Summary
Wir entwickelten ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung großer Mengen von Soja Protoplasten, komplexe regulatorische und Signalisierung Mechanismen in lebenden Zellen zu studieren.
Abstract
Sojabohne (Glycine max (L.) GESEG.) ist eine wichtige Kulturarten und eine Hülsenfrucht-Modell für das Studium der genetischen und biochemischen Wege geworden. Daher ist es wichtig, eine effiziente transiente gen Expressionssystems in Soja zu etablieren. Hier berichten wir ein einfaches Protokoll für die Vorbereitung der Sojabohne Protoplasten und seinen Antrag auf vorübergehende Funktionsanalysen. Wir fanden, dass große Mengen an hochwertigen Protoplasten jungen unifoliate Blätter aus Soja-Keimlingen führte. Durch die Optimierung der PEG-Kalzium-vermittelten Transformationsmethode, erreichten wir hohe Transformationseffizienz mit Soja unifoliate Protoplasten. Dieses System bietet ein effiziente und vielseitige Modell für die Prüfung von komplexen regulatorischen und Signalisierung Mechanismen im live Soja Zellen und können helfen besser zu verstehen, diverse zelluläre, Entwicklungsstörungen und physiologische Prozessen von Leguminosen.
Introduction
Protoplasten sind Pflanzenzellen, die Zellwände entfernt haben. Sie pflegen die meisten Funktionen und Aktivitäten von Pflanzenzellen, Protoplasten sind ein gutes Modellsystem zur Beobachtung und Auswertung der vielfältigen zelluläre Ereignisse, und wertvolle Tools für die somatische Hybridisierung1 zu studieren und Werk Regeneration2. Protoplasten wurden für Werk Verwandlung3,4,5, ebenfalls weit verbreitet genutzt, da Zellwände sonst den Durchgang von DNA in die Zelle blockieren würde. Protoplasten besitzen einige der physiologischen Reaktionen und zelluläre Prozesse der intakten Pflanzen, daher bietet Grundwert in der Grundlagenforschung, Protein subzelluläre Lokalisation6,7,8zu studieren, Protein-Protein Interaktionen9,10und Promotor-Aktivität11,12,13 in Leben Zellen.
Die Isolation der Pflanze Protoplasten wurde erstmals 196014 gemeldet und die Protokolle für Isolation und Transformation von Protoplasten entwickelt und optimiert wurden. Ein Standardverfahren der Protoplasten Isolation beinhaltet das Schneiden der Blätter und enzymatische Verdauung der Zellwände, gefolgt von Trennung von freigegebenen Protoplasten von Gewebe nicht verdaut Schutt. Transformationsstrategien umfasst Elektroporation15,16, Mikroinjektion17,18und Polyethylenglykol (PEG)4,5,19 Methoden. Eine Vielzahl von Arten gemeldet wurden erfolgreich für die Protoplasten Isolierung, einschließlich Zitrusfrüchte20, Brassica21, Solanaceae22 und anderen Zierpflanzen Familien23,24. Während verschiedene Gewebetypen in verschiedenen Arten verwendet werden, wurde ein System von transienten Expression in Arabidopsis Mesophyll Protoplasten (TEAMP) aus den Blättern der Modellpflanze Arabidopsis Thaliana isoliert gut etablierte25 und weit verbreiteten für vielfältige Anwendungen.
Sojabohne (Glycine max (L.) GESEG.) gehört zu den wichtigsten Protein und Öl Nutzpflanzen26. Im Gegensatz zu Arabidopsis und Reis transgene Sojapflanzen zu erhalten gilt eher schwierig und geringe Effizienz. Agrobacterium Tumefaciens-vermittelten Infiltration ist im Volksmund für transiente Genexpressionsstudien in der Epidermiszellen in Tabak27 und Sämlinge in Arabidopsis28,29, verwendet worden, während Transformation von behaarten Wurzeln in Soja30 Agrobacterium Rhizogenes bestritten. Virusbedingte Gen-Silencing-Ansätze wurden für Herabregulation von Ziel Gene31,32 und transiente Expression33 in einer systematischen Art und Weise genutzt. Protoplasten bieten eine wertvolle und vielseitige Alternative zu diesen Ansätzen. Protoplasten können Soja die oberirdische Materialien entnommen werden und ermöglichen schnelle und synchronisierte Transgene Ausdruck. Jedoch, seit die erste erfolgreiche Isolierung der Sojabohne Protoplasten in 198334gab es nur Berichte über die Anwendung von Protoplasten in Soja35,36,37, 38, in erster Linie aufgrund der relativ niedrigen Erträgen von Soja Protoplasten.
Hier beschreiben wir eine einfache und effiziente Protokoll für die Isolierung von Soja Protoplasten und seinen Antrag auf vorübergehende Genexpressionsstudien. Junge unifoliate Blätter aus Soja-Keimlingen konnten wir große Mengen an lebenswichtigen Protoplasten innerhalb weniger Stunden zu erhalten. Darüber hinaus haben wir einen PEG-Kalzium-vermittelten Transformationsmethode optimiert, die einfache und kostengünstige, DNA in Soja Protoplasten mit hohem Wirkungsgrad zu liefern ist.
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Protocol
1. Wachstum der Pflanzen
- Säen von 5-10 Soja (Williams 82) in einem 13 cm-Topf im Gewächshaus unter Bedingungen der langen Tage (16 h Licht bei 1.500 µmol m-2 s-1) bei 25 ° C auf die benutzerdefinierte Erdmischung für Soja (1:1:1 Verhältnis von Erde, Perlite und Torpedo Sand).
2. Vorbereitung von Plasmid DNA
- Mit einem sterilen Pipettenspitze oder Zahnstocher, wählen Sie eine einzelne Kolonie oder gefrorenen Glycerin Lager von E. Coli tragen das Plasmid enthält das gen des Interesses und in 20 mL Luria-Bertani (LB) flüssigen Medium mit geeigneten Antibiotika in ein 50 mL Fläschchen zu impfen.
- Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C über Nacht in einen Shaker geben. Sammeln Sie die Bakterien, indem die Federung bei 12.000 x g bei Raumtemperatur für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verworfen. Extrahieren Sie und zu reinigen Sie das Plasmid des Herstellers Verfahren ein Plasmid Prep Kit.
(3) Protoplasten Isolierung
- Schneiden Sie neu erweiterten unifoliate Blätter von 10 - Tage alten Sojabohnen Keimlinge (Abbildung 1).
Hinweis: Auswahl von Blättern in einer entsprechenden Entwicklungsstadium ist der Schlüssel zum Erfolg für Sojabohnen Protoplasten Vorbereitung. Verwenden Sie nur gerade erweitert Blätter in frühen Entwicklungsstadien. Als ältere Blätter werden Zellwände schwieriger um zu verdauen. - Mit einer frischen Rasierklinge entfernen der Mittelrippe aus der unifoliate Blatt und dann schneiden Sie die Reste in 0,5-1 mm Streifen.
Hinweis: Zwei unifoliate Blätter in 10 mL Enzymlösung verdaut geben ausreichende Protoplasten für mehr als 10 Transformationen. - Das Blatt Streifen mit einer Zange, Transfer sofort und sanft in 10 mL frisch zubereitete Enzymlösung (Tabelle 1) in der 15 mL Tube. Vakuum Infiltrat Streifen das Blatt für 15 min bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Blatt-Streifen in der Enzymlösung mit sanften Agitation (40 u/min) unter schlechten Lichtverhältnissen für 4-6 h bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass das Enzymlösung Gelb-Grün dreht, da Protoplasten veröffentlicht werden. Überprüfen Sie die Enzym/Protoplasten Lösung unter dem Mikroskop (X10).
Hinweis: Die veröffentlichten Protoplasten sind kugelförmige geprägt, während die unverdauten Zellen unregelmäßig oder ovale Form haben. - Übertragen Sie die 10 mL der Lösung Enzym/Protoplasten in einem 50 mL-Tube vorsichtig gießen und 10 mL W5 Lösung (Tabelle 1) bei Raumtemperatur, die Verdauung zu stoppen. Invertieren Sie das Rohr sanft ein paar Mal. Füllen Sie vorsichtig die Enzym/Protoplasten Lösung auf eine saubere 75 µm-Nylon-Mesh platziert eine 50 mL-Tube, unverdaute Blatt Gewebe zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie durchströmten Enzym/Protoplasten Lösung bei 100 X g in der 50 mL Tube für 1-2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer serologischen 10 mL-Pipette ohne störende Protoplasten Pellet.
- Die Protoplasten Aufschwemmen und zu einer Konzentration von 2 x 105 mL-1 in gekühlten W5-Lösung bei 4 ° C von Protoplasten zählen auf eine Hemacytometer unter dem Mikroskop (x10) verdünnen. Halten Sie die Protoplasten für 30 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die Suspension 100 X g für 1-2 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig die W5-Lösung mit einer 1-mL-Pipette ohne störende Protoplasten Pellet. Aufschwemmen der Protoplasten in MMG Lösung (Tabelle 1) in einer Konzentration von 2 x 105 mL-1 bei Raumtemperatur.
4. Protoplasten transformation
- Machen Sie 100 µL-Aliquots von Protoplasten (2 x 104 Protoplasten bei 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL geringe Haftung Mikrozentrifugenröhrchen mit unbeschnittenen 200 µL Pipettenspitzen. Setzen Sie eine aliquote beiseite, um als negative Kontrolle dienen. Fügen Sie 10 µL Plasmid (10-20 µg) in jede der übrigen aliquoten von Protoplasten.
- Fügen Sie langsam 110 µL frisch zubereitete PEG-Lösung (Tabelle 1 hinzu) an der Innenwand der 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, und dann invertieren Sie sanft zu und drehen Sie das Rohr, bis die Lösung homogen wird.
- Inkubieren Sie die Verwandlung-Mischung bei Raumtemperatur für 15 min.
- Um die Transformation zu stoppen, der 1,5 mL Tube bei Raumtemperatur langsam 400 µL W5-Lösung hinzu und invertieren Sie das Rohr sanft zu, bis die Lösung homogen wird. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 g für 1-2 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette zu.
- Das Rohr 1 mL WI-Lösung (Tabelle 1) hinzu und Aufschwemmen von 1-bis 2-mal sanft pipettieren. Fügen Sie 1 mL 5 % (Vol/Vol) sterile Kälberserum in jede Vertiefung einer Gewebekultur 6-Well-Platte Beschichten der Oberfläche zu verhindern, dass die Protoplasten festhalten an der Platte.
- Verwerfen Sie nach ein paar Sekunden die Kälberserum mit einer Pipette. Die resuspendierte Protoplasten in einen Brunnen der Kultur-Platte zu übertragen. Die Platte mit einem Deckel abdecken.
5. Protoplasten Inkubation und Ernte
- 1-2 Tage im Dunkeln inkubieren Sie die Protoplasten bei Raumtemperatur.
Hinweis: Wir fanden, dass zwei Tagen Inkubation stärkeren fluoreszierendes Protein-Signal in der Regel im Vergleich zu einem eintägigen Inkubation ergibt und das fluoreszierende Protein-Signal für bis zu 3-4 Tage dauern kann. - Übertragen Sie die Protoplasten-Lösung auf einem 1,5 mL geringe Haftung Microcentrifuge Schlauch. Zentrifugieren Sie das Rohr 100 X g für 1-2 min bei Raumtemperatur Protoplasten zu ernten. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und übertragen Sie 10 µL Protoplasten auf einen Objektträger.
- Fluoreszenzsignal unter Fluoreszenz oder der konfokalen Mikroskopie zu beobachten. Verwenden Sie nicht-transformierten Protoplasten als Negativkontrolle (kein Signal sollte eingehalten werden).
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Representative Results
Verschiedene Organe des 10 - Tage alten Sojabohnen für Vorbereitung der Protoplasten (Abbildung 1) getestet wurden und Erträge beobachtet, unter dem Mikroskop (Abbildung 2). Zellwände aus Keimachse und Epicotyl waren kaum verdaut, und einige Zellen geblieben (Abbildung 2 b, 2 C) miteinander verbunden. Im Keimblatt (Abb. 2D) und Wurzel (Abbildung 2A) wurden die Zellwände nur in einem kleinen Teil der Zellen entfernt. Im Gegensatz dazu eine große Anzahl von Protoplasten beobachtet wurden, als unifoliate war (Abbildung 2E-G) verwendet. Unifoliate Blätter in unterschiedlichen Entwicklungsstadien wurden weiter untersucht (Abb. 2 H). Während die unexpanded und nur erweiterte unifoliate Blätter in hohe Erträge von Protoplasten geführt, die Größe des Protoplasten von nur erweiterte unifoliate waren mehr Uniform (Abb. 2F) als unausgebreiteten unifoliate (Abb. 2E). Für den voll entfalteten waren unifoliate, die Zellwände noch intakt in den meisten Zellen (Abbildung 2). Wir testeten Zellwand-Verdauung Enzyme von drei verschiedenen Herstellern und vergleichbare Ergebnisse erhalten, wie oben beschrieben. Aufgrund dieser Beobachtungen, schlossen wir, dass Auswahl von Pflanzenmaterial ausschlaggebend war und nur erweiterte unifoliate Blätter von jungen Sojabohnen Keimlinge das beste Material für Protoplasten Vorbereitung waren.
Eine Reihe von unterschiedlichen Mengen von Plasmid DNA (0,1 µg, 1 µg, 5 µg und 20 µg) wurde für optimale Transformationseffizienz von Soja unifoliate Protoplasten (Abb. 3A-D) getestet. 20 µg Plasmid DNA zeigte die höchste Transformationseffizienz mit mehr als 50 % Transformationsrate (Abbildung 3D), während die niedrigste 0,1 µg zeigte (weniger als 1 %) (Abb. 3A). Wir erhalten vergleichbare Transformationseffizienz mit verschiedenen DNA-Reinigung-Kits von drei Herstellern. Dieses Ergebnis legt nahe, dass größere Mengen von Plasmid DNA erheblich dazu beitragen würde, um die Transformationseffizienz zu erhöhen.
Abbildung 4 ist konfokale Bilder von Soja Protoplasten verwandelt mit Konstrukt p2GWF7-E1, die GFP verschmolzen mit der Hülsenfrucht-spezifische gen E1 (Glyma.06G207800), angetrieben von der CaMV 35 s -Promoter in den Vektor p2GWF7 ausdrückt 39. E1-GFP Fusionsprotein zeigt nuklearen Lokalisierung in Soja Protoplasten, die steht im Einklang mit einer früheren Studie mit Arabidopsis Protoplasten System40. Angesichts der Tatsache, dass E1 eine Hülsenfrucht-spezifische gen ist, bietet unser Ergebnis mit dem Soja Protoplasten System einen schlüssigen Einblick in die subzelluläre Lokalisation des E1-Protein.
Abbildung 1: Darstellung, die die Organe eines Keimlings Sojabohnen, die getestet werden Protoplasten Vorbereitung in dieser Studie, einschließlich der Wurzel, Keimachse, Samenlappen, Epicotyl und unifoliate. Nach ein paar unifoliate Blätter entwickeln Sojabohnen Keimlinge zählig Blätter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Protoplasten Zellen aus verschiedenen Organen und Entwicklungsstadien der Sojabohnen Keimlinge vorbereitet. (A-D) Zellen aus verschiedenen Organen der 10 - Tage alten Sojabohnen Keimlinge vorbereitet: root (A), Keimachse (B), Epicotyl (C), Samenlappen (D). (E-G) Protoplasten Zellen aus unifoliate Blätter in unterschiedlichen Entwicklungsstadien vorbereitet: unexpanded (E), nur (F) erweitert und vollständig erweitert (G) unifoliate, entspricht die Sojabohnen Keimlinge in (H) links, Mitte und rechts, beziehungsweise. Der Maßstab ist 25 µm (A-G) oder 25 mm (H). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Konfokale Bilder zeigen Transformationseffizienz Sojabohnen unifoliate Protoplasten mit unterschiedlichen Mengen von Plasmid DNA. Bilder der GLP (grün dargestellt) und hellen Bereich (grau) zusammengeführt werden. Protoplasten verwandelten sich mit unterschiedlichen Mengen des Plasmids p2GWF7-E1: 0,1 µg (A), 1 µg (B), 5 µg (C) und 20 µg (D). Fluoreszenzsignal des GFP wurde 24 Stunden nach der Transformation unter Mikroskopie überwacht. Der schwarze Maßstabsbalken ist 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Konfokale Bilder zeigen die subzelluläre Lokalisation der E1-GLP im Nucleus Soja unifoliate Protoplasten. Das Plasmid p2GWF7-E1 wurde für die Transformation verwendet. Bilder der GLP (grün dargestellt) und hellen Bereich (grau) werden zusammengeführt. Fluoreszenzsignal des GFP wurde 24 Stunden nach der Transformation überwacht. Der schwarze Maßstabsbalken ist 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Enzymlösung (frisch zubereitet) | |
| MES, pH 5,7 | 20mM |
| Cellulasen CELF | 2 % (w/V) |
| Pectolyase Y-23 | 0,1 % (w/V) |
| Mannit | 0,75 M |
| CaCl2 | 0,2 mM |
| BSA | 0,1 % (w/V) |
| DVB-T | 0,5 mM |
| W5-Lösung | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5,7 | 2 mM |
| MMg-Lösung | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Mannit | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| PEG-Lösung (frisch zubereitet) | |
| PEG4000 | 20 % (w/V) |
| Mannit | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| WI-Lösung | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Mannit | 0,5 M |
| KCl | 20 mM |
Tabelle 1. Lösungen für Sojabohnen Protoplasten Isolierung und Transformation verwendet.
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Discussion
Dieses Protokoll für die Isolierung von Soja Protoplasten und die Anwendung auf transiente Expression Studien wurde gründlich getestet und funktioniert sehr gut in unserem Labor. Die Verfahren sind einfach und leicht und erfordern ordentliche Ausrüstung und minimalen Kosten. Unser Protokoll liefert große Mengen an gleichbleibende hohe Qualität Protoplasten im Vergleich zu bereits gemeldeten Methoden34,35,36,37,38. Aber da gibt es viele Faktoren, die Protoplasten Erträge und Transformation Preise beeinflussen, wird es dringend empfohlen für Forscher, die Bedingungen, nach experimentellen Bedingungen, wünschenswerte Ergebnisse und verwendeten Materialien zu optimieren. Während dieses System äußerst nützlich für die Untersuchung der unmittelbaren Regulierungs- und biochemische Ereignisse in pflanzlichen Zellen ist, eignet sie sich nicht für die Beobachtung der langfristigen zelluläre Prozesse und Ereignisse, die im Gewebe oder organismal Ebenen auftreten.
Wir fanden, dass die Auswahl der kräftig wachsenden pflanzlichen Rohstoffen in eine ideale Entwicklungsstadium der entscheidende Faktor bei der Sojabohne Protoplasten Vorbereitung war. Es bestimmt nicht nur die Erträge des Protoplasten, sondern Qualität, die die anschließende DNA-Transformation betrifft. Es ist wichtig, immer Sojapflanzen in eine konstante Umwelt Weg von jeglichem Stress, wie z. B. Dürre, Überschwemmungen, extreme Temperaturen oder Schädlinge wachsen. Die höchste Effizienz der Protoplasten Ertrag und Transformation kann nur erweiterte unifoliate Blätter von Jungpflanzen mit erreicht werden. Für Anfänger wird es vorgeschlagen, unifoliate Blätter in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und machen einen Vergleich die besten Ergebnisse zu erzielen.
Protoplasten/DNA-Verhältnis ist ein wichtiger Faktor für optimale Transformationseffizienz. Es ist in der Regel am besten zunächst das Verhältnis von 2 x 104 Protoplasten/10-20 µg DNA, aber Optimierung des für einzelne Konstrukte25empfohlen wird. Der Einsatz von hochwertigen DNA erhalten durch ein DNA-Reinigung-Kit wird dringend empfohlen.
Bei der Wahl der Vektoren für transiente Expression in Protoplasten sind hohe Kopienzahl und kleine Vektoren im Allgemeinen bevorzugt. Obwohl binäre für Agrobacterium Tumefaciens Vektoren-vermittelten Transformation von Pflanzen für die Protoplasten Transformation verwendet werden, die Größe dieser Vektoren kann weniger optimale Transformationseffizienz führen. Für GLP-Fusion-Protein-Expression verwenden wir in der Regel Vektoren, die kein Selektionsmarker für Pflanzen und sind somit relativ klein (ca. 6-7 kb), wie p2GWF7 und p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be) besitzen.
Mehreren Vektoren können verwendet werden, um Protoplasten gleichzeitig zu verwandeln. Wir hatten Erfolg BiFC Vektoren für die Prüfung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, sowie mehrere fluoreszierende Proteine für Organellen und subzelluläre Beschriftung in Soja Protoplasten zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus bietet Einfachheit und große Erträge unserer Methode ein ideales System zur Prüfung von Regulierungs- und biochemischen Ereignisse, gen-targeting Vektor-Design, Isolierung der Transient exprimierten Proteinen und Protein-komplex und Reinigung des spezifischen Organellen wie Kerne, weitere Anwendungen auf Schwellen-Genomik und Proteomik nähert.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Pflanze Genome Research Program von der National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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