Summary
Das Protokoll beschreibt, wie ein perfusable Kreislauf Netzwerk in ein Sphäroid zu konstruieren. Das Sphäroid umliegenden Mikroumgebung ist entworfen, um induzieren Angiogenese und der Sphäroid an die Mikrokanäle in einem mikrofluidischen Gerät anschließen. Die Methode erlaubt die Perfusion der Sphäroid, das eine lang ersehnte Technik in dreidimensionale Kulturen ist.
Abstract
Ein Sphäroid (vielzelligen Aggregat) gilt als ein gutes Modell der lebende Gewebe im menschlichen Körper. Trotz der erheblichen Fortschritt in der Sphäroid Kulturen bleibt ein perfusable Kreislauf Netzwerk in die Sphäroide eine entscheidende Herausforderung für langfristige Kultur zu pflegen und entwickeln ihre Funktionen, wie z. B. Protein ausdrücken und Morphogenese erforderlich. Das Protokoll stellt eine neuartige Methode um ein perfusable Kreislauf Netzwerk innerhalb der Sphäroid in einem mikrofluidischen Gerät zu integrieren. Um ein perfusable Kreislauf Netzwerk in den Sphäroid induzieren, wurden angiogenen Sprossen mit Mikrokanälen verbunden zu den Sphäroid geführt, durch die Verwendung von angiogenen Faktoren von menschlichen Lunge Fibroblasten in der Sphäroid kultiviert. Die Angiogenese Sprossen erreicht das Sphäroid, fusionierte mit der Endothelzellen Co kultiviert in den Sphäroid und einem kontinuierlichen Kreislauf Netzwerk gebildet. Die vaskuläre Netzwerk könnte das Innere der Sphäroid ohne Undichtigkeiten durchspülen. Das konstruierte vaskuläre Netzwerk kann als Route für die Versorgung mit Nährstoffen und Ableitung von Abfallstoffen, imitiert Blutzirkulation in Vivoweiterverwendet werden. Die Methode bietet eine neue Plattform in der Sphäroid Kultur in Richtung bessere Reprise des lebenden Gewebes.
Introduction
Verlagerung von einer monomolekularen Film (zweidimensional) Kultur zu einer dreidimensionalen Kultur ist motiviert durch die Notwendigkeit, mit Kultur-Modellen arbeiten, die die Zellfunktionen des Lebens imitieren Gewebe1,2,3. Die meisten der extrazellulären Umgebungen im menschlichen Körper ähneln flach und harte Kunststoffsubstraten häufig benutzt in der Zellkultur nicht. In der Tat, belegen viele Studien, dass dreidimensionale Kultur neu gewebespezifischen Architektur, mechanischen und biochemischen Signale und Zell-Zell-Kommunikation, die nicht in herkömmlichen zweidimensionalen Kultur4beobachtet wurden, 5,6,7,8.
Eine mehrzelligen Aggregat oder Sphäroid, ist eine der vielversprechendsten Techniken, um diese dreidimensionale Kultur9,10zu realisieren. Zellen sezernieren die extrazelluläre Matrix (ECM) und können mit anderen in der Sphäroid interagieren. Obwohl einige andere Bioengineering nähert sich11,12,13,14, wie Zelle stapeln, erfolgreich replizieren räumliche Komplexität des menschlichen Körpers, diese Ansätze haben nur zwei oder drei Arten von Zellen für die einfache Analyse und konzentrierte sich auf nur eine Funktion der Zielorgane. Im Gegensatz dazu sind andere Kultur Umgebungen je nach ihrer Position in der Sphäroid aufgrund der heterogenen Zufuhr von Nährstoffen, Sauerstoff, und parakrine und autokrine Signalmoleküle in den Sphäroid Zellen in Sphäroide ausgesetzt. Diese Funktion der Sphäroide imitiert teilweise in Vivo Kultur Zustand und aktivieren die Zellen in Sphäroide erstelle ich sehr viel komplexer, organisierte Gewebe in Vitro als kultiviert in Stapeln Gewebe9, Struktur 15 , 16. beachten Sie, dass wenn ein Sphäroid aus einer einzigen Art von Zellen besteht, die Funktion der Zellen in den Sphäroid nicht aufgrund der heterogenen Umgebung in den Sphäroid einheitlich ist. In den letzten Jahren erlaubt Sphäroid Kulturen embryonale Stammzellen (WSR), induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) oder Gewebe-Resident Stammzellen in Vivo Entwicklungsstörungen Sequenzen zu imitieren und neu erstellen Mini-Organe wie das Gehirn17, Leber18und Niere19,20.
Trotz der erheblichen Fortschritte in Sphäroid Kulturtechniken ist die Kultivierung großer Sphäroide schon seit längerem nach wie vor problematisch. Zellen müssen in einem dreidimensionalen Gewebe innerhalb 150-200 µm eines Blutgefäßes aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen21befinden. Vaskulärer Netzwerke innerhalb der Sphäroid sind notwendig, um den Austausch von Stoffen zwischen Blut und Gewebe in Vivozu rekapitulieren. Um dies zu erreichen, haben andere Gruppen Co kultivierten Endothelzellen mit Ziel Zellen22,23,24 oder induziert die Differenzierung von pluripotenten Zellen in CD31-positiven Zellen20. Die gemeldeten Schiff-ähnliche Strukturen haben jedoch nicht die offenen Enden der Lumina, Sauerstoff und Nährstoffe in die Mitte des Sphäroids zu liefern. Um die vaskuläre Rolle um Zellen in der dreidimensionalen Kultur nähren zu imitieren, muss ergebnisoffen und perfusable vaskuläre Netzwerk der Sphäroid entwickelt werden.
In den vergangenen Jahren berichteten einige Forschungsgruppen im Feld Microengineering Methoden, um ein perfusable Kreislauf Netzwerk, spontan gebildet in einem mikrofluidischen Gerät durch die Verwendung von angiogenen Faktoren von cocultured Fibroblastenzellen25 zu bauen ,26. Dieser Kreislauf Netzwerke haben eine ähnliche Morphologie Pendants in Vivo und können durch Umweltfaktoren, eignen sich für die Nachahmung vaskulärer Funktionen in ein Sphäroid Kultur umgebaut werden. Dieses Protokoll soll ein perfusable Kreislauf Netzwerk in ein Sphäroid mit einem mikrofluidischen Plattform27zu bauen. Mikrofluidische Gerät ist von den zuvor gemeldeten Gerät25 geändert, so dass ein Sphäroid integriert werden kann. Durch die Leitung der angiogenen Sekret Fibroblastenzellen in ein Sphäroid an Endothelzellen in Mikrokanälen, angiogenen Sprossen aus der Mikrokanäle anastomosieren mit den Sphäroid und bildeten ein perfusable Kreislauf Netzwerk. Diese Methode ermöglicht eine direkte Lieferung einer breiten Palette von Substanzen, wie fluoreszierende Moleküle und Mikrometer-Skala Perlen ins Innere des ein Sphäroid, die den Rahmen für eine langfristige Gewebekultur mit vaskulären Netzwerken bietet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von mikrofluidischen Gerät Schimmel
- Das Muster des mikrofluidischen Gerätes mit im Handel erhältlichen Software-Design (Clewin5 oder AutoCAD 2016, etc..). Finden Sie für die die Clewin5-Funktion im Benutzerhandbuch (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
Hinweis: Die Design-Datei steht in ergänzende Datei 1. - Übertragen Sie die Design-Datei auf einem micro Pattern-Generator und laden Sie das Tool mit einer Chrom-Maske mit der positiven Fotolack beschichtet.
- Setzen Sie die positiven Photoresist im Bereich Muster mit einem Mikro-Muster-Generator.
- Entwickeln Sie der positiven Photoresist, mit dem Entwickler (Table of Materials) und spülen Sie die Maske mit entionisiertem Wasser (DI).
- Mit Chrom-Ätzmittel (Table of Materials), etch das Chrom in der exponierten Bereich, wo die positiven Photoresist entfernt wurde. Spülen Sie die Maske mit VE-Wasser.
- Entferne die übrigen Photolack auf die Maske mit Aceton.
Bemerkung: Transparenzmaske kann eine Alternative für die Cr-Maske. - Bereiten Sie einen sauberen Silizium-Wafer (4 Inch, P(100)) und Spin Mantel Hexamethyldisilazane (HMDS) bei 3.000 u/min für 30 s.
- Softbake HMDS für 5 min bei 120 ° C und kühlen der Wafer für 5 min bei Raumtemperatur.
- Spincoat die negativen Fotolack (Tabelle der Materialien) bei 500 u/min für 10 s und 1.200 u/min für 30 s.
Hinweis: Spin Coating Zustand sollte Ausbeute der Fotolack Schichten mit einer Dicke von ca. 100 µm auf den Wafern nach Photolithographie. - Prebake negativer Photoresist für 45 min bei 95 ° C und den Wafer für 60 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Überprüfen Sie die Intensität des UV Lichtes in jedem Experiment und berechnen Sie die Belichtungszeit für eine Gesamtbelastung Energie-Dosis auf 250 mW/cm2. Legen Sie die Fotomaske (Schritt 1.1-1.6) auf dem Wafer und setzen sie das UV-Licht aus.
- Postbake negativer Photoresist für 1 min bei 65 ° C und 5 min bei 95 ° C. Lassen Sie den Wafer für 1 min bei Raumtemperatur abkühlen.
- Entwickeln Sie die negative Photoresist Schicht für 15 min in das erste Entwickler (Table of Materials) Bad und 2 min in das zweite Bad. Spülen Sie die Wafer in das erste Isopropanol (IPA) Bad für 10 s und in der zweiten IPA-Badewanne für 10 s.
- Hardbake die negativen Photoresist für 30 min bei 200 ° C und kühlen der Wafer für 5 min bei Raumtemperatur.
- Messen Sie die Dicke der negativen Photoresist Schicht mit einer Oberfläche Profiler.
- Den Wafer in einem Exsikkator mit einer Vakuumpumpe verbunden und 200 µL Silan (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Schalten Sie die Pumpe für 10 min, dann schalten Sie ihn aus und halten Sie die Wafer in den Exsikkator für 4 h.
(2) Fertigungsschritte sowie die Montage von PDMS-Schichten
- Das Polydimethylsiloxan (PDMS) Pre-Polymer gegossen (PDMS Basis: Härtemittel = 10:1 (w/w)) und degas in einer Vakuumkammer für 2 h.
- PDMS Heilung bei 80° C im Ofen Luft entlüftet über Nacht.
- Ziehen Sie die PDMS aus dem Siliziumwafer.
- Stanzen der Löcher 1A - 3 b (Abbildung 1) und der Sphäroid Kultur gut. Verwenden Sie einen Durchschlag 2 mm Durchmesser für Bohrungen 1A - 3 b und einem Durchmesser von 1 mm Stanzen für den Sphäroid gut.
- Reinigen Sie die PDMS-Platte und einem Glas Deckglas (24 mm × 24 mm) mit Klebeband, durch wiederholtes kleben und das Klebeband abziehen. Dann behandeln die PDMS-Platte mit Luft-Plasma für 40 s (40 mW, 50 Sccm).
- Bindung der PDMS-Platte auf das Glas-Deckglas, eventuell vorhandene Luftbläschen von der Oberfläche zwischen der PDMS-Platte und dem Deckglas Heilung bei 80 ° C für mindestens 12 Stunden zu vertreiben.
(3) Sphäroid Vorbereitung
Hinweis: In der Studie, rot fluoreszierenden Proteins mit dem Ausdruck menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (RFP-Mediumwechsel) und grün fluoreszierendes Protein zum Ausdruck zu bringen, die Mediumwechsel (GFP-Mediumwechsel) in den Sphäroid und Mikrokanäle, bzw. verwendet werden, um die Herkunft zu unterscheiden Mediumwechsel nach dem Bau eines perfusable vaskuläre Netzwerks. Wenn der Ursprung des Mediumwechsel nicht benötigt wird, sind unbeschriftete Mediumwechsel genug für das Experiment.
- Auftauen der RFP-Mediumwechsel (3,0 × 105 Zellen/Vial) und der menschlichen Lunge Fibroblasten (hLF) (1,0 × 106 Zellen/Vial) und fügen Sie sie in 10 mL Medium für Endothelzellen und Fibroblastenzellen bzw. (Table of Materials). Kultur sie in einer 100-mm-Schale bei 37 ° C und 5 % CO2 für 2-3 Tage für Sub konfluierende RFP-Mediumwechsel und hLFs. Dieses Präparat wird ~ 200 Sphäroide Ausbeute.
- Trennen Sie die RFP-Mediumwechsel und hLFs von den Gerichten mit 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und stoppen Sie die Trypsin-Reaktion mit 4 mL DMEM mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % (V/V) Penicillin/Streptomycin.
- Nach Zentrifugation bei 220 X g 3 min entfernen des Überstands und Aufschwemmen RFP-Mediumwechsel und hLFs Endothelzellen Mittel-und letzte Zelle Konzentrationen bei 2,5 × 104 und 1,0 × 105 Zellen/mL, beziehungsweise.
- Fügen Sie sanft 200 µL Zellsuspension (5.000 für RFP-Mediumwechsel) und 20.000 Zellen für hLFs pro Bohrloch in einer 96-Well-Platte mit ultraniedriger Bindung Oberfläche.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 für einen Zeitraum von 2-4 Tagen.
Hinweis: Da die Kulturdauer und anfänglichen Zellzahl in 96-Well-Platte der Sphäroid Durchmesser abhängt, kann es durch diese beiden Parameter gesteuert werden.
(4) Zelle Aussaat in mikrofluidischen Gerät
Hinweis: Die Namenskonvention für die Löcher, Kanäle und das Sphäroid gut sind gezeigt in Abbildung 1. Tag 0 definieren wir als den Tag, wenn Zelle Ernte in mikrofluidischen Gerät fertig ist. Schematische Darstellung der experimentellen Fristen ist in Abbildung 2dargestellt.
- Tag −1) Sphäroid be-
Hinweis: Der folgende Schritt sollte auf Eis, Gelbildung von Kollagen und Fibrin zu verhindern durchgeführt werden.- Fibrinogen in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für eine Endkonzentration von 2,80 mg/mL auflösen.
- Bereiten Sie neutralisiert Kollagen (3,0 mg/mL in PBS) laut Protokoll des Herstellers.
- Kombinieren Sie 107,2 µL Fibrinogen-Lösung (2,80 mg/mL), 8.0 µL neutralisierte Kollagen (3,0 mg/mL) und 3,6 µL Aprotinin (5 U/mL) pro Reaktion in einer Röhre. Diese Lösung ist "master-Mix-Lösung" gekennzeichnet (MS).
Hinweis: Die Lautstärke reicht für das Laden von einem Sphäroid. Ist mehr als ein Sphäroid, multiplizieren Sie jeder Band mit der Anzahl der Sphäroide. - Auflösen von Thrombin mit PBS-Puffer für eine Endkonzentration von 50 U/mL.
Hinweis: Aliquote von 50 U/mL Thrombin (20 µL/Rohr) bei-30 ° C gelagert werden und vor jedem Experiment aufgetaut sind. - Platzieren Sie die 96-Well-Platte mit der Sphäroide innerhalb der Biosicherheit Schrank.
- Bereiten Sie zwei 35-mm-Petrischalen innerhalb der Biosicherheit Schrank, mit einer Schale auf Eis (Schale 1) und das andere Gericht auf der Tischplatte (Schale 2). Pipettieren 99 µL von MS in der Mitte der Schüssel 1 (Abbildung 3a) um ein Tröpfchen zu bilden.
- Schneiden Sie die Spitzen der 2 gelb (10-100 µL) und 3 klare Pipettenspitzen (1-100 µL) für die Erhebung der Sphäroide aus der 96-Well-Platte, mischen Thrombin mit MS, präzise Erfassung der Sphäroide Einspritzen der Sphäroide in das Gerät, und Einspritzen von Medien in das Gerät , beziehungsweise. Die Porengröße der Spitze sollte etwas größer als der Durchmesser der Löcher 1A - 3 b der Kanäle 1 und 3 oder Sphäroid in Kanal 2 für einen gemütlichen gut passen.
Hinweis: Im folgenden, sofern nicht anders angegeben, verwenden Sie die Pipettenspitzen schneiden in diesem Schritt. Das Foto des geschnittenen Tipps gibt es in Abbildung 4. - Sammle ein Sphäroid mit 100 µL Medium von 96-Well-Platte und Teller 2 (Abbildung 3a) hinzufügen.
- Das Sphäroid mit Mindestvolumen von Medien von Dish 2 abholen. Halten Sie die Pipette aufrecht, sollte das Sphäroid in Richtung zur Unterseite der Spitze Pipettieren durch die Schwerkraft bewegen. Werfen Sie das Sphäroid durch Berührung der Pipettieren Spitze auf den Meniskus des MS Tropfenabscheiders in Schale 1 (Abb. 3a).
Hinweis: Die folgenden Schritte 4.1.10 & 4.1.11 sollte schnell durchgeführt werden. - Fügen Sie 1 µL von Thrombin (50 U/mL) und mischen Sie mit den gelben Pipettieren Tipp.
- Mit der Pipette auf 7 µL gesetzt Abholung der Sphäroid und legen Sie sie langsam in den Sphäroid Brunnen (Abb. 3 b).
- 15 min bei 37 ° C für die Gelierung von Fibrin inkubieren.
- Die endotheliale Medium von Bohrungen 1A und 3A und füllen Sie die Kanäle 1 und 3 mit Medien langsam injizieren (20 ~ 30 µL/Kanal).
- Stellen Sie das Gerät in einer 100-mm-Schale mit einer nassen Windex, Verdampfung von Medien aus dem Gerät (Abb. 3 c) zu verhindern.
- Stellen Sie das Gerät bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h die Blasen an der Schnittstelle zwischen Medien und Fibrin entfernen.
- Tag 0) Mediumwechsel be-
- Tauen Sie GFP-Mediumwechsel (3,0 x 105 Zellen/Vial auf) und fügen sie Sie 10 mL des Mediums Endothelzellen. Kultur, sie in ein 100-Millimeter-Teller bei 37 ° C und 5 % CO2 für 2-3 Tage, Sub-Konfluenz zu erreichen. Ein Gericht der Sub konfluierende GFP-Mediumwechsel reicht für die Zubereitung von 8-10-Geräte.
- Lösen Sie GFP-Mediumwechsel vom Geschirr mit 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA zu und stoppen Sie die Trypsin-Reaktion mit 4 mL DMEM mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % (V/V) Penicillin/Streptomycin.
- Nach Zentrifugation bei 220 X g 3 min Aufschwemmen der GFP-Mediumwechsel endotheliale mittelfristig auf 5.0 x 106 Zellen/mL.
- Injizieren Mediumwechsel Zellsuspension in Kanal 1 durch Loch 1 b (20 µL/Kanal).
- Kippen Sie das Gerät von mikrofluidischen 90°, legen Sie sie auf der Seite und Inkubation bei 37 ° C für 30 min, um sicherzustellen, dass die Mediumwechsel das Fibrin in Kanal 2 einhalten.
- Bestätigen Sie die Befestigung der Mediumwechsel auf das Fibrin. Wenn die Anzahl der Mediumwechsel befestigt an der Schnittstelle zwischen dem Gel und Medium nicht ausreicht, kann das Gefäßsystem die vaskuläre Ursache nach ein paar Tagen Gerät Kultur (Abbildung 5) getrennt werden. Im Protokoll, die Erfolgsquote der Durchblutung ist > 50 %.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2.4 und 4.2.5 für Kanal 3.
- Zellkulturen in einem 100-mm-Teller mit einem feuchten Wischtuch bei 37 ° C und 5 % CO2 für 7-14 Tage.
- Tag1 ~) Datenträgeraustausch
- Tauschen Sie die Hälfte der Medien in die Kanäle 1 und 3 jeden Tag.
(5) Kerne Färbung
- Bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer.
- Entfernen Sie das Medium aus Kanäle 1 und 3 und fügen Sie 20 µL 4 % PFA pro Kanal. Die Lösung bei 4 % ersetzen PFA, wiederholen die Lösung vom Gerät zu entfernen und Hinzufügen von 4 % PFA drei Mal.
- Inkubieren Sie das Gerät bei 4 ° C über Nacht.
- Entfernen Sie die 4 % PFA vom Gerät und waschen die Kanäle drei Mal mit PBS.
- Fügen Sie 20 µL 10 µg/mL Fluoreszenzfarbstoff (Table of Materials) pro Kanal, zelluläre Kerne zu beflecken. Um die Lösung in das Gerät auszutauschen, wiederholen Sie die Lösung aus dem Gerät entfernen und Hinzufügen von 10 µg/mL die Fluoreszenzfarbstoff dreimal.
- Lagern Sie das Gerät bei 4 ° C für 24 h.
(6) Flüssigkeit Perfusion der ein Sphäroid
- Bereiten Sie das Sphäroid nach Kultivierung für mehr als 7 Tage im Gerät bei 37 ° C und 5 % CO2 für den Abschluss eines kontinuierlichen Kreislauf Pfades.
- Entfernen Sie das Medium aus Bohrungen 1A, 1 b, 3A und 3 b.
- 10 µL 10 µM-Lösung von Fluorescein erfolgt (FITC) einführen-Dextran in PBS in Löcher 1A und 1 b.
- Überwachen Sie den Fluss der Microbeads oder FITC Farbstoff unter einem inversen Mikroskop.
(7) Quantifizierung der Sprout Länge
Hinweis: ImageJ ver. 1,49 Software ist für alle Analyse des Bildes in dieser Studie verwendet.
- Überschneiden sich die Bilder der GLP-Mediumwechsel Tage 0, 1, 3, 5 und 7.
- Subtrahieren Sie die Position der Spitze Gefäßsystem der Tag 0 von der gleichen Position bei Aufnahmen an Tagen 1, 3, 5 und 7.
- Bestimmen Sie das Wachstum der vaskulären Spitze von der Wurzel-Position (Abbildung 6). Der Abstand zwischen den vaskulären Spitze und Wurzel wurde als Spross Länge in dieser Studie (Abb. 7 b) definiert.
(8) Quantifizierung der vaskulären Winkel
Hinweis: Vaskuläre Winkel wurde definiert als der Winkel von vaskulären Winkel, Wurzel und das Zentrum der Sphäroid (Abb. 7 c) bestand.
- Die fluoreszierende Bilder von der Coculture-Sphäroid, RFP-Mediumwechsel enthält vollständig und Analysefunktion in ImageJ "Schwerpunkt" Position messen. In dieser Studie wird die gemessene "Schwerpunkt" Position als Zentrum der Sphäroid (Abbildung 6) definiert.
- Bestimmen Sie die Position der vaskulären Spitzen und Wurzeln in Schritt 7 auf gleiche Weise.
- Messen der vaskulären Winkeln mit Analysefunktion in ImageJ-Software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein Design und Foto von mikrofluidischen Gerät. Es hat drei parallele Kanäle, in welchem, die Kanal 2 das Sphäroid gut enthält. Kanäle 1 und 3 dienen der HUVECS Kultur und Kanal 2 ist für den Sphäroid. Jeder Kanal ist durch trapezförmige Microposts entworfen, um Muster PDMS getrennt. Die Microposts verhindern, dass das Hydrogel in Kanal 2 Austritt von Flüssigkeit ins Kanäle 1 und 3 durch Oberflächenspannung und ermöglichen den Austausch von Stoffen zwischen den Sphäroid und Mediumwechsel Mikrokanäle28.
Abbildung 7a zeigt das Zentrum eines mikrofluidischen Geräts nach der Aussaat der Zelle. Hellfeld und fluoreszierende Aufnahmen am Tag 0 zeigen, dass Fibrin Gel nur 2 Kanal ohne Undichtigkeiten in Kanäle 1 und 3 gefüllte, und Mediumwechsel erfolgreich an der Seitenwand des Fibrin Gels. Die Hellfeld-Bild ist im Fokus auf die beiden die geladenen Sphäroid und Microposts, darauf hinweist, dass das Sphäroid an der Unterseite des Gerätes richtig abgerechnet. Die Angiogenese-Sprossen sind an Tag 1 und die Länge der Sprossen steigt mit der Zeit (Abb. 7 b) beobachtet. Am 3. Tag die längste sprießen erreicht das Sphäroid und am 7. Tag, die meisten der angiogenen Sprossen erreicht das Sphäroid (mittlere Entfernung von der Kanäle 1 und 3 zu den Sphäroid < 500 µm). Im besten Fall kann nach 4 Tagen im Gerät Kultur Durchströmung der vaskulären Lumen beobachtet werden. Die vaskuläre Winkel wurde als die Richtungen der vaskulären Spitze und das Zentrum der Sphäroid von der vaskulären Wurzel definiert. Abbildung 7 c zeigt den quantifizierten vaskulären Winkel während 7 Tagen in der Gerät-Kultur. Die vaskuläre Winkel verringerte in einer zeitabhängigen Weise, darauf hinweist, dass die Angiogenese Sprossen in Richtung der Sphäroid migriert.
Abbildung 8 zeigt den Abschnitt des Netzwerks aus vaskulären wo RFP-Mediumwechsel und GFP-Mediumwechsel zusammengeschlossen haben. RFP-Mediumwechsel und GFP-Mediumwechsel gebildet koordinativ ein einzelnes Gefäß Lumen, dargestellt durch Pfeilspitzen, die eindeutig zeigen angiogenen Sprossen aus Kanäle 1 und 3 in der Sphäroid, RFP-Mediumwechsel anastomosieren und einem kontinuierlichen Kreislauf Netzwerk gebildet. Um die Perfusability des vaskulären Netzwerks zu bestätigen, wurde FITC-Dextran in Kanal 1 injiziert. FITC-Dextran in Kanal 1 flossen in den konstruierten vaskuläre Netzwerk und Interieur des Sphäroids und endlich auf Kanal 3 (Abbildung 9). Während die Perfusion der FITC-Dextran-Lösung gibt es keine Leckage aus dem Kreislauf Netzwerk in den extravascular Raum. Es wurde bereits gezeigt, dass kleine Moleküle, die in der vaskulären Lumen injiziert die Gefäßwand durchlaufen und mit den Zellen in den extravascular Regionen reagieren. Darüber hinaus zeigte die Durchlässigkeit Koeffizienten des vaskulären Netzwerks nahe, dass in-Vivo-27sein. Diese Ergebnisse bedeuten, dass das integrierte vaskuläre Netzwerk könnte die Nährstoffe zu den Sphäroid liefern und das Abfallprodukt entfernen.
Abbildung 1 : Design und ein Foto des Geräts mikrofluidischen. (a) Überblick über das Design des Geräts mikrofluidischen. Graue Bereich zeigt drei mikrofluidische Kanäle getrennt durch trapezförmige Microposts. Kanal 2 hat einen Brunnen für ein Sphäroid Kultur. Bild rechts zeigt die vergrößerte Ansicht im roten Rechteck in der linken Seite. (b) Foto von mikrofluidischen Gerät deren Kanäle mit roter Tinte gefüllt sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Experimentelle Zeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Methode, ein Sphäroid in mikrofluidischen Gerät laden. (a) machen einen Tropfen von MS und Medien mit ein Sphäroid in zwei separate Küche. Übertragen Sie anschließend die Sphäroid in MS mit Thrombin. (b) schematische Schnittansicht des Geräts während der Injektion des Sphäroids. Überschüssige Menge Gel fließt durch die Löcher 2A und 2 b. Allerdings bleibt das Sphäroid an der Unterseite des Gerätes aufgrund der physischen Geburt. (c) schematische Darstellung der Geräte, wenn sie in einem Inkubator sind. Nasses Wischtuch wurde in ein 100-Millimeter-Teller gelegt und zwei 35-mm-Gerichte mit dem Gerät waren die Windex aufsetzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Die Fotografien von Pipettenspitzen für Zelle Aussaat auf das Gerät geschnitten. Die linke weiße Spitze ist für Löcher 1A, 1 b, 3A und 3C und Übertragung von Sphäroid zu einem Rückgang von Fibrin Gel (Schritte 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 und 4.2.6). Die mittlere gelbe Spitze ist für die Sammlung von den Sphäroid von 96-Well (Schritt 4.1.7). Rechts weiße Spitze ist für den Sphäroid Brunnen (Schritt 4.1.11). Die Spitzen vor Schnitt sind auch auf dem Foto gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Non perfusable Gefäßsystem. Angiogenen Sprossen von Mikrokanälen keine Verbindung zu der Öffnung zwischen Microposts und die Verbindung zwischen dem Lumen und Mikrokanälen (schwarze Pfeile) verloren. Es entsteht durch die unzureichende Mediumwechsel ausgesät in Kanäle 1 und 3. Rot: RFP-Mediumwechsel in den Sphäroid, grün: GFP-Mediumwechsel von Mikrokanälen. Die Zellen wurden in das Gerät 14 Tage lang kultiviert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Definition der vaskulären Wurzel, Tipp und das Zentrum des Sphäroids. (a) die Methode zur Bestimmung der Position der vaskulären Wurzel und Spitze, die Sprossen Länge messen. Nach dem ausrichten die Time-Lapse fluoreszierende Bilder, ist die fluoreszierende Aufnahme ein paar Tage nach der Kultivierung in das Gerät durch das Bild am Tag 0 subtrahiert. Wir haben die Länge der Sprossen nach der Subtraktion von ImageJ Software gemessen. (b) Definition des Zentrums der Sphäroid. Die fluoreszierende Bilder von RFP-Mediumwechsel sind binarisiert und gemessen an seinen Schwerpunkt von ImageJ-Software. Wir definieren den Schwerpunkt als Zentrum der Sphäroid. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Bildung eines vaskulären Netzwerks in mikrofluidischen Gerät. (a) Zeitraffer Bilder eines Zentrums eines mikrofluidischen Geräts nach der Aussaat der Zelle. Rot: RFP-Mediumwechsel kultiviert in den Sphäroid, grün: GFP-Mediumwechsel geerntet in Kanäle 1 und 3. Quantitative Analyse der Keimling Länge (b) und vaskuläre Winkel (c) (n = 42 Sprossen in 3 Geräte, die Fehlerbalken zeigen die Standardfehler (S.E)). Die Sprossen Länge wurde als der Abstand von der Position des Mediumwechsel am Tag 0 bis zur vaskulären Spitze (b, oben) definiert. Der Winkel (∠TRS) wurde von der vaskulären Wurzel (R), Spitze (T) und das Zentrum der Sphäroid (S) (C, oben) definiert. Siehe Abbildung 6 für die Definition der vaskulären Wurzel, Tip und das Zentrum des Sphäroids. Diese Daten wurden mit ImageJ-Software erhalten. Die Schaltpläne erklären, die Definition der Länge sprießen und der vaskulären Winkel sind aus Nashimoto, Y. Et Al. geändert. 27. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 : Bildung von vaskulären Lumen durch Mediumwechsel von Mikrokanälen und den Sphäroid. (a) fluoreszierende Bild der Übersicht der Probe nach 14 Tagen im Gerät Kultur. Gelbes Rechteck zeigt die X-y-Position des optischen Abschnitt (b) gezeigt. (b) X / y, y-Z und X-Z optische Abschnitt des konstruierten vaskulären Netzwerks. Weiße Pfeile zeigen vaskuläre Lumen. Rot: RFP-Mediumwechsel kultiviert in den Sphäroid, grün: GFP-Mediumwechsel kultiviert in den Mikrokanälen, blau: zelluläre Kerne. (a) zeigt keine blaue Fluoreszenz, weil (a) das Bild vor der Fixierung ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9 : Perfusion der ein Sphäroid mit einem konstruierten vaskuläre Netzwerk. Hellfeld (a) und Fluoreszenz (b) Bilder von der Sphäroid nach 7 Tagen im Gerät Kultur. (c) fluoreszierende Bild des gleichen Sphäroid nach FITC-Dextran (70 kDa) laden. Rot: RFP-Mediumwechsel in den Sphäroid und Kanäle 1 und 3, grün: FITC-Dextran, blau: zelluläre Kerne. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Datei 1: das Design des Geräts mikrofluidischen. Die Datei ist im Dxf-Format. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frühere Berichten zufolge hLFs einen Cocktail aus mehreren angiogenen Faktoren wie Angiopoietin-1, Angiogenin, Hepatozyten-Wachstumsfaktor, Umwandlung von Wachstumsfaktor-α, Tumor-Nekrose-Faktor und einige extrazelluläre Matrix Proteine29absondern, 30. Dieser Assay stützt sich auf die Angiogenese-Sekretion von hLFs in ein Coculture-Sphäroid, die die Einschränkung der Technik ist. Daher ist es wichtig für eine stabile vaskulären Bildung ein Sphäroid Coculture an der Unterseite eines Brunnens festlegen, sodass der Abstand zwischen den Coculture-Sphäroid und Mediumwechsel in Kanäle 1 und 3 gekürzt werden kann. Die vaskuläre Länge von Fibroblasten war umgekehrt proportional zum Abstand zwischen den Endothelzellen und Fibroblasten31, so dass die kürzere Strecke vorteilhaft für stabile vaskulären Bildung ist. Die Mindestbreite von Kanal 2 war jedoch um ein Sphäroid Loch (Durchmesser 1 mm) ohne schädliche Kanäle 1 und 3 öffnen, 1,5 mm.
Obwohl das Sphäroid an der Unterseite des Brunnens absetzt, waren vaskuläre Wurzeln gelegentlich Microposts oder Mikrokanäle (Abbildung 5) getrennt. In diesem Fall konnte keine Reagenz der vaskuläre Lumen durch Mikrokanäle (Kanäle 1 oder 3) erreichen. Obwohl wir dieses Problem nicht völlig lösen könnte, setzen wir voraus, dass das Problem durch die unzureichende Anzahl von Mediumwechsel an der Oberfläche des Fibrin Gels (Schritt 4.2.1-4.2.6). Stellen Sie sicher die Mediumwechsel die Seitenwand von Kanal 2 stabil zu befestigen.
Auf die erfolgreiche Injektion von ein Sphäroid in den Brunnen, Optimierung des inneren und äußeren Durchmessers der Mikropipette Tipps im Schritt 4.1.7 ist wichtig: 1) der innere Durchmesser sollte größer als die von den Sphäroid. (2) die äußeren Dimeter sollte an den Rand des Brunnens passen, so dass keine Leckage des Gels an die Spitze des Brunnens während der Injektion tritt und die Spitze nach der Gel-Injektion leicht entfernt werden kann. In diesem Protokoll (φ1 mm ein Sphäroid gut) ist rund 700 µm der maximale Durchmesser für die injizierbare Sphäroid. Wenn die gut Durchmesser größer ist als die in diesem Protokoll ausgelegt ist, können größere Sphäroide injiziert werden, da die Spitze geschnitten werden kann, um größeren Innendurchmesser haben. Sphäroid Durchmesser können leicht gesteuert werden, indem Sie ändern die Anzahl von Zellen in 96-Well-Platte geerntet.
Dieses Protokoll zeigt zum einen neuartigen Mikrofluidik-Plattform, eine perfusable vaskuläre Netzwerk in ein Sphäroid zu bauen. Obwohl die Coculture mit Mediumwechsel die Bildung von Schiff-ähnlichen Strukturen in ein Sphäroid18,23,24 erlaubt, wurden diese nicht durch die Sackgassen der Lumina perfusable. Weil Fibroblast Zellen existieren in vielseitig Gewebe (Knochen, Adipocyte und Krebs, etc.), durch die Zugabe von einigen anderen targeting Zellen zu Coculture Sphäroid, eine Vaskularisierung der verschiedenen Art der Sphäroide erwartet werden kann, können die in der imitieren. Vivo Umwelt besser als die herkömmlichen Sphäroid Kultur. Um die Anwendung der Technik zu erweitern, würden zukünftige Arbeit die Vaskularisierung der Sphäroide ohne Zusatz von Fibroblastenzellen gehören. Einige aktuelle Werke Bericht Knochenmark Stromazellen Zellen32 und Muskel Zellen33 können Angiogenese in mikrofluidischen Geräten auslösen. Unter Verwendung der Stromazellen oder Muskel Zellen anstelle von den Fibroblastenzellen Stiege die Anzahl der Gewebe, die im Gerät mikrofluidischen durchblutet werden kann. Dieses Protokoll bietet eine grundlegende Plattform für Gewebe Vaskularisierung, ist eine lang ersehnte Technik auf dem Gebiet der drei dimensionalen Kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der Autor erklärt, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von CREST JST (Grant-Nummer JPMJCR14W4), Gesellschaft für die Förderung von Science (JSPS) KAKENHI (Grant-Nummer 25600060, 16 K 16386), Center Innovation Program von MEXT und JST, Projekt konzentrierte sich auf Entwicklung Bewertung Schlüsseltechnologie aus unterstützt. Japan Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED, Mizuho-Stiftung zur Förderung der Wissenschaften. Microfabrication wurde von Kyoto Universität Nano Technologiezentrum unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | - | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | - | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surface profiler | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
