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Medicine

Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas

Published: March 22, 2018 doi: 10.3791/57255

Summary

Este protocolo descreve uma técnica de osteossíntese minimamente invasiva usando um parafuso de haste intramedular padronizada estabilização de fraturas de fêmur, o que pode ser usado para analisar endocondral consolidação óssea em ratos.

Abstract

Modelos de cura óssea são necessários para analisar os mecanismos complexos de fratura cura para melhorar o tratamento clínico da fratura. Durante a última década, um aumento da utilização de modelos de rato em pesquisa ortopédica observou-se, muito provavelmente porque os modelos do rato oferecem um grande número de variedades geneticamente modificadas e anticorpos especiais para a análise dos mecanismos moleculares de consolidação da fratura. Para controlar as condições biomecânicas, técnicas de osteossíntese bem caracterizadas são obrigatórias, também em ratos. Aqui, nós relatamos no design e na utilização de uma modelo de consolidação fechada para estabilizar fraturas de fêmur em ratos. O parafuso da haste intramedular, feito de aço inoxidável de grau médico, fornece através da compressão da fratura uma estabilidade axial e rotacional, em comparação com os pinos intramedular simples mais utilizado, que mostram uma completa falta de estabilidade axial e rotacional. A estabilidade alcançada pelo parafuso intramedular permite a análise de endocondral cura. Uma grande quantidade de tecido de calo, recebido após a estabilização com o parafuso, oferece as condições ideais para a colheita de tecidos para análises bioquímicas e moleculares. Uma vantagem adicional do uso do parafuso é o fato de que o parafuso pode ser inserido em fêmur com uma técnica minimamente invasiva sem induzir danos no tecido macio. Em conclusão, o parafuso é um implante exclusivo que pode ser usado idealmente na fratura fechada modelos oferecendo condições biomecânicas padronizadas de cura.

Introduction

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Estudos de cura óssea em ratos estão em grande demanda por causa de um amplo espectro de anticorpos e animais geneticamente modificados. Estes factos permitem estudar os mecanismos moleculares do osso cura1. Nos últimos anos, osso de diferente modelos de cura para os ratos foram desenvolvidos2. Estes modelos podem ser divididos em modelos abertos, em que o osso é osteotomizado usando uma abordagem cirúrgica lateral aberta e em modelos fechados, baseados no modelo apresentado por Bonnares e Einhorn3fratura em que o osso está fraturado. Usando esta técnica, uma fractura transversal padronizada pode ser produzida por um dispositivo de dobrando de 3 pontos e implantes intramedulares podem ser inseridos através de uma incisão parapatelar medial pequeno em uma técnica minimamente invasiva, evitando um trauma de tecido mole principais.

O parafuso de haste intramedular pode ser aplicado para a estabilização da fratura fechada em camundongos. O parafuso oferece estabilidade rotacional e axial. Isto é conseguido por compressão de fratura através de um segmento proximal e uma distal cabeça4. Outras vantagens do parafuso são a técnica cirúrgica simples, o baixo grau de invasivity, o baixo peso e, principalmente, uma maior estabilidade, proporcionando condições biomecânicas padronizadas e controladas, em comparação com outro intramedular do implante implantes de5. Na verdade, nos modelos mais fechados da fratura, os fragmentos são estabilizados somente por pinos simples, que está associado uma completa falta de estabilidade rotacional e axial e um risco elevado de pin em também fratura luxação. Isto marcadamente pode influenciar o processo de cicatrização, que pode resultar em cicatrização ou formação não-sindicalizados.

É sabido que a estabilidade da fixação da fratura tem um impacto tremendo no processo cura6,7. Uma fixação rígida alta resulta em cura intramembranosa, enquanto uma fixação menos rígida, que pode permitir micromovimentos a lacuna de fratura, resultados na cura de endocondral. Estabilização da fratura com o parafuso de haste intramedular mostra predominantemente um endocondral cura com uma grande quantidade de calo de tecido, particularmente após duas semanas de consolidação da fratura. A possibilidade de colher uma grande quantidade de calo de tecido permite a análise de vários parâmetros por diferentes técnicas.

Aqui, nós relatamos sobre a concepção e a aplicação do parafuso intramedular em ratos, bem como sobre suas vantagens e desvantagens em estudos experimentais sobre a cura de osso endocondral normal.

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Protocol

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Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health para o uso de animais experimentais e seguiram as orientações institucionais (turismo für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken Alemanha).

1. preparação de instrumentos cirúrgicos e implantes

  1. Selecione uma lâmina de bisturi (tamanho 15), um pequeno cotonete, pinça fina, agulha 27G, uma sutura não absorvível de 5-0, tesoura e um porta-agulha da caixa instrumento microcirúrgico.
  2. Descompacte o parafuso da haste intramedular, o fio-guia (0,2/0,3 mm de diâmetro, 10 cm de comprimento), o bocado de broca de centragem (0,5 mm de diâmetro) e a broca de mão (Figura 1; consulte Tabela de materiais).
    Nota: O parafuso de haste intramedular (0,5 mm de diâmetro, comprimento de 17,2 milímetros) é feito de aço inoxidável de grau médico para implantação retrógrada em fêmur. O parafuso tem um segmento proximal (0,5 mm de diâmetro, comprimento de 4 mm) com um nariz (0,2 mm de diâmetro, 0,4 mm de comprimento) na ponta e distal em forma de cone de cabeça (0,8 mm de diâmetro, comprimento de 0,9 mm) para alcançar a fratura de compressão, bem como a estabilidade axial e rotacional.
  3. Expor os implantes e todos os instrumentos cirúrgicos para uma solução desinfectante (96% de álcool) por 5 min ou esterilizá-los (esterilização a vapor, 130 ° C, 25 min). Após a desinfecção ou esterilização, coloque os instrumentos sobre um pano de operação. O pano de operação diretamente adjacente à tabela pequena operação animais de posição.

2. animais, anestesia e Analgesia

  1. Escolha a tensão, idade e sexo dos ratos de acordo com a questão de estudo, que é dirigida.
    Nota: Para este estudo foram utilizados camundongos CD-1 sexo masculino de 12 a 14 semanas de idade. O peso de corpo adequado para usar o parafuso intramedular é entre 25-35 g.
  2. Anestesia os ratos com uma injeção intraperitoneal de 15 mg/kg de xilazina e 75 mg/kg de ketamina. Confirme o anesthetization pitada de dedo do pé. Aplique o lubrificante do olho para proteger os olhos dos animais de secagem durante a anestesia. Após a indução da anestesia, posicione o mouse sob um radiador de calor para manter a temperatura corporal constante. Durante o procedimento, os animais foram monitorados com pitada de repetidas do dedo do pé para garantir um plano adequado de anestesia.
  3. Aplica o cloridrato de tramadol em água potável (1,0 mg/mL) para analgesia dia 1, antes da cirurgia, até dia 3, após a cirurgia.
    Nota: Prevenção de infecção e Analgesia deve ser de acordo com as respectivas orientações do país e a instituição onde os experimentos devem ser executadas.

3. ato cirúrgico e implantação do parafuso de haste intramedular

  1. Antes da cirurgia, raspar toda a perna direita traseira e aplique um creme depilatório. Após 5 min, retire o creme e limpe a perna com água. Em seguida, aplica uma solução desinfectante com 96% de álcool. Betadine ou clorexidina pode ser adicionada para o álcool para garantir total assepsia.
  2. Sob condições assépticas, posicione o mouse na posição supina na mesa de operação de animais pequenos. Dobre o joelho direito para permitir uma abordagem anterior para os côndilos do joelho. Realize uma incisão parapatelar medial 5 mm no joelho direito usando a lâmina de bisturi.
  3. Mobilize o ligamento patelar cuidadosamente com a lâmina de bisturi e a amostra. Em seguida, deslocar a patela lateralmente com a pinça fina para expor o entalhe intercondilar do fêmur.
  4. Abra o entalhe intercondilar exatamente no meio do fêmur entre ambos os côndilos. Certifique-se de não deve exceder 1,0 mm de profundidade para o furo.
    1. Inicie-manual de perfuração em uma velocidade lenta e um deslocamento de 45 ° ventralmente ao eixo do fêmur com a 0,5 mm, centrando a broca e a broca de mão (Figura 1 e D, Figura 2). Durante a perfuração, continuamente diminua o ângulo de deslocamento de 0 ° (em paralelo com o eixo do osso do fêmur). Pare quando é alcançada uma profundidade de 1,0 mm de perfuração.
  5. Depois de abrir o osso que o entalhe intercondilar, introduza a agulha 27G na cavidade intramedular a todo o comprimento do fêmur. Resma de cavidade intramedular do fêmur manualmente através de movimentos giratórios da agulha 27G. Empurre a agulha para a frente para perfurar o osso cortical no grande trocanter proximalmente.
  6. Retire a agulha 27G e aplicar o fio-guia através da parte distal do fêmur.
    1. Fazer uma incisão na pele com uma lâmina de bisturi (tamanho 15) proximalmente sobre o fio guia e avance o fio-guia até que ambas as extremidades do fio-guia estão fora. Certifique-se de manter o fio-guia no lugar.
  7. Crie uma fratura fechada definida usando a guilhotina.
    1. Coloque o mouse em posição lateral com a perna direita na guilhotina. Certifique-se de que a parte de diáfise do fêmur é colocada no meio da guilhotina.
    2. Larga o peso (200 g) da distância definida de 25,5 cm.
  8. Controlar a configuração de fratura e fratura posição, bem como a posição do fio-guia (Figura 3), usando o aparelho de raio x (ver Tabela de materiais).
  9. Conecte o parafuso de haste intramedular com o nariz na extremidade distal para o fio-guia de 0.2 mm e inseri-lo no fêmur sob pressão contínua e a rotação no sentido horário.
    1. Cisalhamento do eixo rígido quando é alcançado o torque suficiente.
    2. Retire o fio-guia proximalmente.
  10. Reposicionar a patela e corrigir o tendão da patela aos músculos com uma sutura simples usando um sintético 5-0, monofilamento, sutura não absorvível de polipropileno. Use o única suturas do mesmo material e tamanho para fechar o ferimento. A redução dos fragmentos e a posição do parafuso radiologicamente usando o aparelho de raio-x de controle (veja a Tabela de materiais).
  11. Manter os animais sob o radiador de calor, até se recuperarem da anestesia. Não deixe os animais sem vigilância até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração ventral. Devolver os animais para gaiolas simples na instalação de animais. Não devolva os animais para a companhia de outros animais durante as primeiras 24 horas, mesmo que eles se recuperaram totalmente da anestesia.
  12. Monitore os animais com cuidado todos os dias. Manter a analgesia pós-operatória usando cloridrato de tramadol em água potável com uma dose de 1,0 mg/mL durante os três primeiros dias. Continue a analgesia se, no dia 4, após a cirurgia, os animais ainda mostram evidências de dor, conforme indicado pela vocalização, inquietude, falta de mobilidade, falha ao noivo, postura anormal e falta de interesse normal no ambiente. Finalizar a analgesia, quando os animais estão sem dor.
  13. No final do experimento abater o animal por uma overdose de barbitúricos.

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Representative Results

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O tempo de funcionamento da incisão de pele para fechamento de ferida foi de 20 min. A cirurgia pode ser realizada sem um estereoscópio. No pós-operatório, os animais foram monitorados diariamente. Analgesia pós-operatória foi finalizado depois de 2 dias, porque nenhum dos animais apresentou evidência de dor após este período de tempo. Os animais também mostraram peso-rolamento normal dentro de 2 dias após a cirurgia. Infecção da ferida não foram observadas durante o período de observação inteira.

Análise radiológica após duas semanas mostraram uma evidente formação de tecido de calo aos desníveis de fratura (Figura 4A). Após 5 semanas, a fratura foi curada, e o calo periosteal foi quase completamente remodelado (Figura 4B).

Análise histológica do calo ósseo e a zona de fratura após 2 semanas mostrou distribuição de tecido típico de endocondral cura com construído durante o processo de chondrogenic de tecido cartilaginoso e tecido ósseo (Figura 5A). Após 5 semanas, o tecido cartilaginoso desapareceu, e o tecido ósseo foi convertido para o osso lamelar, a fim de reconstituir o normal anatômico e propriedades de carga do osso (Figura 5B).

Análises biomecânicas após 2 semanas indicado uma rigidez de dobra de 37% em comparação com o osso contralateral. Após 5 semanas, a rigidez a flexão foi quase 100% indicando a completa cicatrização (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: implantes. R. O intramedular parafuso (0,5 mm de diâmetro, comprimento de 17,2 milímetros) com o thread (0,5 mm de diâmetro, comprimento de 4 mm) e o nariz (diâmetro de 0,2 mm, 0.4 mm comprimento) proximal e uma em forma de cone de cabeça (0,8 mm de diâmetro, comprimento de 0,9 mm) distal. B. O fio-guia (0,2/0,3 mm de diâmetro, 10 cm de comprimento). C. A centralização de broca (0,5 mm de diâmetro). M. A broca da mão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: desenho esquemático dos côndilos do fêmur indicando a entrada aponte para o parafuso intramedular. Ver os de côndilos do fêmur com o entalhe intercondilar em ântero-posterior (à esquerda) e visão sagital (à direita). A Cruz (à esquerda) indica o ponto de entrada para o parafuso de haste intramedular, a seta (à direita) indica o deslocamento de 45 ° ao eixo do fêmur para começar a perfurar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: radiografia do fêmur com fratura transversal e o fio-guia inserido. Radiografia mostra a configuração de fratura transversal na parte diafisária do fêmur (seta) e o fio guia dentro da cavidade intramedular da fratura-ponte. Barras de escala representam 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: radiografias após 2 e 5 semanas de consolidação óssea. R. análise radiográfica de um fêmur estabilizado com o parafuso depois de 2 semanas, demonstrando a formação de calo óbvio. B. análise radiográfica de um fêmur estabilizado com o parafuso depois de 5 semanas, demonstrando a cura quase completa da fratura com a remodelação do calo. Barras de escala representam 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: cortes histológicos após 2 e 5 semanas de consolidação óssea. R. análise histológica de um fêmur estabilizado com o parafuso depois de 2 semanas, demonstrando a distribuição de tecido típico durante osso endocondral cura com cartilagem (c) e (b) tecido ósseo dentro o calo. B. análise histológica de um fêmur estabilizado com o parafuso depois de 5 semanas, demonstrando a quase completa remodelação de osso lamelar. Os cortes histológicos foram corados pelo método tricromo. Barras de escala representam 1000 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: análise biomecânica. Análise biomecânica da flexão rigidez após 2 semanas (barra branca, n = 9) e 5 semanas (barra preta, n = 8). Rigidez de dobra é dado em percentagem para o fêmur fraturado não contralateral. Dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM), * p < 0.05 vs 2 semanas. Depois de provar o pressuposto para a distribuição normal (Kolmogorov-Smirnov-test) e igual variância (teste F), a comparação entre os dois grupos experimentais foi realizada usando o teste-t de Student´s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Passos críticos do procedimento cirúrgico são para encontrar o ponto de entrada correta para implantação do parafuso no meio os côndilos do fêmur no entalhe intercondilar, bem como a orientação ideal da agulha paralela ao eixo do osso para fresagem do cavidade intramedular. Para evitar uma posição de entrada incorreta, o cirurgião deve preparar o entalhe até que seja alcançada uma visão ideal. Para controlar a orientação durante a fresagem, o fêmur dos ratos deve ser realizado com os dedos em uma posição estável. Um passo crítico é a inserção do parafuso no fêmur sobre o fio-guia, porque o fio-guia pode deslizar fora o fragmento ósseo proximal, resultando em uma fratura luxação. Neste caso, o cirurgião pode tentar os fragmentos de osso da linha outra vez, mas esta manobra é, principalmente, sem sucesso, e os animais então tem que ser excluídos do estudo.

Além disso, o procedimento cirúrgico pode desenvolver algumas complicações. Por exemplo, o ligamento patelar, que é deslocado lateralmente para obter uma visualização ideal para os côndilos, pode romper-se. Isto requer sutura do ligamento após a inserção do parafuso. Durante a abertura do osso que os côndilos e alargamento da cavidade intramedular, os côndilos podem estourar. Neste caso, não há nenhuma possibilidade de solução de problemas, porque o parafuso não pode adequadamente fixado na extremidade distal e a compressão da fratura não é alcançada. Outra complicação é a luxação do fio-guia inserido ou uma posição incorreta fora do osso. Esta complicação pode ser reduzida pelo tratamento com cautela e análise radiográfica após a inserção para confirmar o posicionamento correto durante a cirurgia. Além disso, o cirurgião deve prestar atenção ao que o parafuso está completamente inserido porque uma protrusão do parafuso pode restringir a mobilidade do mouse ou reduzir a compressão de fratura. Portanto, um aparelho de raio-x é obrigatório para o procedimento cirúrgico. Únicos animais após confirmação radiográfica no final da cirurgia devem ser incluídos no protocolo de estudo.

Remoção do parafuso intramedular no final do experimento pode ser executada sem quaisquer dificuldades, porque a cabeça do parafuso pode ser conectada a um instrumento de remoção especial ou, alternativamente, o parafuso pode ser removido também com o suporte da agulha.

Uma limitação da técnica é que o parafuso de haste intramedular é fornecido pela empresa somente em único tamanho, com um comprimento definido de 17,2 mm e, portanto, o tamanho do fêmur deve ser considerado. Uma limitação adicional sobre o uso do parafuso intramedular é que na vivo micro computado-tomografia computadorizada (CT) ou ressonância magnética (MRI) análises do processo de cura são quase impossíveis devido o material de implante, o que afeta a imagem qualidade. Portanto, estas análises só podem ser executadas após a eutanásia e a remoção do implante no final do período de estudo. Finalmente, o parafuso não pode ser usado para analisar o defeito de consolidação óssea, porque a estabilidade axial é conseguida através da compressão dos fragmentos do osso o segmento proximal e a distal cabeça.

Estudos de cura óssea usam qualquer aberto8,9,10,11,12,13,14 ou fecharam4,15, 16,óssea de17 modelos de cura. Modelos de cura óssea aberto permitem uma fixação mais rígida dos fragmentos em relação ao osso fechado modelos, resultando em uma maior quantidade de cura intramembranosa sem uma formação de calo pronunciado de cura. Porque modelos abertos estão associados com pouca formação de calo, estes modelos não podem ser preferidos em experimentos que requerem quantidades maiores de tecido calo para análises bioquímicas e moleculares. Uma outra desvantagem dos modelos abertos é a necessidade de uma abordagem invasiva lateral com um trauma de tecido mole principais. Em contraste, o uso de um modelo fechado requer apenas uma pequena incisão menos invasiva. Até agora apenas alguns modelos fechados existem em ratos2.

No osso fechado modelos de cura, principalmente um pino intramedular simples é usado. No entanto, esta técnica tem desvantagens distintas. Mais notavelmente, a falta de estabilidade axial e rotacional. Isso pode resultar em um heterogêneo cura resposta5. Embora esta desvantagem é conhecida para influenciar resultados experimentais18, estudos recentes, que pretendem analisar os mecanismos de consolidação óssea, ainda usam modelos murino em que a fratura está estável apenas com um pino ou ainda resta instabilizados7 . Nós sentimos que as técnicas de osteossíntese estável, comparável aos utilizados na prática clínica, também devem ser usadas em ratos. Para alcançar a estabilidade rotacional e axial, o parafuso de haste intramedular foi desenvolvido que induz a fratura de compressão por uma cabeça distal e um segmento proximal. De interesse, a aplicação do parafuso intramedular não produz uma fixação rígida, e, assim, a rigidez torcional dos fêmures fraturados estabilizado com o parafuso de haste intramedular é significativamente menor quando comparada com a dos fêmures fraturados estabilizada por um fixador externo ou um bloqueio de placa5. No entanto, uma fixação menos rígida é necessária estudar endocondral consolidação óssea, porque apenas uma fixação menos rígida permite que os micromovimentos dos fragmentos do osso, que provocam a endocondral processo de cura. Apesar de tudo, como mostrado em um anterior ex estudo vivo, o parafuso intramedular produz uma distinta estabilidade axial e rotacional. Análises biomecânicas revelaram que o parafuso intramedular atinge uma rigidez torcional de 0,34 ± 0,18 Nmm / °, que é significativamente maior quando comparado ao obtido com um pino convencional (± 0,00 0,00 Nmm / °)5. Assim, o parafuso de haste intramedular introduzido aqui é o único implante que pode ser usado em uma técnica minimamente invasiva e que fornecem condições biomecânicas padronizadas para a cura de fratura de endocondral estudo em ratos.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela RISystem AG, Davos, Suíça.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Screw RISystem AG 221,100
Guide wire RISystem AG 521,100
Centering bit RISystem AG 590,205
Hand drill RISystem AG 390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head) Fink Walter GmbH 8822428
Suture (5-0 Prolene) Ethicon 8614H
Forceps Braun Aesculap AG &CoKG BD520R
Scissors Braun Aesculap AG &CoKG BC100R
Needle holder Braun Aesculap AG &CoKG BM024R
27 G needle Braun Melsungen AG 9186182
Scalpel blade size 15 Braun Aesculap AG &CoKG 16600525
Heat radiator Sanitas 605.25
Depilatory cream Asid bonz GmbH NDXZ10
Eye lubricant Bayer Vital GmbH 2182442
Xylazine Bayer Vital GmbH 1320422
Ketamine Serumwerke Bernburg 7005294
Tramadol Grünenthal GmbH 2256241
Disinfection solution (SoftaseptN) Braun Melsungen AG 8505018
CD-1 mice Charles River 22
X-ray Device Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation 2321A0988
Fracture device small RISystem AG 891,100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas
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Cite this Article

Histing, T., Bremer, P., Rollmann, M. F., Herath, S., Klein, M., Pohlemann, T., Menger, M. D., Fritz, T. A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions. J. Vis. Exp. (133), e57255, doi:10.3791/57255 (2018).More

Histing, T., Bremer, P., Rollmann, M. F., Herath, S., Klein, M., Pohlemann, T., Menger, M. D., Fritz, T. A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions. J. Vis. Exp. (133), e57255, doi:10.3791/57255 (2018).

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