Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक Microfluidic डिवाइस में एक ऊतक मॉडल के साथ Perfusable संवहनी नेटवर्क

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57242
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 1, 3, 2, 1
1Department of Micro Engineering, Kyoto University, 2Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University

Summary

प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक अंडाकार आकृति में एक perfusable संवहनी नेटवर्क इंजीनियर है । है अंडाकार आकृति आसपास के microenvironment angiogenesis प्रेरित करने के लिए तैयार है और एक microchannels डिवाइस में microfluidic को अंडाकार आकृति कनेक्ट । विधि अंडाकार आकृति, जो तीन आयामी संस्कृतियों में एक लंबे समय से प्रतीक्षित तकनीक है की छिड़काव की अनुमति देता है ।

Abstract

एक अंडाकार आकृति (एक कोशिकीय समग्र) मानव शरीर में ऊतकों के रहने का एक अच्छा मॉडल के रूप में माना जाता है । अंडाकार आकृति संस्कृतियों में महत्वपूर्ण उंनति के बावजूद, spheroids में एक perfusable संवहनी नेटवर्क दीर्घकालिक संस्कृति को बनाए रखने और उनके कार्यों, जैसे प्रोटीन अभिव्यक्ति और morphogenesis के विकास के लिए आवश्यक के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है । प्रोटोकॉल एक microfluidic डिवाइस में अंडाकार आकृति के भीतर एक perfusable संवहनी नेटवर्क को एकीकृत करने के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत करता है । अंडाकार आकृति में एक perfusable संवहनी नेटवर्क पैदा करने के लिए, angiogenic microchannels से जुड़े अंकुरित अंडाकार आकृति में मानव फेफड़े angiogenic से fibroblasts कारकों का उपयोग करके अंडाकार आकृति के लिए निर्देशित किया गया । angiogenic अंकुरित अंडाकार आकृति तक पहुंच, endothelial अंडाकार आकृति में सह संस्कृति के साथ विलय, और एक सतत संवहनी नेटवर्क का गठन किया । संवहनी नेटवर्क किसी भी रिसाव के बिना अंडाकार आकृति के इंटीरियर perfuse सकता है । निर्माण संवहनी नेटवर्क आगे पोषक तत्वों की आपूर्ति और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए एक मार्ग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, vivo मेंरक्त परिसंचरण नकल उतार । विधि अंडाकार आकृति संस्कृति में रहने वाले ऊतकों के बेहतर recapitulation की ओर एक नया मंच प्रदान करता है ।

Introduction

एक monolayer से (दो आयामी संस्कृति) एक तीन आयामी संस्कृति से स्थानांतरण के लिए संस्कृति मॉडल है कि रहने वाले ऊतकों1,2,3के सेलुलर कार्य नकल के साथ काम करने की आवश्यकता से प्रेरित है । आमतौर पर सेल संस्कृति में प्रयुक्त फ्लैट और हार्ड प्लास्टिक सब्सट्रेट मानव शरीर में extracellular वातावरण के सबसे समान नहीं है । वास्तव में, कई अध्ययनों से यह है कि तीन आयामी संस्कृति ऊतक विशिष्ट वास्तुकला, यांत्रिक और जैव रासायनिक cues, और सेल-सेल संचार है, जो पारंपरिक दो आयामी संस्कृति4में नहीं देखा गया है बहलाना का प्रदर्शन है, 5,6,7,8.

एक कोशिकीय सकल या अंडाकार आकृति, सबसे होनहार तकनीकों में से एक है इस तीन आयामी संस्कृति का एहसास 9, 10 । कोशिकाओं extracellular मैट्रिक्स (ECM) स्राव और अंडाकार आकृति में दूसरों के साथ बातचीत कर सकते हैं. हालांकि कुछ अंय इंजीनियरिंग11के दृष्टिकोण,12,13,14, जैसे सेल स्टैकिंग, सफलतापूर्वक मानव शरीर के स्थानिक जटिलता को दोहराने, इन दृष्टिकोण केवल दो या तीन है विश्लेषण की आसानी के लिए कोशिकाओं के प्रकार और लक्ष्य अंगों के केवल एक समारोह पर ध्यान केंद्रित । इसके विपरीत, spheroids में कोशिकाओं को विभिंन संस्कृति पोषक तत्वों, ऑक्सीजन की विषम आपूर्ति के कारण अंडाकार आकृति में उनकी स्थिति के आधार पर वातावरण को उजागर कर रहे हैं, और paracrine और अंडाकार आकृति में autocrine संकेत अणुओं । spheroids की यह सुविधा आंशिक रूप से vivo संस्कृति हालत में नकल और कोशिकाओं को सक्षम करने के लिए और अधिक जटिल बनाने के लिए spheroids में, संगठित ऊतक संरचना के इन विट्रो में से उन कल्चरल स्टैकिंग ऊतक9, 15 , 16. ध्यान दें कि यदि किसी अंडाकार आकृति में एक ही प्रकार की कोशिकाएं शामिल होती हैं, तो अंडाकार आकृति में प्रकोष्ठों का कार्य अंडाकार आकृति में विषम वातावरण के कारण एकरूप नहीं होता है. पिछले कुछ वर्षों में, अंडाकार आकृति संस्कृतियों भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की अनुमति दी (ESCs), प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) या ऊतक-निवासी स्टेम कोशिकाओं vivo विकासात्मक दृश्यों में नकल करने के लिए और इस तरह के मस्तिष्क 17 के रूप में मिनी अंगों बहलाना, लिवर18और किडनी19,20.

अंडाकार आकृति संस्कृति तकनीक में उल्लेखनीय प्रगति के बावजूद, संवर्धन बड़े spheroids एक लंबे समय के लिए अभी भी समस्याग्रस्त है । एक तीन आयामी ऊतक में, कोशिकाओं क्योंकि ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की सीमित आपूर्ति के21के एक रक्त वाहिका के 150-200 µm के भीतर स्थित होने की जरूरत है । अंडाकार आकृति के भीतर संवहनी नेटवर्क vivoमें रक्त और ऊतकों के बीच पदार्थों का आदान प्रदान दोहराऊंगा करने के लिए आवश्यक हैं । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, अंय समूहों के22,23,24 या CD31-धनात्मक कोशिकाओं20में pluripotent कोशिकाओं के भेदभाव प्रेरित endothelial कोशिकाओं के साथ सह-कल्चर्ड है । फिर भी, रिपोर्ट पोत तरह संरचनाओं lumina के खुले सिरों को ऑक्सीजन और अंडाकार आकृति के केंद्र के लिए पोषक तत्वों की आपूर्ति नहीं है । संवहनी भूमिका की नकल करने के लिए तीन आयामी संस्कृति में कोशिकाओं को पोषण, खुले समाप्त और perfusable संवहनी नेटवर्क अंडाकार आकृति में विकसित किया जाना चाहिए ।

पिछले कुछ वर्षों के दौरान, कुछ अनुसंधान समूहों microengineering क्षेत्र में एक perfusable संवहनी नेटवर्क का निर्माण करने के लिए तरीकों की सूचना दी, अनायास cocultured fibroblast कोशिकाओं 25 से angiogenic कारकों का उपयोग करके एक microfluidic डिवाइस में गठन ,26. इन संवहनी नेटवर्क vivo समकक्षों में उनके लिए एक समान आकृति विज्ञान है और उन्हें एक अंडाकार आकृति संस्कृति में संवहनी कार्यों नकल उतार के लिए उपयुक्त बनाने, पर्यावरणीय कारकों द्वारा remodeled किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक अंडाकार आकृति में एक perfusable संवहनी नेटवर्क का निर्माण एक microfluidic मंच 27 का उपयोग कर रहा है । microfluidic डिवाइस को पहले से रिपोर्ट किए गए डिवाइस25 से संशोधित किया जाता है ताकि कोई अंडाकार आकृति शामिल हो सके । microchannels में endothelial कोशिकाओं को एक अंडाकार आकृति में fibroblast कोशिकाओं से angiogenic स्राव को निर्देशित करके angiogenic microchannels के साथ anastomosed अंकुरित अंडाकार आकृति और एक perfusable संवहनी नेटवर्क का गठन किया । इस विधि एक अंडाकार आकृति है, जो संवहनी नेटवर्क के साथ एक दीर्घकालिक ऊतक संस्कृति के लिए रूपरेखा प्रदान करता है के इंटीरियर में फ्लोरोसेंट अणुओं और माइक्रोमीटर पैमाने पर मोतियों के रूप में पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला, की एक सीधी डिलीवरी की अनुमति देता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microfluidic डिवाइस मोल्ड का निर्माण

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर (Clewin5 या AutoCAD 2016, आदि) का उपयोग करके microfluidic डिवाइस के प्रतिमान डिज़ाइन करें । Clewin5 के समारोह के लिए, उपयोगकर्ता मैनुअल (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual) देखें ।
    नोट: डिज़ाइन फ़ाइल अनुपूरक फ़ाइल 1में उपलब्ध है ।
  2. एक माइक्रो पैटर्न जनरेटर के लिए डिजाइन फ़ाइल स्थानांतरण और एक क्रोमियम सकारात्मक photoresist के साथ लेपित मुखौटा के साथ उपकरण लोड ।
  3. पैटर्न क्षेत्र में सकारात्मक photoresist एक माइक्रो पैटर्न जनरेटर का उपयोग कर बेनकाब ।
  4. डेवलपर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके सकारात्मक photoresist विकसित करना और मास्क को (DI) पानी के साथ कुल्ला करना ।
  5. क्रोमियम नक़्क़ाशी (सामग्री की मेज) का उपयोग करना, क्रोमियम उजागर क्षेत्र जहां सकारात्मक photoresist हटा दिया गया था में खोदना । DI पानी के साथ मुखौटा कुल्ला ।
  6. शेष photoresist एसीटोन का उपयोग कर मास्क पर निकालें ।
    नोट: पारदर्शिता मास्क सीआर मास्क के लिए एक विकल्प हो सकता है ।
  7. एक स्वच्छ सिलिकॉन वेफर (4 इंच, पी (100)) और स्पिन कोट hexamethyldisilazane (HMDS) 3,000 rpm पर 30 एस के लिए तैयार करें ।
  8. Softbake 120 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए HMDS और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए वेफर शांत ।
  9. Spincoat के लिए 500 आरपीएम पर नेगेटिव photoresist (सामग्री की टेबल) को 10 एस और 1,200 आरपीएम के लिए 30 एस.
    नोट: स्पिन कोटिंग हालत photolithography के बाद वेफर्स पर लगभग 100 µm की मोटाई के साथ photoresist परतों उपज चाहिए ।
  10. 95 ° c पर 45 मिनट के लिए नकारात्मक photoresist सेंकना और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए वेफर शांत ।
  11. प्रत्येक प्रयोग में यूवी प्रकाश की तीव्रता की जांच करें और 250 मेगावाट/cm2में एक कुल जोखिम ऊर्जा खुराक के लिए जोखिम समय की गणना । वेफर पर photomask (कदम 1.1-1.6) प्लेस और उंहें यूवी प्रकाश को बेनकाब ।
  12. Postbake 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नकारात्मक photoresist और 5 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर । वेफर कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए नीचे ठंडा करने की अनुमति दें ।
  13. पहले डेवलपर (सामग्री की तालिका) में 15 मिनट के लिए नकारात्मक photoresist परत का विकास स्नान और दूसरा स्नान में 2 मिनट । 10 एस के लिए पहली isopropanol (आइपीएल) स्नान में वेफर कुल्ला और 10 एस के लिए दूसरे आइपीएल स्नान में ।
  14. Hardbake 200 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नकारात्मक photoresist और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए वेफर शांत ।
  15. एक सतह profiler का उपयोग कर नकारात्मक photoresist परत की मोटाई को मापने ।
  16. एक वैक्यूम पंप से जुड़े एक desiccator में वेफर प्लेस और silane के 200 µ एल जोड़ने (trichloro (एक ज, एक सी, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane) । 10 मिनट के लिए पंप पर बारी है, तो इसे बंद और 4 एच के लिए desiccator में वेफर रखना ।

2. निर्माण कदम और PDMS परतों के विधानसभा

  1. कास्ट polydimethylsiloxane (PDMS) पूर्व बहुलक (PDMS आधार: इलाज एजेंट = 10:1 (डब्ल्यू/डब्ल्यू)) और degas 2 एच के लिए एक निर्वात चैंबर में
  2. एक हवा में रात भर ओवन में 80 ° c पर PDMS इलाज ।
  3. सिलिकॉन वेफर से PDMS को छील लें ।
  4. छिद्र पंच 1a-3 बी (चित्रा 1) और अंडाकार आकृति संस्कृति अच्छी तरह से । छेद 1a के लिए एक 2 मिमी व्यास पंच-3 बी, और अच्छी तरह से अंडाकार आकृति के लिए एक 1 मिमी व्यास पंच का उपयोग करें ।
  5. PDMS स्लैब और एक ग्लास कवर स्लिप (24 मिमी × 24 मिमी) को साफ चिपकने वाला टेप के साथ, बार से चिपके हुए और टेप बंद छीलने से । फिर 40 एस (40 मेगावाट, 50 sccm) के लिए एयर प्लाज्मा के साथ PDMS स्लैब का इलाज ।
  6. बांड PDMS स्लैब पर कांच कवर पर्ची के लिए PDMS स्लैब और कवर पर्ची और इलाज के बीच की सतह से किसी भी हवाई बुलबुले निष्कासित करने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस से कम 12 ज ।

३. अंडाकार आकृति तयारी

नोट: अध्ययन में, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (आरएफपी-HUVECs) और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त HUVECs (GFP-HUVECs) व्यक्त अंडाकार आकृति और microchannels, क्रमशः में उपयोग किया जाता है, के मूल भेद करने के लिए एक perfusable संवहनी नेटवर्क के निर्माण के बाद HUVECs । यदि HUVECs की उत्पत्ति की आवश्यकता नहीं है, तो प्रयोग के लिए अनलेबल्ड HUVECs पर्याप्त हैं ।

  1. गल आरएफपी-HUVECs (3.0 × 105 कोशिकाओं/शीशी) और मानव फेफड़ों fibroblast (hLF) (1.0 × 106 कोशिकाओं/) और उंहें endothelial कोशिकाओं और fibroblast कोशिकाओं के लिए मध्यम के 10 मिलीलीटर में जोड़ें, क्रमशः (सामग्री की तालिका) । संस्कृति उंहें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में एक 100 मिमी डिश में उप के लिए 2-3 दिनों के लिए-धाराप्रवाह आरएफपी-HUVECs और hLFs । यह तैयारी ~ 200 spheroids निकलेगा ।
  2. आरएफपी-HUVECs और hLFs व्यंजन से 0.05% trypsin-EDTA के 2 मिलीलीटर के साथ अलग करें और 10% (v/v) भ्रूण गोजातीय सीरम (trypsin) युक्त DMEM की 4 मिलीलीटर के साथ FBS प्रतिक्रिया रोकें और 1% (v/v) पेनिसिलिन/streptomycin/
  3. 3 मिनट के लिए 220 x जी में केंद्रापसारक के बाद, supernatant को हटा दें, और आरएफपी-HUVECs और hLFs को endothelial माध्यम में 2.5 × 104 और 1.0 × 105 कोशिकाओं में अंतिम सेल सांद्रता के लिए reसस्पेंड/
  4. धीरे सेल निलंबन के 200 µ एल जोड़ें (आरएफपी के लिए 5,000 कोशिकाओं-HUVECs और hLFs के लिए 20,000 कोशिकाओं) प्रति अच्छी तरह से एक 96-अल्ट्रा कम बाध्यकारी सतह के साथ अच्छी तरह से थाली में ।
  5. 2-4 दिनों की अवधि के लिए 37 ° c और 5% CO2 पर 96-अच्छी प्लेट वाली मशीन ।
    नोट: चूंकि अंडाकार आकृति व्यास 96-वेल प्लेट में कल्चरल पीरियड और आरंभिक सेल नंबर पर निर्भर करता है, इसलिए इसे इन दो मापदंडों के आधार पर नियंत्रित किया जा सकता है ।

4. Microfluidic डिवाइस में सेल सीडिंग

नोट: छेद, चैनल और अंडाकार आकृति के लिए नामकरण कन्वेंशन अच्छी तरह से चित्रा1 में प्रदर्शन कर रहे हैं. microfluidic डिवाइस में सेल कटाई समाप्त हो गया है जब हम दिन के रूप में 0 दिन को परिभाषित । प्रयोगात्मक समयसीमा के योजनाबद्ध चित्रा 2में दिखाया गया है ।

  1. Day − 1) अंडाकार आकृति लोडिंग
    नोट: निंनलिखित कदम बर्फ पर कोलेजन और फाइब्रिन के जमाना को रोकने के लिए किया जाना चाहिए ।
    1. फॉस्फेट में फाइब्रिनोजेन भंग (पंजाब) 2.80 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए खारा ।
    2. तैयार बेअसर कोलेजन (3.0 mg/पंजाब में) निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    3. फाइब्रिनोजेन समाधान के १०७.२ µ एल का मिश्रण (2.80 मिलीग्राम/एमएल), बेअसर कोलेजन के 8.0 µ एल (3.0 मिलीग्राम/एमएल), और एक ट्यूब में प्रतिक्रिया प्रति aprotinin (5 यू/एमएल) के 3.6 µ एल । यह समाधान "मास्टर मिश्रण समाधान" (MS) लेबल है ।
      नोट: वॉल्यूम एक अंडाकार आकृति लोड करने के लिए पर्याप्त है । यदि एक से अधिक अंडाकार आकृति है, प्रत्येक खंड spheroids की संख्या से गुणा करें ।
    4. 50 यू/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए पंजाब में thrombin भंग ।
      नोट: Aliquots के 50 यू/एमएल thrombin (20 µ एल ट्यूब) − 30 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाते हैं और प्रत्येक प्रयोग से पहले गल जाते हैं ।
    5. 96-अच्छी प्लेट को spheroids से युक्त रखें ।
    6. इस benchtop (डिश 2) पर बर्फ (डिश 1) और अंय पकवान पर एक डिश के साथ, पेट्री-सुरक्षा कैबिनेट के अंदर २ ३५ मिमी व्यंजन तैयार करते हैं । प्लास्टिक 1 डिश के केंद्र में एमएस के 99 µ एल (एक छोटी बूंद के रूप मेंचित्रा 3) ।
    7. 2 पीले (10-100 µ एल) के सुझावों और 3 स्पष्ट पिपेट टिप्स (1-100 µ एल) के लिए spheroids के संग्रह से 96-अच्छी तरह से प्लेट ट्रिम, एमएस, thrombin के सटीक संग्रह के साथ spheroids मिश्रण, डिवाइस में spheroids इंजेक्शन, और उपकरण में मीडिया इंजेक्शन क्रमशः. टिप का ताकना आकार 1 चैनल और 3 या एक सुखद फिट के लिए 2 चैनल में अच्छी तरह से अंडाकार आकृति के 4 बी छेद के व्यास से थोड़ा बड़ा होना चाहिए ।
      नोट: बाद में, जब तक अंयथा नोट, इस चरण में कटौती पिपेट युक्तियों का उपयोग करें । कट युक्तियों का फोटोग्राफ चित्रा 4में उपलब्ध है ।
    8. 96-वेल प्लेट से मीडियम के 100 µ l के साथ एक अंडाकार आकृति लीजिए और इसे डिश 2 (figure3) में डालिए.
    9. डिश 2 से मीडिया की ंयूनतम मात्रा के साथ अंडाकार आकृति उठाओ । pipettor को पकड़ते समय, अंडाकार आकृति को गुरुत्वाकर्षण द्वारा प्लास्टिक टिप के नीचे की ओर बढ़ना चाहिए । डिश 1 (चित्रा 3ए) में एमएस छोटी बूंद के meniscus पर प्लास्टिक टिप को छूने से अंडाकार आकृति बेदखल ।
      नोट: 4.1.10 & 4.1.11 निंन चरणों का पालन शीघ्रता से किया जाना चाहिए ।
    10. thrombin (50 U/एमएल) के 1 µ एल जोड़ें और पीले प्लास्टिक टिप के साथ धीरे से मिश्रण ।
    11. पिपेट 7 µ एल करने के लिए सेट के साथ, अंडाकार आकृति लेने और धीरे अंडाकार आकृति में अच्छी तरह से जगह(चित्र3 बी).
    12. फाइब्रिन के जमाना के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    13. धीरे छेद 1a और 3 ए से endothelial माध्यम इंजेक्षन और 1 चैनल और मीडिया (20 ~ 30 µ एल/चैनल) के साथ भरें ।
    14. डिवाइस से मीडिया का वाष्पीकरण रोकने के लिए एक 100-mm डिश में एक गीले Kimwipe के साथ रखें (चित्र 3सी) ।
    15. मीडिया और फाइब्रिन के बीच इंटरफेस पर बुलबुले को दूर करने के लिए 24 घंटे के लिए 37 ° c और 5% CO2 पर डिवाइस रखें ।
  2. Day 0) HUVECs लोडिंग
    1. गल GFP-HUVECs (3.0 x 105 कोशिकाएं/शीशी) और उन्हें endothelial मीडियम के 10 मिलीलीटर में डालें । उंहें एक 100 मिमी डिश में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 2-3 दिनों के लिए उप-प्रवाह तक पहुंचने में संस्कृति । उप-धाराप्रवाह GFP-HUVECs की एक डिश 8-10 डिवाइसेज तैयार करने के लिए काफी है ।
    2. GFP-HUVECs व्यंजन से 0.05% trypsin-EDTA के 2 मिलीलीटर के साथ अलग करें और 10% (v/v) भ्रूण गोजातीय सीरम (trypsin) और 1% से युक्त DMEM की 4 मिलीलीटर के साथ FBS प्रतिक्रिया बंद करो (v/v) पेनिसिलिन/streptomycin/
    3. 3 मिनट के लिए 220 x g पर केंद्रापसारक के बाद, GFP-HUVECs को endothelial मीडियम में 5.0 x 106 कोशिकाओं/
    4. HUVECs सेल सस्पेंशन 1 चैनल में छेद 1b के माध्यम से सुई (20 µ एल/
    5. microfluidic डिवाइस 90 ° झुकाव, इस पक्ष पर जगह और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी सुनिश्चित करें कि HUVECs 2 चैनल में फाइब्रिन का पालन करने के लिए ।
      1. फाइब्रिन पर HUVECs के लगाव की पुष्टि करें । जब जेल और मध्यम के बीच अंतरफलक पर संलग्न HUVECs की संख्या पर्याप्त नहीं है, vasculature डिवाइस संस्कृति के कुछ दिनों के बाद संवहनी रूट पर डिस्कनेक्ट किया जा सकता है (चित्रा 5) । प्रोटोकॉल में, छिड़काव की सफलता दर > 50% है ।
    6. चैनल 3 के लिए चरण 4.2.4 और 4.2.5 दोहराएं ।
    7. 7-14 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर एक नम Kimwipe के साथ एक 100 मिमी डिश में संस्कृति कोशिकाओं.
  3. दिन 1 ~) मीडिया एक्सचेंज
    1. एक्सचेंज 1 और 3 हर दिन चैनलों में मीडिया का आधा ।

5. नाभिक धुंधलाना

  1. पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करें ।
  2. चैनल 1 और 3 से मीडिया को निकालें और प्रति चैनल 4% पीएफए के 20 µ l जोड़ें । समाधान को 4% पीएफए में बदलने के लिए, डिवाइस से समाधान निकालना और 4% पीएफए को तीन बार जोड़ना दोहराएं ।
  3. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर डिवाइस की मशीन ।
  4. डिवाइस से 4% पीएफए निकालें और चैनलों को तीन बार पंजाबियों से धोएं ।
  5. जोड़ें 20 µ एल के 10 µ g/मिलीलीटर फ्लोरोसेंट डाई (सामग्री की तालिका) के लिए प्रति चैनल सेलुलर नाभिक दाग । डिवाइस में समाधान विनिमय करने के लिए, डिवाइस से समाधान को हटाने और 10 µ g/एमएल फ्लोरोसेंट डाई तीन बार जोड़ने को दोहराने ।
  6. 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डिवाइस स्टोर ।

6. एक अंडाकार आकृति के द्रव छिड़काव

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर डिवाइस में 7 से अधिक दिनों के लिए संवर्धन के बाद अंडाकार आकृति तैयार करें और 5% CO 2 एक सतत संवहनी मार्ग के पूरा होने के लिए ।
  2. छेद 1a, 1b, 3 ए और बी 1 से मध्यम निकालें ।
  3. fluorescein isothiocyanate (FITC) के 10 µ मी समाधान के 10 µ एल परिचय-पंजाब में छेद 1a और 1b में dextran ।
  4. एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत microbeads या FITC डाई के प्रवाह की निगरानी ।

7. अंकुरित लम्बाई का ठहराव

नोट: ImageJ ver. 1.49 सॉफ्टवेयर इस अध्ययन में छवि के विश्लेषण के सभी के लिए प्रयोग किया जाता है ।

  1. GFP की छवियों-HUVECs दिन 0, 1, 3, 5 और 7 ओवरलैप ।
  2. 1, 3, 5 और 7 दिनों पर लिया छवियों पर एक ही स्थिति से दिन 0 के vasculature टिप की स्थिति घटाना.
  3. मूल स्थिति से संवहनी टिप के विकास का निर्धारण (चित्र 6) । संवहनी टिप और जड़ के बीच की दूरी इस अध्ययन में अंकुर लंबाई (चित्रा 7b) के रूप में परिभाषित किया गया था ।

8. संवहनी कोण की ठहराव

नोट: संवहनी कोण संवहनी कोण, जड़ और अंडाकार आकृति के केंद्र (चित्रा7c) द्वारा शामिल कोण के रूप में परिभाषित किया गया था ।

  1. Binarize coculture अंडाकार आकृति युक्त आरएफपी-HUVECs और उपाय केन्द्रक में विश्लेषण समारोह द्वारा "ImageJ" स्थिति की फ्लोरोसेंट छवियों को शामिल करें । इस अध्ययन में, मापा "केन्द्रक" स्थिति अंडाकार आकृति (चित्रा6) के केंद्र के रूप में परिभाषित किया गया है ।
  2. चरण 7 में उसी तरह संवहनी सुझावों और जड़ों की स्थिति का निर्धारण ।
  3. ImageJ सॉफ्टवेयर में विश्लेषण समारोह का उपयोग कर संवहनी कोण को मापने ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्र 1 microfluidic डिवाइस की डिज़ाइन और फ़ोटो दिखाता है । यह तीन समानांतर चैनल है, जिसमें 2 चैनल अंडाकार आकृति अच्छी तरह से शामिल हैं । चैनल 1 और 3 HUVEC संस्कृति और 2 चैनल के लिए उपयोग किया जाता है अंडाकार आकृति के लिए है । प्रत्येक चैनल trapezoidal microposts पैटर्न PDMS के लिए डिज़ाइन द्वारा अलग है । microposts चैनल में hydrogel 2 चैनलों में रिसाव से 1 और 3 में सतह तनाव से रोकने के लिए और अंडाकार आकृति और HUVECs के बीच microchannels में पदार्थों का आदान प्रदान की अनुमति दें 28 ।

चित्रा 7a कोशिका बोने के बाद एक microfluidic डिवाइस के केंद्र से पता चलता है. उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट 0 दिन पर लिया छवियां दिखाने कि फाइब्रिन जेल 1 और 3 चैनलों में किसी भी रिसाव के बिना ही चैनल 2 भरा है, और HUVECs सफलतापूर्वक फाइब्रिन जेल के sidewall से जुड़ी । उज्ज्वल क्षेत्र छवि दोनों लोड अंडाकार आकृति और microposts पर ध्यान केंद्रित में है, यह दर्शाता है कि अंडाकार आकृति ठीक से डिवाइस के तल पर बसे । angiogenic अंकुरित दिन 1 पर मनाया जाता है और अंकुरित की लंबाई समय के साथ बढ़ जाती है (चित्रा 7b) । 3 दिन, सबसे लंबे अंकुर अंडाकार आकृति पर पहुंच गया और 7 दिन पर, angiogenic अंकुर के अधिकांश अंडाकार आकृति (चैनलों 1 और 3 से अंडाकार आकृति < 500 µm) से औसत दूरी तक पहुंच गया । सबसे अच्छा मामले में, डिवाइस संस्कृति में 4 दिनों के बाद, संवहनी लुमेन के माध्यम से प्रवाह मनाया जा सकता है । संवहनी कोण संवहनी टिप और संवहनी जड़ से अंडाकार आकृति के केंद्र के निर्देशों के रूप में परिभाषित किया गया था । चित्रा 7c डिवाइस संस्कृति में 7 दिनों के दौरान quantified संवहनी कोण से पता चलता है. संवहनी कोण एक समय पर निर्भर तरीके में कमी आई, यह दर्शाता है कि angiogenic अंकुरित अंडाकार आकृति की ओर चले गए ।

चित्रा 8 संवहनी नेटवर्क की धारा जहां आरएफपी-HUVECs और GFP-HUVECs विलय कर दिया है इंगित करता है । आरएफपी-HUVECs और GFP-HUVECs समंवय एक एकल संवहनी लुमेन के रूप में तीर प्रमुखों, जो स्पष्ट रूप से angiogenic 1 और 3 anastomosed से आरएफपी-HUVECs में अंकुरित अंडाकार आकृति और एक सतत संवहनी नेटवर्क का गठन से पता चलता है द्वारा दिखाए गए । संवहनी नेटवर्क के perfusability की पुष्टि करने के लिए, FITC-dextran 1 चैनल में इंजेक्ट किया गया था । FITC-1 चैनल में dextran का निर्माण संवहनी नेटवर्क और अंडाकार आकृति के इंटीरियर में बह गया और अंत में 3 चैनल (चित्रा9) तक पहुंच गया । FITC-dextran सॉल्यूशन के छिड़काव के दौरान, संवहनी नेटवर्क से extravascular स्पेस में कोई रिसाव नहीं होता है । यह पहले दिखाया गया था कि छोटे अणुओं संवहनी लुमेन में इंजेक्शन संवहनी दीवार के माध्यम से पारित और extravascular क्षेत्रों में कोशिकाओं के साथ प्रतिक्रिया. इसके अलावा, संवहनी नेटवर्क की पारगम्यता गुणांक vivo में27के करीब होने के लिए दिखाया गया था । इन परिणामों का मतलब है कि एकीकृत संवहनी नेटवर्क अंडाकार आकृति के लिए पोषक तत्वों की आपूर्ति और अपशिष्ट उत्पाद को हटा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 : डिजाइन और microfluidic डिवाइस की एक तस्वीर. (क) microfluidic डिवाइस के डिजाइन का अवलोकन. धूसर क्षेत्र trapezoidal microposts द्वारा पृथक किए गए तीन microfluidic चैनलों को इंगित करता है. 2 चैनल एक अंडाकार आकृति संस्कृति के लिए एक अच्छी तरह से है । दायां आंकड़ा बाएं में लाल आयत में बढ़े हुए दृश्य को दिखाता है । (ख) microfluidic डिवाइस के फोटोग्राफ जिनके चैनल लाल स्याही से भरे हुए हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्रायोगिक समय. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : microfluidic डिवाइस में एक अंडाकार आकृति लोड करने के लिए विधि . (क) दो अलग पकवानों में एक अंडाकार आकृति के साथ एमएस और मीडिया की एक बूंद बना । फिर, अंडाकार आकृति thrombin के साथ एमएस में स्थानांतरण । (ख) अंडाकार आकृति के इंजेक्शन के दौरान उपकरण के योजनाबद्ध अनुभागीय दृश्य. जेल की अतिरिक्त राशि छेद 2a और बी के माध्यम से बाहर बहती है । हालांकि, अंडाकार आकृति शारीरिक शोधन के कारण डिवाइस के तल पर रहता है । (ग) उपकरणों की योजनाबद्ध जब वे एक मशीन में हैं । गीले Kimwipe को 100 एमएम के डिश में रखा गया था और इस डिवाइस के साथ २ ३५ एमएम के व्यंजन Kimwipe पर रखे गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : डिवाइस के लिए सेल सीडिंग के लिए पिपेट युक्तियों की तस्वीरों में कटौती. बाएं सफेद टिप छेद 1a, 1b, 3 ए और 3 सी के लिए है और फाइब्रिन जेल की एक बूंद को अंडाकार आकृति स्थानांतरित (कदम 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 और 4.2.6) । मध्य पीला टिप 96 से अंडाकार आकृति के संग्रह के लिए है-अच्छी तरह से (कदम 4.1.7) । सही सफेद टिप अंडाकार आकृति के लिए अच्छी तरह से (कदम 4.1.11) है । कट से पहले दिए गए सुझावों को भी फोटोग्राफ में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : Non-perfusable vasculature. microchannels से Angiogenic अंकुर microposts के बीच खोलने के लिए कनेक्ट नहीं किया और लुमेन और microchannels (काले तीर) के बीच संबंध खो दिया है । यह 1 और 3 चैनलों में वरीयता प्राप्त अपर्याप्त HUVECs के कारण होता है । लाल: आरएफपी-HUVECs में अंडाकार आकृति, हरा: GFP-HUVECs से microchannels । कोशिकाओं को 14 दिन तक डिवाइस में कल्चर किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : संवहनी जड़, टिप और अंडाकार आकृति के केंद्र की परिभाषा । (क) विधि संवहनी जड़ और टिप की स्थिति का निर्धारण करने के लिए अंकुर लंबाई को मापने के लिए । समय चूक फ्लोरोसेंट छवियों संरेखित करने के बाद, फ्लोरोसेंट छवि डिवाइस में संवर्धन के बाद कुछ दिनों लिया 0 दिन पर छवि द्वारा घटाया है । हम ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा घटाव के बाद अंकुरित की लंबाई मापा । (ख) अंडाकार आकृति के केंद्र की परिभाषा. आरएफपी-HUVECs के फ्लोरोसेंट छवियों बायनेरिज़ और ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा अपनी केन्द्रक पर मापा जाता है । हम केन्द्रक को अंडाकार आकृति के केंद्र के रूप में परिभाषित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : microfluidic डिवाइस में एक संवहनी नेटवर्क का गठन. (एक) सेल बोने के बाद एक microfluidic डिवाइस के एक केंद्र के समय चूक छवियों । लाल: आरएफपी-HUVECs में कल्चर्ड अंडाकार आकृति, ग्रीन: GFP-HUVECs 1 और 3 चैनलों में काटा । अंकुरित लंबाई का मात्रात्मक विश्लेषण (b) और संवहनी कोण (c) (n = 42 अंकुरित 3 उपकरणों में, त्रुटि पट्टियों मानक त्रुटियां (एसई) इंगित करता है) । अंकुर लंबाई 0 दिन पर संवहनी टिप (बी, ऊपर) को HUVECs की स्थिति से दूरी के रूप में परिभाषित किया गया था । कोण (∠ टीआरएस) संवहनी जड़ (आर), टिप (टी) और अंडाकार आकृति (एस) (सी, ऊपर) के केंद्र द्वारा परिभाषित किया गया था । नाड़ी जड़, टिप और अंडाकार आकृति के केंद्र की परिभाषा के लिए चित्रा 6 देखें. इन आंकड़ों ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त किया गया । अंकुरित लंबाई और संवहनी कोण की परिभाषा समझा योजनाबद्ध Nashimoto, Y. et अल से संशोधित कर रहे हैं । 27. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8 : microchannels और अंडाकार आकृति से HUVECs द्वारा संवहनी लुमेन का गठन . (एक) डिवाइस संस्कृति में 14 दिनों के बाद नमूने के अवलोकन के फ्लोरोसेंट छवि । पीला आयत (b) में दर्शाए गए ऑप्टिकल अनुभाग की x-y स्थिति को इंगित करता है । (ख) x-y, y-z और x-z निर्माण संवहनी नेटवर्क के ऑप्टिकल अनुभाग । सफेद तीर संवहनी लुमेन संकेत. लाल: आरएफपी-HUVECs में कल्चर्ड अंडाकार आकृति, ग्रीन: HUVECs, ब्लू: सेलुलर microchannels में GFP-नाभिक कल्चर्ड । (क) कोई नीली प्रतिदीप्ति दिखाता है क्योंकि (क) निर्धारण से पहले की छवि है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : छिड़काव एक अंडाकार आकृति का निर्माण संवहनी नेटवर्क का उपयोग कर । उज्ज्वल क्षेत्र (क) और फ्लोरोसेंट (बी) अंडाकार आकृति की छवियां डिवाइस संस्कृति में 7 दिनों के बाद । (ग) FITC-dextran (70 केडीए) लोडिंग के बाद उसी अंडाकार आकृति की फ्लोरोसेंट इमेज. लाल: आरएफपी-HUVECs में अंडाकार आकृति और चैनल 1 और 3, ग्रीन: FITC-dextran, ब्लू: सेलुलर नाभिक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फ़ाइल 1: microfluidic डिवाइस का डिज़ाइन. फ़ाइल dxf स्वरूप में है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पिछले रिपोर्टों से पता चलता है कि hLFs इस तरह के angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte वृद्धि कारक के रूप में कई angiogenic कारकों, के एक कॉकटेल स्रावित, विकास कारक बदलने-α, ट्यूमर परिगलन कारक और कुछ extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन29, 30. यह परख एक coculture अंडाकार आकृति है, जो तकनीक की सीमा है में hLFs से angiogenic स्राव पर निर्भर करता है । इसलिए, यह एक स्थिर संवहनी गठन के लिए महत्वपूर्ण है एक अच्छी तरह से इतना है कि coculture अंडाकार आकृति और HUVECs में 1 और 3 चैनलों में coculture के बीच की दूरी को छोटा किया जा सकता है के तल पर एक अंडाकार आकृति सेट । fibroblasts से संवहनी लंबाई व्युत्क्रम endothelial कोशिकाओं और fibroblasts के बीच की दूरी के लिए आनुपातिक था31, ताकि कम दूरी स्थिर संवहनी गठन के लिए लाभप्रद है । हालांकि, एक अंडाकार आकृति छेद खोलने के लिए (व्यास में 1 मिमी) हानिकारक चैनल 1 और 3 के बिना, चैनल 2 की ंयूनतम चौड़ाई 1.5 मिमी थी ।

हालांकि अंडाकार आकृति अच्छी तरह के तल पर बसा, नाड़ी जड़ों कभी-कभार microposts या microchannels (चित्रा5) से डिस्कनेक्ट कर दिया गया था । इस मामले में, कोई एजेंट microchannels (चैनल 1 या 3) के माध्यम से संवहनी लुमेन तक पहुँच सकता है. हालांकि हम इस समस्या को पूरी तरह से हल नहीं कर सका, हम अनुमान है कि समस्या फाइब्रिन जेल (चरण 4.2.1-4.2.6) की सतह पर HUVECs की अपर्याप्त संख्या के कारण है । सुनिश्चित करें कि HUVECs छुरा 2 चैनल के पक्ष की दीवार देते हैं ।

अच्छी तरह से में एक अंडाकार आकृति के सफल इंजेक्शन की ओर, आंतरिक और बाहरी व्यास का अनुकूलन चरण में micropipette सुझाव 4.1.7 महत्वपूर्ण है: 1) भीतरी व्यास अंडाकार आकृति की तुलना में बड़ा होना चाहिए । 2) बाहरी डायमीटर को अच्छी तरह से किनारे पर फिट करना चाहिए ताकि इंजेक्शन के दौरान कोई भी लीकेज अच्छी तरह से ऊपर न हो और जेल इंजेक्शन के बाद टिप को आसानी से निकाला जा सके । वर्तमान प्रोटोकॉल में (एक अंडाकार आकृति के φ1 mm अच्छी तरह से), लगभग 700 µm इंजेक्शन अंडाकार आकृति के लिए अधिकतम व्यास है । अगर अच्छी तरह से व्यास है कि इस प्रोटोकॉल में, बड़ा spheroids क्योंकि टिप बड़ा भीतरी व्यास है काटा जा सकता है इंजेक्ट किया जा सकता से बड़ा बनाया गया है । अंडाकार आकृति व्यास 96-वेल प्लेट में काटी गई कोशिका संख्या को बदलकर आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल सबसे पहले एक अंडाकार आकृति में एक perfusable संवहनी नेटवर्क का निर्माण करने के लिए उपंयास microfluidic मंच से पता चलता है । हालांकि HUVECs के साथ coculture एक अंडाकार आकृति में पोत की तरह संरचनाओं के गठन की अनुमति देता है 18, 23, 24, इन lumina के मृत सिरों के कारण perfusable नहीं थे । क्योंकि fibroblast कोशिकाओं बहुमुखी ऊतकों में मौजूद (हड्डी, adipocyte और कैंसर, आदि), coculture अंडाकार आकृति के लिए कुछ अन्य लक्ष्यीकरण कोशिकाओं के अलावा द्वारा, vascularization की एक विभिन्न प्रकार की एक spheroids की उम्मीद की जा सकती है, जो में नकल कर सकते हैं वीवो वातावरण परम्परागत अंडाकार आकृति कल्चर से बेहतर है । तकनीक के आवेदन का विस्तार करने के लिए, भविष्य के काम fibroblast कोशिकाओं के अलावा बिना spheroids के vascularization शामिल होंगे । कुछ हाल ही में काम करता है रिपोर्ट अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं32 और मांसपेशी कोशिकाओं33 microfluidic उपकरणों में angiogenesis पैदा कर सकते हैं. fibroblast कोशिकाओं के बजाय stromal या मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग ऊतकों कि microfluidic डिवाइस में संवहनी किया जा सकता है की संख्या में वृद्धि होगी । इस प्रोटोकॉल ऊतक vascularization, जो तीन आयामी संस्कृतियों के क्षेत्र में एक लंबे समय से प्रतीक्षित तकनीक है के लिए एक बुनियादी मंच प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक की घोषणा की है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम शिखा JST (ग्रांट नंबर JPMJCR14W4), सोसायटी ऑफ साइंस (JSPS) KAKENHI (ग्रांट नंबर २५६०००६०, 16K16386), MEXT और JST से नवाचार कार्यक्रम के केंद्र, परियोजना से प्रमुख मूल्यांकन प्रौद्योगिकी के विकास पर केंद्रित द्वारा समर्थित था जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एण्ड डेवलपमेंट, एमएड, मिजुहो फाउंडेशन फॉर प्रमोशन ऑफ साइंसेज । Microfabrication को क्योटो यूनिवर्सिटी नैनो टेक्नोलॉजी हब का सपोर्ट मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD 2017 Autodesk AutoCAD 2017
A chromium mask coated with AZP 1350. CLEAN SURFACE TECHNOLOGY CBL2506Bu-AZP
Micro pattern generator Heidelberg uPG101
MF CD-26 developer Rohm and haas electronic materials - Developer in protocol 1.4
S-Clean Sasaki Chemical S-24 Chromium etchant in protocol 1.5
Aceton Wako 012-00343
Silicon Wafer Canosis SiJ-4
Spin Coater MIKASA 1H-D7
Hexamethyldisilazane (HMDS) Tokyo Ohka Kogyo H0089
SU-8 3050 MicroChem - Negative photoresist in protocol 1.9
UV Exposure Nanometric Technology Inc LA310s
SU-8 Developer MicroChem Y020100 Developer for the negative photoresist in protocol 1.13
2-propanol Wako 163-04841
Surface profiler Veeco Veeco Dektak XT-S
(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma 448931
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Toray 184W/C
Biopsy Punch (1.0mm)  Kai Industries BP-10F
Biopsy Punch (2.0mm)  Kai Industries BP-20F
Plasma System Femto Science COVANCE
Cover glass MATSUNAMI GLASS C024241
Culture Dishes Iwaki 1000-035
RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell Angio Proteomie cAP-0001RFP
Normal Human Lung Fibroblasts Lonza CC-2512
Endothelial Cell Growth Medium Lonza CC-3162
Fibroblast Growth Media Kits Lonza CC-3132
DMEM Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 26140079
Penicillin-Streptomycin Solution Wako 168-23191
0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red Wako 204-16935
PBS (Phosphate Buffered Salts) Takara bio T900
96-well plate Sumitomo bakelite 631-21031
1000ul Chip NIPPON Genetics FG-402
200ul  Chip NIPPON Genetics FG-301
10ul Chip NIPPON Genetics 37650
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Model 370
GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell Angio Proteomie cAP-0001GFP
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Aprotinin from bovine lung Sigma A6279
Collagen I Corning 354236
Thrombin from bovine plasma Sigma T4648
Hoechst 33342 Invitrogen H21492 Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5
Paraformaldehyde Solution Wako 163-25983
Inverted Fluorescence Microscope OLYMPUS IX71
Degital CCD Camera OLYMPUS ORCA-R2
Confocal Laser Scanning Biological Microscope OLYMPUS FV1000
Inverted Fluorescence Microscope OLYMPUS IX-83
Fluorescein isothiocyanate-dextran Sigma FD70S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
  5. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  6. Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
  8. Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  11. Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
  12. Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  17. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
  18. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
  19. Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  20. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  21. Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
  22. Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
  23. Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
  24. Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
  25. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  26. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  27. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  28. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  29. Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
  30. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  31. Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
  32. Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
  33. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).

Tags

इंजीनियरिंग अंक 134 संवहनी नेटवर्क microfluidic डिवाइस टिशू कल्चर अंग-पर-a-चिप angiogenesis अंडाकार आकृति त्रि-आयामी संस्कृति
एक Microfluidic डिवाइस में एक ऊतक मॉडल के साथ Perfusable संवहनी नेटवर्क
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nashimoto, Y., Teraoka, Y., Banan… More

Nashimoto, Y., Teraoka, Y., Banan Sadeghian, R., Nakamasu, A., Arima, Y., Hanada, S., Kotera, H., Nishiyama, K., Miura, T., Yokokawa, R. Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (134), e57242, doi:10.3791/57242 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter