Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Neuroinflammation के पीईटी इमेजिंग का उपयोग कर [11ग] DPA-७१३ कोरोनरी स्ट्रोक के एक माउस मॉडल में

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Summary

पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) translocator प्रोटीन की इमेजिंग 18 केडीए (TSPO) मस्तिष्क रोगों के विकास और प्रगति में neuroinflammation की गतिशील भूमिका की कल्पना करने के लिए एक गैर इनवेसिव साधन प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल का वर्णन TSPO-पीईटी और पूर्व vivo autoradiography कोरोनरी स्ट्रोक के एक माउस मॉडल में neuroinflammation का पता लगाने के लिए ।

Abstract

Neuroinflammation कोरोनरी स्ट्रोक के बाद रोग झरना के लिए केंद्रीय है । गैर इनवेसिव आणविक इमेजिंग तरीकों को लौकिक गतिशीलता और स्ट्रोक में कुछ neuroimmune बातचीत की भूमिका में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है । विशेष रूप से, पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) translocator प्रोटीन की इमेजिंग 18 केडीए (TSPO), सक्रिय microglia और परिधीय माइलॉयड-वंश कोशिकाओं के एक मार्कर, vivo मेंneuroinflammation का पता लगाने और ट्रैक करने के लिए एक साधन प्रदान करता है. यहां, हम सही [11C] N का उपयोग neuroinflammation यों तो एक विधि वर्तमान, एन-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5, 7-dimethylpyrazolo [1, 5-ए] pyrimidin-3-yl] acetamide ([11सी] DPA-७१३), एक होनहार दूसरी पीढ़ी TSPO-पीईटी रेडियो ट्रेसर, बाहर मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (dMCAO) में अन्तर्वासना संचालित चूहों की तुलना में. एमआरआई स्ट्रोक की पुष्टि और infarct स्थान और मात्रा को परिभाषित करने के लिए 2 दिनों के बाद dMCAO सर्जरी प्रदर्शन किया गया । पीईटी/गणना टोमोग्राफी (सीटी) इमेजिंग बाहर किया गया था 6 दिनों के बाद dMCAO स्ट्रोक के बाद TSPO के स्तर में पीक वृद्धि को पकड़ने के लिए । पीईटी छवियों के Quantitation का आकलन करने के लिए आयोजित किया गया था [11ग] DPA-७१३ मस्तिष्क और dMCAO और अन्तर्वासना चूहों की तिल्ली में सूजन के केंद्रीय और परिधीय स्तर का आकलन करने के लिए. वीवो में [11सी] DPA-७१३ मस्तिष्क के सालभर पूर्व वीवो autoradiography के प्रयोग की पुष्टि हुई ।

Introduction

स्ट्रोक मौत का पांचवां प्रमुख कारण है और संयुक्त राज्य अमेरिका में विकलांगता का एक प्रमुख कारण1। कोरोनरी स्ट्रोक इन मामलों (~ ८७%), के एक भारी बहुमत का प्रतिनिधित्व करता है जब वहां मस्तिष्क को रक्त के प्रवाह में स्थानीय व्यवधान है (जैसे, एक खून का थक्का या वसायुक्त जमा करके) । प्रभावित क्षेत्रों के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति बाद में कम कर रहे हैं और एक जटिल रोग झरना आसपास के क्षेत्रों के अलावा स्ट्रोक कोर (infarct) के भीतर न्यूरॉन्स मौत में जिसके परिणामस्वरूप शुरू की है । Neuroinflammation इस क्षति के लिए अग्रणी मार्ग में एक महत्वपूर्ण घटक है, दोनों निवासी मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं (microglia) और परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ (न्यूट्रोफिल, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और monocytes/मैक्रोफेज) के साथ इस के लिए योगदान करने के लिए सोचा विनाशकारी झरना2,3। सक्रिय microglia और मैक्रोफेज इस neuroinflammatory प्रतिक्रिया के लिए केंद्रीय हैं, दोनों बचके और लाभ के प्रभाव की रिपोर्ट के साथ कोरोनरी स्ट्रोक2. इस प्रकार, यह आवश्यक है का आकलन करने के लिए vivo में इन कोशिकाओं का योगदान स्ट्रोक के बाद ।

पीईटी एक शक्तिशाली 3 आयामी आणविक इमेजिंग तकनीक है कि vivo में जैविक प्रक्रियाओं के दृश्य सक्षम बनाता है पोजीट्रान के साथ लेबल विशिष्ट अणुओं के उपयोग के माध्यम से (β +) ऐसे 11सी के रूप में radionuclides उत्सर्जक, 13एन, १५हे आणि १८च. यह गैर इनवेसिव विधि पूर्व vivo तरीकों पर कई फायदे है (जैसे, immunohistochemistry) के रूप में यह वास्तविक समय में आणविक जानकारी के अधिग्रहण, बरकरार विषयों में रहने में परमिट, और अनुदैर्ध्य जांच के लिए अनुमति देता है । TSPO के पीईटी इमेजिंग, सक्रिय microglia और परिधीय माइलॉयड-वंश कोशिकाओं का एक मार्कर, मात्रा और शरीर के भीतर सहज प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए एक साधन प्रदान करता है, और स्ट्रोक और चिकित्सकीय के लिए प्रतिक्रिया के बाद सूजन का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता हस्तक्षेप. TSPO, पूर्व में परिधीय प्रकार बेंजोडाइजेपाइन रिसेप्टर के रूप में जाना जाता है, एक 18 केडीए प्रोटीन है कि कोलेस्ट्रॉल परिवहन में एक भूमिका निभाने के लिए माना जाता है और neurosteroids4के संश्लेषण. इसके अलावा, सबूत पता चलता है कि TSPO neuroinflammation और ंयूरॉंस अस्तित्व5,6में शामिल है, कई स्नायविक स्ट्रोक7सहित सूजन से जुड़े विकारों में वृद्धि की अभिव्यक्ति की रिपोर्ट के साथ, डिमेंशिया8, पार्किंसंस रोग9 और मल्टीपल स्केलेरोसिस10। TSPO बाहरी mitochondrial झिल्ली पर स्थित है और अत्यधिक परिधि में व्यक्त की है, विशेष रूप से स्टेरॉयड जुड़े ऊतकों में (जैसे, ग्रंथियों) और मध्यवर्ती दिल में देखा स्तर के साथ, गुर्दे, और फेफड़ों10. हालांकि स्वस्थ मस्तिष्क में, TSPO का स्तर कम है और मुख्य रूप से6,11glia के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं । पर न्यूरॉन चोट, जैसे कि स्ट्रोक में मनाया, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में TSPO स्तर (सीएनएस) में काफी वृद्धि हुई है. यह स्वीकार्य TSPO के ऊपर देखा है vivo में छवि neuroinflammation के लिए शोषण किया जा सकता है, अभिव्यक्ति की सूजन गंभीरता का एक सटीक संकेतक उपलब्ध कराने के स्तर के साथ । इसलिए, इस विधि का लक्ष्य सही TSPO-पीईटी का उपयोग कर कोरोनरी स्ट्रोक का एक माउस मॉडल मेंvivo neuroinflammation के योगदान को बढ़ाता है ।

एकाधिक TSPO अनुरेखकों neuroinflammation के पीईटी इमेजिंग के लिए विकसित किया गया है. यहां, TSPO-पीईटी इमेजिंग [11सी] DPA-७१३12, एक होनहार दूसरी पीढ़ी TSPO अनुरेखक, जो शोर करने के लिए बढ़ाया संकेत दिखाया गया है और अधिक ऐतिहासिक इस्तेमाल की तुलना में कम गैर विशिष्ट बंधन का उपयोग कर वर्णित है [11ग] PK11195 13 . उदाहरण के रूप में, इस विधि14के लिए स्ट्रोक का dMCAO माउस मॉडल चुना गया था । इस मॉडल लौकिक craniotomy और बाहर मध्य मस्तिष्क धमनी के स्थाई बंधाव, somatosensory प्रांतस्था के केंद्र के ischemia में जिसके परिणामस्वरूप शामिल है । इस पूर्व नैदानिक स्ट्रोक अनुसंधान के कारण कोरोनरी क्षति और कम मृत्यु दर इस मॉडल के साथ जुड़े उच्च reproducibility में लाभप्रद है । तारीख करने के लिए, TSPO-पीईटी इमेजिंग अध्ययन अभी तक dMCAO कुतर मॉडल में सूचित किया है । हालांकि, पिछले पीईटी इमेजिंग अध्ययन मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (MCAO) मॉडल, एक और अधिक गंभीर और चर स्ट्रोक मॉडल का उपयोग कर, दोनों चूहों और चूहों में, TSPO अभिव्यक्ति की सूचना दी है दिन से वृद्धि करने के लिए 3 और चोटी के दिन के आसपास 7 के बाद स्ट्रोक15, 16,17,18. इसलिए, हम पीईटी इमेजिंग 6 दिनों के बाद प्रदर्शन के लिए ऊंचा TSPO अभिव्यक्ति के साथ मेल dMCAO । [11सी] DPA-७१३ मस्तिष्क में अधिक से अधिक ipsilateral (infarcted) और contralateral गोलार्द्धों में मूल्यांकन किया गया था । TSPO-पीईटी संरचनात्मक एमआरआई के साथ संयुक्त, ब्याज की infarct और contralateral क्षेत्रों (ROIs) के सटीक विरेखांकन के लिए अनुमति दी गई थी । यहां हम दोनों एक एटलस आधारित है और एक एमआरआई-रॉय दृष्टिकोण [11सी] DPA-७१३ की गणना करने के लिए प्रेरित का वर्णन । तिल्ली में रेडियो ट्रेसर भी समूहों के बीच सूजन के परिधीय स्तर की जांच करने के लिए मूल्यांकन किया गया था । इस विधि spatiotemporal गतिशीलता और स्ट्रोक और अंय स्नायविक रोगों में विशिष्ट neuroimmune बातचीत की भूमिका में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है ।

Protocol

सभी पशु अध्ययन प्रयोगशाला पशु देखभाल पर प्रशासनिक पैनल (APLAC) के अनुसार स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय, एक आकलन और प्रयोगशाला पशु देखभाल के प्रत्यायन के लिए संघ द्वारा मांयता प्राप्त कार्यक्रम में किए गए थे । इस प्रक्रिया से पहले, तीन महीने पुराने C57BL/6 महिला चूहों मानक प्रक्रिया और बाँझ शर्तों14के बाद dMCAO सर्जरी से गुजरा ।

1. स्ट्रक्चरल एमआरआई (2 दिनों के बाद dMCAO सर्जरी)

  1. ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक नई परीक्षा बनाने के द्वारा निर्धारित अधिग्रहण । स्थानीयकरण और पैलेट एक्सप्लोरर में turborare टी 2 अनुक्रम का चयन करें और परीक्षा खिड़की में खींचें ।
  2. नरम टेप का उपयोग कर माउस बिस्तर करने के लिए श्वसन और गर्मी की जांच सुरक्षित है, और एक बाँझ वातावरण बनाने के लिए दोनों पर गद्दी सुरक्षात्मक शोषक की एक पट्टी जगह है ।
  3. पशु बिस्तर पर एक एयर हीटर देते हैं और इतना है कि गर्म हवा पर है और माउस गर्म रखने के प्रशंसक पर बारी । शरीर का तापमान और श्वसन दर को सुनिश्चित करने के लिए एक स्वचालित निगरानी प्रणाली का उपयोग स्कैन की अवधि के लिए उचित स्तर पर बनाए रखा जाता है ।
  4. शुरू में 3% Isoflurane का उपयोग कर एक प्रेरण कक्ष में माउस Anesthetize, तो 1-2% पर बनाए रखने (2 L/मिनट, १००% ओ2) । एक गर्मी पैड को प्रेरण चैंबर के तहत चालू है सुनिश्चित करने प्रेरण के दौरान गर्म माउस रखने के लिए । एक बार anesthetized, सुखाने और corneal अल्सर के गठन से बचने के लिए माउस के लिए नेत्र स्नेहक लागू होते हैं ।
    1. संज्ञाहरण प्रणाली पर बारी (Isoflurane 1-2%, 2 एल/मिनट १००% O2) एमआरआई स्कैनर से जुड़े और माउस बिस्तर पर पशु हस्तांतरण ।
    2. स्थिति माउस सिर काटने पट्टी पर प्रवण और जगह में कान सलाखों के ठीक, यकीन है कि वे बिस्तर के व्यास के बाहर बहर नहीं कर रही ।
    3. माउस सिर पर आरएफ कुंडल स्लाइड और तार और बोर में बिस्तर धक्का, यह विशेष रूप से isocenter के लिए रख ।
    4. सभी 3 आयामों में माउस की स्थिति को देखने और इस छवि का उपयोग करने के लिए टी 2 turborare (ते: ३३ एमएस, TR: २,५०० ms, 2 औसत, 17 स्लाइसें, ०.०८३ x ०.९२ मिमी संकल्प, 2 मिनट ४० सेकंड कुल समय) अधिग्रहण के लिए मात्रा को परिभाषित करने के लिए स्थानीयर मोल । dMCAO सर्जरी somatosensory प्रांतस्था14में एक infarct में परिणाम; इसलिए, यह सुनिश्चित करें कि इस क्षेत्र टी 2 भारित छवि में शामिल किया गया है ।
    5. स्कैनर से चूहों को निकालें और एक गर्म चैंबर में चूहों को ठीक.

2. पीईटी/सीटी अंशांकन और कार्यप्रवाह सेटअप (6 दिनों के बाद dMCAO सर्जरी)

  1. एक सीटी क्षीणन अधिग्रहण शामिल करने के लिए स्कैनर-ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर में एक इमेजिंग कार्यप्रवाह बनाएँ, ६०-मिनट सी-11 गतिशील पालतू अधिग्रहण (३५०-६५० कीव स्तर भेदभाव, ३.४३८ एनएस संयोग खिड़की), हिस्टोग्राम (20 फ्रेम: 5 x 15 सेकंड, 4 x 1 मिनट, 11 x 5 मिनट के साथ; मृत समय सुधार) और एक 3DOSEM-OP पुनर्निर्माण (2 पुनरावृत्तियां, 18 सबसेट) बनाने के लिए १२८ x १२८ x १५९ छवियों के साथ ०.७७६ x ०.७७६ x ०.९६ mm voxel आकार ।
  2. सीटी अंशांकन पैनल के माध्यम से एक्स-रे स्रोत कंडीशनिंग प्रदर्शन अंतरफलक के शीर्ष बाएं कोने पर स्थित है । यह अंशांकन साप्ताहिक या स्कैन करने से पहले किया जाना चाहिए यदि सिस्टम का उपयोग पिछले ४८ h में नहीं किया गया है ।
  3. डार्क/लाइट (D/L) और केंद्र ऑफ़सेट (C/O) अंशांकन निष्पादित करें ।
    1. सीटी अंशांकन बटन (एक्स) अंतरफलक के ऊपर छोड़ दिया में दबाएँ.
    2. d/l का चयन करें और C/O सीटी फ़ाइल जो आप चला रहे हैं, के लिए गैन्ट्री से बिस्तर निकालें और d/l अंशांकन चलाएँ ।
    3. स्कैनर में अंशांकन उपकरण बिस्तर डालें और C/O अंशांकन चलाने के लिए "७० mm पैलेट" के बजाय "अंशांकन उपकरण" के लिए इंटरफ़ेस पर चयन स्विच करने के लिए सुनिश्चित कर रहा है ।
  4. अंशांकन उपकरण निकालें और मानक पालतू बिस्तर वापस, "७० mm पैलेट" के लिए वापस अंतरफलक पर चयन को बदलने के लिए सुनिश्चित कर रही है ।
  5. स्कैनर टेप का उपयोग कर मंच पर एक 4 माउस इमेजिंग बिस्तर सुरक्षित और संज्ञाहरण टयूबिंग संलग्न (चित्रा 1a) । सुनिश्चित करें कि isoflurane ट्यूबों के माध्यम से बह रही है और कि कोई गुत्थी हैं ।
  6. बिस्तर आगे पुश तो यह देखने के क्षेत्र के केंद्र में है (FOV), सीटी दरवाजा बंद करो और सीटी के एक स्काउट दृश्य प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करने के बिस्तर सही स्थिति में है ।
  7. एक विकिरण स्रोत के रूप में सी-11 समाधान की एक ज्ञात खुराक युक्त एक घर में निर्मित प्रेत का उपयोग कर पालतू/सीटी स्कैनर के एक "मानक" अंशांकन प्रदर्शन ।
    1. एक 20 मिलीलीटर एक माउस (~ २५०-३५० µ ci/9-13 MBq सी-11 अनुरेखक खारा में पतला की) के बराबर अनुरेखक खुराक से भरा सिरिंज तैयार करें.
    2. एक खुराक औजार का उपयोग मानक में गतिविधि रिकॉर्ड और माप के समय ध्यान दें ।
    3. आचरण एक पालतू मानक की सटीक एक ही पैरामीटर है कि छवि चूहों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (जैसा कि ऊपर वर्णित) का उपयोग कर स्कैन । इस साप्ताहिक इमेजिंग डेटा के लिए लागू करने के लिए पालतू स्कैनर के लिए एक सुधार कारक बनाने के लिए करते हैं ।

3. पालतू/सीटी इमेजिंग के लिए कार्यक्षेत्र सेटअप

  1. virucide के साथ एक विसंक्रमित का उपयोग करके एक बाँझ वातावरण बनाएँ ( सामग्री की तालिकादेखें) और सुरक्षात्मक शोषक सभी सतहों पर गद्दी रखने.
  2. सुनिश्चित isoflurane और ऑक्सीजन टैंक पर्याप्त रूप से भर रहे हैं ।
  3. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरने से पूंछ नस कैथेटर तैयार (एक २७.५ जी सुई टिप के साथ सज्जित) ०.९% सोडियम क्लोराइड (बाँझ खारा) के साथ और एक २७.५ जी, 24 सेमी तितली कैथेटर के माध्यम से निस्तब्धता. cannulating से पहले कैथेटर के पंखों को काट कर सुनिश्चित करें कि वे पूंछ नस के दृश्य को ब्लॉक नहीं करते हैं और कैथेटर को बिना बताए स्कैनर में चूहों को ले जाने में आसानी के साथ मदद करते हैं ।
  4. सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक उपकरणों के अतिरिक्त "फ्लश" सीरिंज सहित कार्यस्थान पर रखी है (बाँझ खारा से भरा), नेत्र स्नेहक, इथेनॉल झाड़ू, गर्मी लैंप, तैयार कैथेटर (पूर्व-खारा से भरा), सर्जिकल टेप, ऊतक गोंद, ०.५ मिलीलीटर खुराक सीरिंज, कैंची, और एक लाइटर पूंछ नस में सफल प्लेसमेंट के बाद कैथेटर सील करने के लिए (चित्रा 1ख) ।

4. पशु तैयार करना और Cannulation

  1. चूहों तौलना करने के लिए अधिकतम मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक माउस (यानी, अनुरेखक की मात्रा और किसी भी खारा प्रशासन शरीर के वजन का 10% से अधिक नहीं होना चाहिए) में इंजेक्ट किया जा करने के लिए अनुमति दी ।
  2. एक प्रेरण 3% Isoflurane का उपयोग कर कक्ष में चूहों Anesthetize और 1-2% पर बनाए रखने (2 L/
  3. प्रत्येक माउस के लिए नेत्र स्नेहक लागू करें और पेडल पलटा (पैर की अंगुली चुटकी) के माध्यम से anesthetization की पुष्टि. यदि आवश्यक संज्ञाहरण के स्तर को समायोजित करें ।
  4. एक गर्म एक नाक शंकु के साथ लगे बिस्तर पर माउस प्लेस को 1-2% (2 L/मिनट १००% हे2) पर isoflurane उद्धार ।
  5. माउस anesthetized है, जबकि पूंछ शिरा cannulation प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन:
    1. एक पार्श्व नसों का पर्दाफाश करने के लिए अपनी तरफ माउस प्लेस, जबकि सिर नाक शंकु में रहता है ।
    2. एक गर्मी चिराग का उपयोग कर पूंछ गर्म, सावधान नहीं किया जा रहा से गरम करना या पूंछ जला, और एक शराब पोंछ के साथ झाड़ू नस को चौड़ा और इंजेक्शन साइट निष्फल ।
    3. ऊपर बेवल के साथ सुई पकड़ो और यह एक तीव्र कोण पर नस के साथ संरेखित करें ।
    4. हल्के से त्वचा और सुई बाहर स्तर पंचर तो यह नस के साथ लाइन में है दबाव लागू होते हैं ।
    5. धीरे आगे बेवल पिछले कुछ मिलीमीटर धक्का तो सुई नस में प्रवेश करती है ।
    6. की पुष्टि करें कैथेटर खारा के एक छोटे (10-20 µ एल) फ्लश प्रशासन द्वारा में है । खारा सिरिंज को सुचारू रूप से छोड़ना चाहिए और नस को साफ करना चाहिए । किसी भी प्रतिरोध या वापस दबाव मनाया जाता है, तो यह संभावना कैथेटर नस में नहीं है और पुन: प्रयास cannulation उचित है । यदि थक्के मनाया जाता है, cannulation सेटअप और निस्तब्धता के लिए हेपरिन (१,००० इकाइयों हेपरिन प्रति मिलीलीटर खारा) का उपयोग करें ।
      नोट: हम के साथ और ब्याज की माउस तनाव में हेपरिन के बिना cannulation का आकलन किया है, और के बाद से कोई थक्के मनाया गया था, खारा अकेले cannulations के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    7. , ऊतक गोंद की एक छोटी सी बूंद का उपयोग कर पूंछ करने के लिए कैथेटर सुरक्षित सर्जिकल टेप द्वारा पीछा किया, सुनिश्चित करें कि कैथेटर रहता है जब स्कैनर के लिए चूहों को स्थानांतरित करने के लिए ।
    8. कैथेटर के अंत से फ्लश सिरिंज निकालें और लाइटर के साथ अंत सील, शोधकर्ता किसी भी isoflurane या इथेनॉल के पास नहीं है यह सुनिश्चित करने.
    9. 3 अतिरिक्त चूहों के लिए दोहराएँ ताकि सभी 4 चूहों को स्कैन किया जा करने के लिए cannulated और तैयार कर रहे हैं.
  6. संज्ञाहरण प्रवाह को चालू करें (२.५% Isoflurane, 2 L/मिनट १००% हे2) पालतू से जुड़ा/सीटी और सावधानी से स्कैनर बिस्तर में प्रवण चूहों की स्थिति, सुनिश्चित करना कैथेटर्स जगह में रहने के लिए और प्रत्येक माउस के सिर सीधे है और नाक शंकु के भीतर सुरक्षित है । सिर और एक माउस के शरीर को शीतल शल्य टेप के साथ बिस्तर पर टेप, श्वास सुनिश्चित करने के टेप के स्थान से प्रतिबंधित नहीं है । छवि विश्लेषण के लिए सही स्थान और समूह आबंटन के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक माउस की स्थिति रिकॉर्ड करें ।
  7. प्रक्रिया में गर्म चूहों रखें (उदाहरण के लिए, एक गर्मी लैंप या गर्म हवा पंप प्रणाली का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित चूहों overheating के बिना गर्म रखा जाता है) । सभी चूहों की श्वसन दर की निगरानी, या तो नेत्रहीन एक खुले गैन्ट्री का उपयोग कर या श्वसन पैड का उपयोग कर एक दूरदराज के निगरानी प्रणाली के माध्यम से, और आवश्यक के रूप में संज्ञाहरण के स्तर को बदल.

5. सीटी अर्जन

  1. एक बार जानवरों बिस्तर में सुरक्षित है और श्वसन स्थिर है, लेजर पार बाल पर बारी और स्कैनिंग बिस्तर इतना है कि वे सभी चार चूहों के मस्तिष्क के साथ संरेखित करें । संभव के रूप में FOV के केंद्र के करीब के रूप में चूहों के दिमाग के साथ अधिग्रहण की स्थिति (स्थिति 3) में स्कैनर बिस्तर ले जाएँ.
  2. चूहों की एक स्काउट दृश्य छवि प्राप्त करने के लिए उनकी स्थिति को सत्यापित करने के लिए (एक २०० mm FOV का उपयोग करें), और यदि आवश्यक हो तो इंटरफ़ेस पर FOV बॉक्स खींचकर स्थिति को समायोजित । सीटी स्कैन शुरू करने के लिए स्कैनर सॉफ्टवेयर में "प्रारंभ कार्यप्रवाह" पर क्लिक करें, का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें "प्रदर्शन इंटरैक्टिव उपयोगकर्ता संकेत" तो पालतू स्कैन मैन्युअल अनुरेखक इंजेक्शन से पहले शुरू किया जा सकता है.

6. [11ग] DPA-७१३ गुनी तैयारी

  1. संश्लेषित [11C] DPA-७१३ के रूप में पहले वर्णित12, आप एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और व्यक्तिगत उंगली और शरीर dosimeters सहित रेडियोधर्मिता से निपटने के लिए उपयुक्त पीपीई (व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण) पहने हुए हैं, यह सुनिश्चित करने. सुनिश्चित करें कि आप नियमित रूप से दस्ताने बदलने के लिए रेडियोधर्मी संदूषण को रोकने, और जब संभव रेडियोधर्मी स्रोत से अपनी दूरी बढ़ाने के लिए ।
  2. एक लीड शील्ड के पीछे रेडियो ट्रेसर शीशी को सावधानीपूर्वक हस्तांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें ।
  3. प्रत्येक माउस के लिए ०.५ मिलीलीटर खुराक सीरिंज तैयार लगभग 250-350 µ ci/9-13 MBq 100-200 µ l मात्रा में एक ६० के लिए पर्याप्त खुराक सुनिश्चित करने के लिए मिनट गतिशील पीईटी स्कैन (खुराक प्रशासित आइसोटोप और समय-रेखा के आधे जीवन पर विचार निर्धारित किया जाना चाहिए अध्ययन डिजाइन के, माउस वजन के आधार पर मात्रा के साथ) ।
  4. cannulation साइट के लिए बंद निकटता में स्थित सी-11, के लिए सेट एक खुराक औजार का उपयोग गतिविधि को मापने, और क्षय सुधार सक्षम करने के लिए माप और इंजेक्शन के समय रिकॉर्ड. बस सीटी से पहले की खुराक ड्रा क्षय को सीमित करने के लिए समाप्त होता है और रेडियोधर्मिता के वांछित स्तर सुनिश्चित प्रत्येक माउस में इंजेक्ट किया जाएगा.
  5. सत्यापित करें कि कोई हवा में बुलबुले खुराक सिरिंज से पहले गतिविधि को मापने और प्रत्येक माउस में इंजेक्ट कर रहे हैं.

7. पालतू अधिग्रहण

  1. एक बार चूहों स्वचालित रूप से सीटी से पालतू करने के लिए अग्रिम, [11सी] DPA-७१३ इंजेक्शन (चित्रा 1सी) के लिए स्कैनर के पीछे की स्थापना की । सुरक्षात्मक शोषक एक कगार पर जगह और यकीन है कि कैंची और लाइटर हाथ पर कर रहे हैं ।
  2. गोली चलाना कैंची के साथ सील कैथेटर ट्यूबिंग, कैथेटर लाइनों की जाँच किसी भी बुलबुले के स्पष्ट कर रहे हैं, और प्रवेशनी एक 10-20 µ एल खारा फ्लश प्रदर्शन करके नस के भीतर अभी भी है की पुष्टि करें । मापा खुराक सीरिंज से प्रत्येक 4 कैथेटर में ६.४ कदम से लोड, ट्रैक जो की खुराक प्रत्येक माउस के लिए दिया गया था रखते हुए.
  3. क्लिक करें "ठीक है" जब पीईटी स्कैन शुरू करने के लिए तैयार है, जबकि एक साथ एक 10 सेकंड टाइमर शुरू । हाथ में खुराक सीरिंज के साथ स्कैनर के पीछे दो शोधकर्ताओं ने शून्य तक पहुँचने टाइमर पर एक साथ सभी 4 चूहों इंजेक्षन करने के लिए. खारा के 50-100 µ एल के साथ प्रत्येक कैथेटर फ्लश (कैथेटर ट्यूबिंग की लंबाई पर निर्भर करता है-यानी, मृत मात्रा) सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण खुराक पूंछ नस में प्रवेश करती है, और फिर से एक बार फिर से टयूबिंग सील एक लाइटर का उपयोग कर ।
  4. उपाय खुराक सीरिंज एक खुराक औजार का उपयोग कर एक अवशिष्ट रेडियोधर्मिता मूल्य प्राप्त करने के लिए (किसी भी अनुरेखक सिरिंज में छोड़ दिया). मूल्यों पर ध्यान दें और समय रहते उन्हें रिकॉर्ड कर लें ।
  5. स्कैन पूरा हो जाने के बाद, गति नियंत्रण कक्ष के भीतर क्षैतिज "घर" बटन का उपयोग कर मूल स्थिति के लिए पालतू बिस्तर घर । स्कैनर से चूहों को निकालें और सावधानी से कैथेटर को हटा दें । धीरे अत्यधिक रक्तस्राव को रोकने के लिए cannulation साइट के लिए दबाव लागू होते हैं ।
  6. पहले वर्णित के रूप में एक खुराक औजार का उपयोग कैथेटर में अवशिष्ट गतिविधि को मापने ।
  7. यदि चूहों को बरामद किया जाना सुनिश्चित कर रहे है यह एक गर्म वातावरण में किया जाता है (जैसे, एक बॉक्स में नीचे एक गर्म पैड के साथ या गर्म पानी से भरा दस्ताने युक्त) वसूली को कम करने के लिए । यदि चूहों euthanize करने की योजना बना, एक प्रेरण isoflurane युक्त कक्ष में चूहों जगह इतनी है कि वे छिड़काव के माध्यम से इच्छामृत्यु से पहले anaesthetized रहते हैं ।
  8. डेटा को पुन: बनाने के लिए, पोस्ट-प्रोसेसिंग प्रबंध सॉफ़्टवेयर ( सामग्री तालिकादेखें) खोलें, जो lst फ़ाइल से जनरेट किए गए हिस्टोग्राम डेटा का उपयोग करके प्रत्येक स्कैन को स्वचालित रूप से खंगाला जाएगा ।

8. ब्रेन Autoradiography

  1. प्रयोग करने से पहले, 10-15 मिनट के लिए सफेद प्रकाश को उजागर करके डिजिटल autoradiography फिल्म मिटा और उपयोग करने तक एक रेडियोधर्मिता मुक्त क्षेत्र में रखना.
  2. autoradiography के लिए पर्याप्त खुराक सुनिश्चित करने के लिए लगभग 1.0-1.5 एमसीआई/37-56 MBq वाले प्रत्येक माउस के लिए ०.५ मिलीलीटर खुराक सीरिंज तैयार करें ।
  3. खुराक सिरिंज में रेडियोधर्मिता को मापने, एक खुराक औजार का उपयोग, गतिविधि का एक सटीक पढ़ने प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन से पहले.
  4. Cannulate के रूप में पहले से वर्णित है और एक क्षेत्र में तुरंत चूहों सुई रेडियोधर्मिता के लिए उपयुक्त.
  5. इंजेक्शन के बाद कैथेटर निकालें और अवशिष्ट रेडियोधर्मिता को मापने.
  6. चूहों को एक गरम प्रेरण कक्ष में छोड़ दें ताकि वे छिड़काव और इच्छामृत्यु से पूर्व anaesthetized रहें.
  7. इच्छामृत्यु निष्पादित करते समय चूहों को गहरा anaesthetized (4% Isoflurane की नित्य साँस लेना, 2 L/मिनट १००% हे2) वाया पंजाब छिड़काव और द्विपक्षीय thoracotomy 30 मिनट के बाद-[11सी] DPA-७१३ इंजेक्शन ।
    1. उदर गुहा खोलें और डायाफ्राम के माध्यम से कटौती करने के लिए दिल का पर्दाफाश ।
    2. दिल की बाईं निलय में एक तितली कैथेटर अर्क सुई डालें, और सही atrium और अवर वेना कावा गोली चलाना ।
    3. धीरे से perfuse (~ 20-30 मिलीलीटर) के साथ एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ।
  8. संदंश और कैंची का प्रयोग करके खोपड़ी से मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक निकालें ।
  9. एक ठंड इष्टतम काटने के तापमान (OCT) तरल से भरा मोल्ड में मस्तिष्क प्लेस, सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क स्तर है और मोल्ड के भीतर केंद्रित घ्राण बल्ब के साथ मोल्ड में पायदानों की ओर उंमुख (स्थलों और अभिविंयास प्रदान करने के लिए एक बार मस्तिष्क मोल्ड से हटा दिया जाता है) ।
  10. 10 -15 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर प्लेस मोल्ड या OCT तक अपारदर्शी हो जाता है ।
  11. तुरंत cryostat microtome में प्रत्येक मोल्ड प्लेस-18 ° c के लिए सेट है, और 10 मिनट के लिए equilibrate बढ़ते से पहले ।
  12. दूर ठंड मोल्ड छील और microtome मंच के लिए मस्तिष्क माउंट ताजा OCT की एक छोटी राशि का उपयोग कर के रूप में "गोंद" ।
  13. microtome में घुड़सवार मस्तिष्क छोड़ दो मिनट के लिए फ्रीज करने के लिए ।
  14. स्ट्रोक स्थान (यानी, रॉय) उजागर होने तक मस्तिष्क के माध्यम से स्लाइस । प्रत्येक जानवर के मस्तिष्क के भीतर infarct का पता लगाने के लिए श्री छवि का प्रयोग करें । dMCAO के लिए, यह लगातार somatosensory प्रांतस्था में होना चाहिए; हालांकि, स्ट्रोक की लंबाई थोड़ा भिंन हो सकते हैं ।
  15. अनुभाग infarct फैले मस्तिष्क के क्षेत्र, ग्लास माइक्रोस्कोप पर उपयुक्त माउस संख्या के साथ लेबल स्लाइड पर 20 µm-मोटी वर्गों रखने.
  16. autoradiography कैसेट और सारण लपेटो के एक पत्रक के साथ कैसेट के नीचे लाइन खोलो । स्लाइड्स अनुभाग को ऊपर की ओर व्यवस्थित करें और कैसेट में सारण रैप के ऊपर रखें और प्रत्येक स्लाइड की स्थिति का ध्यान दें । वैकल्पिक रूप से, बाद के विश्लेषण में सहायता के लिए स्लाइड प्लेसमेंट का चित्र लें.
  17. धीरे शीर्ष पर सारण लपेटो की एक और परत प्लेस (प्रतीक्षा के बाद पिछले मस्तिष्क अनुभाग के ~ 2 मिनट निंनलिखित संग्रह-यह शुष्क और स्लाइड का पालन करने की अनुमति) और ध्यान से डिजिटल autoradiography फिल्म जगह (सफेद पक्ष नीचे का सामना करना पड़) स्लाइड के शीर्ष पर ।
  18. बंद कैसेट कसकर और एक में छोड़-20 ° c फ्रीजर, एक पर्याप्त जोखिम समय के लिए फिल्म पर क्षय के लिए वर्गों की अनुमति (~ 5-10 आधा रहता है) ।
  19. बाद विश्लेषण के लिए एक डिजिटल छवि उत्पंन करने के लिए एक फास्फोरस imager का उपयोग कर जोखिम समय के बाद फिल्म स्कैन ।

9. गतिशील पालतू छवि विश्लेषण

  1. ओपन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) और सीटी छवि (स्रोत के रूप में) लोड करने के लिए "खुला डेटा" आइकन पर क्लिक करें और गतिशील पालतू (संदर्भ के रूप में) लोड करने के लिए "डेटा जोड़ें" आइकन.
  2. ड्रॉप-डाउन मेनू में समय-श्रृंखला ऑपरेटर के माध्यम से डेटा का दृश्य गुणवत्ता नियंत्रण निष्पादित करें: संदर्भ ("ref") और "वैश्विक" का चयन करना और रंग स्केल के लिए उपयुक्त न्यूनतम और अधिकतम लागू करना. फ्रेम द्वारा गतिशील पालतू डेटा फ्रेम कल्पना, रेडियोधर्मिता के ऊपर की जांच और स्कैन के भीतर किसी भी गति की जांच के लिए जाँच ।
  3. "अंकगणित ऑपरेटर" का उपयोग करके एक औसत पीईटी छवि बनाएँ.
    1. चुनें "औसत चुना", अचयनित "रेफरी", और इनपुट 1 ("Inp1"), इनपुट 2 ("Inp2") और इनपुट स्टार ("Inp *"-स्कैन में पालतू फ्रेम के बाकी शामिल हैं) सभी पालतू फ्रेम के एक औसत बनाने के लिए चुना जाता है सुनिश्चित करते हैं ।
    2. "डेटा प्रबंधक" टैब (डीएम) पर जाएं और दृश्य प्रयोजनों के लिए औसत छवि को "input1" स्थिति तक खींचें । "ंयूनतम-max" उपकरण में स्वचालित परिकलन पर क्लिक करके रंग स्केल को पुनर्वितरित करें ।
  4. औसत पालतू फ़ाइल के लिए सीटी रजिस्टर "में स्वत: 3 डी समारोह" का उपयोग कर फिर से अभिविन्यास/पंजीकरण "ड्रॉप डाउन मेनू ।
    1. चुनें "रेफरी" और "Inp1", और चुनें "कठोर", "फास्ट", "रेफरी के लिए Inp1" पंजीकरण । नेत्रहीन सभी 3 आयामों में पंजीकरण की जाँच करें और मैन्युअल "अनुवाद" और "रोटेशन" कार्यों का उपयोग "मैनुअल 3 डी" टैब में आवश्यक अगर समायोजित.
    2. पंजीकरण से संतुष्ट होने पर, "Inp2" और "Inp *" चुनें, और चेकमार्क पर क्लिक करके सभी पालतू फ़्रेम पर लागू करें । सीटी और डीएम में पालतू फ़ाइलों पर दायां क्लिक करें और रॉ के रूप में सहेजें ।
  5. एक गाइड के रूप में सीटी का उपयोग कर मस्तिष्क विश्लेषण के लिए एक समय में एक माउस के मस्तिष्क फसल: ड्रॉप-डाउन मेनू से "फसल" का चयन करें और brainstem के नीचे माउस के सिर को क्रॉप करने के लिए छवि सीमाओं को खींचें । फिर से पीईटी और सीटी छवियों के रूप में ऊपर वर्णित है कि खोपड़ी सभी आयामों में सीधे है के रूप में "मैनुअल 3 डी अभिविन्यास" समारोह का उपयोग मालूम ।
  6. कि माउस के लिए श्री छवि में लोड (DICOM प्रारूप में) इंटरफ़ेस के ऊपर छोड़ दिया पर "डेटा जोड़ें" बटन का उपयोग कर । "मैनुअल 3 डी अभिविन्यास" का उपयोग श्री हटो और सीटी छवि के भीतर खोपड़ी के लिए फिट (सुनिश्चित करें कि सभी मोडलों एक ही अभिविन्यास में हैं).
  7. "3 डी रॉय उपकरण" का उपयोग कर श्री छवि पर स्ट्रोक रॉय ड्रा ।
    1. यह दृश्य नियंत्रक टैब (VC) के भीतर अचयनित द्वारा पालतू दृश्य बंद करें और केवल एमआर और सीटी का उपयोग करने के लिए रॉय आकर्षित ।
    2. "रॉय जोड़ें" बटन पर क्लिक करें एक नया रॉय बनाने के लिए और यह नाम "infarct" । "पट्टी उपकरण" का चयन करें, रॉय सीमा और इसे बंद करने के लिए ठीक क्लिक आकर्षित करने के लिए छोड़ दिया क्लिक ।
    3. सभी स्ट्रोक को शामिल स्लाइस के माध्यम से दोहराएँ, यकीन है कि नहीं करने के लिए रॉय में खोपड़ी के किसी भी कब्जा करने के लिए, सबसे अच्छा करने के लिए खोपड़ी सीमा और स्ट्रोक रॉय के बीच एक voxel अंतर छोड़ जा रहा अभ्यास के साथ ।
  8. infarct वॉल्यूम का उपयोग करके एक contralateral ROI जेनरेट करें.
    1. एक नया रॉय बनाएं और यह लेबल "contralateral" । Infarct रॉय पर दायां क्लिक करें और चुनें "निर्यात" । ROI को 2 स्थान पर खींचें ("Inp1").
    2. केवल "Inp1" के साथ चयनित, एक वाम अधिकार लागू "" reओरिएंटेशन के भीतर "ऑपरेटर समारोह" का उपयोग कर फ्लिप/ "roi" बॉक्स पर टिक करें, "केवल देखें" चुनें और मैन्युअल रूप से नए roi को contralateral ओर समान क्षेत्र पर ले जाएँ. का चयन करें "है अंकगणित" ऑपरेटर और 2 के एक अदिश गुणा लागू करने के लिए नए रॉय, ROIs के स्वतंत्र ठहराव की अनुमति ।
    3. 3d ROI टूल पर लौटें. "विशेषज्ञ और प्रयोगात्मक" टैब पर जाएं और "आयात रॉय" बटन पर क्लिक करें । नया वॉल्यूम contralateral ROI के रूप में लोड करने के लिए संवाद बॉक्स से Inp1 चयन करें ।
  9. औसत पालतू छवि पर दायां क्लिक करें और इसे उतारना और पालतू बारी पर वापस । 3d ROI टूल के अंतर्गत "परिणाम निर्यात करें" चिह्न का उपयोग करके मात्रात्मक रूप से अधिक परिणाम जेनरेट करें.
  10. अतिरिक्त विभाजन मस्तिष्क विश्लेषण प्रदर्शन अगर वांछित (यानी, सही Vivoquant सॉफ्टवेयर के लिए एक 3 डी माउस ब्रेन एटलस प्लगइन मॉड्यूल का उपयोग कर छोड़ दिया मस्तिष्क गोलार्द्ध क्षेत्रों बनाम के स्वचालित रॉय पीढ़ी) ।
    1. फिर से लोड पंजीकृत पालतू/
    2. "उन्नत मॉड्यूल" मेनू पर क्लिक करके और 3 डी मस्तिष्क एटलस उपकरण का चयन करके माउस ब्रेन एटलस आयात. "उन्नत सेटिंग्स" में "सभी क्षेत्रों छोड़ दिया/सही" का चयन करें और 3 डी एटलस आयात करने के लिए "भागो" क्लिक.
    3. मैन्युअल रूप से एक सीमा के रूप में खोपड़ी का उपयोग मस्तिष्क के भीतर एटलस फिट.
    4. पुनः एटलस चलाने यकीन है कि "आयात 3 डी रॉय" के लिए सभी 14 बाएँ और दाएँ गोलार्द्ध के लिए परिणामों की एक स्प्रेडशीट उत्पन्न करने के लिए जाँच की है ROIs (मज्जा, सेरिबैलम, midbrain, pons, प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस, thalamus, hypothalamus, striatum, pallidum, घ्राण बल्ब, महासंयोजिका और सफेद पदार्थ) ।
  11. (सामग्री की तालिका देखें) स्कैनर ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तिल्ली में अनुरेखक को बढ़ाता है ।
    1. लोड पालतू और सीटी छवि फ़ाइलें डेटाबेस में उंहें हाइलाइटिंग और पर क्लिक करके "सामांय विश्लेषण" ।
    2. पंजीकरण टैब पर क्लिक करें और सह रजिस्टर पालतू और सीटी छवियों "कठोर पंजीकरण" आइकन पर क्लिक ।
    3. रॉय ठहराव टैब पर क्लिक करें, "रॉय बनाएं" आइकन पर क्लिक करें और यह तिल्ली नाम ।
    4. संदर्भ के लिए सीटी फाइल का उपयोग कर तिल्ली ROIs आकर्षित करने के लिए "क्षेत्र" उपकरण का चयन करें, यह सुनिश्चित करने के लिए गुर्दे के साथ कोई ओवरलैप नहीं है (पालतू छवि और गुर्दे से spillover से बचने के लिए संकेत का उपयोग कर).
    5. जानवरों के बीच लगातार ROI मात्रा बनाए रखने के लिए ROIs संपादित करें.
  12. अधिक सामान्यीकरण के लिए एक मानक सुधार मान परिकलित करें.
    1. मानक स्कैन से पीईटी/सीटी डेटा लोड और एक सिलेंडर रॉय को शामिल 20 मिलीलीटर सिरिंज "मैनुअल 3 डी रॉय" उपकरण का उपयोग कर बना ।
    2. मानक के भीतर निहित रेडियोधर्मिता का स्तर स्प्रेडशीट आइकन का उपयोग कर प्राप्त करें.
    3. इस nCi/सीसी परिणाम और मानक के लिए मूल दर्ज रेडियोधर्मिता का उपयोग करें (यानी, nCi/सीसी में मानक की खुराक औजार माप) पालतू के लिए एक सुधार कारक बनाने के लिए मूल्यों । यही कारण है, मानक की रेडियोधर्मिता से गणना की रेडियोधर्मिता द्वारा खुराक औजार द्वारा दर्ज की गई मानक के पीईटी छवि ।
  13. खुराक गतिविधियों और सभी चूहों के लिए पालतू अधिग्रहण के समय के लिए सही क्षय करने के लिए माप के समय का उपयोग करें (यानी पीईटी स्कैन के शुरू में खुराक गतिविधि की गणना).
  14. अवशिष्ट मूल्यों के लिए दोहराएँ और क्षय सही खुराक से घटाना प्रत्येक जानवर प्राप्त सटीक गतिविधि की गणना करने के लिए.
  15. इस क्षय सुधार लागू करने के बाद, यह भी सुनिश्चित करें कि डेटा सही गतिविधि स्तर पर कर रहे हैं करने के लिए मानक सुधार लागू होते हैं । सुनिश्चित करें कि इन सुधारों को मैन्युअल रूप से तैयार roi परिणामों पर लागू किया जाता है, और ब्रेन एटलस रॉय डेटा प्रासंगिक मस्तिष्क क्षेत्रों dMCAO स्थान के लिए (यानी, प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस और striatum).
  16. निंन समीकरण का उपयोग करके सभी ROIs के लिए% id/g परिकलित करें:% id/g = (रॉय रेडियोधर्मिता में nCi/cc/क्षय सही मात्रा में प्राप्त nCi/cc) x १०० । समय के एक समारोह के रूप में भूखंड% आईडी/जी सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक रॉय के लिए समय गतिविधि curves उत्पंन ।
  17. अंतिम छवि विज़ुअलाइज़ेशन और चित्रा पीढ़ी के लिए स्कैनर सॉफ्टवेयर का उपयोग करें । स्कैन के समय में प्रत्येक माउस द्वारा प्राप्त क्षय सही खुराक के अनुसार छवियों को सामान्य, सभी छवियों को सुनिश्चित करने के लिए एक ही% आईडी/जी पैमाने पर कर रहे हैं.
    नोट: यह विभिन्न चूहों से छवियों की सटीक तुलना सक्षम करने के लिए आवश्यक है और/

10. Autoradiography छवि विश्लेषण

  1. ImageJ सॉफ़्टवेयर में डिजिटल छवि (. gel फ़ाइल) खोलें । छवि को नेत्रहीन थ्रेशोल्ड और एक उपयुक्त रंग "लुकअप तालिका" लागू करने के लिए चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें ।
    नोट: रॉयल सबसे सही पालतू में इस्तेमाल किया रंग पैमाने जैसा दिखता है ।
  2. infarct और इसी contralateral क्षेत्रों के आसपास ROIs को मैन्युअल रूप से आकर्षित करने के लिए ROI प्रबंधक का उपयोग करें.
  3. प्रत्येक ROI और निर्यात परिणामों के माध्य पिक्सेल तीव्रता को मापने के लिए माप फ़ंक्शन का उपयोग करें. सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग प्लाट ।

Representative Results

चूहों एमआरआई सफल स्ट्रोक की पुष्टि करने के लिए आया था, और [11सी] DPA-७१३ पालतू एक साथ 4 चूहों स्कैनिंग से बाहर किया गया था. पीईटी, सीटी, और श्री छवियों को मैंयुअल रूप से मस्तिष्क ROIs ड्राइंग और अर्द्ध स्वचालित विभाजन मस्तिष्क एटलस विश्लेषण प्रदर्शन, ipsilateral और contralateral क्षेत्रों (चित्रा 2) में अनुरेखक की जांच करने के लिए पहले सह पंजीकृत थे ।

पीईटी/सीटी छवियों और समय गतिविधि घटता (TACs-रेडियो ट्रेसर गतिविधि समय के एक समारोह के रूप में) प्रदर्शन बढ़ा [11ग] DPA-७१३ ipsilateral बनाम contralateral गोलार्द्धों (चित्रा 3ए) में । गतिशील पीईटी मस्तिष्क छवियों के ठहराव, 50-60 मिनट से अभिव्यक्त आंकड़ों का उपयोग कर, dMCAO में contralateral गोलार्द्ध की तुलना में ipsilateral (infarcted) में अनुरेखक (% आईडी/जी) में एक उल्लेखनीय वृद्धि का पता चला, लेकिन नहीं में अन्तर्वासना चूहों का उपयोग कर मैन्युअल रूप से तैयार रॉय दृष्टिकोण (चित्रा 3बी) । dMCAO और अन्तर्वासना चूहों के बीच ipsilateral गोलार्द्ध में बढी हुई वृद्धि भी देखी गई । ipsilateral और contralateral गोलार्द्धों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर एटलस दृष्टिकोण का उपयोग कर मनाया गया, की संभावना एटलस ROIs के कारण infarct के आकार से भी बड़ा किया जा रहा है (आमतौर पर somatosensory प्रांतस्था के लिए प्रतिबंधित), इसलिए कमजोर संकेत. हालांकि, dMCAO में समग्र वृद्धि हुई है अन्तर्वासना की तुलना में सभी ROIs, जो पिछले MCAO मॉडल चूहों का उपयोग कर रिपोर्ट के साथ संरेखित करता है के लिए मनाया गया था, infarct19के बाहर क्षेत्रों में वृद्धि की TSPO अभिव्यक्ति का प्रदर्शन. Ipsilateral/contralateral अनुपात dMCAO बनाम शम चूहों में वृद्धि की गई दोनों तरीकों का उपयोग; हालांकि, यह अंतर केवल रॉय दृष्टिकोण में बड़ा विचरण के कारण मस्तिष्क एटलस दृष्टिकोण का उपयोग कर प्रांतस्था में महत्वपूर्ण था । इससे हर समूह में चूहों की संख्या बढ़ने से निजात मिल सकती है । की ठहराव [11ग] DPA-७१३ तिल्ली में ले समूह (चित्रा 4) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाई ।

ब्रेन dMCAO माउस पीईटी इमेजिंग परिणाम पूर्व vivo उच्च संकल्प डिजिटल autoradiography (चित्रा 5) द्वारा पुष्टि की गई । वृद्धि हुई [11सी] DPA-७१३ infarcted में स्वस्थ मस्तिष्क ऊतक आसपास के नगण्य संकेत के साथ ऊतक में मनाया गया । इन छवियों के Quantitation से dMCAO चूहों में १.४ से लेकर २.०९ contralateral अनुपात तक ipsilateral का पता चला.

Figure 1
चित्रा 1: पीईटी स्कैनर और कार्यक्षेत्र सेट-अप । सभी कार्यस्थानों एक बाँझ वातावरण बनाने के लिए गद्दी सुरक्षात्मक शोषक में कवर किया गया । (क) अंशांकन के बाद, एक 3 डी-मुद्रित माउस बिस्तर, इमेजिंग 4 चूहों के लिए सुसज्जित एक साथ सभी 4 संज्ञाहरण के लिए संलग्न चूहों के लिए स्कैनर और नाक शंकु में सुरक्षित था । (ख) पीईटी इमेजिंग के लिए आवश्यक उपकरण पहले से तैयार किए गए थे, जिनमें खारा-भरा २७.५ ग्राम कैथेटर, नेत्र स्नेहक, इथेनॉल झाड़ू, हीट लैंप, सर्जिकल टेप, टिशू गोंद, ०.५ मिलीलीटर खुराक सिरिंज, कैंची और एक हल्का सा. (ग) रेडियो ट्रेसर इंजेक्शन के लिए, जगह खारा-फ्लश सिरिंज और कैंची स्कैनर के पीछे पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Ipsilateral/Contralateral रॉय और दाएं/वाम-विभाजन गोलार्द्ध मस्तिष्क एटलस पीईटी छवि विश्लेषण प्रक्रिया । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ipsilateral और ब्याज की contralateral क्षेत्रों में अनुरेखक को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (ROIs) मैन्युअल रूप से तैयार की ROIs और एक अर्द्ध स्वचालित 3d विभाजन मस्तिष्क एटलस दृष्टिकोण का उपयोग. स्वत: 3 डी पीईटी/सीटी छवि में परिभाषित इसी माउस खोपड़ी के भीतर मस्तिष्क एमआरआई के मैनुअल पंजीकरण के बाद बाहर किया गया था । 3 डी रॉय उपकरण के लिए मैंयुअल रूप से ipsilateral आकर्षित (लाल) और contralateral (हरा) ROIs एक संदर्भ के रूप में एमआरआई पर infarct का उपयोग किया गया था । विभाजन मस्तिष्क दृष्टिकोण के लिए, 3 डी वाम/दाएँ-विभाजित माउस मस्तिष्क एटलस लोड और सीटी छवि द्वारा परिभाषित के रूप में खोपड़ी के भीतर फिट किया गया था । मस्तिष्क ROIs इस 3 डी माउस मस्तिष्क एटलस में ठहराव के लिए इस्तेमाल किया वाम प्रांतस्था (डार्क ग्रे), वाम हिप्पोकैम्पस (Cornflower नीला), वाम Striatum (गहरे गुलाबी), सही प्रांतस्था (टमाटर लाल), सही हिप्पोकैम्पस (हरा) शामिल है, और सही Striatium (सियान) । [11C] DPA-७१३ प्रत्येक क्षेत्र में nCi/cc में प्राप्त किया गया था और बाद में प्रत्येक माउस के लिए स्कैनिंग के समय क्षय-सही खुराक को सामान्य करके% ID/g में परिवर्तित कर दिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : Vivo [11C] DPA-७१३ में प्रतिनिधि DMCAO और अन्तर्वासना चूहों में दिमागी तीनो । (क) गतिशील पालतू/सीटी छवियां और TACs का प्रदर्शन बढ़ा [11सी] DPA-७१३ ipsilateral प्रांतस्था चूहों कि DMCAO (n = 3) और (एन = 3) के लिए एक मामूली वृद्धि में गुजरना चूहों का संचालन किया, DMCAO चूहों के साथ काफी अधिक प्रदर्शन प्रतिशत में इसके विपरीत मस्तिष्क के infarct और contralateral पक्ष के बीच खुराक इंजेक्शन (% ID/ (ख) पीईटी ठहराव (50-60 मिनट अभिव्यक्त) ipsilateral रॉय में काफी वृद्धि हुई roi दृष्टिकोण का उपयोग और प्रांतस्था (Ctx) में विभाजन ब्रेन एटलस दृष्टिकोण का उपयोग करके पता चला । हिप्पोकैम्पस (कोर्ट) या striatum (एसटीआर) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया । contralateral अनुपात में वृद्धि हुई ipsilateral दोनों विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए देखा गया था, लेकिन मस्तिष्क एटलस दृष्टिकोण का उपयोग कर Ctx में केवल सांख्यिकीय महत्वपूर्ण था. * (p < 0.05), * * * (p < 0.001) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: Vivo में प्रतिनिधि [11C] DPA-७१३ प्लीहा dMCAO और शम चूहों में । (A) [11C] DPA-७१३ गतिशील पीईटी/dMCAO (n = 3) और शम (n = 3) चूहों में तिल्ली ROIs दिखा रहा है । (ख) मात्रात्मक परिणाम dMCAO और अन्तर्वासना चूहों के बीच प्लीहा में कोई महत्वपूर्ण परिणाम नहीं दिखा सके. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : प्रतिनिधि Autoradiography परिणाम. डिजिटल autoradiography छवियों का प्रदर्शन बढ़ [11ग] DPA-७१३ contralateral गोलार्द्ध की तुलना में ipsilateral में वृद्धि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल dMCAO और शम चूहों में neuroinflammation के ठहराव के लिए एक विधि का वर्णन [11ग] DPA-७१३-पीईटी । TSPO-पीईटी तारीख करने के लिए vivo में neuroinflammation visualizing और मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से जांच की इमेजिंग के लिए चिह्नित है । TSPO अभिव्यक्ति मस्तिष्क में glia पर सूजन के दौरान अनियमित है गैर इनवेसिव पता लगाने और neuroinflammation के ठहराव की अनुमति । इसके अलावा, यह एक उच्च अनुवाद तकनीक है, यह दोनों नैदानिक और पूर्व नैदानिक अनुसंधान में एक मूल्यवान उपकरण बना रही है । इस प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम का उपयोग कर की उपयुक्तता पर प्रकाश डाला [11ग] DPA-७१३ पीईटी का पता लगाने और neuroinflammatory परिवर्तन की निगरानी में स्ट्रोक और अन्य स्नायविक विकारों में vivo.

इस अध्ययन में, dMCAO सर्जरी 3 महीने की पुरानी C57BL/6 मादा चूहों का उपयोग कर बाहर किया गया था । इस मॉडल के रूप में यह एक उच्च reproducible infarct somatosensory प्रांतस्था को प्रतिबंधित करने के लिए वृद्धि देता है चुना गया था, स्ट्रोक के अंय मॉडलों की तुलना में कम परिवर्तनशीलता के साथ स्थाई फोकल ischemia के एक मॉडल प्रदान (जैसे, मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) रेशा कृती)१४. स्ट्रोक मॉडल के पीईटी इमेजिंग contralateral गोलार्द्ध के भीतर ROIs का उपयोग कर प्रत्येक जानवर के लिए मस्तिष्क में एक आंतरिक संदर्भ क्षेत्र युक्त का लाभ है । के बाद से वहां कुछ सूजन है कि अकेले सर्जरी से परिणाम होगा, यह चूहों कि अध्ययन डिजाइन, जिससे craniotomy और धमनी रोड़ा बिना मेनिन्जेस के हेरफेर किया गया था में शर्म की बात सर्जरी से गुजरना शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है । अकेले Craniotomy अंतर्निहित न्यूरॉन ऊतक और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए अग्रणी रोगज़नक़ों की शुरूआत करने के लिए विघटन में परिणाम कर सकते हैं20स्ट्रोक के स्वतंत्र. कुछ सूजन के बाद अन्तर्वासना सर्जरी की उम्मीद की जाती है और dMCAO के समानांतर में आकलन किया जाना चाहिए कि अकेले शल्य चिकित्सा के कारण सिग्नल की संभावना को बाहर रखा जाए. dMCAO पलटन विश्लेषण में स्ट्रोक के बिना शल्य चिकित्सा से उत्पंन सूजन सहित से बचने के लिए, श्री इमेजिंग सफल स्ट्रोक सर्जरी और infarct विकास की पुष्टि करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए । एमआरआई भी एक संरचनात्मक संदर्भ फ्रेम है, जो सही infarct और contralateral ROIs आकर्षित करने के लिए आवश्यक है प्रदान करता है । इसके अलावा, छवि पंजीकरण और रॉय परिभाषा सहित सटीक छवि प्रसंस्करण के लिए विश्वसनीय ठहराव सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं ।

पीईटी और autoradiography अध्ययन के लिए सी-11 लेबल्ड radiotracers के साथ कार्य करते समय अतिरिक्त सीमाएं ध्यान में रखनी चाहिए । यह आवश्यक है के लिए लघु आधा जीवन पर विचार (सी के २०.३३ मिनट)-11, इसके उपयोग के साथ आम तौर पर साइट साइक्लोट्रॉन पहुंच के साथ अनुसंधान संस्थानों तक ही सीमित है । उपयुक्त रेडियोधर्मिता परिवहन मार्ग, खुराक प्रशासन, और अधिग्रहण समय अंक अग्रिम में प्रयोग के कार्यप्रवाह की एक पूर्व तैयार विस्तृत योजना के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए ताकि टीम जल्दी और कुशलता से काम कर सकते हैं. डिजाइन और इस अध्ययन के सेट अप के लिए 4 चूहों के इमेजिंग समायोजित करने के लिए एक साथ डेटा उत्पादन जब एक सी-11 अनुरेखक का उपयोग प्राप्य बढ़ाने के लिए रेखांकित किया गया है. यदि संभव हो तो, यह सभी चूहों cannulated है और उनके सीटी स्कैन के बीच में समय सी-11 अनुरेखक इमेजिंग सुविधा में आने के लिए इंजेक्शन से पहले न्यूनतम रेडियो ट्रेसर क्षय सुनिश्चित करने के लिए सलाह दी जाती है. यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल भी सबसे अच्छा एक टीम से बाहर किया जाता है कम से अधिक 3 शोधकर्ताओं से युक्त करने के लिए त्वरित cannulation, खुराक माप, अनुरेखक इंजेक्शन, पीईटी स्कैनिंग और मस्तिष्क महत्वपूर्ण रेडियोधर्मी क्षय से पहले अनुभाग के लिए अनुमति देते हैं. इसके लिए दो लोगों को एक साथ सभी 4 चूहों के पीईटी स्कैन और इंजेक्शन की दीक्षा आयोजित करने की आवश्यकता है । पालतू अधिग्रहण बस इंजेक्शन से पहले शुरुआत के लिए कारण फार्माकोकाइनेटिक्स और रक्त और ब्याज के क्षेत्रों में अनुरेखक वितरण की गतिशीलता को सुनिश्चित करने के लिए सही है और पूरी तरह से कब्जा कर लिया है । कई कदम जोरदार प्रशिक्षण और अभ्यास की आवश्यकता के लिए प्रयोग की चिकनी चल सुनिश्चित कर सकते हैं । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल C57BL के सफल पूंछ नस cannulation पर निर्भर है/6 चूहों, जो उनकी पूंछ पर मौजूद काले बालों के कारण मुश्किल हो सकता है, और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है के बाद स्ट्रोक हुआ है या यदि इमेजिंग एकाधिक समय में एक ही चूहों-अंक .

पीईटी इमेजिंग के लिए एक और विचार माप का सही समय सहित रेडियो ट्रेसर खुराक और अवशिष्ट गतिविधि माप की सावधान रिकॉर्डिंग भी शामिल है । इस स्कैन के समय में इंजेक्शन खुराक के सटीक क्षय सुधार के लिए आवश्यक है और प्रत्येक रॉय के लिए अनुरेखक के एक सटीक माप (यानी, % ID/जी) के लिए प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है । यह सटीक छवि विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए स्कैनिंग के समय प्रत्येक माउस में मौजूद था कि रेडियोधर्मिता की सही मात्रा पता करने के लिए आवश्यक है. इसलिए, यह स्कैनर कंप्यूटर और खुराक औजार पर घड़ियों सिंक्रनाइज़ करने के लिए जब सी-11 जैसे अल्पकालिक आइसोटोप का उपयोग करते समय त्रुटि से बचने के लिए सलाह दी जाती है ।

सटीक पीईटी छवि ठहराव भी स्कैनर और सेट अप की सटीकता से सीमित किया जा सकता है । इसलिए पालतू/सीटी छवियों के सटीक ठहराव सुनिश्चित करने के लिए, यह स्कैनर के सीटी और पीईटी घटकों दोनों के लिए गुणवत्ता नियंत्रण की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । सीटी गुणवत्ता नियंत्रण जांच एक्स-रे स्रोत कंडीशनिंग, डार्क/प्रकाश, और सेट अंशांकन बंद केंद्र शामिल हैं । इन अंशांकन उपाय और सिस्टम शोर के लिए सही है और स्कैनर निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में अधिग्रहण करने से पहले किया जाना चाहिए । अंशांकन भी पालतू स्कैनर के लिए किया जाना चाहिए । यह आमतौर पर एक "मानक/पालतू प्रेत स्कैनिंग शामिल है" स्कैन, रेडियोधर्मिता की एक ज्ञात एकाग्रता युक्त. जब मानक की तैयारी, यह एक ही रेडियो आइसोटोप अध्ययन में इस्तेमाल किया, एक माउस के शरीर के समान मात्रा में एक ही माउस के लिए प्रशासित करने के लिए एक तुलनीय खुराक, और पशु इमेजिंग के रूप में एक ही अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है । एक 20 मिलीलीटर पानी में पतला रेडियो ट्रेसर से भरा सिरिंज इस प्रोटोकॉल में मानक के लिए प्रयोग किया जाता है, बाद में पीईटी इमेजिंग के लिए एक सुधार कारक वास्तविक खुराक के आधार पर अंशांकन डिटेक्टर द्वारा मापा गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है । सुधार अनुपात प्रयोग में अधिग्रहीत इमेजिंग डेटा के लिए लागू किया जा सकता है के लिए सही ठहराव के लिए सुनिश्चित करने के लिए, पीईटी छवियों में ब्याज के क्षेत्रों में अनुरेखक । स्कैनिंग के दिन पर मौजूद किसी भी पृष्ठभूमि गतिविधि पर विचार करने के अलावा रेडियोन्यूक्लाइड के पोजीट्रान रेंज के लिए यह खाते । के रूप में खुराक औजार इस सुधार कारक की पीढ़ी का एक अभिंन हिस्सा है, यह आवश्यक है कि यह उपकरण भी नियमित रूप से निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार तुले है ।

जब आयोजित पूर्व vivo autoradiography यह इंजेक्शन के बाद इच्छामृत्यु के लिए एक इष्टतम समय-बिंदु लेने के लिए महत्वपूर्ण है, ब्याज के क्षेत्र (ओं) में उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए । तीस मिनट के बाद इंजेक्शन के लिए चुना गया था [11c] DPA-७१३ autoradiography गतिशील पीईटी इमेजिंग के दौरान अधिग्रहीत डेटा का उपयोग कर-यानी, एक गाइड के रूप में vivo गतिशील TACs में, जबकि भी सी के छोटे आधे जीवन पर विचार-11 और समय अनुभाग में शामिल है और निष्कर्षण के बाद मस्तिष्क ऊतक बेनकाब । इस पर विचार, [11ग] DPA-७१३ autoradiography चूहों के एक अलग पलटन पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए एक उच्च [11सी] DPA-७१३ खुराक और संज्ञाहरण के तहत छिड़काव और इच्छामृत्यु के लिए एक 30 मिनट के समय बिंदु के इंजेक्शन के लिए अनुमति देते हैं । एक 3-4 चूहों के साथ vivo पालतू पायलट अध्ययन में एक छोटा प्रदर्शन पूर्व vivo autoradiography आयोजित करने से पहले autoradiography के लिए इष्टतम समय बिंदु निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो जाएगा. पूर्व vivo autoradiography के लिए एक अतिरिक्त विचार है कि इंजेक्शन के बाद चूहों को ठीक करने के लिए या उन्हें इच्छामृत्यु तक anesthetized रखने के लिए है । उंहें रखते हुए anesthetized स्कैन की शर्तों नकल करता है और रेडियो ट्रेसर वितरण या उत्सर्जन कैनेटीक्स सुनिश्चित वसूली द्वारा नहीं बदल रहे हैं । इसके अलावा, यह वसूली और बाद में प्रेरण से बचने के द्वारा चूहों पर अतिरिक्त तनाव को रोकता है । अंत में, पूर्व vivo प्रोटोकॉल के लिए एक उपयोगी इसके अलावा करने के लिए मस्तिष्क immunohistochemical धुंधला (रेडियोधर्मी क्षय के बाद) के माध्यम autoradiography के लिए इस्तेमाल किया स्लाइस में क्षेत्रीय क्षति का आकलन करने के लिए infarct स्थान की एक उच्च संकल्प छवि उत्पंन होगा और वॉल्यूम.

के रूप में वहां एक सी के उपयोग के साथ सीमाएं है 11 आधारित अनुरेखक, इस प्रोटोकॉल को आसानी से एक एफ के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है 18 (१०९.७७ मिनट के आधे जीवन) TSPO अनुरेखक आधारित है, जो और अधिक स्थानों पर लागू हो सकता है एक पर साइट साइक्लोट्रॉन के बिना. साथ ही, यह प्रोटोकॉल 4-माउस इमेजिंग सेट-अप के उपयोग का वर्णन करता है । इस उच्च प्रवाह विधि एक C-11 अनुरेखक का उपयोग करते समय इष्टतम है, यद्यपि यह प्रोटोकॉल भी एकल माउस इमेजिंग बिस्तरों का उपयोग करने वालों के लिए संशोधित किया जा सकता है । सावधान योजना और इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीकों में लगातार प्रशिक्षण [11ग] DPA-७१३, जो आसानी से रोग अभिव्यक्ति में neuroinflammation की भूमिका जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है का उपयोग कर डेटा का खजाना की पीढ़ी को बढ़ावा मिलेगा और स्नायविक विकारों के अन्य कुतर मॉडलों में प्रगति । इसके अलावा, इस तकनीक का आकलन करने के लिए vivo में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी चिकित्सीय microglia/मैक्रोफेज पर लक्षित चिकित्सकीय प्रतिक्रिया का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

लेखकों को माउस मॉडल प्रदान करने और dMCAO और अन्तर्वासना सर्जरी का प्रदर्शन करने के लिए Buckwalter लैब (विशेष रूप से डॉ. टोड पीटरसन) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इसके अतिरिक्त, हम VivoQuant छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ अपनी तकनीकी सहायता के लिए Invicro से थॉमस Liguori शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, डॉ टिम डॉयल, डॉ लौरा Pisani, डॉ Frezghi Habte उनकी सलाह के लिए स्टैनफोर्ड में SCi3 छोटे जानवर इमेजिंग सुविधा से और इस इमेजिंग प्रोटोकॉल के विकास में सहायता, और Radiochemistry सुविधा (विशेष रूप से डॉ. Jun पार्क) के संश्लेषण के साथ उनकी मदद के लिए [11C] DPA-७१३ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inveon PET/CT scanner Siemens Version 4.2
MRI scanner Varian 7 Telsa
ParaVision software Bruker Version 6.0.1 MRI operating software
VivoQuant software InVicro Version 2.5 Image analysis software
Inveon Research Workspace software Siemens Version 4.2 Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator Capintech CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
Butterfly catheters SAI Infusion Technologies BFL-24 27.5 G needle
1 mL syringes BD
Insulin syringes BD 329461 0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe  VWR BD302831 BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue Santa Cruz Animal Health sc-361931 3 mL
Heat lamp Fluker 27002 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline Pfizer 00409-4888-10 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant Watson Rugby PV926977 Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets ThermoFisher Scientific 1420662 Disposable absorbent padding
Iris scissors World Precision Instruments 503708-12 11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape 3M Durapore 1538-0 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed In house 4 mouse PET bed
Lighter Bic UDP2WMDC
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2 Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen Praxiar UN1072 Compressed gas
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades ThermoFisher Scientific 30-508-35 MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome Microm HM 550
Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid VWR 25608-930 Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds Poly sciences 18646A-1 Disposable paraffin molds
Saran wrap Saran 25700001300
Disinfectant Virkon S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: A report from the american heart association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
  2. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87 (5), 779-789 (2010).
  3. Wang, Q., Tang, X. N., Yenari, M. A. The inflammatory response in stroke. J Neuroimmunol. 184 (1-2), 53-68 (2007).
  4. Brown, R. C., Papadopoulos, V. Role of the peripheral-type benzodiazepine receptor in adrenal and brain steroidogenesis. Int Rev Neurobiol. 46, 117-143 (2001).
  5. Papadopoulos, V., Lecanu, L., Brown, R. C., Han, Z., Yao, Z. X. Peripheral-type benzodiazepine receptor in neurosteroid biosynthesis, neuropathology and neurological disorders. Neuroscience. 138 (3), 749-756 (2006).
  6. Scarf, A. M., Kassiou, M. The translocator protein. J Nucl Med. 52 (5), 677-680 (2011).
  7. Cerami, C., Perani, D. Imaging neuroinflammation in ischemic stroke and in the atherosclerotic vascular disease. Curr Vasc Pharmacol. 13 (2), 218-222 (2015).
  8. Stefaniak, J., O'Brien, J. Imaging of neuroinflammation in dementia: a review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 87 (1), 21-28 (2016).
  9. Gerhard, A. TSPO imaging in parkinsonian disorders. Clin Transl Imaging. 4, 183-190 (2016).
  10. Airas, L., Rissanen, E., Rinne, J. O. Imaging neuroinflammation in multiple sclerosis using TSPO-PET. Clin Transl Imaging. 3, 461-473 (2015).
  11. Fan, J., Lindemann, P., Feuilloley, M. G., Papadopoulos, V. Structural and functional evolution of the translocator protein (18 kDa). Curr Mol Med. 12 (4), 369-386 (2012).
  12. James, M. L., et al. Synthesis and in vivo evaluation of a novel peripheral benzodiazepine receptor PET radioligand. Bioorg Med Chem. 13 (22), 6188-6194 (2005).
  13. Boutin, H., et al. 11C-DPA-713: A novel peripheral benzodiazepine receptor PET ligand for in vivo imaging of neuroinflammation. J Nucl Med. 48 (4), 573-581 (2007).
  14. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: distal middle cerebral artery occlusion. Methods Mol Biol. 1135, 103-110 (2014).
  15. Wang, Y., et al. [(18)F]DPA-714 PET imaging of AMD3100 treatment in a mouse model of stroke. Mol Pharm. 11 (18), 3463-3470 (2014).
  16. Domercq, M., et al. PET Imaging with [(18)F]FSPG evidences the role of system xc(-) on brain inflammation following cerebral ischemia in rats. Theranostics. 6 (11), 1753-1767 (2016).
  17. Toth, M., et al. Acute neuroinflammation in a clinically relevant focal cortical ischemic stroke model in rat: longitudinal positron emission tomography and immunofluorescent tracking. Brain Struct Funct. 221 (3), 1279-1290 (2016).
  18. Walter, H. L., et al. In vivo analysis of neuroinflammation in the late chronic phase after experimental stroke. Neuroscience. 292, 71-80 (2015).
  19. Rojas, S., et al. Imaging brain inflammation with [(11)C]PK11195 by PET and induction of the peripheral-type benzodiazepine receptor after transient focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (12), 1975-1986 (2007).
  20. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (4), 545-553 (1994).

Tags

मेडिसिन इश्यू १३६ Neuroinflammation translocator प्रोटीन 18 केडीए (TSPO) पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) neuroimaging स्ट्रोक चूहे ।
Neuroinflammation के पीईटी इमेजिंग का उपयोग कर [<sup>11</sup>ग] DPA-७१३ कोरोनरी स्ट्रोक के एक माउस मॉडल में
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaney, A. M., Johnson, E. M.,… More

Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (136), e57243, doi:10.3791/57243 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter