प्राप्त करने के लिए । पूरे पत्ती ऊतक इस प्रदर्शन के दौरान इस्तेमाल किया गया था; हालांकि, प्रोटोकॉल सैद्धांतिक रूप से संयंत्र ऊतक के किसी भी प्रकार शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । पहले, शोधकर्ताओं ने पत्ती नस ऊतक से जीनोमिक डीएनए निकाला है, बल्कि पूरी पत्ती ऊतक से, और इसी तरह11परिणाम हासिल की । यदि खट्टे FBOX जीन के लिए इसी बैंड को प्रदर्शित करने में विफल रहता है, परिणाम अमांय है, और वहां एक या कई तकनीकी त्रुटियों के ऑपरेटिंग प्रक्रिया में हो सकता है । आम त्रुटियों में शामिल हैं: दूषित या गलत तरीके से निष्फल पानी का उपयोग करना, micropipette टिप्स, या microcentrifuge ट्यूबों; जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के दौरान या पीसीआर मिश्रण में आवश्यक एक या एक से अधिक घटकों को जोड़ने के लिए असफल; उचित thermocycler शर्तों को बनाए रखने में विफल; रिएजेंट या अंय सामग्री है कि उनके समय सीमा समाप्ति तिथि पिछले है का उपयोग करना; agarose जेल के लिए ethidium ब्रोमाइड या एक और डीएनए दाग जोड़ने के लिए असफल; electrophoresing भी उच्च एक वोल्टेज या बहुत लंबे समय के लिए पर परिवर्धित डीएनए; और पुराने या अनुचित रूप से मिश्रित ताे बफर का उपयोग करना, या बस के बजाय पानी का उपयोग करना ताे बफर को जेल बॉक्स भरना होता है.

प्राइमरों LAA2_F और LAJ5_R पिछले अनुसंधान से चुना गया कैंडिडेटस Liberibacter asiaticum और africanum की पहचान करने में उनकी सफलता के कारण । इन प्राइमरों बढ़ाना राइबोसोमल उपइकाई जीन rplA और rplJ, सी से एक परिवर्धित ६६९ बीपी टुकड़ा उपज एल africanum या सी से ७०३ बीपी का टुकड़ा । l. asiaticum9. प्राइमरों LSS_F और LSS_R पिछले उनके स्थापित कम झूठी नकारात्मक दर, सटीकता के कारण अनुसंधान से इस परख के लिए चुना गया है, और सी के लिए विशिष्टता एल. asiaticum. LSS प्राइमर सेट सी में मौजूद सभी तीन 16S rDNA जीन में एक ५०० बीपी अनुक्रम को प्रवर्धित करता है । l. asiaticum6. FBOX प्राइमर एक आंतरिक प्रवर्धन नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए निर्माण किया गया और एक ४०० बीपी नींबू पौधों में पाया अनुक्रम बढ़ाना । पिछले अनुसंधान से पता चलता है कि FBOX चाकू खट्टे पौधों में व्यक्त की है, और एक संदर्भ जीन के रूप में उपयोग के लिए एक महान उंमीदवार जब RT-qPCR10के लिए इस परख अनुकूल बनाना होगा ।

इस परख के लिए खट्टे ऊतक के किसी भी प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा अनुकूलित किया जा सकता है, और अतिरिक्त पीसीआर के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है आधारित परख, RT-qPCR के रूप में । इस परख की सीमाएं कुछ हैं, और सबसे पारंपरिक पीसीआर के लिए अंतर्निहित हैं । इन सीमित कारकों में शामिल हैं: इथेनॉल या पीसीआर मिश्रण में अंय निरोधात्मक रसायनों की उपस्थिति, एक अधिक उंनत परख प्रदर्शन के बिना quantitation की कमी, छोटे प्रयोगशालाओं में एक thermocycler के लिए की जरूरत है, और डीएनए संदूषण की उपस्थिति ।

जबकि इस परख की विशिष्टता सीधे अधिक विशिष्ट RT-qPCR तरीकों की तुलना में नहीं किया गया है, इस परख कैंडिडेटस liberibacter पर अनुसंधान प्रदर्शन वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी है, और संभावित संक्रमित खट्टे निदान की मांग किसानों उनके खेतों में पेड़, खासकर यदि अधिक विशिष्ट विधियों उपलब्ध है या लागत प्रभावी नहीं हैं । वास्तव में, यह कल्पना है कि एक एकल खट्टे उत्पादकों या शोधकर्ता जल्दी और सस्ते में कुछ ही दिनों में कई सौ नमूने परख सकता है, कई ९६ के साथ संयुक्त मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से प्लेटें, एक महंगी आरटी-qPCR thermocycler खरीद के बिना ।

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Disclosures

हुआ़ चेन, इयान आर्थर पामर, जीआईपी चेन, मिंग चांग, स्टीफन एल थॉमसन, Fengquan लियू, और झेंग किंग फू ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा ।

Acknowledgments

अवधारणा, H.C. और जेड. क्यू. एफ.; जांच, एच. सी., जे. सी., और जेड. क्यू. एफ; संसाधन, जेड. क्यू. एफ.; लेखन-मूल मसौदा, आई. ए. पी.; लेखन – समीक्षा एवं सम्पादन, आई. ए. पी., जे. सी., एच. सी., एस. एल. टी., तथा जेड. क्यू. एफ.; विज़ुअलाइज़ेशन, एच. सी.; पर्यवेक्षण, जेड. क्यू. एफ.; अनुदान प्राप्ति, जेड. क्यू. एफ और एफ. क्यू. एल.

परियोजना के एक दक्षिण कैरोलिना शिक्षक गुणवत्ता में सुधार उच्च शिक्षा राज्य अनुदान शीर्षक से समर्थन किया, मध्यम ग्रेड विज्ञान संयंत्र प्रक्रियाओं, संरचनाओं के शिक्षकों के ज्ञान को बढ़ाने, और कार्यों सगाई के माध्यम से संयंत्र में विज्ञान अनुसंधान संयंत्र ( विज्ञान)

यूनाइटेड सॅटीस एजुकेशन डिपार्टमेंट (प्रेजेंट नंबर 84.367 बी) द्वारा सम्मानित फंड

लेखकों को संक्रमित खट्टे sinensis वालेंसिया से जीनोमिक डीएनए नमूने प्रदान करने के लिए फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के डॉ नियन वांग का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen Air Products N/A
Mastercycler pro with control panel Eppendorf 6321000019
1250 W Microwave Panasonic N/A
5424 table top centrifuge Eppendorf 05-403-93
Isotemp 215 digital water bath Fisher scientific 15-462-15Q
Metal spatula Sigma-Aldrich Z283274
Mortar and pestle Sigma-Aldrich Z247464
LSE Vortex Mixer Corning 6775
2-propanol Sigma-Aldrich I9516
Sterile 10 μL tips TipOne 1161-3730
Sterile 200 μL tips TipOne 1163-1730
Sterile 1250 μL tips TipOne 1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit VWR 75788-460
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510
Agarose IBI Scientific IB70041
EDTA Thermo Fisher Scientific 17892
Acetic acid Fisher Chemical A38-212
Tris base Sigma-Aldrich 10708976001
μcuvette Eppendorf 6138000018
Stackable casting tray and combs Carolina 213655
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Mini-Sub Cell GT System Bio-Rad 1704487EDU
Biospectrometer basic Eppendorf 6135000009
0.2 mL PCR tubes Fisher scientific AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3439
2X Taq Green PCR Master Mix Promega M7122
Forward Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Reverse Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Water, PCR grade Sigma-Aldrich 3315953001
Gel Doc XR+ Bio-Rad 1708195
1 KB+ DNA ladder Thermo Fisher Scientific 10787018

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References

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  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
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  5. Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
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पर्यावरण विज्ञान अंक १३६ खट्टे खट्टे हरियाली Huanglongbing कैंडिडेटस liberibacter पीसीआर Psyllid
नींबू के विशिष्ट और सटीक का पता लगाने हरियाली रोगज़नक़ <em>कैंडिडेटस liberibacter</em> एसपीपी. खट्टे पत्ती ऊतक के नमूनों पर पारंपरिक पीसीआर का प्रयोग
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Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J.,More

Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J., Chang, M., Thompson, S. L., Liu, F., Fu, Z. Q. Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples. J. Vis. Exp. (136), e57240, doi:10.3791/57240 (2018).

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