Summary
Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel'ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.
Abstract
Bir küresel (çok hücreli agrega) insan vücudunun içinde yaşayan doku iyi bir model olarak kabul edilir. Küresel kültürler içinde önemli ilerleme rağmen pulcuklarının perfusable vasküler ağlarda korumak ve protein ifadeler ve morfogenetik gibi işlevlerini geliştirmek için gerekli uzun vadeli kültür için kritik bir meydan okuma kalır. Protokol perfusable bir damar ağı içinde küresel bir mikrosıvısal cihazın entegre etmek için yeni bir yöntem sunuyor. Küresel perfusable vasküler ağlarda ikna etmek için mikro için bağlı anjiogenik lahanası için küresel anjiogenik faktörler küresel kültürlü insan akciğer fibroblastlar üzerinden kullanarak destekli. Anjiogenik lahanası küresel işbirliği kültürlü endotel hücreleri ile birleştirilmiş küresel ulaştı ve sürekli bir damar ağı kurdu. Vasküler ağ olmadan herhangi bir küresel iç sıvı. İnşa vasküler ağ daha fazla besin temini ve atık ürünlerin, kan dolaşımını içinde vivotaklit kaldırılması için bir yol olarak kullanılabilir. Yöntemi küresel kültür yaşam dokuların daha iyi Rekapitülasyon doğru yeni bir platform sağlar.
Introduction
Üç boyutlu bir kültüre monolayer (iki boyutlu) kültüründen değişen motive yaşayan hücresel işlevlerini taklit kültür modelleri ile çalışması gerektiğinden dokular1,2,3. Düz ve sert plastik yüzeylerde yaygın olarak kullanılan hücre kültüründe insan vücudu hücre dışı ortamlarda çoğu benzer değil. Aslında, birçok çalışma o üç boyutlu kültür yeniden doku özgü mimari, mekanik ve biyokimyasal ipuçları ve hücre-hücre iletişim, geleneksel iki boyutlu kültür4' tegözlenen değil göstermek, 5,6,7,8.
Bir çok hücreli agrega veya küresel, bir bu üç boyutlu kültür9,10gerçekleştirmek için en umut verici teknikleri biridir. Hücreleri hücre dışı Matriks (ECM) salgılar ve diğerleri ile küresel etkileşim kurabilir. Her ne kadar bazı diğer Biyomühendislik gibi hücre istifleme,11,12,13,14, yaklaşımlar başarıyla insan vücudunun kayma karmaşıklık çoğaltmak, yalnızca iki veya üç bu yaklaşımlar var hücreler analiz kolaylığı ve hedef organlar üzerinde duruldu yalnızca bir işlev için türlü. Buna ek olarak, pulcuklarının hücrelerde besinler, oksijen ve parakrin ve küresel olarak sinyal otokrin heterojen temini nedeniyle küresel konumlarına bağlı olarak farklı kültür ortamlara maruz kalır. Bu özelliği pulcuklarının, kısmen vivo içinde kültür durumu ve olanaklı kılmak çok daha karmaşık, organize doku oluşturmak için pulcuklarının hücrelerde vitro bu yığın doku9', kültürlü yapısı taklit eder 15 , 16. bir küresel tek bir hücre oluşur, küresel hücrelerde işlevi nedeniyle küresel türdeş olmayan ortamda tek tip olmadığını unutmayın. Son birkaç yıl içinde küresel kültürler embriyonik kök hücreleri (ESCs), indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) veya doku yerleşik kök hücre içinde vivo gelişimsel dizileri taklit ve mini-organ beyin17gibi yeniden girebilir, karaciğer18ve böbrek19,20.
Küresel kültür teknikleri önemli ilerlemeye rağmen hala uzun bir süre için büyük pulcuklarının kültür problemlidir. Üç boyutlu bir doku hücreleri oksijen ve besin21sınırlı kaynağı nedeniyle bir kan damarı 150-200 µm içinde bulunduğu gerekir. Küresel içinde damar ağları arasında kan ve doku içinde vivoalışverişi maddeler özetlemek gereklidir. Bunu başarmak için diğer gruplar endotel hücreleri hedef hücre22,23,24 ile birlikte kültürlü veya pluripotent hücreler farklılaşma CD31 pozitif hücreler20içine indüklenen. Yine de, bildirilen gemi benzeri yapıları lumina oksijen ve besin küresel ortasına sağlamak için açık uçları var mı. Üç boyutlu kültür hücrelerde besleyen damar rol taklit etmek için açık uçlu ve perfusable damar ağı içinde küresel geliştirilmelidir.
Son birkaç yıl içinde bazı araştırma grupları microengineering alanındaki kendiliğinden bir mikrosıvısal cihazda anjiogenik faktörler cocultured fibroblast hücreleri25 kullanarak oluşturduğu bir perfusable vasküler ağ oluşturmak için yöntemleri bildirdi. ,26. Vasküler bu şebekeler için in vivo meslektaşlarına benzer görünümdeki ve vasküler fonksiyonlar bir küresel kültür taklit için uygundur çevresel faktörler tarafından yenilenmiş. Bu iletişim kuralının amacı bir mikrosıvısal platformu27kullanarak bir küresel perfusable vasküler ağlarda oluşturmaktır. Böylece bir küresel dahil edilebilir mikrosıvısal aygıt daha önce bildirilen aygıt25 değiştirilir. Bir küresel fibroblast hücrelerinde üzerinden anjiogenik salgı mikro endotel hücreleri yönlendirerek tarafından anjiogenik ile küresel anastomosed mikro üzerinden lahanası ve perfusable bir damar ağı kurdu. Bu yöntem, floresan molekülleri ve damar ağları ile uzun vadeli bir doku kültürü için çerçeve sağlar bir küresel iç içine mikrometre ölçekli boncuk gibi maddeleri geniş bir doğrudan teslim sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikrosıvısal aygıt kalıp imalatı
- Piyasada bulunan yazılım kullanarak mikrosıvısal aygıt desen tasarım (Clewin5 veya AutoCAD 2016, vs.). Clewin5 işlevi için (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual) kullanım kılavuzuna başvurun.
Not: Tasarım dosyası ek dosya 1' de kullanılabilir. - Bir mikro desen jeneratör için tasarım dosya transferi ve olumlu fotorezist ile kaplı bir krom maske aracı yükleyin.
- Bir mikro Desen Oluşturucu'yu kullanmamanızı desen alanında pozitif fotorezist maruz.
- Geliştirici (Tablo reçetesi) kullanarak pozitif fotorezist geliştirmek ve maskeyi deiyonize (DI) su ile durulayın.
- Krom etchant (Malzeme tablo) kullanarak, nerede olumlu fotorezist kaldırıldı açık alan içinde krom etch. Maskeyi DI su ile durulayın.
- Fotorezist aseton kullanarak maske üzerinde kalan kaldırın.
Not: Saydamlık maskesi Cr maskesi için bir alternatif olabilir. - Temiz silikon gofret hazırlamak (4 inç, P(100)) ve spin kat hexamethyldisilazane (HMDS) 3000 devirde 30 s.
- 120 ° C ve serin gofret oda sıcaklığında 5 min için 5 min için Softbake HMDS.
- Spincoat negatif fotorezist (tablo malzemelerin) 10 s 500 devir/dakika ve 30 için 1200 devir/dakika, s.
Not: Spin kaplama koşulu fotorezist katmanları gofret üzerinde yaklaşık 100 µm kalınlığında fotolitografi sonra verim. - 95 ° C'de 45 dk için negatif fotorezist ppost ve gofret için oda sıcaklığında 60 dk serin.
- Her denemede UV ışık yoğunluğunu kontrol edin ve toplam pozlama enerji dozu 250 mW/cm2çekim hızı hesaplamak. Photomask (Adım 1.1-1.6) üzerinde gofret yerleştirin ve UV ışığına karşılaşmazlar.
- 1 dk. 65 ° c ve 95 ° C'de 5 min için negatif fotorezist postbake Oda sıcaklığında 1 dakika soğumasını gofret ver.
- Negatif fotorezist katmanı 15dk ilk geliştirici (Tablo reçetesi) banyoda ve ikinci banyoda 2 min için geliştirmek. 10 için ilk isopropanol (IPA) banyoda gofret durulama s ve 10 ikinci IPA banyoda s.
- Hardbake negatif fotorezist 200 ° C ve serin gofret için oda sıcaklığında 5 dk, 30 dk için.
- Bir yüzey profiler kullanarak negatif fotorezist katman kalınlığını ölçmek.
- Bir vakum pompası bağlı bir desiccator gofret yerleştirin ve silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)., 200 µL ekleyin 10 dk için pompa açmak sonra kapatmak ve gofret 4 h için desiccator unutmayın.
2. üretim adımları ve PDMS katmanları montajı
- Polydimethylsiloxane (PDMS) ön polimer döküm (PDMS Bankası: Ajan kür 10:1 (w/w) =) ve 2 h için bir vakum odasında degas.
- Bir hava Bacalı fırın gecede 80° C'de PDMS kesin çözüm.
- Silikon gofret üzerinden PDMS akasındaki.
- Delik 1A - 3B yumruk (şekil 1) ve küresel kültür iyi. 3B ve 1 mm çapında küresel için de yumruk - 2 mm çapında yumruk delikleri 1A için kullanın.
- PDMS levha ve cam kapak kayma (24 mm × 24 mm) yapışkan bant ile tekrar tekrar yapışmasını ve bandı peeling temizleyin. Hava plazma 40 ile PDMS levha tedavi s (40 mW, 50 sccm).
- PDMS levha üzerine herhangi bir hava kabarcıkları PDMS levha ve kapak astarlı ve tedavi için en az 12 h 80 ° c arasında yüzeyinden çıkarmak için cam kapak Not bağ.
3. küresel hazırlık
Not: kırmızı floresan protein insan göbek ifade çalışmada, damar endotel hücreleri (RFP-HUVECs) ve yeşil flüoresan protein ifade HUVECs (GFP-HUVECs) küresel ve mikro, sırasıyla, kökeni ayırt etmek için kullanılır HUVECs sonra perfusable vasküler ağ. HUVECs kökeni gerekmiyorsa, etiketlenmemiş HUVECs deney için yeterlidir.
- RFP-HUVECs (3.0 × 105 hücreleri/flakon) ve insan akciğer fibroblast (hLF) (1,0 × 106 hücreler/flakon) çözülme ve endotel hücreleri ve fibroblast hücreleri, orta 10 mL içine sırasıyla ekleyin (Malzemeler tablo). Onları CO2 37 ° C ve %5 100-mm tabak içinde 2-3 gün boyunca alt Konfluent RFP-HUVECs ve hLFs için kültür. Bu hazırlık ~ 200 pulcuklarının ortaya çıkarır.
- RFP-HUVECs ve hLFs yemeklerin 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve DMEM % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin içeren tripsin tepki 4 mL ile durdurmak.
- Santrifüjü vasıl 220 x g 3 dk sonra süpernatant kaldırmak ve RFP-HUVECs ve hLFs sırasıyla son hücre konsantrasyonları 2.5 × 104 ve 1,0 × 105 hücre/mL, endotel orta resuspend.
- Yavaşça iyi başına hücre süspansiyon (RFP HUVECs için 5000 hücreleri) ve hLFs için 20.000 hücreleri 200 µL Ultra düşük bağlama yüzeyli bir 96-şey plaka ekleyin.
- 96-şey plaka CO2 37 ° C ve %5 2-4 günlük bir süre için kuluçkaya.
Not: Kültür süresi ve ilk cep numarasını 96-şey plaka üzerinde küresel çapı bağlı olduğundan, bu iki parametre tarafından denetlenebilir.
4. hücre mikrosıvısal cihazda tohumlama
Not: Delikleri, kanalları ve küresel için adlandırma kuralı de gösterdi şekil 1' de. Biz gün 0 zaman mikrosıvısal cihazın içine hücre hasat bitmiş gün tanımlar. Deneysel zaman çizelgeleri şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.
- Gün – 1) küresel yükleme
Not: Aşağıdaki adımı buza jelleşme kollajen ve fibrin önlemek için yapılmalıdır.- Fibrinojen fosfat tamponlu tuz (PBS) 2.80 mg/mL nihai bir konsantrasyon için geçiyoruz.
- Etkisiz kollajen (3.0 mg/mL PBS) üreticinin protokolüne göre hazırlayın.
- 107.2 µL fibrinojen çözüm (2.80 mg/mL), 8.0 µL etkisiz kollajen (3.0 mg/mL) ve aprotinin tepki bir tüp (5 U/mL) 3.6 µL birleştirir. Bu çözüm "ana mix çözüm" etiketli (MS).
Not: Bir küresel yükleme için yeterli birimdir. Birden fazla küresel ise, her birim pulcuklarının sayısı ile çarpın. - 50 U/mL nihai bir konsantrasyon için PBS içinde Trombin geçiyoruz.
Not: 50 U/mL Trombin (20 µL/tüp) Aliquots −30 ° C saklanır ve her deneme önce çözdürülen. - Biyogüvenlik kabini içinde pulcuklarının içeren 96-şey tabak koyun.
- Biyogüvenlik dolap, bir tabak üzerinde buz (çanak 1) ve benchtop (dish 2) üzerinde diğer çanak içinde iki 35-mm Petri yemekler hazırlamak. Damlalıklı 99 µL of MS çanak 1 (bir damlacık oluşturmak içinşekil 3a) ortasına.
- İpuçları (10-100 µL) 2 sarı trim ve 3 pulcuklarının pulcuklarının cihazın içine enjekte ve medya cihazın içine enjekte MS, hassas pulcuklarının topluluğu ile Trombin karıştırma 96-şey plaka topluluğu için pipet İpuçları (1-100 µL) temizleyin , sırasıyla. İpucu gözenek boyutu biraz delik 1A - 3B Kanal 1 ve 3 çapından daha büyük olmalıdır veya küresel su kuyusu içinde Kanal 2 bir rahat için uygun.
Not: Bundan sonra aksi belirtilmediği sürece, bu adımda kesmek pipet ipuçlarını kullanın. Kesme ipuçları fotoğraf şekil 4' te kullanılabilir. - Bir küresel orta 100 µL ile 96-şey plaka toplayabilir ve çanak 2 (şekil 3a) ekleyebilir.
- Küresel medya dish 2 üzerinden en küçük birim ile almak. Pipettor dik tutarak, küresel yerçekimi tarafından damlalıklı ipucu dibe doğru hareket etmeliyiz. Küresel damlalıklı ipucu tabak 1 (şekil 3a) MS damlacık Menisküs üzerine dokunarak dışarı atmak.
Not: Aşağıdaki adımları 4.1.10 & 4.1.11 hızlı bir şekilde yapılmalıdır. - Trombin (50 U/mL) 1 µL ekleyin ve karışımı yavaşça sarı damlalıklı ucu ile.
- 7 µL ayarla pipet ile küresel kadar almak ve yavaş yavaş küresel kuyuya (şekil 3b) yerleştirin.
- Fibrin jelleşme için 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
- Yavaş yavaş delik 1A ve 3A ve dolgu Kanal 1 ve 3 endotel ortamından medya ile enjekte (20 ~ 30 µL/kanal).
- Aygıtın aygıt (şekil 3 c) ortamdan buharlaşma önlemek için ıslak bir Kimwipe ile 100 mm çanak yerleştirin.
- Aygıt için medya ve fibrin arasında arayüz kabarcıklar kaldırmak 24 h 37 ° C ve % 5 CO2 yerleştirin.
- 0 gün) HUVECs yükleme
- GFP-HUVECs (3.0 x 105 hücreleri/şişe) çözülme ve endotel orta 10 mL ekleyin. Onları 100-mm bulaşık 37 ° C ve % 5 CO2 alt-confluency ulaşmak 2-3 gün içinde kültür. Bir tabak alt Konfluent GFP-HUVECs 8-10 cihazların hazırlama için yeterli.
- GFP-HUVECs 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ile yemeklerin bağlantısını kesin ve DMEM % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin içeren tripsin tepki 4 mL ile durdurmak.
- 220 x g 3 dk de aralıklarla sonra GFP HUVECs 5.0 x 106 hücre/mL, endotel ortamda resuspend.
- HUVECs hücre süspansiyon Kanal 1 delik 1B aracılığıyla içine enjekte (20 µL/kanal).
- Mikrosıvısal aygıt 90 ° yatırmayı, yanına koyun ve HUVECs Kanal 2 fibrin uymasını sağlamak 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- HUVECs eki fibrin üzerinde onaylayın. Jel ve orta arasında arayüz, bağlı HUVECs sayısı yeterli olmadığı zaman damarlara vasküler kökündeki aygıt kültür (şekil 5) bir kaç gün sonra bağlantısı kesilmiş olabilir. İletişim kuralında, perfüzyon başarı oranı olduğunu > % 50.
- 4.2.4 4.2.5 kanal 3 aygıtlarından.
- 37 ° C ve % 5 CO2 7-14 gün boyunca nemli bir Kimwipe ile 100 mm çanak kültür hücreleri.
- Gün 1 ~) ortam değişimi
- Kanal 1 ve 3 medyada yarısı her gün değişimi.
5. çekirdek boyama
- %4 paraformaldehyde (PFA) PBS hazırlayın.
- Kanal 1 ve 3 medyayı çıkarın ve 20 µL % 4'lük eklemek PFA kanal başına. %4 çözümde değiştirmek için İngiltere'de yılın, tekrar çözüm aygıtınızdan kaldırdığınızda ve % 4 ekleyerek PFA üç kez.
- Cihazın 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
- % 4 kaldırma aygıt ve yıkama PFA kanalları üç kez PBS ile.
- 10 µg/ml floresan boyalar (Tablo reçetesi) 20 µL hücresel çekirdeği leke kanal başına ekleyin. Cihazın çözümde değişimi için çözüm aygıtınızdan kaldırdığınızda ve 10 µg/mL ekleyerek floresan boya üç kez tekrarlayın.
- 4 ° C'de 24 h için aygıt depolar.
6. sıvı perfüzyon bir küresel
- Küresel fazla 7 gün içinde belgili tanımlık aygıt 37 ° C ve % 5 CO2 sürekli bir damar yolu tamamlanması için kültür sonra hazırlayın.
- Orta delik 1A, 1B, 3A ve 3B kaldırın.
- Floresein isothiocyanate (FITC) 10 µM çözüm 10 µL tanıtmak-PBS içinde dextran delik 1A ve 1B.
- Lastikteki veya ters bir mikroskop altında FITC boya akışını izlemek.
7. Filiz uzunluğu miktar
Not: ImageJ ver 1.49 yazılım tüm bu çalışmada görüntü analizi için kullanılır.
- GFP-HUVECs gün 0, 1, 3, 5 ve 7 görüntülerin üst üste geliyor.
- Damarlara Günün İpucu'nu 0, 1, 3, 5 ve 7 gün çekilen görüntüleri aynı konumdan konumunu çıkarma.
- Kök konumu (şekil 6) vasküler ucundan büyüme belirlemek. Vasküler ipucu ve kök arasındaki mesafe (şekil 7b) Bu çalışmada Filiz uzunluğu olarak tanımlanmıştır.
8. miktar vasküler açıların
Not: damar Açı açı oluşuyordu damar açı, kök ve küresel (Şekil 7 c) merkezi olarak tanımlanmıştır.
- RFP-HUVECs içeren coculture küresel floresan görüntülerini binarize ve ImageJ analiz fonksiyonu tarafından "centroid" konum ölçmek. Bu çalışmada, ölçülen "centroid" konumu (şekil 6) küresel merkezi olarak tanımlanır.
- 7. adımda aynı şekilde vasküler ipuçları ve kökleri konumunu belirleyin.
- ImageJ yazılımında analiz işlevini kullanarak vasküler açıları ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 bir tasarım ve fotoğraf mikrosıvısal cihazın gösterir. Hangi kanalda 2 küresel de içeren üç paralel kanal içerir. Kanal 1 ve 3 HUVEC kültürü için kullanılan ve 2 için küresel kanalıdır. Her kanal trapez microposts desen PDMS tasarlanmış ayrılır. Microposts Kanal 2 hidrojel yüzey gerilimi tarafından kanallarına 1 ve 3 sızıntı önlemek ve mikro28arasında küresel ve HUVECs maddelerin değişimi sağlar.
Şekil 7a bir mikrosıvısal Aygıt Merkezi hücre tohum sonra gösterir. Parlak alan ve floresan görüntüleri gün 0 alınan fibrin jel sadece 2 olmadan herhangi bir kanalı kanal 1 ve 3 dolu ve HUVECs başarıyla fibrin jel yanak için bağlı olduğunu göstermektedir. Her iki dolu küresel odak parlak alan görüntü olduğunu ve küresel düzgün cihazın alt kısmında yerleşmiş gösteren microposts. Anjiogenik filizi 1 gün ve saat (şekil 7b) ile lahanası artar uzunluğu gözlenir. Günde 3, en uzun Filiz küresel ulaştı ve 7 günde anjiogenik lahanası çoğunu küresel (ortalama mesafe Kanal 1 ve 3 küresel < 500 µm) ulaştı. En iyi durumda, aygıt kültür, 4 gün sonra vasküler Lümen ile akışı görülebilir. Damar açı vasküler ipucu yönleri ve vasküler kökünden küresel merkezi olarak tanımlanmıştır. Şekil 7 7 gün içinde aygıt kültür sırasında quantified damar açı görüntülenir. Vasküler açıları anjiogenik lahanası küresel doğru göç gösteren bir saat-bağımlı şekilde azaldı.
Şekil 8 nerede RFP-HUVECs ve GFP-HUVECs birleştirilmiş vasküler ağ bölümünü gösterir. Coordinately RFP-HUVECs ve GFP-HUVECs tek bir vasküler Lümen açıkça anjiogenik lahanası kanallardan 1 ve 3 küresel RFP-HUVECs için anastomosed gösterir ve sürekli bir damar ağı kurdu ok uçları ile gösterildiği gibi kurdu. Perfusability damar ağının onaylamak için FITC dextran Kanal 1 enjekte ettiler. FITC-dextran Kanal 1 inşa vasküler ağ ve küresel iç akıyordu ve sonunda Kanal 3 (Şekil 9) ulaştı. FITC dextran çözüm perfüzyon sırasında extravascular uzaya damar ağından hiçbir sızıntı vardır. Bu daha önce küçük moleküller vasküler Lümen enjekte damar duvarından geçmek ve extravascular bölgelerinde hücrelerle tepki gösterilmiştir. Buna ek olarak, permeabilite katsayısı damar ağının bu vivo içinde27yakın olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar tümleşik vasküler ağ küresel için besin kaynağı ve atık ürün kaldırmak anlamına.
Resim 1 : Tasarım ve mikrosıvısal aygıt fotoğrafı. (a) mikrosıvısal cihazın tasarımına genel bakış. Gri alan üç mikrosıvısal kanal trapez microposts tarafından ayrılmış gösterir. Kanal 2 küresel kültür için iyi vardır. Doğru rakam soldaki kırmızı dikdörtgende büyütülmüş görünümü görüntüler. (b) olan kanalları kırmızı mürekkeple doldurulur mikrosıvısal aygıt fotoğrafı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Deneysel saat. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Bir küresel mikrosıvısal cihazın içine yüklemek için yöntem. (a) MS ve medya ile bir küresel bir damla iki ayrı yemekleri yapma. Ardından küresel Trombin ile MS aktarın. (b) şematik kesit görünümü küresel enjeksiyon sırasında cihazın. Jel aşırı miktarda dışarı delik 2A ve 2B'yi akar. Ancak, küresel fiziksel doğumdan nedeniyle cihazın altındaki kalır. (c) şeması cihazların bir kuluçka makinesine olduklarında. 35-mm tabağı ile cihazın üzerinde Kimwipe konuldu ve ıslak Kimwipe 100-mm tabak içinde yerleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Pipet ipuçları fotoğraf kesmek aygıta tohum hücrenin. Sol beyaz ucu delik 1A, 1B, 3A ve 3 C ve fibrin jel (Adım 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 ve 4.2.6) bir damla için transfer küresel içindir. Orta sarı ucu küresel kuyudan 96-(Adım 4.1.7) topluluğu içindir. Şu beyaz ucu küresel kuyu (adımı 4.1.11) olduğunu. İpuçları kesim önce de fotoğrafta gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Perfusable damarlara. Anjiogenik lahanası mikro üzerinden microposts arasında açılması için bağlamak vermedi ve Lümen ve mikro (siyah oklar) arasındaki bağlantıyı kaybettim. Kanal 1 ve 3 numaralı seribaşı yetersiz HUVECs neden olur. Kırmızı: RFP-HUVECs küresel içinde yeşil: GFP-HUVECs mikro üzerinden. Hücreleri cihazda 14 gün boyunca kültürlü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Vasküler kök, ipucu ve küresel Merkezi tanımını. (a) vasküler kök ve Filiz uzunluğu ölçmek için ipucu konumunu belirlemek için yöntem. Hızlandırılmış floresan görüntüleri hizalama sonra birkaç gün sonra aygıtı kültür alınan floresan görüntü gün 0 görüntü tarafından çıkarılır. ImageJ yazılım tarafından çıkarma sonra filizi uzunluğu ölçülür. (b) küresel Merkezi tanımı. RFP HUVECs floresan görüntülerini binarized ve kendi centroid ImageJ yazılım tarafından ölçülür. Biz centroid küresel merkezi olarak tanımlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Mikrosıvısal cihazın vasküler bir ağ oluşumu. (a) hücre tohum sonra bir mikrosıvısal cihazın bir merkezinin zaman hata görüntüler. Kırmızı: Küresel, yeşil RFP HUVECs kültürlü: GFP-HUVECs Kanal 1 ve 3 hasat. Filiz uzunluğu (b) ve vasküler açı (c) kantitatif analiz (n = 42 filizi 3 aygıtlar'da, hata çubukları standart hatalar (S.E.) gösterir). Filiz uzunluğu gün 0 (b, üst) vasküler ucu HUVECs konumunu mesafe olarak tanımlanmıştır. Açısı (∠TRS) vasküler kök (R), uç (T) ve (S) (c, üst) küresel Merkezi tarafından tanımlanmıştır. Şekil 6 vasküler kök, ipucu ve küresel Merkezi açıklaması için bkz. Bu veri ImageJ yazılımını kullanarak elde edilmiştir. Filiz uzunluğu ve damar açı tanımını açıklayan şemaları Nashimoto, Y. ve ark. değiştirilir 27. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Mikro ve küresel HUVECs tarafından vasküler Lümen oluşumu. (a) örnek aygıt kültür 14 gün sonra bakış floresan görüntü. Sarı dikdörtgen (b) gösterilen optik bölüm x-y konumunu gösterir. (b) x-y, y-z ve x-z optik bölümünü inşa vasküler ağ. Beyaz okları vasküler Lümen gösterir. Kırmızı: Küresel, yeşil RFP HUVECs kültürlü: GFP-HUVECs mikro, mavi kültürlü: hücresel çekirdeği. (a) (a) görüntü fiksasyonun önce olduğu için hiçbir mavi Floresans gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9 : İnşa bir damar ağı kullanarak bir küresel perfüzyon. Parlak alan (a) ve floresan görüntüleri (b) küresel aygıt kültür 7 gün sonra. (c) floresan FITC dextran sonra aynı küresel imajını (70 kDa) yükleme. Kırmızı: RFP-HUVECs küresel ve Kanal 1 ve 3, yeşil: FITC-dextran, mavi: hücresel çekirdeği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek dosya 1: mikrosıvısal aygıt tasarımını. Dxf biçiminde dosyasıdır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki raporları hLFs angiopoietin-1, angiogenin, hepatosit büyüme faktörü, büyüme faktör-α, tümör nekrozis faktör ve bazı hücre dışı matriks proteinleri29dönüşüm gibi birden çok anjiogenik faktörlerin bir kokteyl salgılar göstermek, 30. Bu tahlil anjiogenik salgı ilgili kısıtlama tekniği, coculture küresel hLFs üzerinden kullanır. Bu nedenle, coculture küresel ve Kanal 1 ve 3 HUVECs arasındaki mesafe kısaltılmış bir kuyunun dibinde bir coculture küresel ayarlamak istikrarlı bir damar oluşumu için önemlidir. Böylece daha kısa mesafe istikrarlı damar oluşumu için avantajlı fibroblastlar gelen damar uzunluğu endotel hücreleri ile fibroblastlar31arasındaki mesafe ters orantılıdır. Ancak, bir küresel delik (1 mm çapında) zarar veren Kanal 1 ve 3 açmak için 1.5 mm Kanal 2 minimum genişliği oldu.
Her ne kadar küresel Kuyunun dibinde yerleşir, vasküler kökleri microposts veya mikro (şekil 5) Zaman zaman kesildi. Bu durumda, hiçbir reaktif vasküler Lümen mikro (Kanal 1 veya 3) üzerinden ulaşabilir. Her ne kadar biz bu sorunu tamamen çözmek olabilir değil, sorun HUVECs yetersiz sayıda fibrin jel (Adım 4.2.1-4.2.6) yüzeyine, kaynaklanmaktadır varsayıyorum. Stabil Kanal 2 yan duvar eklemek HUVECs emin olun.
Kuyunun içine bir küresel başarılı enjeksiyon doğru iç ve dış çap micropipette ipuçları adım 4.1.7 en iyi duruma getirme önemlidir: 1) iç çap küresel daha büyük olmalıdır. 2) dış dimeter böylece hiçbir sızıntı jel kuyunun başında enjeksiyon sırasında oluşur ve belgili tanımlık uç-ebilmek var olmak kolayca çıkarmak jel enjeksiyon sonra kuyu kenarına oturur. Mevcut içinde iyi bir küresel (φ1 mm), yaklaşık 700 µm enjekte edilebilir küresel için maksimum çapı iletişim kuralıdır. Eğer iyi çapı daha büyük iç çapları için belgili tanımlık uç kesilmiş çünkü bu protokol için daha büyük pulcuklarının enjekte büyük ressam. Küresel çapı 96-şey plaka hasat cep numarasını değiştirerek kolaylıkla kontrol edilebilir.
Bu iletişim kuralı öncelikle roman mikrosıvısal platform bir küresel perfusable bir damar ağı oluşturmak için gösterir. Her ne kadar HUVECs ile coculture içinde bir küresel18,23,24gemi benzeri yapıların oluşumu sağlar, bunlar lumina çıkmaz nedeniyle perfusable değildi. Çünkü fibroblast hücreleri coculture küresel bir vaskülarizasyon pulcuklarının çeşitli bir tür bazı hedefleme diğer hücrelere eklenmesiyle çok yönlü dokularda (kemik, adipocyte ve kanser, vb), mevcut beklenebilir, hangi içinde taklit edebilir vivo ortamı geleneksel küresel kültür daha iyi. Teknik uygulama genişletmek için yapılacak çalışmalar pulcuklarının olmadan fibroblast hücreleri ilavesi vaskülarizasyon yer alacak. Bazı son çalışır rapor kemik iliği stromal hücreler32 ve kas hücreleri33 angiogenez mikrosıvısal cihazlarda tetikleyebilir. Fibroblast hücreleri yerine stromal veya kas hücreleri kullanan mikrosıvısal cihazda skarların doku sayısını artıracak. Bu iletişim kuralı bir uzun zamandır beklenen teknik üç boyutlu kültür alanında olduğu doku vaskülarizasyon için temel bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar ilan hiçbir rakip mali çıkarlarının zorundalar.
Acknowledgments
Bu eser CREST JST (grant sayı JPMJCR14W4), toplum için promosyon, bilim (JSP'ler) KAKENHI (grant sayı 25600060, 16 K 16386), MEXT ve JST, proje anahtar değerlendirme teknoloji geliştirme odaklı yenilik Program Merkezi tarafından desteklenmiştir Tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED, Mizuho temel bilimler tanıtımı için Japonya Ajansı. Microfabrication Kyoto Üniversitesi Nano teknoloji Hub tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | - | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | - | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surface profiler | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
