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Medicine

Un modelo mínimamente invasivo para analizar la fractura endocondral en ratones en condiciones biomecánicas estandarizadas

doi: 10.3791/57255 Published: March 22, 2018

Summary

Este protocolo describe una técnica de osteosíntesis mínimamente invasiva utilizando un tornillo intramedular para estandardizado estabilización de fracturas de fémur, que puede utilizarse para analizar el hueso endocondral en ratones.

Abstract

Modelos de curación ósea son necesarios para analizar los complejos mecanismos de fractura cura para mejorar el tratamiento clínico de la fractura. Durante la última década, un mayor uso de modelos murinos en investigación ortopédica observó, probablemente porque los modelos de ratón ofrecen un gran número de cepas genéticamente y anticuerpos especiales para el análisis de los mecanismos moleculares de la curación de la fractura. Para controlar las condiciones biomecánicas, técnicas de osteosíntesis bien caracterizados son obligatorias, también en ratones. Aquí, Divulgamos sobre el diseño y uso de un hueso cerrado modelo de curación para estabilizar las fracturas de fémur en ratones. El tornillo intramedular, de acero inoxidable de grado médico, ofrece a través de la compresión de la fractura una estabilidad axial y rotacional en comparación a los pines intramedulares simple usa principalmente, que demuestran una total falta de estabilidad axial y rotacional. La estabilidad alcanzada por el tornillo intramedular permite el análisis de la curación endocondral. Una gran cantidad de tejido de callo, recibido después de la estabilización con el tornillo ofrece las condiciones ideales para la cosecha de tejido para análisis bioquímicos y moleculares. Otra ventaja del uso del tornillo es el hecho de que el tornillo puede insertarse en el fémur con una técnica mínimamente invasiva, sin provocar daño a los tejidos blandos. En conclusión, el tornillo es un implante único que idealmente puede ser utilizado en fractura cerrada cura modelos ofreciendo condiciones biomecánicas estandarizadas.

Introduction

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Hueso curativos estudios en ratones están en gran demanda debido a un amplio espectro de anticuerpos y animales modificados genéticamente. Estos hechos permiten para estudiar los mecanismos moleculares del hueso curativo1. En los últimos años, diferentes hueso curativo modelos para ratones se han desarrollado2. Estos modelos pueden dividirse en modelos abiertos, en que el hueso es osteotomized usando un acercamiento quirúrgico lateral abierto y en modelos cerrados, en el que se fractura el hueso basados en el modelo de fractura introducido por Bonnares y Einhorn3. Usando esta técnica, una fractura transversal estandarizada puede ser producida por un dispositivo de flexión de 3 puntos e implantes intramedulares pueden insertarse a través de una incisión parapatelar medial pequeño en una técnica mínimamente invasiva, evitando un trauma de tejidos blandos importantes.

El tornillo intramedular puede aplicarse para la estabilización de la fractura cerrada en ratones. El tornillo ofrece estabilidad rotacional y axial. Esto se logra por la compresión de la fractura a través de un hilo proximal y una distal de la cabeza4. Otras ventajas de los tornillos son la simple técnica quirúrgica, implante del bajo grado de invasivity, el bajo peso y, en particular, una mayor estabilidad de condiciones biomecánicas estandarizados y controlados en comparación con otros intramedular implantes de5. De hecho, en los modelos más cerrados de la fractura, los fragmentos se estabilizan por pernos simples, que se asocia con una total falta de estabilidad rotacional y axial y un alto riesgo de pin y también la fractura luxación. Esto puede influir notablemente el proceso de curación, que puede resultar en cicatrización o la formación de la Unión no.

Es bien sabido que la estabilidad de la fijación de la fractura tiene un tremendo impacto en el proceso curativo6,7. Una alta fijación rígida resulta en curación intramembranosa, mientras que una fijación menos rígida, que puede permitir micromovements en la brecha de la fractura, los resultados en la curación endocondral. Estabilización de la fractura con el tornillo intramedular muestra predominante un endocondral la curación con una gran cantidad de tejido de callo, particularmente después de 2 semanas de la curación de la fractura. La posibilidad de cosechar una gran cantidad de tejido de callo permite el análisis de múltiples parámetros mediante diferentes técnicas.

Aquí, Divulgamos sobre el diseño y la aplicación del tornillo intramedular en ratones, así como sus ventajas y desventajas en los estudios experimentales en curación de hueso endocondral normal.

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Protocol

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Todos los procedimientos fueron realizados según las directrices de institutos nacionales de salud para la utilización de animales de experimentación y siguieron directrices institucionales (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Alemania).

1. preparación de instrumental quirúrgico e implantes

  1. Seleccione una hoja de bisturí (tamaño 15), una esponja pequeña, pinzas finas, una aguja de 27 G, una sutura no reabsorbible 5-0, tijeras y un sostenedor de la aguja en el cuadro de instrumentos microquirúrgicos.
  2. Desembale el tornillo intramedular, el alambre de guía (0.3/0.2 mm de diámetro, 10 cm de longitud), la broca de centrado (0,5 mm de diámetro) y el taladro de mano (figura 1; véase Tabla de materiales).
    Nota: El tornillo intramedular (0,5 mm de diámetro, longitud de 17,2 mm) se hace del acero inoxidable de grado médico para su implantación retrógrada en el fémur. El tornillo tiene rosca proximal (0,5 mm de diámetro, 4 mm de longitud) con una nariz (0,2 mm de diámetro, 0,4 mm de longitud) en la punta y el distal en forma de cono cabeza (diámetro de 0,8 mm, 0,9 mm de longitud) para lograr la compresión de la fractura así como estabilidad axial y rotacional.
  3. Exponer los implantes y los instrumentos quirúrgicos en una solución desinfectante (alcohol de 96%) durante 5 minutos o esterilización (esterilización por vapor, 130 ° C, 25 min.). Después de la desinfección o esterilización, colocar los instrumentos en un paño de operación. Coloque la tela de operación directamente adyacente a la tabla de operación de animales pequeños.

2. los animales, la anestesia y Analgesia

  1. Elegir la cepa, edad y sexo de los ratones según la pregunta de estudio que se trata.
    Nota: Para este estudio se emplearon ratones CD-1 machos de 12 a 14 semanas de edad. El peso corporal adecuado para utilizar el tornillo intramedular es entre 25-35 g.
  2. Anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de 15 mg/kg xilacina y 75 mg/kg de ketamina. Confirmar la anestesia por presión del dedo del pie. Aplique lubricante ocular para proteger los ojos de los animales de secado durante la anestesia. Después de la inducción de la anestesia, colocar el ratón en un radiador de calor para mantener la temperatura corporal constante. Durante el procedimiento, los animales fueron monitoreados con pizca de repetida del dedo del pie para garantizar un adecuado plano de anestesia.
  3. Clorhidrato de tramadol en el agua potable (1.0 mg/mL) se aplican para la analgesia desde 1 día antes de la cirugía hasta 3 después de la cirugía.
    Nota: Prevención infección y Analgesia debe estar de acuerdo con las directrices respectivas del país y de la institución donde los experimentos deben realizarse.

3. intervención e implantación tornillo intramedular

  1. Antes de la cirugía, afeitarse la pata trasera derecha toda y aplicar una crema depilatoria. Después de 5 min, retirar la crema y limpie la pierna con agua. Luego, aplicar una solución desinfectante con alcohol de 96%. Betadine o clorhexidina puede añadirse al alcohol para garantizar asepsia completa.
  2. Bajo condiciones asépticas, coloque el ratón en la posición supina sobre la mesa de operación de animales pequeños. Doble la rodilla derecha para permitir un abordaje anterior de los cóndilos de la rodilla. Realizar una incisión de 5 mm parapatelar medial en la rodilla derecha con la hoja de bisturí.
  3. Movilizar el ligamento patelar con cuidado con la hoja de bisturí y el hisopo. A continuación, cambie la rótula lateralmente con las pinzas finas para exponer la muesca intercondílea del fémur.
  4. Abra la muesca intercondílea exactamente en el centro del fémur entre ambos cóndilos. Asegúrese de que no debe exceder de 1,0 mm de profundidad para la perforación.
    1. Inicio manual de perforación a una velocidad lenta y una compensación de 45 ° ventralmente al eje del fémur usando 0,5 mm centrado broca y el taladro de mano (figura 1C y D, figura 2). Durante la perforación, reducir continuamente el ángulo 0 ° de offset (paralela al eje del hueso del fémur). Pare cuando se alcanza una profundidad de 1,0 mm de perforación.
  5. Después de abrir el hueso en la muesca intercondílea, inserte la aguja de 27 G en la cavidad intramedular sobre toda la longitud del fémur. Escarie la cavidad intramedular del fémur manualmente mediante movimientos rotatorios de la aguja de 27 G. Empuje la aguja hacia adelante para perforar el hueso cortical en el mayor trocánter proximal.
  6. Retire la aguja de 27 G y aplicar la guía a través de la parte distal del fémur.
    1. Hacer una incisión en la piel con una hoja de bisturí (tamaño 15) proximal sobre el alambre guía y avanzar la guía hasta que ambos extremos de la guía están fuera. Asegúrese de que mantenga el alambre guía en su lugar.
  7. Crear una fractura cerrada definida mediante la guillotina.
    1. Coloque el ratón en posición lateral con la pierna derecha debajo de la guillotina. Asegúrese de que la parte diafisaria del fémur se coloca en medio de la guillotina.
    2. Soltar el peso (200 g) de la distancia definida de 25,5 cm.
  8. Controlar la configuración de la fractura y la posición de la fractura así como la posición del alambre guía (figura 3) utilizando el aparato de rayos x (véase Tabla de materiales).
  9. Conecte el tornillo intramedular con la nariz en el extremo distal de la guía de 0,2 mm e inserte en el fémur bajo presión continua y rotación a la derecha.
    1. Corte del eje impulsor cuando se logra el suficiente esfuerzo de torsión.
    2. Retire el alambre guía proximal.
  10. Vuelva a colocar la rótula y fijar el tendón de la rótula a los músculos con una sola sutura utilizando un sintético 5-0, monofilamento, sutura no absorbible de polipropileno. Utilizar suturas individuales del mismo material y tamaño para cerrar la herida. La reducción de los fragmentos y la posición del tornillo radiológico utilizando el aparato de rayos x de control (véase Tabla de materiales).
  11. Mantener los animales bajo el radiador de calor hasta que se recuperen de la anestesia. No descuide los animales hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency ventral. Devolver los animales a las jaulas individuales en el Animalario. No devolver los animales a la compañía de otros animales durante las primeras 24 h, aunque han recuperado de la anestesia.
  12. Controlar los animales con cuidado cada día. Mantener analgesia postoperatoria con tramadol clorhidrato en el agua potable con una dosis de 1.0 mg/mL durante los primeros tres días. Continuar la analgesia si, el día 4 después de la cirugía, los animales aún muestran evidencia de dolor, indicado por vocalización, inquietud, falta de movilidad, falta de novio, postura anormal y la falta de interés normal en un entorno. Terminar la analgesia cuando los animales están libres de dolor.
  13. Al final del experimento eutanasia al animal por una sobredosis de barbitúricos.

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Representative Results

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El tiempo de funcionamiento de la incisión cutánea al cierre de la herida era 20 minutos. La cirugía puede realizarse sin un microscopio estéreo. Postoperatoriamente, los animales fueron monitoreados diariamente. Analgesia postoperatoria fue terminada después de 2 días porque ninguno de los animales mostraron evidencia de dolor después de este período de tiempo. Los animales demostraron también carga normal dentro de 2 días después de la cirugía. Infecciones de la herida no se observaron durante el período de observación todo.

Análisis radiológicos después de 2 semanas demostró una evidente formación de tejido de callo cerrar la brecha de la fractura (Figura 4A). Después de 5 semanas, fue sanada la fractura y el callo perióstico fue casi totalmente remodelado (Figura 4B).

Análisis histológicos de callo y la zona de fractura después de 2 semanas mostraron distribución del típico tejido de cicatrización con tejido cartilaginoso, construido durante el proceso de condrogénica endocondral y tejido óseo (figura 5A). Después de 5 semanas, desapareció el tejido cartilaginoso y el tejido óseo se convirtió en el hueso laminar para reconstituir la normalidad anatómica y propiedades de carga del hueso (figura 5B).

Análisis biomecánicos después de 2 semanas indicó una flexión rigidez del 37% en comparación con el hueso fracturas contralateral. Después de 5 semanas, la rigidez de flexión fue de casi 100% que indica curación completa (figura 6).

Figure 1
Figura 1: implantes de. A. el intramedular tornillo (0,5 mm de diámetro, longitud de 17,2 mm) con el hilo (diámetro de 0,5 mm, 4 mm de longitud) y la nariz (0,2 mm de diámetro, 0,4 mm de longitud) proximal y una cónica (diámetro de 0,8 mm, 0,9 mm de longitud) distal. B. el alambre guía (0.3/0.2 mm de diámetro, 10 cm de longitud). C. centrado de la broca (0,5 mm de diámetro). D. el taladro de mano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: dibujo esquemático de los cóndilos del fémur que indica la entrada del punto para el tornillo intramedular. Cóndilos del fémur con la muesca intercondílea en antero-posterior ve (izquierda) y sagital (derecha). La Cruz (izquierda) indica el punto de entrada para el tornillo intramedular, la flecha (derecha) indica el desplazamiento de 45 ° con el eje del fémur para empezar a taladrar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: radiografía de fémur con una fractura transversal y el alambre guía colocado. La radiografía muestra la configuración de la fractura transversal en la parte diafisaria del fémur (flecha) y la guía dentro de la cavidad intramedular tendiendo un puente sobre la fractura. Barras de escala representan 5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: radiografías después de 2 y 5 semanas de curación ósea. A. análisis radiográfico de un fémur estabilizado con el tornillo después de 2 semanas, demostrando la formación de un callo obvio. B. análisis radiográfico de un fémur estabilizado con el tornillo después de 5 semanas, demostrando una curación casi completa de la fractura con la remodelación del callo. Barras de escala representan 5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: las secciones histológicas después de 2 y 5 semanas de curación ósea. A. análisis histológico de un fémur estabilizado con el tornillo después de 2 semanas, demostrando la distribución de tejido típico durante endocondral hueso con cartílago (c) y (b) tejido dentro del callo del hueso. B. el análisis histológico de un fémur estabilizado con el tornillo después de 5 semanas, demostrando la remodelación casi completa de hueso laminar. Los cortes histológicos fueron teñidos según el método trichrome. Barras de escala representan 1000 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: análisis biomecánico. Análisis Biomecánico de la rigidez de flexión después de 2 semanas (barra blanca, n = 9) y 5 semanas (barra negra, n = 8). Rigidez de flexión se da en porcentaje el fémur contralateral no fracturada. Los datos se dan como media ± error estándar de la media (SEM), * p < 0.05 vs 2 semanas. Después de probar la hipótesis de distribución normal (prueba de Kolmogorov Smirnov) y de igual varianza (prueba F), la comparación entre los dos grupos experimentales se realizó utilizando la prueba t de Student´s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Pasos críticos de la intervención quirúrgica son encontrar el punto de entrada correcto para la implantación de tornillo en el centro de los cóndilos del fémur en la muesca intercondílea, así como la óptima orientación de la aguja paralela al eje del hueso para el escariado de la cavidad intramedular. Para evitar una posición de entrada incorrecta, el cirujano debe preparar la muesca hasta que se logra una vista óptima. Para controlar la orientación durante el fresado, el fémur de los ratones se debe sostener con los dedos en una posición estable. Otro paso fundamental es la inserción del tornillo en el fémur sobre el alambre guía porque el alambre guía puede deslizarse fuera el fragmento de hueso proximal resultando en una dislocación de la fractura. En este caso, el cirujano puede tratar a los fragmentos de hueso nuevo, pero esta maniobra es sobre todo fracasada, y los animales tienen entonces que ser excluidos del estudio.

Además, el procedimiento quirúrgico puede desarrollar algunas complicaciones. Por ejemplo, puede romper el ligamento rotuliano, que se desplaza lateralmente para obtener una visión óptima de los cóndilos. Esto requiere sutura del ligamento después de la inserción del tornillo. Durante la apertura del hueso en los cóndilos y escariado de la cavidad intramedular, los cóndilos pueden reventar. En este caso, no hay ninguna posibilidad de solución de problemas, porque el tornillo no puede ser reparado adecuadamente en el extremo distal y no se logra la compresión de la fractura. Otra complicación es la dislocación de la guía insertada o una posición incorrecta de los huesos. Esta complicación puede reducirse por análisis radiográfico y manejo con precaución después de la inserción para confirmar la correcta colocación durante la cirugía. Además, el cirujano debe prestar la atención que el tornillo se inserta completamente debido a una protrusión del tornillo puede limitar la movilidad del ratón o reducir la compresión de la fractura. Por lo tanto, un dispositivo de rayos x es obligatorio para el procedimiento quirúrgico. Animales después de la confirmación radiográfica en el final de la cirugía se deben incluir en el protocolo del estudio.

Extracción del tornillo intramedular en el final del experimento se puede realizar sin dificultad, porque la cabeza del tornillo puede ser conectada a un instrumento de especial retirada o, alternativamente, el tornillo puede eliminarse también con el soporte de la aguja.

Una limitación de la técnica es que el tornillo intramedular es proporcionado por la empresa solamente en un tamaño con una longitud definida de 17,2 mm y por lo tanto se debe considerar el tamaño del fémur. Otra limitación en el uso del tornillo intramedular es que en vivo micro computarizada tomografía-(CT) o imágenes por resonancia magnética (MRI) los análisis del proceso de curación están casi imposibles debido al material del implante, que afecta a la imagen calidad. Por lo tanto, estos análisis sólo pueden realizarse después de la eutanasia y el retiro del implante al final del período de estudio. Finalmente, el tornillo no puede utilizarse para analizar huesos defecto curativo, porque la estabilidad axial se consigue mediante la compresión de los fragmentos de hueso por el hilo proximal y la distal cabeza.

Hueso curativos estudios utilizan cualquiera abierto8,9,10,11,12,13,14 o cerraron4,15, 16,hueso de17 modelos de curación. Modelos de curación ósea abierta permiten una fijación más rígida de los fragmentos en comparación con el hueso cerrado curación modelos, resultando en una mayor cantidad de curación intramembranosa sin una formación de callo pronunciado. Porque los modelos abiertos se asocian poco formación de callo, estos modelos no pueden ser preferidos en los experimentos que requieren grandes cantidades de tejido de callo para análisis bioquímicos y moleculares. Otra desventaja de los modelos abiertos es la necesidad de un enfoque lateral invasivo con un trauma de tejidos blandos importantes. En contraste, el uso de un modelo cerrado requiere solamente un pequeño menos incisión invasiva. Hasta ahora sólo unos pocos modelos cerrados existen en ratones2.

En el hueso cerrado modelos de curación, se utiliza principalmente un pin intramedular simple. Sin embargo, esta técnica tiene desventajas distintas. En particular, la falta de estabilidad axial y rotacional. Esto puede resultar en cicatrización heterogénea respuesta5. Aunque esta desventaja es conocida por influir en los resultados experimentales18, estudios recientes, que pretenden analizar los mecanismos de curación del hueso, utilizan modelos murinos en los que la fractura se estabiliza sólo con un alfiler o incluso queda inestabilizado7 . Creemos que deben utilizarse también técnicas de osteosíntesis estable, comparables a los utilizados en la práctica clínica, en ratones. Para lograr estabilidad axial y rotacional, el tornillo intramedular fue desarrollado que provoca fractura compresión por un hilo proximal y una cabeza distal. De interés, la aplicación del tornillo intramedular no produce una fijación rígida, y, por lo tanto, la rigidez torsional de los fémures fracturados estabilizados con el tornillo intramedular es significativamente menor en comparación con la de fémures fracturados estabilizado por un fijador externo o un bloqueo de la placa5. Sin embargo, una fijación menos rígida es necesaria estudiar endocondral hueso curativo, porque sólo una fijación menos rígida permite los micromovements de los fragmentos de hueso, que provocan la endocondral proceso de curación. Sin embargo, como se muestra en un anterior ex estudio vivo, el tornillo intramedular produce una distinta estabilidad axial y rotacional. Análisis biomecánicos revelaron que el tornillo intramedular alcanza una rigidez torsional de 0.34 ± 0.18 Nmm °, que es significativamente mayor en comparación con la conseguida con un perno convencional (± 0.00 0.00 ° Nmm)5. Así, el tornillo intramedular introducido aquí es el único implante que puede ser utilizado en una técnica mínimamente invasiva y que proporcionan condiciones biomecánicas estandarizadas para el estudio endocondral fractura cura en ratones.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por RISystem AG, Davos, Suiza.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Screw RISystem AG 221,100
Guide wire RISystem AG 521,100
Centering bit RISystem AG 590,205
Hand drill RISystem AG 390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head) Fink Walter GmbH 8822428
Suture (5-0 Prolene) Ethicon 8614H
Forceps Braun Aesculap AG &CoKG BD520R
Scissors Braun Aesculap AG &CoKG BC100R
Needle holder Braun Aesculap AG &CoKG BM024R
27 G needle Braun Melsungen AG 9186182
Scalpel blade size 15 Braun Aesculap AG &CoKG 16600525
Heat radiator Sanitas 605.25
Depilatory cream Asid bonz GmbH NDXZ10
Eye lubricant Bayer Vital GmbH 2182442
Xylazine Bayer Vital GmbH 1320422
Ketamine Serumwerke Bernburg 7005294
Tramadol Grünenthal GmbH 2256241
Disinfection solution (SoftaseptN) Braun Melsungen AG 8505018
CD-1 mice Charles River 22
X-ray Device Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation 2321A0988
Fracture device small RISystem AG 891,100

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References

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Un modelo mínimamente invasivo para analizar la fractura endocondral en ratones en condiciones biomecánicas estandarizadas
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Histing, T., Bremer, P., Rollmann, M. F., Herath, S., Klein, M., Pohlemann, T., Menger, M. D., Fritz, T. A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions. J. Vis. Exp. (133), e57255, doi:10.3791/57255 (2018).More

Histing, T., Bremer, P., Rollmann, M. F., Herath, S., Klein, M., Pohlemann, T., Menger, M. D., Fritz, T. A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions. J. Vis. Exp. (133), e57255, doi:10.3791/57255 (2018).

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