Summary
Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.
Abstract
Soja (Glycine max (L.) Merr.) est une espèce de culture importante et est devenu un modèle de légumineuses pour l’étude des voies génétiques et biochimiques. Par conséquent, il est important de mettre en place un système d’expression de gène transitoire efficace chez le soja. Nous rapportons ici un protocole simple pour la préparation des protoplastes de soja et sa demande d’analyses fonctionnelles en régime transitoire. Nous avons constaté que les jeunes feuilles unifoliées de semis de soya résulte en grande quantité des protoplastes de haute qualité. En optimisant une méthode de transformation PEG-calcium-négociée, nous avons atteint l’efficacité de transformation élevés à l’aide de protoplastes unifoliées soja. Ce système fournit un modèle efficace et polyvalent pour l’examen des mécanismes de réglementation et signalisation complexes dans les cellules de soja direct et peut aider à mieux comprendre divers processus cellulaires, physiologiques et du développement des légumineuses.
Introduction
Les protoplastes sont des cellules végétales qui ont enlevé les parois cellulaires. Qu’ils conservent la plupart des fonctions et activités des cellules végétales, les protoplastes sont un système de bon modèle d’observer et d’évaluer les divers événements cellulaires et sont des outils précieux pour étudier l’hybridation somatique1 et2de la régénération des plantes. Protoplastes ont été également largement utilisés pour usine de transformation3,4,5, puisque les parois cellulaires bloquerait sinon le passage de l’ADN dans la cellule. Les protoplastes possèdent certaines des réponses physiologiques et des processus cellulaires des plantes intactes, offrant ainsi une valeur fondamentale dans la recherche fondamentale pour étudier les protéines subcellulaire localisation6,7,8, interactions de protéine-protéine9,10et promoteur activité11,12,13 en vivent les cellules.
L’isolement de protoplastes végétaux a été pour la première fois en 196014 et les protocoles d’isolement et de transformation des protoplastes ont été développés et optimisés. Une procédure normalisée d’isolement de protoplastes implique le découpage des feuilles et la digestion enzymatique des parois cellulaires, suivi par séparation des protoplastes libérés de débris tissulaires non digérés. Stratégies de transformation comprend électroporation15,16, microinjection17,18et à base de polyéthylène glycol (PEG)4,5,19 méthodes. Un large éventail d’espèces ont été signalées avec succès pour l’isolement de protoplastes, y compris les agrumes20, Brassica21, Solanaceae22 et autres plantes ornementales familles23,24. Tandis que les types de tissus différents sont utilisés dans diverses espèces, un système d’expression transitoire dans Arabidopsis protoplast de mésophylle (TEAMP) isolé des feuilles de la plante modèle Arabidopsis thaliana a été bien établi25 et largement adopté pour diverses applications.
Soja (Glycine max (L.) Merr.) est l’une des plus importantes protéines et huile cultures26. À la différence des Arabidopsis et le riz, obtention de plants de soja transgénique est connu pour être plutôt difficile et faible efficacité. Agrobacterium tumefaciens-médiation infiltration a été populairement utilisée pour des études d’expression génétique transitoire dans les cellules épidermiques en tabac27 et semis dans Arabidopsis28,29, alors que Agrobacterium rhizogenes a été utilisé pour la transformation des racines velues en soja30. Les silencieux approches gène induite par le virus ont été utilisés pour downregulation de cible gènes31,32 et transitoires expression33 de façon systémique. Protoplastes fournissent une alternative utile et polyvalente à ces approches. Les protoplastes peuvent provenir de matériaux hors sol de soja et permettent l’expression du transgène rapide et synchronisée. Cependant, depuis l’isolement succès initial des protoplastes de soja dans les 198334, on a signalé limitée sur l’application des protoplastes de soja35,36,37, 38, principalement en raison des rendements relativement bas de protoplastes de soja.
Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour l’isolement de protoplastes de soja et son application pour des études d’expression génétique transitoire. À l’aide de jeunes feuilles unifoliées de semis de soya, nous avons pu obtenir de grandes quantités de protoplastes vitales en quelques heures. En outre, nous avons optimisé une méthode de transformation PEG-calcium-négociée qui est simple et bon marché pour livrer l’ADN dans des protoplastes de soja à haut rendement.
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Protocol
1. la croissance des plantes
- Semer les graines de soja de 5-10 (82 Williams) dans un pot de 13 cm en serre dans des conditions de jours longs (16 h de lumière à 1 500 µmol m-2 s-1) à 25 ° C sur le mélange de sol personnalisé pour le soya (1:1:1 ratio de sable sol, de perlite et de torpilles).
2. préparation d’ADN plasmidique
- À l’aide d’une pointe de pipette stérile ou un cure-dent, choisir une seule colonie ou stock de glycérol congelés de e. coli portant le plasmide contenant le gène d’intérêt et il inoculer dans 20 mL de milieu liquide de Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques appropriés dans un ballon jaugé de 50 mL.
- Incuber le ballon à 37 ° C durant la nuit sur un agitateur. Récolter les germes par centrifugation de la suspension à 12 000 x g à température ambiante pendant 5 min et jeter le surnageant. Extraire et purifier le plasmide suivant la procédure par le fabricant d’un kit de préparation de plasmide.
3. isolement de protoplastes
- Couper les feuilles unifoliées nouvellement agrandis d’un vieux de 10 jours, semis de soya (Figure 1).
Remarque : Sélection de feuilles à un stade de développement approprié est la clé du succès pour la préparation de protoplastes de soja. Utilisez uniquement des feuilles juste élargis aux premiers stades du développement. Que les feuilles matures, les parois cellulaires deviennent plus difficiles à digérer. - Avec une lame de rasoir fraîche, enlever la nervure centrale des feuilles unifoliées et puis couper les restes dans 0,5 à 1 mm des bandes.
Remarque : Deux feuilles unifoliées digérés dans 10 mL de solution d’enzyme donnera des protoplastes suffisantes pour plus de 10 transformations. - La feuille à l’aide d’une paire de pinces, transfert des bandes immédiatement et délicatement dans 10 mL de solution d’enzyme fraîchement préparée (tableau 1) dans un tube de 15 mL. Infiltration sous vide la feuille bandes pendant 15 min à température ambiante.
- Incuber les bandes de feuilles dans la solution enzymatique avec agitation modérée (40 t/mn) sous une lumière faible pendant 4-6 h à température ambiante. Veiller à ce que la solution enzyme vire au jaune-vert comme les protoplastes sont libérés. Vérifier la solution d’enzyme/protoplastes au microscope (X10).
Remarque : Les protoplastes libérés sont sphériques en forme, tandis que les cellules non digérées ont une forme ovale ou irrégulière. - Transférer les 10 mL de solution d’enzyme/protoplaste dans un tube de 50 mL en versant doucement et ajouter 10 mL de la solution W5 (tableau 1) à température ambiante pour arrêter la digestion. Retourner doucement le tube quelques fois. Verser doucement la solution d’enzyme/protoplastes sur une maille de nylon propre 75 µm placée au dessus d’un tube de 50 mL pour enlever les tissus foliaires non digérés.
- Centrifuger la solution intermédiaire enzyme/protoplastes à 100 x g dans le tube de 50 mL pour 1-2 min à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL sans déranger le culot de protoplastes.
- Remettre en suspension les protoplastes et diluer jusqu'à une concentration de 2 x 105 mL-1 dans une solution W5 réfrigérée à 4 ° C en comptant le nombre de protoplaste sur un Hémacytomètre sous le microscope (x10). Garder les protoplastes sur glace pendant 30 min.
- Centrifuger la suspension à 100 x g pendant 1 à 2 min à température ambiante et retirer doucement la solution W5 en utilisant une pipette 1 mL sans déranger le culot de protoplastes. Remettre en suspension les protoplastes dans la solution MMG (tableau 1) à une concentration de 2 x 105 mL-1 à la température ambiante.
4. transformation de protoplaste
- Faites 100 µL d’extraits de protoplastes (2 x 104 protoplastes à 2 x 105 mL-1) à tubes de microcentrifuge de faible adhérence 1,5 mL utilisant uncut pointes de pipette 200 µL. Placer une aliquote de côté pour servir de témoin négatif. Ajouter 10 µL de plasmide (10 à 20 µg) dans chaque portion aliquote reste de protoplastes.
- Ajouter lentement 110 µL de la solution fraîchement préparée de PEG (tableau 1) sur la paroi interne du tube microtubes 1,5 mL et puis retourner doucement et faites pivoter le tube jusqu'à ce que la solution devienne homogène.
- Incuber le mélange de la transformation à température ambiante pendant 15 min.
- Pour arrêter la transformation, lentement ajouter 400 µL de solution W5 dans le tube de 1,5 mL à température ambiante et retourner doucement le tube jusqu'à ce que la solution devienne homogène. Centrifuger le tube à 100 g pour 1-2 min à température ambiante et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 1 mL de solution WI (tableau 1) dans le tube et remettre en suspension par pipetage doucement 1 ou 2 fois. Ajouter 1 mL de sérum de veau stérile (vol/vol) de 5 % dans chaque puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits à recouvrir la surface et empêcher les protoplastes de coller à la plaque.
- Après quelques secondes, jeter l’aide d’une pipette de sérum de veau. Transférer les protoplastes resuspendues dans un puits de la plaque de culture. Couvrir le plat avec un couvercle.
5. protoplaste incubation et récolte
- Incuber les protoplastes à température ambiante pendant 1 à 2 jours dans l’obscurité.
NOTE : Nous avons constaté que deux-jours d’incubation génère un signal de la protéine fluorescente en général par rapport à un jour d’incubation, et que le signal de la protéine fluorescente peut durer jusqu'à 3-4 jours. - Transférer la solution de protoplastes dans un tube microtubes de 1,5 mL faible adhérence. Centrifuger le tube à 100 x g pendant 1 à 2 min à température ambiante pour récolter des protoplastes. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et transférer 10 µL des protoplastes sur une lame de verre.
- Observer le signal fluorescent sous fluorescence ou microscopie confocale. Utilisez des protoplastes non transformées comme contrôle négatif (aucun signal ne doit être observé).
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Representative Results
Différents organes de soja vieux de 10 jours, ont été testés pour la préparation de protoplaste (Figure 1) et les rendements ont été observés au microscope (Figure 2). Les parois cellulaires de l’hypocotyle et épicotyles sont difficilement digérés, et certaines cellules sont restés attachés les uns aux autres (Figure 2 b, 2C). Cotylédon (Figure 2D) et racine (Figure 2 a), les parois cellulaires ont été retirés que dans une petite partie des cellules. En revanche, un grand nombre des protoplastes ont été observé lorsque unifoliées a été utilisé (Figure 2E-G). Nouvelles, des feuilles unifoliées à différents stades de développement ont été examinées (Figure 2 H). Les deux feuilles unifoliées non expansées et juste élargis a donné lieu à des rendements élevés de protoplastes, la taille des protoplastes de la juste élargi Unifoliée étaient plus uniforme (Figure 2F) que la non expansées unifoliées (Figure 2E). Pour le pleinement développée unifoliées, les parois cellulaires étaient encore intacts dans la plupart des cellules (Figure 2). Nous avons testé des enzymes de digestion de la paroi cellulaire de trois fabricants différents et obtenu des résultats comparables, comme décrit ci-dessus. Se fondant sur ces observations, nous avons conclu que la sélection du matériel végétal a été un facteur crucial et que des feuilles unifoliées juste élargis d’un semis de soya jeunes étaient le meilleur matériel pour la préparation des protoplastes.
Une gamme de différentes quantités de plasmides d’ADN (0,1 µg, 1 µg, 5 µg et 20 µg) a été testée pour l’efficacité de la transformation optimale des protoplastes unifoliées soja (Figure 3 a-D). 20 µg ADN plasmidique a montré la plus grande efficacité de transformation avec plus de taux de transformation de 50 % (Figure 3D), tandis que 0,1 µg a montré la plus basse (moins de 1 %) (Figure 3 a). Nous avons obtenu l’efficacité de la transformation comparable à l’aide de différents kits de purification de l’ADN de trois fabricants. Ce résultat suggère que les plus grandes quantités d’ADN plasmidique aiderait considérablement à augmenter l’efficacité de la transformation.
La figure 4 est images confocales de protoplastes de soja transformés avec construction p2GWF7-E1, qui exprime la GFP fusionnée au gène de la légumineuse spécifique E1 (Glyma.06G207800), conduit par le promoteur CaMV 35 s dans le vecteur p2GWF7 39. protéine de fusion de GFP-E1 montre localisation nucléaire de protoplastes de soja, qui est conforme à une étude antérieure à l’aide de l’Arabidopsis protoplast système40. Étant donné que E1 est un gène spécifique légumineuse, notre résultat en utilisant le système de protoplastes de soja jette un regard concluant dans la localisation subcellulaire des protéines E1.
Figure 1. Illustration montrant les organes d’un semis de soja qui sont testés pour la préparation des protoplastes dans cette étude, y compris les racines, hypocotyle, cotylédon épicotyle et unifoliées. Après une paire de feuilles unifoliées, semis de soya développent des feuilles trifoliées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Cellules de protoplastes préparés à partir de différents organes et des stades de développement des semis de soya. (A-D) Préparé de cellules de différents organes du vieux de 10 jours, semis de soya : racine (A), hypocotyle (B), épicotyle (C), cotylédon (D). (E-G) Cellules de protoplastes préparés à partir des feuilles unifoliées à différents stades de développement : non expansée (E), juste élargi (F) et entièrement déployées (G) unifoliées, correspondant pour les semis de soya en (H) à gauche, milieu et à droite, respectivement. La barre d’échelle est 25 µm (A-G) ou 25 mm (H). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Images confocales montrant l’efficacité de transformation du soja des protoplastes unifoliées avec différentes quantités d’ADN plasmidique. Images de GFP (représentées en vert) et lumineux champ (gris) sont fusionnées. Les protoplastes ont été transformées avec différentes quantités du plasmide p2GWF7-E1 : 0,1 µg (A), 1 µg (B), 5 µg (C) et 20 µg (D). Signal de fluorescence de la GFP a été surveillée 24 heures après transformation en microscopie. La barre d’échelle noire est 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Images confocales montrant la localisation subcellulaire de E1-GFP dans le noyau du soja protoplastes unifoliées. Le plasmide p2GWF7-E1 a été utilisé pour la transformation. Images de GFP (représentées en vert) et lumineux champ (gris) sont fusionnées. Signal de fluorescence de la GFP a été surveillée 24 heures après transformation. La barre d’échelle noire est 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Solution d’enzyme (fraîchement préparée) | |
| MES, pH 5,7 | 20mM |
| Cellulase CELF | 2 % (p/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0,1 % (p/v) |
| Mannitol | 0,75 M |
| CaCl2 | 0. 2 mM |
| BSA | 0,1 % (p/v) |
| TNT | 0,5 mM |
| Solution de W5 | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5,7 | 2 mM |
| Solution de MMg | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Mannitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| Solution de PEG (fraîchement préparée) | |
| PEG4000 | 20 % (p/v) |
| Mannitol | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| Solution WI | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Mannitol | 0. 5 M |
| KCl | 20 mM |
Le tableau 1. Solutions utilisées pour la transformation et l’isolement de protoplastes de soja.
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Discussion
Ce protocole pour l’isolement de protoplastes de soja et de l’application aux études d’expression transitoire a été testé et fonctionne très bien dans notre laboratoire. Les procédures sont simples et faciles et nécessitent des équipements ordinaires et coût minimum. Notre protocole génère de grandes quantités de protoplastes uniforme et de grande qualité par rapport aux méthodes rapportées antérieurement34,35,36,37,38. Cependant, puisqu’il y a plusieurs facteurs qui affectent les rendements de protoplastes et taux de transformation, il est fortement recommandé pour les chercheurs à optimiser les conditions selon leurs conditions expérimentales, des résultats souhaitables et des matériaux utilisés. Alors que ce système est extrêmement utile pour l’examen des événements immédiates de réglementation et biochimiques chez les cellules végétales, il n’est pas adapté pour l’observation des processus cellulaires à long terme et les événements qui se produisent au niveau organismique ou de tissu.
Nous avons trouvé que la sélection des matières végétales à croissance vigoureuse à un stade de développement idéal était le facteur le plus crucial dans la préparation de protoplastes de soja. Il détermine non seulement les rendements des protoplastes, mais qualité qui touche la transformation ultérieure de l’ADN. Il est important de toujours pousser des plants de soya dans un environnement constant loin de tout stress, comme la sécheresse, des inondations, des températures extrêmes ou parasites. La plus grande efficacité de production et de transformation de protoplaste est possible en utilisant des feuilles unifoliées juste élargis de jeunes plantes. Pour les débutants, il est suggéré d’utiliser des feuilles unifoliées à différents stades de développement et effectuer une comparaison afin d’obtenir les meilleurs résultats.
Ratio de protoplastes/ADN est un facteur important pour l’efficacité de la transformation optimale. Il est généralement préférable de commencer avec le ratio de 2 x 104 protoplastes/10-20 µg ADN, mais l’optimisation du ratio pour les constructions individuelles est recommandé25. L’utilisation d’ADN obtenu par un kit de purification de l’ADN de haute qualité est fortement recommandée.
Pour le choix des vecteurs d’expression transitoire de protoplastes, nombre de haut-copies et vecteurs de petite taille sont généralement préférées. Bien que binaire, vecteurs d’Agrobacterium tumefaciens-transformation médiée par des plantes peut être utilisé pour la transformation de protoplaste, la grande taille de ces vecteurs peut entraîner moins d’efficacité optimale de transformation. Pour l’expression de la protéine GFP-fusion, nous employons habituellement des vecteurs qui ne possèdent pas un marqueur de sélection des plantes et sont donc relativement faible (6-7 Ko), tels que p2GWF7 et p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Multiples vecteurs peuvent être utilisées pour transformer les protoplastes simultanément. Nous avons eu des succès pour exprimer les vecteurs BiFC pour tester les interactions protéine-protéine, ainsi que plusieurs protéines fluorescentes pour organite et le marquage subcellulaires protoplastes de soja. En outre, la simplicité et des rendements élevés de notre méthode offre un système idéal pour l’examen des événements biochimiques et réglementation, conception de vecteur-ciblage de gènes, isolement des protéines exprimées de façon transitoire et complexe protéique et la purification du particulier organites comme les noyaux, permettant aux autres applications de nouvelles génomiques et protéomiques s’approche.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme de recherche de génome de plante de la National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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