Summary
Протокол описывает инженер perfusable сосудистой сети в сфероида. Окружающие микроокружения сфероида разрабатывается побудить ангиогенеза и подключить сфероида к микроканалов microfluidic устройства. Метод позволяет перфузии сфероида, который является долгожданный технику в трехмерном культур.
Abstract
Сфероиде (многоклеточных совокупности) рассматривается как хорошая модель живых тканей в организме человека. Несмотря на значительные улучшения в культурах сфероида perfusable сосудистой сети в сфероидов остается важнейшей задачей для долгосрочной культуры, необходимо поддерживать и развивать их функции, такие как выражения протеина и морфогенеза. Протокол представляет новый метод для интеграции perfusable сосудистой сети в пределах сфероида microfluidic устройства. Чтобы побудить perfusable сосудистой сети в сфероида, ангиогенных ростки, подключенных к микроканалов на сфероиде руководствовались используя ангиогенных факторов от человеческих легких фибробластов, культивируемых в сфероида. Ростки ангиогенных достиг сфероида, объединилась с эндотелиальных клеток, совместно культивируемых в сфероида и формируется непрерывный сосудистой сети. Сосудистой сети может perfuse интерьер сфероида без какой-либо утечки. Сконструированный сосудистой сети может далее использоваться в качестве маршрута для поставки питательных веществ и удаления отходов, имитируя циркуляцию крови в vivo. Этот метод предоставляет новую платформу в культуре сфероида сторону лучше перепросмотре живых тканей.
Introduction
Переход от монослойном культивировании (двухмерный) к трехмерной культуре мотивируется необходимость работы с моделями культуры, которые имитируют клеточных функций живых тканей1,2,3. Плоские и жесткие пластиковые субстраты, широко используется в культуре клеток не напоминают большую часть внеклеточных средах в человеческом теле. В самом деле многие исследования показывают, что трехмерная культуры воссоздать ткани конкретных архитектуры, механические и биохимических подсказки и связи ячеек, которые не наблюдались в обычных двумерных культуры4, 5,6,,78.
Мультиклеточные агрегат или сфероида, является одним из наиболее перспективных методов для реализации этой трехмерной культуры9,10. Клетки секретируют внеклеточного матрикса (ECM) и может взаимодействовать с другими в сфероида. Хотя некоторые другие биоинженерии подходы11,12,13,14, например, клеток укладки, успешно реплицировать пространственная сложность человеческого тела, эти подходы имеют только два или три виды клеток для облегчения анализа и сосредоточены на только одной функции органов-мишеней. В отличие от клеток в сфероидов подвергаются различные культуры среды в зависимости от их позиции в сфероида из-за разнородных поставки питательных веществ и кислорода и паракринными Аутокринный сигнальных молекул в сфероида. Эта особенность сфероидов частично имитирует в естественных условиях состояния культуры и включить клетки в сфероидов для создания гораздо более сложной, организованной ткани структуры в vitro чем те, которые культивировали в укладки ткани9, 15 , 16. Обратите внимание, что если сфероиде состоит из одного вида клеток, функции клеток в сфероида не равномерное вследствие неоднородной среды в сфероида. В последние несколько лет сфероиде культур позволило эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) или ткани резидентов стволовые клетки, чтобы имитировать в естественных условиях развития последовательностей и воссоздать мини органы как мозг17, печени18и почек19,20.
Несмотря на значительный прогресс в сфероида культуры техники по-прежнему проблематично культивирования большой сфероидов долгое время. В трехмерные ткани клетки должны быть расположены в пределах 150-200 мкм кровеносного сосуда из-за ограниченное количество кислорода и питательных веществ,21. Сосудистой сети в пределах сфероида необходимы для пилки обмена веществ между кровью и тканями в естественных условиях. Для достижения этой цели, другие группы совместно культивируемых эндотелиальных клеток с целевой ячейки22,,2324 или индуцированной дифференцировка плюрипотентных клеток в CD31-положительных клеток20. Тем не менее сообщил корабля как структуры не имеют открытые концы lumina на поставку кислорода и питательных веществ в центр сфероида. Чтобы имитировать сосудистой роль питают клетки в трехмерном культуре, открытого и perfusable сосудистой сети должны разрабатываться в сфероида.
В течение последних нескольких лет некоторые исследовательские группы в поле микротехники сообщили методы построить perfusable сосудистой сети, спонтанно формируется в устройстве microfluidic используя ангиогенных факторов от cocultured фибробластов клетки25 ,26. Эти сосудистой сети имеют аналогичные морфология с их коллегами в естественных условиях и может быть перестроен факторами окружающей среды, что делает их пригодными для подражая сосудистой функции в культуре сфероида. Цель настоящего Протокола заключается в строительстве perfusable сосудистой сети в сфероида, используя microfluidic платформа27. Microfluidic устройство изменяется от ранее сообщалось устройство25 , так что сфероиде могут быть включены. Направляя ангиогенных секреции от клетки фибробластов в сфероиде эндотелиальных клеток в микроканалов, ангиогенных ростки от микроканалов, анастамозные с сфероида и сформировали perfusable сосудистой сети. Этот метод позволяет прямой поставкой широкого круга веществ, таких как флуоресцентных молекул и микрометр шкала бусины в интерьер сфероиде, который обеспечивает основу для долгосрочной культуры ткани с сосудистой сети.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление прессформы Microfluidic устройства
- Дизайн-шаблон microfluidic устройства с использованием имеющегося программного обеспечения (Clewin5 или AutoCAD 2016, и т.д.). Для функции Clewin5 смотрите руководство пользователя (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
Примечание: Файл дизайн доступен в дополнительных файлов 1. - Перенесите файл дизайн микро модель генератора и загрузить инструмент с маской хром покрытием с позитивного фоторезиста.
- Разоблачить позитивного фоторезиста в области шаблон, с помощью микро модель генератора.
- Развитие позитивного фоторезиста, используя разработчик (Таблица материалов) и промойте маску с дейонизированной водой (DI).
- Использование хрома etchant (Таблица материалов), etch хрома в пораженном участке, где был удален позитивный фоторезист. Смыть маску водой ди.
- Удалите оставшиеся фоторезиста на маску с помощью ацетона.
Примечание: Маски прозрачности может быть альтернативой для Cr маски. - Подготовьте чистую кремниевой пластины (4 дюйма, P(100)) и спин пальто Гексаметилдисилазан (ГМДО) при 3000 об/мин за 30 s.
- Softbake HMDS 5 мин при 120 ° C и прохладный пластины для 5 мин при комнатной температуре.
- Spincoat негативного фоторезиста (таблица материалов) на 500 rpm для 10 s и 1200 об/мин за 30 s.
Примечание: Состояние покрытия спина должна принести слоёв фоторезиста с толщиной примерно 100 мкм на пластинах после фотолитографии. - Prebake негативного фоторезиста для 45 мин при 95 ° C и прохладный вафельные для 60 мин при комнатной температуре.
- Проверка интенсивности света в каждом эксперименте и рассчитать время экспозиции для общей экспозиционной дозы энергии на 250 МВт/см2. Место фотошаблонов (шаг 1.1-1.6) на пластины и подвергать их УФ-излучения.
- Postbake негативного фоторезиста за 1 мин при температуре 65 ° C и 5 мин при 95 ° C. Разрешить вафельные остыть в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Разработка слой негативного фоторезиста для 15 мин в первой ванной разработчик (Таблица материалов) и 2 мин в втором баня. Промойте пластины в первой ванной изопропиловый спирт (IPA) для 10 s и второй ванной АПИ для 10 s.
- Hardbake негативного фоторезиста на 30 минут при 200 ° C и прохладный пластины для 5 мин при комнатной температуре.
- Измерьте толщину слоя негативного фоторезиста, используя профилировщик поверхности.
- Поместите пластины в эксикатор, подключенных к вакуумного насоса и 200 мкл силана (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Включите насос за 10 мин, затем выключите его и держите пластины в эксикатор для 4 ч.
2. Изготовление шаги и Ассамблея PDMS слоев
- Литой полидиметилсилоксан (PDMS) предварительно полимера (PDMS база: Вулканизирующий агент = 10:1 (w/w)) и Дега в вакуумной камере за 2 ч.
- Лечение PDMS при 80° C в воздух вентилируемые печи на ночь.
- Отделите PDMS из кремниевой пластины.
- Пробейте отверстия 1A - 3B (рис. 1) и культура сфероида хорошо. Используйте удар диаметром 2 мм для отверстий 1A - 3B и диаметром 1 мм удар для сфероида хорошо.
- Очистите плиты PDMS и стекла Крышка выскальзования (24 × 24 мм) с клейкой лентой, неоднократно наклеивания и отшелушивающим ленты. Затем обработать PDMS плиты с воздуха плазмой для 40 s (40 МВт, 50 sccm).
- Бонд PDMS плиты на стекла Крышка выскальзования высылать воздушные пузыри от поверхности между PDMS плиты и крышка выскальзования и лечения при 80 ° C в течение 12 часов.
3. сфероида подготовка
Примечание: В исследовании, красный флуоресцирующий белок, выражая человеческие пупочной вены эндотелиальных клеток (ППК-HUVECs) и выражая Зеленый флуоресцирующий белок HUVECs (GFP-HUVECs) используются в сфероида и микроканалов, соответственно, чтобы отличить происхождение HUVECs после строительства perfusable сосудистой сети. Если происхождение HUVECs не нужна, неподписанном HUVECs являются достаточно для эксперимента.
- Оттепель ЗП-HUVECs (3.0 × 105 клеток/флакона) и легкое человека фибробластов (hLF) (1.0 × 106 клеток/флакона) и добавить их в 10 мл среды для эндотелиальные клетки и клетки фибробластов, соответственно (Таблица материалов). Культура их в 100-мм блюдо на 37 ° C и 5% CO2 на 2-3 дней для югу вырожденная ЗП-HUVECs и hLFs. Эта подготовка будет выход ~ 200 сфероидов.
- Отсоединить ЗП-HUVECs и hLFs из блюд с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и остановить трипсина реакции с 4 мл DMEM, содержащие 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина.
- После центрифугирования в 220 g x 3 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте ЗП-HUVECs и hLFs в эндотелиальных средне окончательный клеток концентрации на 2,5 × 104 и 1.0 × 105 кл/мл, соответственно.
- Аккуратно добавьте 200 мкл суспензии клеток (5000 ячейки для ЗП-HUVECs) и 20 000 hLFs на хорошо в 96-луночных плита с ультра-низким привязки поверхностью.
- Инкубируйте 96-луночных пластины при 37 ° C и 5% CO2 в течение 2-4 дней.
Примечание: Поскольку сфероида диаметр зависит от культуры периода и первоначальный мобильный номер в 96-луночных пластины, он может управляться этими двумя параметрами.
4. клетки посева в Microfluidic устройства
Примечание: Именования для отверстия, каналы и сфероида хорошо демонстрируются на рисунке 1. Мы определяем день 0 как день, когда ячейка уборки в устройство microfluidic закончена. Схема экспериментальной график показан на рисунке 2.
- Загрузка сфероида день −1)
Примечание: Следующий шаг должен выполняться на льду для предотвращения гелеобразования коллагена и фибрином.- Растворите фибриногена в фосфатный буфер (PBS) для окончательного концентрации 2,80 мг/мл.
- Подготовьте нейтрализованы коллагена (3,0 мг/мл в PBS) согласно протоколу производителя.
- Объедините 107.2 мкл раствора фибриногена (2,80 мг/мл), 8.0 мкл нейтрализованы коллагена (3,0 мг/мл) и 3.6 мкл Апротинин (5 ед/мл) в реакции в трубку. Это решение обозначено как «мастер смесь решение» (МС).
Примечание: Объем достаточен для загрузки одним сфероид. Если имеется более одного сфероида, умножьте количество сфероидов каждого тома. - Растворите тромбина в PBS для конечной концентрации 50 ед/мл.
Примечание: Аликвоты 50 ед/мл тромбина (20 мкл/трубка) хранятся в −30 ° C и разморожен перед каждой эксперимент. - Место пластину 96-луночных, содержащий сфероидов внутри шкафа биобезопасности.
- Подготовьте два Петри 35-мм внутри шкафа, с одно блюдо на льду (1 блюдо) и другое блюдо на benchtop (блюдо 2) биобезопасности. Накапайте 99 µL из MS в центре блюдо 1 (рис. 3a) в форме капли.
- Обрежьте кончики 2 желтый (10-100 мкл) и 3 Очистите наконечники (1-100 мкл) для сбора сфероидов от 96-луночных пластины, смешивая тромбина с МС, точные коллекции сфероидов, впрыскивать сфероидов в устройство и инъекционных средств массовой информации в устройство , соответственно. Размер пор кончика должно быть немного больше, чем диаметр отверстия 1A - 3B каналов 1 и 3 или сфероида хорошо в канале 2 для snug вписывается.
Примечание: Далее, если не указано иное, используйте пипетку советы, сократить в этом шаге. Фотография среза советы доступны на рисунке 4. - Собирать сфероиде с 100 мкл среды от 96-луночных пластины и добавить его в блюдо 2 (рис. 3a).
- Подберите сфероида с минимальным объемом средств массовой информации из блюдо 2. Удерживая дозаторов вертикально, сфероида должен двигаться в направлении нижней части кончика пипетки самотеком. Сфероида выкинуть прикоснувшись наконечник пипетки на мениск MS капелька в блюдо 1 (рис. 3a).
Примечание: Следующие шаги 4.1.10 & 4.1.11 должны выполняться быстро. - 1 мкл тромбина (50 ед/мл) и перемешать аккуратно с кончик желтый пипетки.
- С пипеткой, равным 7 мкл подобрать сфероида и медленно, поместите его в скважину сфероида (рис. 3b).
- Инкубируйте 15 мин при 37 ° C для гелеобразования фибрина.
- Медленно вводить эндотелиальной среднего от отверстия 1A и 3A и заполнить каналы 1 и 3 с СМИ (20 ~ 30 мкл/канал).
- Поместите устройство в 100-мм блюдо с мокрой Kimwipe для предотвращения испарения СМИ от устройства (рис. 3 c).
- Поместите устройство на 37 ° C и 5% CO2 для 24 h удалить пузырьки на стыке между СМИ и фибрином.
- HUVECs день 0) Загрузка
- Оттепель GFP-HUVECs (3,0 x 105 клеток/флакона) и добавить их в 10 мл эндотелиальной среды. Культура их в тарелку 100-мм при 37 ° C и 5% CO2 на 2-3 дней, чтобы достичь суб confluency. Одно блюдо югу вырожденная GFP-HUVECs достаточно для приготовления 8-10 устройств.
- Отсоединить GFP-HUVECs из блюд с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и остановить трипсина реакции с 4 мл DMEM, содержащие 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина.
- После центрифугирования в 220 g x 3 мин Ресуспензируйте GFP-HUVECs в среде эндотелиальной 5.0 x 106 клеток/мл.
- Инъекционные суспензии клеток HUVECs в канал 1 через отверстие 1B (20 мкл/канал).
- Наклоните устройство microfluidic 90°, поместите его на стороне и инкубировать при 37 ° C за 30 минут, чтобы обеспечить соблюдение HUVECs фибрина в канале 2.
- Подтвердите вложение HUVECs на фибрин. Когда количество HUVECs, придает на стыке между гелем и среднего не является достаточным, сосудистую может быть отключен в корне сосудистых после нескольких дней культуры устройства (рис. 5). В протоколе, успех перфузии составляет > 50%.
- Повторите шаги 4.2.4 и 4.2.5 для канала 3.
- Культура клетки в 100-мм блюдо с влажной Kimwipe при 37 ° C и 5% CO2 на 7-14 дней.
- День 1 ~) Обмен СМИ
- Обмен половина средств массовой информации в каналах 1 и 3 каждый день.
5. окрашивания ядер
- Подготовьте параформальдегида 4% (PFA) в PBS.
- Извлеките из каналы 1 и 3 и 20 мкл 4% PFA на канал. Чтобы заменить решение в 4% PFA, повторить удаление решения из устройства и добавление 4% PFA три раза.
- Инкубируйте устройство на 4 ° C на ночь.
- Удалите 4% PFA от устройства и мыть каналы три раза с PBS.
- 20 мкл 10 мкг/мл Люминесцентную краску (Таблица материалов), на канал пятно клеточных ядер. Для обмена решение в устройство, повторите удаление решения из устройства и добавление 10 мкг/мл Люминесцентную краску три раза.
- Храните прибор при температуре 4 ° C на 24 часа.
6. жидкости перфузии сфероида
- Подготовьте сфероида после культивирования для более чем 7 дней в устройстве при 37 ° C и 5% CO2 для завершения непрерывной сосудистые пути.
- Удалите носитель из отверстия 1A, 1B, 3A и 3B.
- Ввести 10 мкл 10 мкм решения флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстрана в PBS в отверстия 1A и 1B.
- Мониторинг потока микрошарики или FITC краска под инвертированным микроскопом.
7. Количественная оценка длины Росток
Примечание: ImageJ ver. 1,49 программное обеспечение используется для анализа изображения в этом исследовании.
- Перекрытие изображений GFP-HUVECs дней, 0, 1, 3, 5 и 7.
- Вычтите положение кончика сосудистую день 0 из той же позиции на снимки, сделанные на 1, 3, 5 и 7 дней.
- Определите рост сосудов подсказка от корневого позиции (рис. 6). Расстояние между сосудистой наконечник и корень был определен как длина прорастают в этом исследовании (рис. 7b).
8. Количественная оценка сосудистой углов
Примечание: Сосудистая угол был определен как угол состояла сосудистой угол, корень и центр сфероида (рис. 7 c).
- Бинаризация флуоресцентного изображения coculture сфероида, содержащих ЗП-HUVECs и измерить положение «центр тяжести», функции анализа в ImageJ. В этом исследовании измеренные «центр тяжести» положение определяется как центр сфероида (рис. 6).
- Определите положение сосудистой советы и корни в так же, как в шаге 7.
- Измерьте сосудистой углов с помощью функции анализа в ImageJ программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает, Дизайн и фото microfluidic устройства. Она имеет три параллельных каналов, в котором канал 2 содержит сфероида хорошо. Для культуры HUVEC используются каналы 1 и 3 и 2 канал для сфероида. Каждый канал отделяется трапециевидной microposts предназначен шаблон PDMS. Microposts предотвратить гидрогеля на канале 2 от утечки в каналах 1 и 3, поверхностное натяжение и позволяют обмена веществ между сфероида и HUVECs в микроканалов28.
7а Рисунок показывает центр microfluidic устройства после заполнения ячейки. Яркие области и флуоресцентных изображений, снятых в день 0 показывают, что фибрина Гель заполнены только канал 2 без какой-либо утечки в каналы 1 и 3, и HUVECs успешно подключился к боковине гель фибрина. Светлые области изображения находится в фокусе на обоих загруженного сфероида и microposts, указав, что сфероида должным образом урегулирован в нижней части устройства. Ростки ангиогенных наблюдаются на 1 день и длина проростков увеличивается с течением времени (рис. 7b). На 3 день длинный Росток достиг сфероида, и на 7 день, большая часть ангиогенных ростки достигла сфероида (среднее расстояние от каналы 1 и 3 на сфероиде < 500 мкм). В лучшем случае после 4 дней в культуре устройства, можно наблюдать поток через сосудистые люмен. Сосудистые угол был определен как направления кончик сосудистой и центр сфероида от сосудистых корня. Рисунок 7 c показывает количественных сосудистой угол во время 7 дней в культуре устройства. Сосудистая углы сократилась в зависимости от времени, указывающее, что ростки ангиогенных мигрировали к сфероида.
Рисунок 8 показывает раздел сосудистой сети, где слились ЗП-HUVECs и GFP-HUVECs. ЗП-HUVECs и GFP-HUVECs соответственно сформировали единый сосудистой люмен как показано стрел, который четко указывают ангиогенных ростки от каналы 1 и 3, анастамозные для ЗП-HUVECs в сфероида и сформировали непрерывной сосудистой сети. Для подтверждения perfusability сосудистой сети, FITC-декстран было впрыснуто в канал 1. FITC-декстрана в канале 1 пропустило в построенных сосудистой сети и интерьер сфероида и наконец достигли канал 3 (рис. 9). Во время перфузии FITC-декстран решения нет никакой утечки из сосудистой сети в внесосудистой пространства. Ранее было показано, что малые молекулы, вводят в просвете сосудов проходят через сосудистую стенку и реагировать с клетками в внесосудистой регионах. Кроме того коэффициент проницаемости сосудистой сети было показано рядом что в естественных условиях27. Эти результаты подразумевают что интегрированной сосудистой сети может поставлять питательные вещества для сфероида и удаления отходов продукта.
Рисунок 1 : Дизайн и фотография устройства microfluidic. a обзор дизайн microfluidic устройства. Серая область указывает три microfluidic каналы, разделенные трапециевидной microposts. Канал 2 имеет хорошо сфероида культуры. Правом рисунке показано увеличенное изображение в красный прямоугольник в левом. (b) фотография microfluidic устройства, чьи каналы заполнены с красными чернилами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Экспериментальная время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Метод для загрузки в устройство microfluidic сфероида. a обеспечения падение MS и СМИ с сфероиде в двух отдельных блюд. Затем перевести сфероида на MS с тромбина. (b) Схематический разрез устройства во время инъекции сфероида. Избыточное количество геля вытекает через отверстия 2A и 2B. Однако сфероида остается в нижней части устройства из-за физической изоляции. (c) схема устройства, когда они находятся в инкубаторе. Мокрые Kimwipe был помещен в блюдо 100-мм и два блюда 35-мм с устройством были поставлены на Kimwipe. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Фотографии наконечники вырезать для посева на устройство ячейки. Левый белый кончик предназначен для отверстия 1A, 1B, 3A и 3C и передачи сфероида капля геля фибрина (шаги 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 и 4.2.6). Средний Желтый наконечник предназначен для коллекции сфероида от 96-луночных (шаг 4.1.7). Право белым кончиком предназначен для хорошо сфероида (шаг 4.1.11). Советы перед вырезать также показан на фотографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Non-perfusable сосудистую. Ангиогенных ростки от микроканалов не удалось подключиться к открытию между microposts и потерял связь между люмен и микроканалов (черные стрелки). Это вызвано недостаточной HUVECs посеяны в каналах 1 и 3. Красный: ППП-HUVECs в сфероида, зеленый: GFP-HUVECs от микроканалов. Клетки были культивировали в устройстве на 14 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Определение сосудистой корень, наконечник и центр сфероида. () метод для определения позиции сосудистой корня и наконечник, чтобы измерить длину прорастают. После пристрелки покадровой флуоресцентного изображения, флуоресцентный изображение, принятое за несколько дней после культивирования в устройстве вычитается в изображении на день 0. Мы измерили длину ростки после вычитания ImageJ программного обеспечения. (b) определение центр сфероида. Флуоресцентного изображения ЗП-HUVECs binarized и измеряется в ее центр тяжести ImageJ программного обеспечения. Мы определяем центроид как центр сфероида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Формирование сосудистой сети в устройстве microfluidic. (a) промежуток времени изображения центра microfluidic устройства после заполнения ячейки. Красный: ППП-HUVECs культивировали в сфероида, зеленый: GFP-HUVECs собирают в каналах 1 и 3. Количественный анализ Росток Длина (b) и сосудистой угол (c) (n = 42 ростки в 3 устройств, погрешностей указывают стандартные ошибки (ФБ)). Росток длина был определен как расстояние от позиции HUVECs в день 0 сосудистой оконечности (b, сверху). Угол (∠TRS) определяется сосудистой корень (R), наконечник (T) и центр сфероида (S) (c, сверху). Для определения сосудистой корень, подсказки и центр сфероида см. Рисунок 6 . Эти данные были получены с помощью ImageJ программного обеспечения. Схемы, объясняя определение длины прорастают и сосудистой угол изменяются от Насимото, ю. и др. 27. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Формирование сосудистой люмен микроканалов и сфероида, HUVECs. () флуоресцентных изображение обзор образца после 14 дней в культуре устройства. Желтый прямоугольник указывает позицию x-y оптических секции показано в пункте (b). (b) x-y, y-z и x-z оптических Секция сконструированный сосудистой сети. Белые стрелки указывают просвета сосудов. Красный: ППП-HUVECs культивировали в сфероида, зеленый: GFP-HUVECs культивировали в микроканалов, синий: клеточных ядер. () показывает не голубой флуоресценцией, потому что (а) представляет собой изображение до фиксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9 : Перфузии сфероида, с использованием сконструированного сосудистой сети. Яркие области (а) и флуоресцентные (b) изображения сфероида после 7 дней в культуре устройства. (c) флуоресцентного изображения же сфероида после FITC-декстрана (70 кДа) загрузки. Красный: ППП-HUVECs в сфероида и каналы 1 и 3, зеленый: FITC-декстрана, синий: клеточных ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный файл 1: дизайн устройства microfluidic. Файл находится в формате dxf. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие доклады показывают, что hLFs выделяют коктейль из нескольких ангиогенных факторов, таких, как Ангиопоэтин-1, Ангиогенин, фактора роста гепатоцитов, превращая фактор роста α, фактора некроза опухоли и некоторые внеклеточного матрикса белки29, 30. Этот assay полагается на секрецию ангиогенных из hLFs в coculture сфероиде, который является ограничение техники. Таким образом крайне важно для формирования стабильной сосудистой установить сфероиде coculture в нижней части хорошо, таким образом, чтобы расстояние между сфероида coculture и HUVECs в каналах 1 и 3 может быть сокращен. Сосудистые длиной от фибробластов был обратно пропорциональна расстоянию между эндотелиальных клеток и фибробластов31, так что короче расстояние является выгодным для стабильного формирования сосудов. Однако чтобы открыть отверстие сфероида (1 мм в диаметре) без повреждения каналы 1 и 3, минимальная ширина канала 2 был 1,5 мм.
Хотя сфероида оседает на дне колодца, сосудистая корни иногда были отключены от microposts или микроканалов (рис. 5). В этом случае не реагент может достичь сосудистой люмен через микроканалов (каналы 1 или 3). Хотя мы не могли решить эту проблему полностью, мы предполагаем, что эта проблема обусловлена недостаточное количество HUVECs на поверхности геля фибрина (шаг 4.2.1-4.2.6). Убедитесь, что HUVECs стабильно Прикрепите боковой стенке канала 2.
К успешным инъекций сфероиде в колодец, оптимизировать внутренний и наружный диаметр микропипеткой советы на шаге 4.1.7 имеет важное значение: 1) внутренний диаметр должен быть больше, чем сфероида. 2 Наружный диметр должны соответствовать на край колодца, так что никакой утечки геля происходит в верхней части колодца во время инъекции и чаевые могут быть легко удалены после инъекции геля. В настоящем Протоколе (φ1 мм сфероиде хорошо) около 700 мкм-максимальный диаметр для инъекционного сфероида. Если хорошо диаметр предназначен больше, чем в настоящем Протоколе, больше сфероидов могут быть введены, потому что можно отрезать кончик иметь больше внутреннего диаметра. Сфероида диаметра можно легко контролировать путем изменения количества клеток, найденным в 96-луночных пластины.
Во-первых, этот протокол показывает Роман microfluidic платформа для построения perfusable сосудистой сети в сфероида. Хотя coculture с HUVECs позволяет формирование судна подобных структур в сфероида18,23,24, это были не perfusable из-за мертвых заканчивается lumina. Потому что фибробласты, клетки существуют в универсальный тканях (кости, Адипоцит и рака, и т.д.), путем добавления некоторых других ориентации клетки coculture сфероида, васкуляризации различного вида сфероидов можно ожидать, что можно имитировать в VIVO лучше, чем обычные сфероида культуры окружающей среды. Чтобы расширить применение техники, будущая работа будет включать васкуляризации сфероидов без добавления клетки фибробластов. Некоторые недавние работ доклад костного стромальные клетки32 и мышечные клетки33 может вызвать ангиогенеза в microfluidic приборы. Используя стромальные или мышечные клетки вместо клетки фибробластов увеличит количество тканей, которые могут быть васкуляризированной microfluidic устройство. Этот протокол обеспечивает базовую платформу васкуляризации ткани, что долгожданный технику в области три размерные культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана гребень JST (Грант № JPMJCR14W4), общества для поощрения от науки (JSP) KAKENHI (номер 25600060, 16K 16386 Грант), центр инновационной программы от МПКСНТ и JST, проект был сосредоточен на разработке технологии оценки ключ от Японское агентство для медицинских исследований и развития, AMED, Mizuho Фонд содействия развитию наук. Микротехнологий поддержали Киотский университет нано технологии концентратора.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | - | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | - | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surface profiler | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
