Summary
Questo protocollo descrive una tecnica di osteosintesi mininvasiva utilizzando una vite intramidollare per standardizzato stabilizzazione delle fratture di femore, che può essere usato per analizzare endocondrale ossa guarigione nei topi.
Abstract
Modelli di guarigione ossea sono necessari per analizzare i complessi meccanismi di frattura che guarisce per migliorare il trattamento delle fratture cliniche. Durante l'ultimo decennio, è stato notato un maggiore utilizzo di modelli murini in ricerca ortopedica, molto probabilmente perché i modelli murini offrono un gran numero di ceppi geneticamente modificati e particolari anticorpi per l'analisi dei meccanismi molecolari della guarigione della frattura. Per controllare le condizioni biomeccaniche, tecniche di osteosintesi ben caratterizzati sono obbligatorie, anche nei topi. Qui, segnaliamo sulla progettazione e l'uso di un osso chiuso modello curativo per stabilizzare le fratture di femore nei topi. La vite intramidollare, in acciaio inox medicale, fornisce attraverso compressione frattura una stabilità assiale e rotazionale rispetto ai perni intramidollari semplice usato principalmente, che mostrano una completa mancanza di stabilità assiale e rotazionale. La stabilità raggiunta dalla vite intramidollare permette l'analisi di endochondral guarigione. Una grande quantità di tessuto di callo, ricevuto dopo stabilizzazione con la vite, offre le condizioni ideali per la raccolta del tessuto per le analisi biochimiche e molecolari. Un ulteriore vantaggio dell'uso della vite è il fatto che la vite può essere inserita nel femore con tecnica mininvasiva senza indurre danni al tessuto molle. In conclusione, la vite è un unico impianto che può essere utilizzato idealmente in frattura chiusa guarigione modelli che offrono condizioni biomeccaniche standardizzate.
Introduction
Guarigione ossea condotti in topi sono molto richiesti a causa di un ampio spettro di anticorpi e animali geneticamente modificati. Questi fatti permettono di studiare i meccanismi molecolari di1di guarigione ossea. Negli ultimi anni, diversa ossa guarigione modelli per topi sono stati sviluppati2. Questi modelli possono essere diviso in modelli aperti, in cui l'osso è osteotomized utilizzando un approccio chirurgico laterale aperto e in modelli chiusi, in cui l'osso è fratturato sulla base del modello di frattura introdotto da Bonnares ed Einhorn3. Utilizzando questa tecnica, una frattura trasversale standardizzata può essere prodotta da un dispositivo di piegatura di 3 punti e intramidollare impianti possono essere inseriti attraverso un'incisione pararotulea mediale piccolo in una tecnica mini-invasiva evitando un trauma dei tessuti molli principali.
La vite intramidollare può essere applicata per la stabilizzazione della frattura chiusa in topi. La vite offre stabilità rotazionale e assiale. Ciò si ottiene mediante compressione frattura attraverso un filo di prossimale e distale testa4. Ulteriori vantaggi della vite sono la semplice tecnica chirurgica, impiantare il basso grado di invasività, il basso peso e, soprattutto, una maggiore stabilità fornendo condizioni biomeccaniche standardizzate e controllate rispetto ad altri intramidollare gli impianti5. Infatti, nei modelli più chiusi di frattura, i frammenti sono stabilizzati solo da semplice PIN, che è associato con una completa mancanza di stabilità rotazionale e assiale e un elevato rischio di perno e anche frattura lussazione. Questo può influenzare notevolmente il processo di guarigione, che può provocare la guarigione ritardata o mancata unione formazione.
È noto che la stabilità della fissazione di frattura ha un enorme impatto sulla guarigione processo6,7. Una fissazione rigida alta risultati nella guarigione intramembranous, mentre una fissazione meno rigida, che potrebbe consentire micromovimenti del divario di frattura, con la conseguente guarigione endochondral. Stabilizzazione della frattura con la vite intramidollare Mostra principalmente un endochondral guarigione con una grande quantità di tessuto di callo, particolarmente dopo 2 settimane di guarigione di frattura. La possibilità di raccogliere una grande quantità di tessuto callo permette l'analisi di più parametri con tecniche diverse.
Qui, segnaliamo sulla progettazione e applicazione della vite intramidollare nei topi, così come sui suoi vantaggi e svantaggi in studi sperimentali su endochondral normale guarigione ossea.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite secondo le direttive del National Institutes of Health per l'uso di animali da esperimento e seguivano le linee guida istituzionali (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Germania).
1. preparazione di strumenti chirurgici e protesi
- Selezionare una lama per bisturi (taglia 15), un piccolo tampone, una pinzetta, un ago da 27 G, una sutura non riassorbibile 5-0, forbici e un porta-aghi nella finestra strumento microsurgical.
- Disimballare la vite intramidollare, il filo guida (0,3/0,2 mm di diametro, 10 cm di lunghezza), la punta di centraggio (0,5 mm di diametro) e il trapano a mano (Figura 1; Vedi Tabella materiali).
Nota: La vite intramidollare (0,5 mm di diametro, 17,2 mm di lunghezza) è fatta in acciaio inox medicale per impianto retrogrado nel femore. La vite ha una filettatura prossimale (diametro 0,5 mm, 4 mm di lunghezza) con un naso (0,2 mm di diametro, lunghezza 0,4 mm) in punta e distale testa a forma di cono (diametro 0,8 mm, 0,9 mm di lunghezza) per raggiungere la frattura di compressione, nonché stabilità assiale e rotazionale. - Esporre gli impianti e tutti gli strumenti chirurgici per una soluzione disinfettante (96% di alcool) per 5 min o sterilizzarli (sterilizzazione a vapore, 130 ° C, 25 min). Dopo la disinfezione o la sterilizzazione, mettere gli strumenti su un panno di operazione. Posizionare il panno di funzionamento direttamente adiacente alla tabella piccola operazione animale.
2. gli animali, l'anestesia e Analgesia
- Scegliere il ceppo, età e sesso dei topi secondo la domanda di studio che si rivolge.
Nota: Per questo studio sono stati utilizzati topi CD-1 maschi di 12 a 14-week-old. Il peso del corpo appropriato utilizzare la vite di intramidollare è tra 25-35 g. - Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 15 mg/kg xylazina e 75 mg/kg ketamina. Confermare l'amputate pizzico di punta. Applicare il lubrificante di occhio per proteggere gli occhi degli animali da essiccazione durante l'anestesia. Dopo induzione dell'anestesia, posizionare il mouse sotto un radiatore di calore per mantenere costante la temperatura corporea. Durante la procedura, gli animali sono stati controllati con pizzico di ripetute punta a garantire un adeguato piano di anestesia.
- Applicare tramadol-cloridrato nell'acqua potabile (1,0 mg/mL) per analgesia dal 1 ° giorno prima dell'intervento chirurgico fino al 3 ° giorno dopo l'intervento chirurgico.
Nota: Analgesia e infezione prevenzione dovrebbe essere d'accordo con le rispettive linee guida del paese e istituzione dove gli esperimenti devono essere eseguiti.
3. intervento chirurgico e l'impianto a vite intramidollare
- Prima dell'intervento chirurgico, radere tutta la gamba destra posteriore e applicare una crema depilatoria. Dopo 5 minuti, rimuovere la crema e pulire l'arto con acqua. Quindi, applicare una soluzione disinfettante con alcool al 96%. Clorexidina o Betadine può aggiungersi all'alcool per garantire completa asepsi.
- In condizioni asettiche, posizionare il mouse nella posizione supina sul tavolo piccola operazione animale. Piegare il ginocchio destro per consentire un approccio anteriore per i condili del ginocchio. Eseguire un'incisione di 5 mm pararotulea mediale al ginocchio destro utilizzando la lama del bisturi.
- Mobilitare il legamento patellar attentamente con il bisturi e il tampone. Quindi, spostare lateralmente la rotula con una pinzetta per esporre intercondiloidea del femore.
- Aprire la tacca intercondylar esattamente nel mezzo del femore tra entrambi i condili. Assicurarsi che non deve superare 1,0 mm di profondità per il foro di trapano.
- Avvio manuale di perforazione ad una velocità lenta e un offset 45 ° ventralmente all'asse del femore con 0,5 mm di centraggio trapano e il trapano a mano (Figura 1 e D, Figura 2). Durante la perforazione, continuamente diminuire l'angolo di offset di 0 ° (parallelo all'asse dell'osso del femore). Interrompere quando viene raggiunta una profondità di 1,0 mm di perforazione.
- Dopo l'apertura dell'osso alla tacca intercondylar, inserire l'ago 27 G nella cavità intramidollare su tutta la lunghezza del femore. Scremare la cavità intramidollare del femore manualmente attraverso movimenti rotativi dell'ago 27 G. Spingere l'ago avanti per perforare l'osso corticale alle grande trocantere prossimalmente.
- Rimuovere l'ago 27G e applicare il filo guida attraverso la parte distale del femore.
- Fare un'incisione della pelle con un bisturi (taglia 15) prossimalmente sopra il filo guida e spingere in avanti il filo guida fino a quando entrambe le estremità del filo guida sono fuori. Assicurarsi di mantenere il filo guida in posizione.
- Creare una frattura chiusa definita utilizzando la ghigliottina.
- Posizionare il mouse in posizione laterale con la gamba destra sotto la ghigliottina. Assicurarsi che la parte della diafisi del femore è posto nel mezzo della ghigliottina.
- Eliminare il peso (200 g) dalla distanza definita di 25,5 cm.
- Controllare la configurazione di frattura e frattura posizione così come la posizione del filo guida (Figura 3) utilizzando il dispositivo a raggi x (Vedi Tabella materiali).
- Collegare la vite intramidollare con il naso all'estremità distale per il filo di guida di 0.2 mm e inserirla nel femore sotto pressione continua e la rotazione in senso orario.
- Taglio dell'albero motore quando viene raggiunta la coppia sufficiente.
- Rimuovere il filo guida prossimalmente.
- Riposizionare la rotula e fissare il tendine della rotula ai muscoli con una sutura singola utilizzando un sintetico 5-0, monofilamento, nonabsorbable sutura in polipropilene. Utilizzare suture singole dello stesso materiale e dimensione per chiudere la ferita. Controllare la riduzione dei frammenti e la posizione della vite radiologicamente utilizzando il dispositivo a raggi x (Vedi Tabella materiali).
- Tenere gli animali sotto il radiatore di calore fino a quando recuperano dall'anestesia. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito ventrale. Restituire gli animali nelle gabbie singole nella struttura degli animali. Non restituire gli animali per la compagnia di altri animali durante le prime 24 ore, anche se hanno pienamente recuperato dall'anestesia.
- Monitorare gli animali con cura ogni giorno. Mantenere l'analgesia postoperatoria usando tramadol cloridrato in acqua potabile con un dosaggio di 1,0 mg/mL durante i primi tre giorni. Continuare l'analgesia se, il giorno 4 dopo la chirurgia, gli animali mostrano ancora prova del dolore, come indicato dalla vocalizzazione, irrequietezza, mancanza di mobilità, il mancato sposo, postura anormale e mancanza di normale interesse nei dintorni. Terminare l'analgesia quando gli animali sono senza dolore.
- Alla fine dell'esperimento eutanasia animale da un'overdose di barbiturici.
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Representative Results
Il tempo di funzionamento da incisione cutanea alla chiusura della ferita era 20 min. La chirurgia può essere eseguita senza stereo-microscopio. Postoperatorio, gli animali sono stati controllati giornalmente. L'analgesia postoperatoria è stata terminata dopo 2 giorni perché nessuno degli animali ha mostrato la prova del dolore dopo questo periodo di tempo. Gli animali hanno mostrato anche normale peso-cuscinetto entro 2 giorni dopo la chirurgia. Le infezioni della ferita non sono state osservate durante l'intero periodo di osservazione.
Analisi radiologiche dopo 2 settimane hanno mostrato un'evidente formazione di tessuto di callo colmare il divario di frattura (Figura 4A). Dopo 5 settimane, la frattura è guarita, e il callo periostale è stato quasi completamente ristrutturato (Figura 4B).
Le analisi istologiche del callo e la zona di frattura dopo 2 settimane ha mostrato la distribuzione tissutale tipico di endochondral guarigione con tessuto cartilagineo costruito durante il processo di chondrogenic e tessuto osseo (Figura 5A). Dopo 5 settimane, è sparito il tessuto della cartilagine e l'osso tessuto è stato convertito per l'osso lamellare al fine di ricostituire la normale anatomia e proprietà a carico dell'osso (figura 5B).
Analisi biomeccaniche dopo 2 settimane hanno indicato una rigidità alla flessione del 37% rispetto all'osso cui controlaterale. Dopo 5 settimane, la rigidità alla flessione era quasi al 100% che indica la completa guarigione (Figura 6).
Figura 1: protesi. R. l'intramidollare vite (0,5 mm di diametro, lunghezza 17,2 mm) con il filo (diametro 0,5 mm, 4 mm di lunghezza) e il naso (0,2 mm di diametro, lunghezza 0,4 mm) prossimale e una a forma di cono testa (diametro 0,8 mm, 0,9 mm di lunghezza) distale. B. il filo guida (0,3/0,2 mm di diametro, 10 cm di lunghezza). C. il centraggio della punta da trapano (0,5 mm di diametro). D. il trapano a mano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: disegno schematico dei condili del femore che indica la voce punto per la vite endomidollare. Condili del femore con la tacca intercondylar anteriore-posteriore Mostra (a sinistra) e sagittale (a destra). La Croce (a sinistra) indica il punto di ingresso per la vite intramidollare, la freccia (a destra) indica l'offset di 45 ° rispetto all'asse del femore per iniziare la foratura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: radiografia del femore con una frattura trasversale e il filo guida inserita. Radiografia mostra la configurazione di frattura trasversale nella parte della diafisi del femore (freccia) e il filo guida all'interno della cavità intramidollare colmare la frattura. Barre della scala rappresentano 5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: le radiografie dopo 2 e 5 settimane di guarigione ossea. A. analisi radiografica di un femore stabilizzato con la vite dopo 2 settimane, dimostrando la formazione del callo ovvio. B. analisi radiografica di un femore stabilizzato con la vite dopo 5 settimane, dimostrando quasi completa guarigione della frattura con il rimodellamento del callo. Barre della scala rappresentano 5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: sezioni istologiche dopo 2 e 5 settimane di guarigione ossea. A. l'analisi istologica di un femore stabilizzato con la vite dopo 2 settimane, dimostrando la distribuzione tissutale tipico durante endocondrale ossa guarigione con cartilagine (c) e (b) tessuto all'interno il callo osseo. B. l'analisi istologica di un femore stabilizzato con la vite dopo 5 settimane, dimostrando la ristrutturazione quasi completa di osso lamellare. Le sezioni istologiche erano macchiate secondo il metodo tricromica. Barre della scala rappresentano 1000 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: analisi biomeccanica. Analisi biomeccanica della rigidità alla flessione dopo 2 settimane (barra bianca, n = 9) e 5 settimane (barra nera, n = 8). Rigidità alla flessione è dato in percentuale al femore fratturato non controlaterale. Dati sono riportati come media ± errore standard della media (SEM), * p < 0.05 vs 2 settimane. Dopo aver dimostrato il presupposto per la distribuzione normale (Kolmogorov-Smirnov-test) e varianza (test F), il confronto tra i due gruppi sperimentali è stato eseguito utilizzando il test t dello studente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Fasi critiche della procedura chirurgica sono per trovare il punto di ingresso corretto per l'impianto di vite in mezzo i condili del femore a tacca intercondylar, nonché l'orientamento ottima dell'ago parallelo all'asse dell'osso per l'alesatura della cavità intramidollare. Per evitare una posizione di voce non corretta, il chirurgo dovrebbe preparare la tacca fino a quando si ottiene una vista ottimale. Per controllare l'orientamento durante la scrematura, femore dei topi deve essere tenuto con le dita in una posizione stabile. Un ulteriore punto critico è l'inserimento della vite nel femore sopra il filo guida, perché il filo guida può scivolare fuori il frammento prossimale dell'osso con conseguente una dislocazione di frattura. In questo caso, il chirurgo può cercare di infilare i frammenti di osso nuovo, ma questa manovra è in gran parte infruttuosa, e gli animali devono quindi essere esclusi dallo studio.
Inoltre, la procedura chirurgica può sviluppare alcune complicazioni. Ad esempio, il legamento patellare, che è spostato lateralmente per ottenere una visualizzazione ottima per i condili, può rompersi. Ciò richiede sutura del legamento dopo inserimento della vite. Durante l'apertura dell'osso presso i condili e alesatura cavità intramidollare, potrebbero scoppiare i condili. In questo caso, non c'è alcuna possibilità di risoluzione dei problemi, perché la vite non può essere adeguatamente fissata all'estremità distale e la compressione della frattura non è raggiunto. Un'altra complicazione è la dislocazione del filo guida inserito o una posizione non corretta dall'osso. Questa complicazione può essere ridotto gestendo con attenzione e di analisi radiografica dopo inserimento per confermare il corretto posizionamento durante l'intervento chirurgico. Inoltre, il chirurgo dovrebbe prestare attenzione che la vite sia completamente inserita perché una protrusione della vite può limitare la mobilità del mouse o ridurre la compressione di frattura. Pertanto, un dispositivo a raggi x è obbligatorio per la procedura chirurgica. Animali solo dopo la conferma radiografica alla fine della chirurgia dovrebbero essere incluso nel protocollo di studio.
Rimozione della vite intramidollare alla fine dell'esperimento può essere eseguita senza alcuna difficoltà, perché la testa della vite può essere collegata a uno strumento di rimozione speciali o, in alternativa, la vite può essere rimosso anche con il supporto dell'ago.
Una limitazione della tecnica è che la vite intramidollare è fornita dalla società solo in unica taglia con una lunghezza definita di 17,2 mm e pertanto deve essere considerata la dimensione del femore. Un'ulteriore limitazione sull'uso della vite intramidollare è che in vivo micro computato tomografia-(CT) o analisi di risonanza magnetica (MRI) del processo di guarigione sono quasi impossibili a causa del materiale di impianto, che colpisce l'immagine qualità. Di conseguenza, queste analisi possono essere eseguite solo dopo la rimozione dell'impianto alla fine del periodo di studio e l'eutanasia. Infine, la vite non può essere utilizzata per analizzare la guarigione del difetto dell'osso, perché la stabilità assiale avviene attraverso la compressione dei frammenti dell'osso dal thread prossimale e distale testa.
Studi di guarigione dell'osso uso entrambi aprire8,9,10,11,12,13,14 o chiuso4,15, 16,17 osso modelli di guarigione. Ossee aperte guarigione modelli consentono una più rigida fissazione dei frammenti rispetto all'osso chiuso guarigione modelli, risultante in una maggiore quantità di guarigione intramembranous senza una formazione di callo pronunciate. Perché modelli aperti sono associati con piccola formazione del callo, questi modelli non possono essere preferiti negli esperimenti che richiedono grandi quantità di tessuto callo per le analisi biochimiche e molecolari. Uno svantaggio ulteriore dei modelli aperti è la necessità di un approccio invasivo laterale con un trauma dei tessuti molli principali. Al contrario, l'uso di un modello chiuso richiede solo una piccola incisione meno invasiva. Fino ad ora solo pochi modelli chiusi esistevano in topi2.
In modelli di guarigione ossea chiuso, viene utilizzato per lo più un pin semplice intramidollare. Tuttavia, questa tecnica presenta svantaggi distinti. In particolare, la mancanza di stabilità assiale e rotazionale. Questo può comportare una guarigione eterogenei di risposta5. Sebbene questo svantaggio è conosciuto per influenzare i risultati sperimentali18, recenti studi, che intendono analizzare i meccanismi di guarigione ossea, utilizzano modelli murini in cui la frattura è stabilizzata solo con un pin o addirittura è lasciata non stabilizzata7 . Riteniamo che le tecniche di osteosintesi stabile, paragonabili a quelli utilizzati nella pratica clinica, inoltre dovrebbero essere usati in topi. Per raggiungere la stabilità assiale e rotazionale, la vite intramidollare è stata sviluppata che induce la frattura di compressione da una testa distale e un thread prossimale. Di interesse, l'applicazione della vite intramidollare non produce una fissazione rigida e, quindi, la rigidità torsionale dei femori fratturati stabilizzato con la vite intramidollare è significativamente inferiore rispetto a quello dei femori fratturati stabilizzato da un fixator esterno o un bloccaggio piastra5. Tuttavia, una fissazione meno rigida è richiesta di studiare endochondral guarigione ossea, perché solo una fissazione meno rigida permette i micromovimenti dei frammenti dell'osso, che provocano la endochondral processo di guarigione. Tuttavia, come mostrato in un precedente ex vivo uno studio, la vite intramidollare produce una distinta stabilità assiale e rotazionale. Analisi biomeccaniche hanno rivelato che la vite intramidollare raggiunge una rigidità torsionale di 0,34 ± 0.18 Nmm / °, che è significativamente più alto rispetto a quello ottenuto con un pin convenzionale (± 0.00 0.00 Nmm / °)5. Così, la vite intramidollare introdotta qui è l'unico impianto che può essere utilizzato in una tecnica mini-invasiva e che forniscono condizioni biomeccaniche standardizzate per la guarigione di frattura endochondral del Studio nei topi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da RISystem AG, Davos, Svizzera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Screw | RISystem AG | 221,100 | |
| Guide wire | RISystem AG | 521,100 | |
| Centering bit | RISystem AG | 590,205 | |
| Hand drill | RISystem AG | 390,130 | |
| Cotton-Swab (150 mm, small head) | Fink Walter GmbH | 8822428 | |
| Suture (5-0 Prolene) | Ethicon | 8614H | |
| Forceps | Braun Aesculap AG &CoKG | BD520R | |
| Scissors | Braun Aesculap AG &CoKG | BC100R | |
| Needle holder | Braun Aesculap AG &CoKG | BM024R | |
| 27 G needle | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Scalpel blade size 15 | Braun Aesculap AG &CoKG | 16600525 | |
| Heat radiator | Sanitas | 605.25 | |
| Depilatory cream | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Eye lubricant | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | 7005294 | |
| Tramadol | Grünenthal GmbH | 2256241 | |
| Disinfection solution (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| CD-1 mice | Charles River | 22 | |
| X-ray Device | Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation | 2321A0988 | |
| Fracture device small | RISystem AG | 891,100 |
References
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