Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57241
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Immunology Division, Department of Pathology, University of Utah

Summary

Synergetische drug combinaties zijn moeilijk en tijdrovend te identificeren empirisch. Hier beschrijven we een methode voor het vaststellen en valideren van synergetische kleine moleculen.

Abstract

Hoewel antimicrobiële geneesmiddelen dramatisch de levensduur en de kwaliteit van leven in de 20ste eeuw toegenomen zijn, dreigt antimicrobiële resistentie onze hele samenleving vermogen om systemische infecties te behandelen. In de Verenigde Staten alleen al doden antibiotica-resistente infecties ongeveer 23.000 mensen per jaar en de kosten ongeveer 20 miljard USD in de aanvullende gezondheidszorg. Een aanpak ter bestrijding van antimicrobiële resistentie is combinatietherapie, die vooral handig in de kritische vroeg stadium van de infectie, is voordat het infecteren organisme en haar weerstandsprofiel drug zijn geïdentificeerd. Vele antimicrobiële behandelingen gebruiken combinatie therapieën. Echter, de meeste van deze combinaties zijn additief, wat betekent dat de gecombineerde doeltreffendheid hetzelfde als de som van de individuele antibiotica werkzaamheid is. Sommige combinatie therapieën zijn synergetische: de gecombineerde doeltreffendheid is veel groter dan additief. Synergetische combinaties zijn bijzonder nuttig, omdat ze de groei van antimicrobiële drug resistente stammen remmen kunnen. Deze combinaties zijn echter zeldzaam en moeilijk te identificeren. Dit is te wijten aan het grote aantal moleculen moest worden getest in een paarsgewijze wijze: een bibliotheek met 1000 moleculen heeft 1 miljoen mogelijke combinaties. Dus, hebben inspanningen geleverd om te voorspellen van moleculen voor de synergie. Dit artikel beschrijft onze high-throughput methode voor het voorspellen van synergetische klein molecuul paren bekend als de overlapping2 methode (O2M). O2M maakt gebruik van patronen van chemische-genetische datasets te identificeren van mutanten die overgevoelig zijn voor elke molecuul in een synergetische paar maar niet voor andere moleculen. De bruine lab exploiteert dit verschil groei door het uitvoeren van een high-throughput scherm voor moleculen die de groei van mutant maar niet wild-type cellen remt. De lab werk eerder aangeduid moleculen die synergize met de antibiotica trimethoprim en de antischimmel drug fluconazol met behulp van deze strategie. Hier, presenteren de auteurs een methode om scherm voor roman synergetische combinaties, die voor meerdere micro-organismen kan worden gewijzigd.

Introduction

Antibiotica-resistente bacteriën veroorzaken meer dan 2 miljoen infecties en 23.000 sterfgevallen per jaar in de Verenigde Staten volgens de CDC-1. Nieuwe behandelingen zijn nodig om deze infecties te overwinnen. Strategieën om te identificeren deze nieuwe behandelingen omvatten de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële geneesmiddelen of de herbestemming van kleine moleculen goedgekeurd voor andere voorwaarden voor het behandelen van microbiële infecties2,3,4. Nieuwe drugontdekking is echter zeer duur en tijdrovend. Herbestemming van drugs kan niet identificeren nieuwe medicijnen of drugs richt zich op5,6. Onze lab richt zich op een derde strategie synergetische combinatie therapie genoemd. Synergetische combinaties optreden wanneer twee kleine moleculen samen een werkzaamheid die groter is dan het additieve effect van hun individuele efficacies7. Bovendien, kunnen synergetische combinaties effectief tegen een aan één van de kleine moleculen in het paar naast het hebben van minder ongewenste effecten van de af-target, waardoor ze grote potentiële8,9, resistente pathogenen 10.

Synergetische paren zijn zeldzaam, die zich in ongeveer 4-10% van de drug combinaties11,12,13. Dus zijn traditionele technieken zoals paarsgewijze schermen uitdagende en tijdrovend, met duizenden mogelijke combinaties van een kleine bibliotheek van honderd moleculen. Bovendien, synergetische interactie meestal niet kan worden voorspeld uit de activiteit van de verbindingen14. Echter, de auteurs een benadering van de hoge gegevensdoorvoer aan het scherm voor synergetische paren, genaamd de overlapping2 methode (O2M)12ontwikkeld. Deze methode wordt hier beschreven, zorgt voor snellere en efficiëntere identificatie van deze synergetische paren. O2M vereist het gebruik van een bekende synergetische pair en een chemische-genetica dataset. Chemische-genetica datasets worden gegenereerd wanneer een bibliotheek van knock-out mutanten wordt geteeld in de aanwezigheid van veel verschillende kleine moleculen. Als één molecule in een bekende synergetische paar het hetzelfde fenotype van een mutant bepaalde knock-out als de tweede synergetische molecuul induceert, moet andere klein molecuul dat het fenotype van dat dezelfde mutant lokt ook met elk lid van de bekende synergize synergetische paar. Deze motivering is gebruikt in de bruine lab te identificeren synergetische antibiotica paren actief tegen Escherichia coli (E. coli) en synergetische antischimmel drug paren actief tegen de pathogene schimmel Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M is niet alleen geschikt voor verschillende ziekteverwekkers, maar zorgt voor de screening van grote bibliotheken van moleculen te identificeren synergetische paren gemakkelijk en snel. Screening met de genetische mutant geïdentificeerd door O2M laat ons toe om alleen die kleine moleculen voorspeld voor synergie te valideren. Dus, een 2.000-molecuul bibliotheek pairwise testing maanden zou duren, overwegende dat mochten er slechts 20 moleculen in die bibliotheek voorspeld synergize, testen voor synergie nu een kwestie van dagen neemt. O2M vereist geen programmering vaardigheden, en de benodigde apparatuur is beschikbaar in de meeste laboratoria of core faciliteiten. Naast de onderzoekers ook geïnteresseerd in de drug combinaties is O2M analyse van belang voor iedereen die een drug-scherm heeft afgerond en wil hun hits uit te breiden door het identificeren van belangrijke drug-drug-interacties. Hieronder is het protocol voor het identificeren van synergetische kleine molecules in bacteriën, evenals het valideren van de voorspelde synergetische interacties in bekende assays15,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. identificatie van de synergie voorspelling mutanten uit chemische-genetica Dataset door de overlapping2 methode (O2M)

Opmerking: Dit is de methode voor de identificatie van synergie voorspelling mutanten met de gepubliceerde dataset van Nichols et al. 17 in E. coli. Echter, dit kan gebeuren op elke chemische-genetica dataset en micro-organisme. Deze data sets bevatten een bibliotheek van knock-out mutanten gegroeid in aanwezigheid van meer dan 100 kleine molecules, geven een kwantitatieve groei-score voor elke mutant in elk klein molecuul. Een synergetische paar moet bekend zijn, en er moet groei scores voor zowel kleine moleculen inbegrepen in de dataset.

  1. Bereken de gemiddelde groei score en de standaarddeviatie voor alle mutanten gegroeid in aanwezigheid van een interne concentratie van elk klein molecuul.
    Opmerking: Dit kan gebeuren met behulp van een spreadsheet-software. De bruine afwerkcentrale gebruikt Excel en de functies =AVERAGE(B3:B3981) en =STDEV(B3:B3981) voor de berekening van elke kolom van klein molecuul.
    1. Bereken de gemiddelde en standaardafwijking uit elke kolom van klein molecuul, hoewel deze oriëntatie afwijken als met een verschillende dataset.
  2. Z scores voor elke concentratie van kleine molecuul gebruikmakend van dezelfde dataset van Nichols et al.te berekenen. 17 in een spreadsheet-programma. Hiervoor zullen de negatieve z-scores Z(2.5) = betekenen - 2,5 * standaarddeviatie, en positieve z-scores zullen Z(2.5) = gemiddelde + 2,5 * standaarddeviatie.
  3. Bepalen welke gen mutanten bevatten belangrijke Z-scores in de kleine molecules die deel van het bekende synergetische paar uitmaken, waarbij u te kijken naar alle concentraties van deze moleculen. Als de score van een mutant is groei minder dan de negatieve Z (2.5) score of groter is dan de positieve Z (2.5) score voor dat kleine molecuul, wordt het beschouwd als belangrijke.
  4. Bepalen als een van de belangrijke gene mutanten tot een operon behoren.
    Opmerking: Voor E. coli, de auteurs adviseren controlerend "Ecoli wiki" voor informatie met betrekking tot als genen worden getranscribeerd als onderdeel van een polycistronic RNA.
  5. Identificeren van gene/operon mutanten die voor de meerderheid van de kleine moleculen van belang in verschillende concentraties gelden (bv., toen op zoek naar moleculen die met de antibiotica trimethoprim, synergize identificeren mutanten die aantonen dat een aanzienlijke Z Score van als volwassen in aanwezigheid van trimethoprim en haar bekende synergetische partners zoals sulfamethizole of sulfamethoxazol). Dit zijn de vermeende synergie voorspelling mutanten.

2. het voorspellen van Synergizers binnen de chemische-genetica Dataset door O2M

  1. Terug te keren naar de dataset17, identificeren elke concentratie van kleine molecule dat een score van de aanzienlijke groei van de synergie voorspelling mutant lokt. Dit wordt gedaan door te kijken naar de Z-scores berekend voor elke concentratie van kleine moleculen. Nogmaals, een aanzienlijke groei-score is minder dan de negatieve Z-score of hoger is dan de positieve Z-score voor die concentratie van klein molecuul.
    Opmerking: Als een molecule wordt weergegeven op één van de concentraties, de molecule wordt beschouwd als een voorspelde synergizer. Een molecuul dat niet een aanzienlijke groei-score uitlokken doet is een voorspelde niet-synergizer.

3. bevestiging van de voorspelde synergetische interacties

  1. Het vinden van minimale remmende concentratie (MIC) van voorspelde synergizers.
    1. Groeien van een overnachting cultuur van E. coli in M9 minimale media bij 37 ° C.
      Opmerking: Elke overnachting cultuur kan worden geteeld in adequaat beschreven medium voor het organisme van belang. De bruine lab adviseert niet rijke media zoals LB of YPD. M9 minimale media bestaat uit 10,5 g/L M9 Bouillon, 0,2% casamino zuren, 0,1 M CaCl2, 0,4% glucose, 1 M MgSO4, 0,25% nicotinezuur en 0,33% thiamine in H2O.
    2. Als geen gegevens MIC voor pathogen van belang te in de literatuur vinden is na ontvangst van de kleine molecules, los in dimethylsulfoxide (DMSO) in een hoge concentraties (> 10 mg/mL).
    3. Met behulp van een 96-wells-plaat, 100 µL van de M9 media toevoegen aan elk putje. Voeg een extra 100 µL van de M9 media in kolom 1, zodat het bevat in totaal 200 µL.
    4. Voeg een willekeurige hoeveelheid (~ 10 µL) geconcentreerd klein molecuul oplossing in kolom 1. Een klein molecuul per putje van kolom 1 (8 kleine moleculen per plaat).
      Opmerking: Dit zijn de kleine molecules van belang, die zijn voorspeld te synergize. De bruine lab in het algemeen voegt 10 µL van sterk geconcentreerde klein molecuul oplossing, hetgeen lager is dan het bedrag van 100% DMSO dat E. colikan remmen.
    5. Zodra de kleine molecules bijgekomen, Verdun de kleine moleculen over de x-as van de plaat. Neem 100 µL van oplossing uit kolom 1, plaats in kolom 2 en meng. Neem 100 µL uit kolom 2, plaats in kolom 3 en meng. Herhaal dit proces totdat 100 µL in kolom 11 zijn geplaatst. Meng kolom 11, neem 100 µL van die kolom en negeren. Laat de kolom 12 met alleen media te normaliseren van de gegevens.
    6. Het enten van de plaat. De optische dichtheid (OD600) verkrijgen bij een overnachting cultuur. Bereid een oplossing met de cultuur en de M9 media op een OD600 van 0.002 (of in geval van concentratie dat 500 cellen/µL voor het gewenste organisme van belang vertegenwoordigt). Pipetteer 2 µL van cultuur oplossing in elk putje van de plaat dus er 1000 cellen per putje zijn.
    7. Voorzichtig schudden van de plaat en verkrijgen van de OD-600 voor de 0 h lezen. Laat de plaat groeien bij 37 ° C gedurende 24 h. verkrijgen de OD-600 voor de 24 h lezen.
      Opmerking: Gebruik juiste groeiomstandigheden voor andere organismen van belang.
    8. Bereken de netto groei voor elk goed met een spreadsheetprogramma.
    9. Het gemiddelde van de netto groei van kolom 12 te verkrijgen van het gemiddelde geen groei van de drug. Normaliseren van de andere putjes met het gemiddelde van geen groei van de drug een spreadsheet-programma. Zoekt u een goed met minder dan 10% groei te identificeren van de MIC90. Een goed met minder dan 50% groei geeft aan de MIC50. Bereken de concentratie van kleine molecule in die putjes.
  2. Dambord Assays voor synergetische interacties
    1. Een overnachting cultuur van E. coli in M9 minimale media als voor te groeien.
      Opmerking: Gebruik juiste groeiomstandigheden voor andere organismen.
    2. Voeg 100 µL van M9 media aan elk putje van een 96 goed plaat en een extra 100 µL in kolom 1.
    3. Toevoegen van het kleine molecuul test (op ~ 8 x MIC) aan elk goed in kolom 1 en het toevoegen van dubbele de concentratie (~ 16 x MIC) goed a1 (een klein molecuul getest per plaat).
      Opmerking: Dit bedrag wordt bepaald van het MIC test voltooid voorafgaand en verschilt voor elke potentiële synergizer.
    4. Maak een kleurovergang verdunning op de x-as door het nemen van 100 µL van kolom 1 en overbrengen naar kolom 2. Herhaal dit proces totdat 100 µL wordt toegevoegd aan de kolom 11. Meng 100 µL van kolom 11 nemen en vervreemden. Voeg geen drugs aan kolom 12 (figuur 1A).
    5. Het tweede drug verloop opgezet over de y-as voor de input drug. Voeg 100 µL van media met 2 x microfoon van de input molecule in rij A. Mix en verdunde als vóór, houdend 100 µL van rij en plaatsen in B. doorgaan totdat 100 µL is geplaatst in rij G. Mix, neem 100 µL en vervreemden, ervoor te zorgen om niet toe te voegen elke input drug in rij H. Hierdoor H rij en de kolom 12 individuele microfoons van de drug paar getest (figuur 1B) bevatten.
    6. Het enten van de plaat. Voeg 2 µL van een cultuur van E. coli van OD600 0.002 toe aan elk putje (1000 cellen per putje).
    7. Het meten van de OD600 van elk putje in de plaat voor de lezing van het 0 h.
    8. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 ° C.
    9. De OD-600 van elk putje op 24 h te meten.
  3. Berekening van de index van de fractionele remmende concentratie (FICI) vanuit schaakborden
    1. Bereken de netto groei voor elk putje van de plaat door af te trekken van de OD600 bij 0 h van de OD600 op 24u in een spreadsheet-programma.
    2. Normaliseren van de groei in de software door te delen elke goed door goed H12, waarin geen klein molecuul.
    3. Vind de MIC90 van de input molecule in kolom 12 en de MIC90 van de potentiële synergist in rij H.
    4. Kijk voor alle putjes die een remmende werking van 90% van de groei.
    5. Berekenen van de FICI90 voor de Nou dat is ofwel de laagste hieronder (synergetische) of hoogste boven (antagonistische) beide MIC90 waarden, met behulp van de vergelijking:
      Equation 1
    6. Overweeg een FICI ≤ 0,5 zo synergetische en FICI ≥ 4 als antagonistische (Figuur 2).
      Opmerking: Dit kan ook gebeuren met MIC50 (50% remming van de groei) om een FICI50 op basis van deze MIC-waarden.
  4. Bliss onafhankelijkheid Assay
    Opmerking: Bliss onafhankelijkheid wordt uitgevoerd met elke potentiële synergist dat niet een microfoon op zijn eigen hebben.
    1. Een overnachting cultuur van E. coli in M9 media bij 37 ° C, als voorheen groeien.
      Opmerking: Nogmaals, juiste groeiomstandigheden voor andere organismen van belang kunnen worden gebruikt in deze stap.
    2. Bereiden 96-wells-platen voor het testen van de potentiële synergetische molecule, de input molecule, de combinatie en een niet-behandelde besturingselement.
    3. De potentiële synergist plaat door 50 µL van M9 media toe te voegen aan elk putje maken Voeg 50 µL van media met een set concentratie (10 µM of 100 µM) van de potentiële synergistisch aan elk putje van een rij. Test 8 moleculen per plaat.
    4. Maak de input molecuul plaat door 50 µL van media toe te voegen aan elk putje. Voeg 50 µL met 4 x microfoon van de input drug aan elk putje in kolom 1. Maak een verloop verdunning langs de x-as vergelijkbaar met MIC platen, 50 µL van kolom 1 nemen, verspreiden en mengen in kolom 2. Herhaal dit proces totdat de kolom 12, 50 µL verwijdering uit kolom 12. Voeg een extra 50 µL van media toe aan elk putje zodat het eind totaal voor elk putje 100 µL.
    5. Maken de combinatie plaat met behulp van een 96 goed plaat, 50 µL van media toevoegen aan elk putje. Voeg 50 µL met 4 x microfoon van de input drug aan elk putje in kolom 1. Verdun langs de x-as vergelijkbaar met MIC platen, 50 µL van kolom 1 nemen, verspreiden en mengen in kolom 2. Blijven dit de hele weg naar kolom 12, 50 µL verwijdering uit kolom 12. Voeg 50 µL van media met de potentiële synergist op 10 µM of 100 µM aan elk putje van een rij. Nogmaals, er moet een concentratie of drug per rij.
    6. De niet-behandelde besturingselement maken door 100 µL van de M9 media toe te voegen aan alle putjes van de plaat.
    7. Inoculeer alle platen door 2 µL van bacteriële cultuur met een OD600 0.002 of 1000 cellen toe te voegen aan elk putje als vóór.
    8. Het meten van de OD600 van elk putje op 0 en 24 h.
  5. Berekening van de Bliss onafhankelijkheid Score
    1. Bereken de netto groei voor elk putje van de plaat door af te trekken van de OD600 bij 0 h van de groei in 24 h met gebruikmaking van een spreadsheet-programma.
    2. Normaliseren de putten aan de gemiddelde groei van de geen drug-plaat in een spreadsheet-programma.
    3. Met behulp van spreadsheet-software, berekenen de remming door af te trekken van de netto groei van 1.
    4. Het gemiddelde van de kolommen in het besturingselement plaat met alleen de invoer verloop in de spreadsheet-software.
    5. Bereken de score van de bliss voor elk putje met de vergelijking:
      Bliss Score = (goed X + invoer kolom X) – combinatie goed X
    6. Kijk voor negatieve scores in putten onder de MIC90 van de input.
      Opmerking: Negatieve scores in meerdere concentraties zou geven een synergetische interactie.

4. high-throughput scherm met synergie voorspelling mutanten te identificeren roman synergetische paren

  1. Identificeren van synergie voorspelling mutanten
    Opmerking: Stap 1.5 geïdentificeerd putatief synergie voorspelling mutanten. Hier, bepalen wij welke van deze mutanten best in een high-throughput scherm voor synergetische drugs zal functioneren. We deze test uitgevoerd in een Bioscreen-machine, maar 96 goed plaat lezers ook aanvaardbaar zou moeten zijn.
    1. Groeien elke vermeende synergie voorspelling mutanten en wild-type cellen in M9 minimale media.
    2. Instellen van de 100 honingraat goed plaat (of 96 goed plaat) met de juiste groeimedium, groeimedium input drug, groeimedium + bekende synergetische partner van de input drug, en het groeimedium + de bekende niet-synergetische drug. Zorgen om het voertuig-besturingselementen bevatten.
      Opmerking: We raden aan dat vier repliceren putten voor elke stam/drugs/concentratie.
    3. Inoculeer 1000 cellen per goed, met inbegrip van lege-controleputjes.
    4. 48 uur bij 37 ° C, met schudden, groeien en lees OD600 iedere 20 min.
    5. Drug-concentratie en tijd punt dat de grootste groei-verschil tussen wild-type en synergie voorspelling mutantcellen in aanwezigheid van de input drug en haar bekende synergetische partners toont bepalen. Op het optimale tijdstip en concentratie, mag er niet veel groei verschil tussen wild-type en synergie voorspelling mutantcellen als volwassen in aanwezigheid van drugs bekend om op te treden niet synergetisch met de input drug (Figuur 3).
  2. High-throughput scherm voor synergetische drugs
    1. Groeien wild-type cellen en synergie voorspelling mutantcellen in M9 minimale media.
      Opmerking: Gebruik juiste groeimedium voor organisme van belang.
    2. Drugs uit de bibliotheek toevoegen aan media zo elke goed waarin 100 µL media met kleine moleculen bij ingestelde concentratie die is vastgesteld in de vorige stap. Lege wells (zonder cellen) en putjes met voertuig besturingselementen opnemen (e.g., DMSO) ter verantwoording voor een groeiremming door de drug verdunning voertuig.
      1. Bereiden ten minste vier voertuig-controleputjes per plaat, een ideale verspreid over de plaat ter verantwoording voor goed standpunt effecten. Als tests variabele zijn, vervolgens minstens één voertuig besturingselement goed per rij/kolom bevatten en elke controle van de rij/kolom gebruiken evenals het besturingselement voor het berekenen van Z-scores voor elke rij/kolom in plaats van voor een hele plaat (stap 4.2.5).
    3. Voeg 2 µL van cultuur aan elk putje als vóór. (Één plaat voor wild type bacteriën en een plaat voor de voorspelde synergie Gemuteerde bacteriën).
    4. De OD-600 op 0 en 18 h voor E. coli of 48u voor C. neoformansbeoordelen.
    5. Met behulp van spreadsheet-software, bereken de netto groei door af te trekken van de OD600 van lege putten van de voertuig-controleputjes. Identificeren van putten met een Z-score van -2,5 (Z-score = gemiddelde - 2,5 * standaarddeviatie). Deze putjes bevatten een potentiële synergist klein molecuul.
    6. Valideren scherm hits met behulp van de methoden die worden beschreven in stap 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dambord testen zijn een semi-kwantitatieve methode voor het meten van synergistische interacties. De eindscore uitgang, FICI, bepaalt de combinatie van een drug wordt geacht synergetische (FICI ≤0.5), niet-interactie (0,5 < FICI < 4), of antagonistische (FICI ≥4.0). Figuur 1 illustreert het instellen van de drug verlopen in een dambord assay. Figuur 2 illustreert gemeenschappelijke resultaten. Overwegen groei (paarse wells) die minder dan 90% groeiremming weergeven. Na het meten van de OD600 van elk putje in een bord, normaliseren we alles aan het geen drug-besturingselement goed. Iets met een genormaliseerde waarde > 0.1 (10% van de OD600 van het besturingselement goed) is scoorde als "groei". FICI scores kunnen variëren afhankelijk van die goed is geplukt; Wij selecteren de Nou dat de laagste FICI voor elke plaat geeft. In figuur 2A, dat zou goed F9 (kolommen worden genummerd, rijen letters), = met een FICI 0.07. In figuur 2B, de FICI is berekend op basis van goed C3 (FICI = 1.0). Antagonistische interacties, zoekt de hoogste score van FICI mogelijk. In figuur 2C, de FICI is berekend op basis van goed A1, die geven een FICI voor 8.0.

Optimale screening voorwaarden wordt voorkomen dat een groot aantal valse positieven van het scherm, dat tijd en geld bespaart. Als we de mutanten voorspelling synergie voor de schimmel Cryptococcus neoformansgeoptimaliseerd, testten we de input drug (fluconazol), vier bekende niet-synergetische drugs (cafeïne, climbazole, trimethoprim en brefeldin A), en vijf van fluconazol de synergetische partners (rifamycin, myriocin, nigericin, rapamycin en FK506, allemaal besproken in Chandrasekaran, S. et al. 18). omdat we deze moleculen door O2M analyse (afdelingen 1 en 2) ontdekten, wij verwachtten de bekende synergizers dat selectief remt de groei van synergie voorspelling mutantcellen maar niet wild-type cellen. Het maximaliseren van het verschil van de verwachte groei, testten we een aantal uiteenlopende concentraties voor elke kleine molecuul, waarvan de meeste sub-inhibitory werden.

Voorbeeld resultaten worden weergegeven in Figuur 3. Een molecuul dat niet handelt synergetisch met fluconazol, brefeldin A, geremde wild-type en synergie voorspelling mutant groei slechts in geringe mate, en ongeveer hetzelfde bedrag. Rifamycin (figuur 3B), de groei van de synergie voorspelling mutant (cnag_03917Δ) is geremd, maar wild-type celgroei was niet. De grootste groei verschil was tussen 32 en 49 h na inoculatie, dus het timepoint voor screening was in dit bereik. Groeicurven van de andere synergetische en niet-synergetische moleculen leek op die van rifamycin en brefeldin A, respectievelijk.

Figure 1
Figuur 1 : Afbeelding van dambord Assay vanaf stap 3. De test drug en input drug verlopen worden geïllustreerd A en B, respectievelijk. De definitieve assay plaat moet worden weergegeven zoals in C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Grafische resultaten van dambord Assay. Illustraties van synergetische, geen, en antagonistische interacties zijn afgebeeld A, B en C, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Voorbeeldgegevens voor het identificeren van screening tijd. (A) Wild-type (groen) en synergie voorspelling mutant (blauw) van C. neoformans gegroeid in aanwezigheid van een brefeldin A, een klein molecuul bekend niet synergize met fluconazol. Wild-type controle (donkergroen) en drug behandeld (lichtgroen) hebben een soortgelijk verschil in groei met de synergie voorspelling mutant controle (donkerblauw) en drug behandeld (lichtblauw). (B) Wild-type en synergie voorspelling mutant gegroeid in aanwezigheid van rifamycin, een klein molecuul bekend bij synergize met fluconazol. Wild-type controle (donkergroen) en drug behandeld (lichtgroen) hebben een kleiner verschil wilt groei dan de synergie voorspelling mutant controle (donkerblauw) en drug behandeld (lichtblauw). Het grootste verschil is waargenomen bij 48u voor de bekende synergetische molecuul en het verschil gelijkt op dat tijdstip voor de bekende niet-synergetische molecuul. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Synergetische klein molecuul paren kunnen een krachtig instrument in de behandeling van infecties die micro-organismen, maar ze hebben niet hun volledige klinische potentieel bereikt omdat synergetische paren zijn uitdagend om te identificeren. Dit document wordt een methode voor het identificeren van synergetische paren veel sneller dan eenvoudige paarsgewijze combinaties beschreven. Met behulp van chemische-genetica datasets, identificeert O2M mutanten met gene uitsparingen die vervolgens kunnen worden gebruikt als een uitlezing naar scherm grote bibliotheken van kleine moleculen om te voorspellen synergetische paren. Het vermogen om te voorspellen van kleine molecules zorgt voor de hoge schaalbaarheid van schermen, die op zijn beurt voor grote identificatie van synergetische partners zorgt. Na het identificeren van synergetische paren, kunt een verheldering van het moleculaire mechanisme onderliggende synergistische interacties en vervolgens rationeel ontwerp extra synergetische paren11.

O2M vereist een chemische-genetische dataset en een bekende synergetische paar. Gelukkig, chemische-genetica datasets gelden voor een verscheidenheid van microben19,20,21. De bruine lab eerder aangetoond dat O2M synergetische paren met succes in zowel C. neoformans en E. coli11,12 vinden kunnen. Dit toont aan dat de brede impact O2M als een schaalbare methode, die over het algemeen geldt voor een verscheidenheid van organismen. Alle stappen die hier vermeld kunnen worden gewijzigd voor de groei van een verschillende micro-organisme met relatief vergelijkbare resultaten, waardoor O2M een waardevol instrument voor de algemene identificatie van synergetische paren. Verscheidene andere groepen zijn het identificeren van synergetische combinaties van chemische-genetica datasets door verschillende analysemethoden, hoewel O2M de minste programmeer kennis van een van deze methoden vereist. Elke methode geeft verschillende sets van synergetische antibiotica of antischimmelmiddelen 18,22,23,24, suggereren dat een groot aantal synergetische paren moeten nog worden ontdekt. O2M en andere methoden van de voorspelling synergie gelden ook potentieel voor zoogdieren systemen, met inbegrip van identificatie van kanker drug combinaties.

Kortom beschrijft deze methode een snelle manier aan het scherm voor synergetische paren uit een dataset van chemische-genetica. Deze methode en anderen helpen synergetische paren uitgegroeid tot een meer haalbare behandelingsoptie in klinieken. Bovendien bewijst O2M van snelle en algemene methode het een waardevol instrument bij het zoeken naar uit synergetische klein molecuul paren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het opstarten van de afdeling Pathologie, Universiteit van Utah naar J.C.S.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioscreen C instrument Growth Curves USA
Synergy H1 instrument BioTek
M9 broth reagent Amresco J863-500G
Casamino Acids reagent Fisher Scientific BP1424-500
Glucose reagent Sigma G7021-10KG
Nicotinic Acid reagent Alfa Aesar A12683
Thiamine reagent Acros Organics 148991000
CaCl2 Dihydrate reagent Fisher C79-500
MgSO4 Heptahydrate reagent Fisher M63-500
chemical-genetics dataset dataset examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.
trimethoprim (example input drug; any can be used) reagent Fisher Scientific ICN19552701
sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) reagent Fisher Scientific ICN15671125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
  2. Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
  3. Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
  4. Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
  5. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
  6. Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
  7. Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
  8. Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
  9. Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
  10. Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
  11. Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
  12. Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
  13. Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
  14. Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
  15. Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
  16. Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
  17. Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
  18. Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
  19. Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
  20. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
  21. Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
  22. Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
  23. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
  24. Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).

Tags

Genetica kwestie 135 antibioticaresistentie antimicrobiële resistentie combinaties van drugs drug synergie high-throughput scherm overlapping2 methode
High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping<sup>2</sup> methode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wambaugh, M. A., Brown, J. C. S.… More

Wambaugh, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method. J. Vis. Exp. (135), e57241, doi:10.3791/57241 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter