Specifika och korrekt upptäckt av den Citrus grönare patogen Candidatus liberibacter spp. med konventionella PCR på Citrus Leaf vävnadsprover

Summary

Citrus grönare är en särskilt destruktiv sjukdom som påverkar citrus grödor globalt. Presenteras här är en enkel metod med hjälp av PCR och genomisk DNA-extraktion av citrus bladvävnad för korrekt och exakt identifiering av citrus grönare patogener, Candidatus liberibacter spp.

Abstract

Citrus grönare, även känd som huanglongbing, är en destruktiv citrus sjukdom härjar citrus gårdar globalt. Denna sjukdom orsakar asymmetriska gult löv fläckar, ven gulfärgning, kronutglesning, roten förfall och slutligen döden av en citrus växt. När smittade, citrusväxter har hämmad tillväxt och producerar blommor utanför säsongen. Dessa blommor ge sällan frukt, och de som ger små, bitter, oregelbundet formade citrusfrukter som är inte önskvärt. Sjukdomen sprids genom den asiatiska citrus psyllid, Diaphorina citri, och genom ympning av infekterade citrus vävnad. Patogenen har en lång och varierande inkubationstid på citrus anläggningen — ibland år, framför symtom framträda. Försök att kultur denna patogen i vitro har misslyckats, möjligen på grund av låga och ojämn koncentration av patogenen inom infekterade citrus vävnad, eller eftersom det är svårt att replikera den miljömässiga förutsättningar för tillväxt av patogenen. Det är mycket svårt att identifiera sjukdomen innan det har spridit sig, på grund av dess lång inkubationstid och forskarnas oförmåga att kultur patogenen. Som ett resultat, blir sjukdomen bara uppenbara efter plötsligt förstör en citrus bondens hela avkastningen. Presenteras här är en metod för den korrekta och specifikt påvisande av citrus grönare patogener, Candidatus liberibacter spp. med en genomisk DNA extraktion kit och PCR. Denna metod är enkel, effektiv, kostnadseffektiv och anpassningsbar för kvantitativ analys. Denna metod kan anpassas för användning på någon citrus vävnad; Det är dock potentiellt begränsas av mängden patogener närvarande i vävnaden. Denna metod kommer dock tillåta citrus jordbrukare att identifiera smittade citrusväxter tidigare och stävja spridningen av denna destruktiva sjukdom innan det kan ytterligare spridning.

Introduction

Citrus grönare, även känd som huanglongbing, har orsakat en betydande förlust av citrusträd. Ett representativt fall är Florida, där sjukdomen förutspås orsaka en 70% minskning i produktionen av Florida orange lådor från 244 miljoner lådor under säsongen 1997-1998 till 70 miljoner lådor per den 2016-2017 säsong¹. 90% av citrusträd i Florida är över infekterade², och det uppskattas att Florida citrus industrin förlorar ungefär en miljard dollar varje år på grund av citrus sjukdomar, vari citrus grönare spelar en viktig roll³. Citrus grönare sprids främst genom den invasiva asiatiska citrus psyllid Diaphorina citri, men kan också spridas genom ympning av infekterad vävnad. Sjukdomen orsakar gulfärgning av vener, asymmetriska gult löv fläckar, tidig avlövning, twig ramorum, roten förfall och död av anläggningen. Ännu viktigare, orsakar sjukdomen citrus anläggningen att producera blommor utanför säsongen, som sällan ger frukt. Frukt som produceras av infekterade citrusväxter är omogna, gröna och bitter smak⁴.

Syftet med denna metod är att noggrant och identifiera exakt de motila bakterien Candidatus liberibacter spp., vilka smittämnen av citrus grönare, bor inom phloemen av infekterade citrusträd⁵. Genomiskt DNA extraheras från hela bladvävnad, som innehåller levande bakterier. Denna extraherade genomiskt DNA används som mall för konventionella PCR, där oligonukleotider komplement till bakteriens 16S rDNA sekvens används för att förstärka denna sekvens. Oligonukleotider komplement till en citrus FBOX -gen används som en inre förstärkning kontroll. Vi valde att använda denna metod, eftersom det har visat sig vara framgångsrika i tidigare forskning⁶.

Denna metod har tydligt fördelen att vara enkel, relativt billig och kunna utföras i någon normalt utrustade biokemi lab. Dessutom förblir PCR metoden mest exakta och precisa för att upptäcka denna patogen, på grund av svårigheten att odla denna patogen⁷och patogens förmåga att överleva och reproducera år inom en asymtomatisk värd⁸. Många olika specialitet PCR-analyser har använts för att identifiera denna patogen; konventionella PCR är dock fortfarande den enklaste test för korrekt och specifikt påvisande, särskilt inom asymtomatiska värdar⁸.

Protocol

1. isolera genomiskt DNA från växtvävnad använder en genomisk Extraction Kit

1. Erhålla citrus bladvävnad genom att skära en hela färska blad från ett citrus träd med ren sax och placera bladet i en ren plast smörgås väska.
   Obs: Den påsen som innehåller bladvävnad bör placeras i kylskåp 4 ° C eller på is i en isolerad behållare så snart som möjligt efter samlingen för undvikande av svinn.
2. Lägga till en liten mängd flytande kväve för att kyla en mortel och stöt. Medan de är kylning, använd sax för att klippa ut en liten bit av bladvävnad, cirka 1 kvadrat tum i storlek. Plats skära vävnaden i mortel till ögonblickligen frysa den. Lägg till mer flytande kväve, om det behövs.
   Obs: Isolerade handskar ska alltid användas vid hantering av flytande kväve.
3. Snabbt slipa växt vävnaden till ett fint pulver med murbruk. Fortsätt slipning tills det flytande kvävgasen helt avdunstar, och ett fint grönt pulver finns kvar.
4. Kort chill en metall spatel i flytande kväve för 10-15 s, och sedan ösa marken vävnaden inuti mortel i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, Använd spateln.
5. Lägga till 600 µL atomkärnor Lysis lösning (se Tabell för material) med en 1000 µL Pipettera och vortex provet för 1-3 s, sedan Inkubera i vattenbad 65 ° C i 15 min.
6. Tillsätt 3 µL RNase lösning i den lysate med 10 µl pipett, Invertera röret 2 - 5 gånger att blanda och inkubera vid 37 ° C i ett skåp inkubator för 15 min.
   Obs: Låt blandningen svalna till rumstemperatur innan du fortsätter.
7. Tillsätt 200 µL av Protein nederbörd lösning, vortex vid hög hastighet för 20 s, sedan Centrifugera under 3 minuter vid 13 000 x g att bilda en fast pellet. Medan att vara centrifugeras provet, lägga till en fräsch 1,5 mL mikrocentrifug rör 600 µL av rumstemperatur isopropanol.
8. Med 1000 µL pipett noggrant avlägsna supernatanten från centrifugeras provet, överföra den till den färska 1,5 mL mikrocentrifug rör som innehåller isopropanol. Pelleten kan nu kasseras.
   Obs: Undvik att förorena supernatanten med protein genom att lämna en mycket liten mängd supernatanten ovan pelleten.
9. Vänd röret tills DNA blir synlig som en massa tråd-liknande trådar, sedan Centrifugera 13 000 x g för 1 min i rumstemperatur.
10. Dekantera supernatanten, lägga till 600 µL av 70% etanol i pelleten, Invertera röret flera gånger att tvätta DNA, och centrifugera vid 13 000 x g i 1 min.
11. Noggrant aspirera etanolen, lämnar lös DNA pelleten, öppna och Invertera röret, vilande på absorberande papper. Torka i rumstemperatur i 15 min.
12. Tillsätt 100 µL av DNA rehydrering lösning till torkade DNA pelleten och inkubera DNA i 65 ° C vattenbad för 1 h, medan blandning med jämna mellanrum genom att trycka på röret.
13. Placera 1 µL av renat vatten på en microcuvette och sätt in det i en spektrofotometer för att användas som en tom. Beräkna koncentrationen av DNA närvarande genom att placera 1 µL prov på microcuvette, och att infoga i spektrofotometern. DNA-koncentration (ng/µL) kan beräknas som (en₂₆₀- en₃₂₀) × utspädning faktor × 50 ng/µL.
    Obs: Protokollet kan pausas här. Provet kan förvaras vid 4 ° C.

2. utför PCR på genomisk DNA-prover

1. Kombinera 10 µL 2 x PCR Master Mix (se tabell material), 1 µL framåt primer (10 pM/µL), 1 µL reverse primer (10 pM/µL) (se tabell 2 för primer sekvenser), 100 ng av genomisk DNA extraheras från provet, och renat vatten (upp till 20 µL slutliga volym) i en 50 µL PCR-röret, flick att blanda och kort centrifug.
2. För in PCR-röret i termocyklern och kör med detta (se tabell 1).
   Obs: Protokollet kan pausas här. Vid behov förvara provet vid 4 ° C när reaktionen är klar.

3. electrophorese amplifierade DNA i en agarosgel

1. Väger 0,4 g agaros pulver och Lägg det tillsammans med 1 x TAE buffert till en ren 200 mL Erlenmayerkolv, fylla upp till 50 mL.
2. Mikrovågsugn på hög i 1,5 min, skaka varje 30 s, tills agaros är helt upplöst.
   Obs: Isolerade handskar bör bäras vid hantering av flytande agaros att förhindra brännskador.
3. Tillsätt 2,5 µL 10 mg/mL etidiumbromid till flytande agaros och skaka för att blanda och häll på flytande agarosgel i en nivå gel mögel. Snabbt infoga standard 12-tooth gel kammar efter hälla.
4. Låt gelen att svalna i 20 min i rumstemperatur, sedan ta bort gel kammar, och placera gelen i en nivå gel låda fylld med 1 x TAE buffert.
5. Med hjälp av en mikropipett, Ladda de totala amplifierade DNA-proverna i brunnar. Tillsätt 5 µL av DNA stege (se Tabell för material) i en separat brunn från dina prover.
6. Electrophorese proverna för 35 min på en konstant 90 V, sedan bort gelen och placera i en UV-transilluminator.
7. Fotografera och analysera gelen banding mönster medan du använder UV-genomlysning på 302 nm.

Representative Results

Ett positivt resultat ger ett distinkt band motsvarar 500 bp för Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, och/eller en distinkt band som motsvarar 700 bp för Laa2/Laj5, ett skär i av 16S ribosomal β operon⁹. Det inre förstärkning kontrollbandet måste också visas vid 400 bp. Detta band motsvarar förstärkning av citrus FBOX gen¹⁰och måste visas för ett resultat anses vara giltig (figur 1 och figur 2). Brist på både 500 bp och 700 bp band medan ett 400 bp-band är närvarande representerar ett negativt resultat. Utför PCR på friska prover kan ge vissa icke-specifik banding mönster runt 700 bp och 400 bp; men visar bara en enda fet band som motsvarar dessa molekylvikter ett positivt resultat (figur 1).

Drift	Temp.	Tid	Cykler
Inledande denaturering	95 ° C	3 - 5 min	1
Denaturering	95 ° C	30 SEK	35
Glödgning	55 ° C	30 SEK
Töjning	72 ° C	40 SEK
Slutliga töjning	72 ° C	10 min	1

Tabell 1. Termocyklern inställningar används för att förstärka mål 16S rDNA gener och citrus FBOX.

Namnet på Primer	Sekvens		Referens
LAA2_F	5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC GAG TTT-3'		Hocquellet, et al., 1999
LAJ5_R	5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3 '		Hocquellet, et al., 1999
FBOX_F	5'-TTG GAA ACT CTT TCG CCA CT-3'		Denna analys
FBOX_R	5'-AGC AGA CCT GGC TAT TAT ACG ACT G-3'		Denna analys
LSS_F	5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT CCG A-3 '		Fujikawa, et al., 2012
LSS_R	5'-ACC CAA KATT CTA GGT AAA AAC C-3 '		Fujikawa, et al., 2012

Tabell 2. Namnet på primers, sin DNA-sekvens och referens.

Figur 1. Analys av konventionella PCR resultat från fyra infekterade citrus leaf vävnadsprover och två heathy prover används som negativa kontroller. 'gDNA' indikerar en genomisk DNA-provet extraheras från citrus bladvävnad. Prover gDNA 1 och gDNA 4 är från oinfekterade citrus leaf prover; gDNA 2, 3, 5 och 6 är Candidatus liberibacter asiaticum (Clas) infekterade prover. DNA extraherades som skrivits i protokollet. PCR utfördes med hjälp av den extraherade genomiskt DNA som mall, per protokoll (se tabell 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS, och FBOX hänvisar till de primer uppsättningar används (se tabell 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Klar gel fotografi av tre förstärkta gDNA prover. Prov 1 är frisk citrus vävnad; prov 2 och 3 är Clas infekterade vävnadsprover. Dessa prover motsvarar gDNA 1, 2 och 3, som kan ses i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det är viktigt att alla åtgärder följs exakt för att uppnå optimal försöksbetingelser. Hela bladvävnad användes under denna demonstration; protokollet kan dock ändras för att teoretiskt innehålla typ av växtvävnad. Forskare har tidigare utvunnits genomiskt DNA från ven bladvävnad, snarare än hela bladvävnad och uppnådde liknande resultat¹¹. Om bandet motsvarar citrus FBOX genen inte infinner sig, resultatet är ogiltig, och det kan finnas en eller flera av flera tekniska fel i förfarandet operativa. Vanliga fel inkluderar: med förorenade eller felaktigt steriliserat vatten, mikropipett tips eller mikrocentrifugrör; underlåta att lägga till en eller flera komponenter som är nödvändiga i PCR-mix eller under genomisk DNA-extraktion; undelåtenhet att föra ordentlig termocyklern villkoren; med hjälp av reagenser eller andra ingredienser som är förbi deras utgångsdatum; underlåta att lägga till etidiumbromid fläcken metylbromid eller en annan DNA till agarosgel; electrophoresing amplifierade DNA vid för hög spänning eller för länge; och med hjälp av gammal eller felaktigt blandade TAE buffert, eller helt enkelt använda vatten istället för TAE buffert för att fylla rutan gel.

Primers LAA2_F och LAJ5_R valdes från tidigare forskning på grund av sin framgång på att identifiera Candidatus Liberibacter asiaticum och africanum. Dessa primers förstärka ribosomal subuniten gener rplA och rplJ, vilket ger en förstärkt 669 bp-fragmentet från C. l. africanum eller ett 703 bp fragment från C. l. asiaticum⁹. Primers LSS_F och LSS_R valdes ut för denna analys från tidigare forskning på grund av deras etablerade låg falsk minusräntan, noggrannhet och specificitet för C. l. asiaticum. Den LSS primer som förstärker en 500 bp sekvens i alla tre 16S rDNA gener närvarande i C. l. asiaticum⁶. FBOX primers konstruerades för användning som en inre förstärkning kontroll och förstärka en 400 bp-sekvens som finns i citrus växter. Tidigare forskning visar att FBOXEN uttrycks stabilt i citrusväxter, och skulle göra en bra kandidat för användning som en referens gen när anpassa denna analys för RT-qPCR¹⁰.

Denna analys kan anpassas för att användas för någon typ av citrus vävnad och kan ändras för användning med ytterligare PCR-baserade analyser, såsom RT-qPCR. Begränsningarna i denna analys är få, och de flesta är inneboende till konventionella PCR. Dessa begränsande faktorer inkluderar: förekomsten av etanol eller andra hämmande kemikalier i PCR-blandningen, bristen på kvantitering utan att utföra en mer avancerad analys, behovet av en termocykler i mindre labs, och närvaron av DNA-kontaminering.

Medan specificiteten av denna analys inte har jämförts direkt till mer specifika metoder som RT-qPCR, denna analys är användbar för forskare som utför forskning på Candidatus liberibacter och jordbrukare försöker diagnostisera potentiellt infekterade citrus träd inom sina områden, särskilt om mer specifika metoder inte är tillgängliga eller kostnadseffektivt. Det är tänkbart att en enda citrus odlaren eller forskare kunde snabbt och billigt assay flera hundra prover i ett par dagar, med hjälp av multikanal pipetter kombinerat med flera 96 brunnar, utan att behöva köpa en dyr RTqPCR termocykler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen	Air Products	N/A
Mastercycler pro with control panel	Eppendorf	6321000019
1250 W Microwave	Panasonic	N/A
5424 table top centrifuge	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 digital water bath	Fisher scientific	15-462-15Q
Metal spatula	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortar and pestle	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Sterile 10 μL tips	TipOne	1161-3730
Sterile 200 μL tips	TipOne	1163-1730
Sterile 1250 μL tips	TipOne	1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit	VWR	75788-460
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acetic acid	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Stackable casting tray and combs	Carolina	213655
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectrometer basic	Eppendorf	6135000009
0.2 mL PCR tubes	Fisher scientific	AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Water, PCR grade	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018