Summary
פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.
Abstract
סויה (מקסימום גליצין (ל') עליזה משחק.) הוא מין חשוב חיתוך, הפך למודל קטניות המחקרים של מסלולים גנטי וביוכימי. לכן, חשוב להקים מערכת ביטוי גנים ארעי יעיל סויה. כאן, אנו מדווחים פרוטוקול פשוט להכנת protoplasts סויה ויישומו עבור ניתוחים פונקציונליים ארעית. מצאנו כי צעיר עוזב unifoliate של סויה שתילים, גרמו כמויות גדולות של protoplasts באיכות גבוהה. על-ידי מיטוב שיטה פג סידן-בתיווך טרנספורמציה, השגנו יעילות המרה גבוהה באמצעות protoplasts unifoliate סויה. מערכת זו מספקת מודל רב תכליתי ויעיל לבדיקה של מנגנונים מורכבים איתות ולניהולו בתאים חיים סויה, עזרה טוב יותר להבין תהליכים מגוונים הסלולר, התפתחותית, פיזיולוגיים של קטניות.
Introduction
Protoplasts הם תאי הצמח יש קירות התא הוסר. ככל שישמרו על רוב תכונות ופעילויות של תאי צמחים, protoplasts הם מערכת מודל טוב להתבונן ולהעריך מגוון אירועים הסלולר, הם כלי רב ערך מחקר סומאטית hybridisation1 ולשתול התחדשות2. Protoplasts כבר נעזרו גם נרחב צמח טרנספורמציה3,4,5, שכן קירות התא אחרת לחסום את המעבר של ה-DNA בתא. Protoplasts מחזיקים חלק התגובות הפיזיולוגיות, תהליכים תאיים של צמחים שלמים, ולכן מציע ערך יסוד במחקר בסיסי ללמוד חלבון subcellular לוקליזציה6,7,8, 9,אינטראקציות חלבון-חלבון10ויזם פעילות11,12,13 חיים תאים.
בידודו של צמח protoplasts דווחה לראשונה בשנת 196014 , הפרוטוקולים עבור בידוד והן טרנספורמציה של protoplasts יש פותחה, אופטימיזציה. תהליך סטנדרטי של בידוד פרוטופלאסט כרוך החיתוך של עלים עיכול אנזימטי של קירות התא, ולאחריה הפרדת protoplasts המשוחררים פסולת רקמות שאינו מתעכל. אסטרטגיות שינוי כולל אלקטרופורציה15,16,17,microinjection18ושיטות מבוסס-פוליאתילן גליקול (PEG)4,5,19 . מגוון רחב של מינים דווחו מוצלחת פרוטופלאסט בידוד, כולל הדרים20, כרוב21, סולניים22 ו23,משפחות אחרות צמח נוי24. בעוד סוגי רקמות מגוונות משמשים במינים שונים, מערכת של ביטוי ארעי תודרנית פרוטופלאסט mesophyll (TEAMP) מבודד מן העלים של צמח מודל תודרנית לבנה כבר וותיקה25 אומץ באופן נרחב ליישומים מגוונים.
סויה (מקסימום גליצין (ל') עליזה משחק.) הוא אחד של חלבון חשוב ביותר, שמן גידולי26. בניגוד תודרנית , אורז, קבלת הצמחים הטרנסגניים סויה ידועה להיות קשה למדי ויעילות הנמוכה. Agrobacterium tumefaciens-חדירה בתיווך העממי שימש במשך הלימודים ביטוי גנים ארעי התאים באפידרמיס טבק27 שתילים תודרנית28,29, ואילו Agrobacterium rhizogenes שימש במשך טרנספורמציה של שורשים שעירים סויה30. גישות שתיקה הנוצרות על-ידי וירוס הגן כבר נעזרו downregulation של היעד גנים31,32 ו ארעי ביטוי33 באופן מערכתי. Protoplasts לספק אלטרנטיבה יקר ופסיביות הגישות האלה. Protoplasts ניתן להשיג חומרים מעל פני הקרקע של סויה ומאפשרים ביטוי transgene מהירה ומסונכרן. עם זאת, הבידוד מוצלח הראשונית של סויה protoplasts בשנת 198334, מאז דוחות מוגבלת על היישום של protoplasts ב סויה35,36,37, 38, בעיקר בשל תפוקה נמוכה יחסית של סויה protoplasts.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור בידוד של סויה protoplasts ויישומו ללימודי ביטוי גנים ארעית. באמצעות צעיר עוזב unifoliate של סויה שתילים, הצלחנו להשיג כמויות גדולות של protoplasts חיוני תוך מספר שעות. בנוסף, אנו יש אופטימיזציה שיטה טרנספורמציה פג סידן-בתיווך פשוט וניתן בעלות נמוכה כדי לספק את ה-DNA לתוך protoplasts סויה עם יעילות גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הגידול של הצמחים
- לזרוע זרעי סויה 5-10 (82 וויליאמס) בתוך סיר 13 ס מ בחממה בתנאים היום (16 h אור 1,500 µmol m s-2 -1) 25 ° c-תערובת אדמה מותאם אישית עבור סויה (1:1:1 יחס של חול אדמה, פרליט, טורפדו).
2. הכנת פלסמיד דנ א
- באמצעות פיפטה סטרילי עצה או קיסם, בחר שמושבה בודדת או גליצרול קפואים מלאי של e. coli נושאת את פלסמיד המכיל את הגן עניין, לחסן אותו 20 מ"ל לוריא-Bertani (LB) בינוני נוזלי באנטיביוטיקה המתאימה בבקבוקון 50 מ.
- דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מטרף. לאסוף את החיידקים על ידי צריך שתוציאו את המתלים ב g x 12,000 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ומחיקת את תגובת שיקוע. תמצית ולטהר את פלסמיד הליך של היצרן של ערכת ההכנה פלסמיד.
3. פרוטופלאסט בידוד
- חותכים את העלים unifoliate שהורחבו זה מכבר מן סויה 10 - בן יום שתילים (איור 1).
הערה: מבחר עלים בשלב ההתפתחותי המתאים הוא המפתח להצלחת להכנה פרוטופלאסט סויה. השתמש רק עלים רק מורחב בשלבים התפתחותיים מוקדם. עלים בוגרים, קירות התא להיות קשה יותר לעיכול. - עם סכין גילוח טריים, הסר את midrib עלה unifoliate ולאחר מכן לחתוך השאריות לתוך 0.5-1 מ מ רצועות.
הערה: שני עלים unifoliate מתעכל 10 מ ל תמיסת האנזים ייתן protoplasts מספיק להמרות יותר מ-10. - העלה באמצעות זוג מלקחיים, העברת רצועות מיידית ובעדינות לתוך 10 מ"ל של אנזים הטרי פתרון (טבלה 1) צינור 15 מ"ל. לחדור ואקום העלה רצועות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- דגירה את רצועות עלה בהפתרון האנזים עם עצבנות עדין (40 סל ד) תחת אור נמוכה עבור 4-6 שעות בטמפרטורת החדר. ודא כי הפתרון האנזים הופך צהוב, ירוק כמו protoplasts משתחררים. בדוק את הפתרון אנזים/protoplasts תחת המיקרוסקופ (X10).
הערה: protoplasts שפורסמו הם כדורי בצורת, בעוד תאי מעוכל בצורה לא סדירה או אליפסה. - להעביר את 10 מ ל אנזים/פרוטופלאסט פתרון בשפופרת 50 מ על ידי לשפוך בעדינות ולהוסיף 10 מ"ל של W5 פתרון (טבלה 1) בטמפרטורת החדר כדי לעצור את העיכול. בעדינות היפוך הצינור כמה פעמים. יוצקים בעדינות את הפתרון אנזים/protoplasts על רשת ניילון נקייה 75 מיקרומטר להציב על גבי צינור 50 מ ל להסיר רקמות עלים מעוכל.
- Centrifuge הפתרון זרימה דרך האנזים/protoplasts ב g x 100 לשפופרת 50 מ ל 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בעדינות את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל מבלי להפריע בגדר פרוטופלאסט.
- Resuspend את protoplasts ו לדלל את ריכוז של 2 x 105 מ ל-1 בפתרון W5 צוננת ב 4 ° C על ידי ספירת מספר פרוטופלאסט hemacytometer תחת המיקרוסקופ (x10). שמור את protoplasts על קרח למשך 30 דקות.
- Centrifuge את המתלים ב g x 100 למשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר בעדינות את הפתרון W5 באמצעות פיפטה 1 מ"ל מבלי להפריע בגדר פרוטופלאסט. Resuspend את protoplasts בתמיסה MMG (טבלה 1)-ריכוז של 2 x 105 מ ל-1 בטמפרטורת החדר.
4. פרוטופלאסט טרנספורמציה
- להפוך 100 aliquots µL של protoplasts (protoplasts4 עונה 2 פרק 10-2 x 105 מ ל-1) 1.5 מ ל נמוכה אדהזיה microcentrifuge צינורות באמצעות טיפים פיפטה µL 200 נימולים. לשים אחד aliquot הצידה כדי לשמש בקרה שלילית. להוסיף 10 µL של פלסמיד (10-20 µg) לתוך כל אחד aliquot יתר של protoplasts.
- לאט לאט להוסיף µL 110 של פג הטרי פתרון (טבלה 1) על הקיר הפנימי של הצינור microcentrifuge 1.5 mL, ואז בעדינות היפוך, סובב את הצינורית עד הפתרון הופכת הומוגנית.
- דגירה התערובת שינוי בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- כדי לעצור את השינוי, לאט להוסיף 400 µL של פתרון W5 הצינור 1.5 mL בטמפרטורת החדר, היפוך בעדינות את הצינורית עד הפתרון הופך הומוגנית. Centrifuge את הצינור ב- 100 גרם עבור 1-2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה.
- להוסיף 1 מ"ל של פתרון אינטרנט (טבלה 1) הצינור, resuspend על ידי בעדינות pipetting 1 - 2 פעמים. להוסיף 1 מ"ל של נסיוב עגל סטרילי (vol/כרך) 5% כל טוב של צלחת תרביות רקמה 6-ובכן מעיל השטח ולמנוע את protoplasts מפני לצלחת.
- לאחר מספר שניות, למחוק את הנסיוב עגל באמצעות פיפטה. להעביר את protoplasts resuspended לבאר של צלחת תרבות. מכסים את הצלחת עם מכסה.
5. פרוטופלאסט הדגירה והקציר
- תקופת דגירה של protoplasts בטמפרטורת החדר של 1-2 ימים בחושך.
הערה: מצאנו כי שני ימי דגירה התשואות באופן כללי לעומת יום אחד הדגירה האות החזק של חלבון פלואורסצנטי, כי האות חלבון פלואורסצנטי עשוי להימשך עד 3-4 ימים. - להעביר את הפתרון פרוטופלאסט צינור microcentrifuge 1.5 mL אדהזיה נמוכה. Centrifuge את הצינור ב g x 100 למשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר למסוק protoplasts. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה ולהעביר protoplasts 10 µL על זכוכית.
- להתבונן אות ניאון תחת זריחה או מיקרוסקופיה קונפוקלית. להשתמש protoplasts הפך ללא שליטה שלילי (אין אות להתייחס).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איברים שונים של פולי סויה 10 - בן יום נבדקו עבור פרוטופלאסט הכנה (איור 1), התשואות נצפו תחת המיקרוסקופ (איור 2). קירות התא hypocotyl, epicotyl היו בקושי מתעכל, ונשאר כמה תאים המחוברים אחד לשני (איור 2B, 2 ג). Cotyledon (דמות 2D), שורש (איור 2 א), קירות התא הוסרו רק בחלק קטן של התאים. לעומת זאת, נצפו מספר רב של protoplasts unifoliate היה בשימוש (איור 2E-G). עלים unifoliate בשלבים התפתחותיים שונים היו נוספים שנבדקו (איור 2 H). בעוד שני מבקשה ומורחבת רק unifoliate העלים, גרמו תפוקה גבוהה של protoplasts, גודל protoplasts מ המורחב רק unifoliate היו יותר אחיד (איור 2F) מאשר מבקשה unifoliate (2E איור). עבור המורחב באופן מלא unifoliate, קירות התא היו עדיין שלם ברוב התאים (איור 2G). נבדק אנזימים לעיכול דופן התא של שלושה יצרנים שונים ואנו השיגו תוצאות דומות כמתואר לעיל. על סמך תצפיות אלה, הגענו למסקנה כי בחירה של חומרים צמח היה גורם מכריע וכי רק מורחב unifoliate עלים של שתילים צעירים סויה הבד הטוב ביותר עבור פרוטופלאסט הכנה.
מגוון של כמויות שונות של פלסמיד ה-DNA (0.1 µg, 1 µg, 5 µg, 20 µg) נבדקה יעילות אופטימלית טרנספורמציה protoplasts unifoliate סויה (איור 3 א-ד). 20 µg פלסמיד דנ א מעיד על יעילות טרנספורמציה הגבוהה ביותר עם יותר מ- 50% שינוי קצב (דמות תלת-ממד), בעוד 0.1 µg הראה הנמוך ביותר (פחות מ 1%) (איור 3 א). אנו להשיג יעילות דומה טרנספורמציה באמצעות ערכות טיהור DNA שונים מיצרנים שלוש. תוצאה זו עולה כי כמויות גדולות יותר של פלסמיד DNA יסייעו רבות כדי להגביר את היעילות טרנספורמציה.
איור 4 הוא תמונות קונאפוקלית של protoplasts סויה הפך עם לבנות p2GWF7-E1, אשר מבטא GFP דבוקה הגן הספציפי קטניות E1 (Glyma.06G207800), מונע על ידי האמרגן 35S CaMV ב p2GWF7 וקטור 39. חלבון כימרי E1-GFP מציג לוקליזציה גרעיני סויה protoplasts, אשר עולה בקנה אחד עם מחקר קודם באמצעות מערכת פרוטופלאסט תודרנית40. בהתחשב בכך E1 הוא גן ספציפי קטניות, תוצאה שלנו באמצעות מערכת פרוטופלאסט סויה מספק של תובנה חד משמעי בלוקליזציה subcellular לחלבון E1.
איור 1. איור המציג את האיברים של נבט סויה נבדקים להכנה פרוטופלאסט במחקר זה, כולל בסיס, hypocotyl, cotyledon, epicotyl, unifoliate. לאחר זוג עלים unifoliate, סויה שתילים לפתח עלים trifoliate. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. פרוטופלאסט תאים מקריסטלים של איברים שונים, בשלבים התפתחותיים של סויה שתילים. (י-ם) תאים מקריסטלים של איברים שונים של 10 - בן יום שתילים סויה: שורש (א), hypocotyl (B), epicotyl (ג), cotyledon (ד). (E-G) פרוטופלאסט תאים שהוכנו עלים unifoliate בשלבים התפתחותיים שונים: לא מורחב (E), התרחב (נ) ולאחר מורחבת במלואה (G) unifoliate, התואם השתילים סויה ב (H) בצד ימין, התיכון וגם נכון, בהתאמה. סרגל קנה מידה הוא 25 מיקרומטר (A-G) או 25 מ מ (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תמונות קונאפוקלית מראה יעילות טרנספורמציה של סויה protoplasts unifoliate עם כמויות שונות של פלסמיד ה-DNA. תמונות של ה-GFP (המיוצגת בירוק) ובאור שדה (אפור) ימוזגו. Protoplasts נהפכו עם כמויות שונות של פלסמיד p2GWF7-E1: 0.1 µg (א), 1 µg (B), 5 µg (ג) ו- µg 20 (ד). קרינה פלואורסצנטית אות של GFP היה פיקוח 24 שעות לאחר שינוי תחת מיקרוסקופ. הבר סולם שחור הוא 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. תמונות קונאפוקלית מציג לוקליזציה subcellular של E1-GFP בגרעין של סויה unifoliate protoplasts. P2GWF7-E1 פלסמיד שימש טרנספורמציה. תמונות של ה-GFP (המיוצגת בירוק) ובאור שדה (אפור) ימוזגו. קרינה פלואורסצנטית אות של GFP היה פיקוח 24 שעות לאחר השינוי. הבר סולם שחור הוא 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פתרון אנזים (הטרי) | |
| MES, pH 5.7 | 20 מ מ |
| Cellulase CELF | 2% (w/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0.1% (w/v) |
| מניטול | 0.75 מ' |
| CaCl2 | 0.2 מ מ |
| BSA | 0.1% (w/v) |
| DTT | 0.5 מ מ |
| פתרון W5 | |
| NaCl | 154 מ מ |
| CaCl2 | 125 מ מ |
| אשלגן כלורי | 5 מ מ |
| MES, pH 5.7 | 2 מ מ |
| MMg פתרון | |
| MES, pH 5.7 | 4 מ מ |
| מניטול | 400 מ |
| MgCl2 | 15 מ מ |
| פתרון פג (הטרי) | |
| PEG4000 | 20% (w/v) |
| מניטול | 200 מ מ |
| CaCl2 | 100 מ מ |
| פתרון אינטרנט | |
| MES, pH 5.7 | 4 מ מ |
| מניטול | 0.5 מ' |
| אשלגן כלורי | 20 מ מ |
טבלה 1. פתרונות המשמש בידוד פרוטופלאסט סויה וטרנספורמציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה עבור בידודו של סויה protoplasts לבין היישום ללימודים ביטוי ארעית נבדק ביסודיות, עובד טוב מאוד במעבדה שלנו. ההליכים הם פשוט וקל, דורשת ציוד רגיל, עלות מינימלית. פרוטוקול שלנו מניב כמויות גדולות של protoplasts איכותי אחיד לעומת שיטות שדווחה בעבר34,35,36,37,38. עם זאת, מאז, ישנם גורמים רבים המשפיעים על התשואות פרוטופלאסט וקצבי טרנספורמציה מומלץ לחוקרים למטב את התנאים לפי תנאי הניסוי שלהם, רצוי תוצאות החומרים שנעשה בהם שימוש. בעוד מערכת זו הוא מאוד שימושי עבור בחינת תקינה מיידית ואירועים הביוכימי בתאי צמח, היא לא מתאימה להשגחה של תהליכים תאיים לטווח ארוך ואת האירועים המתרחשים רקמות או רמות organismal.
מצאנו כי הבחירה נמרצות גידול צמח חומרי בשלב התפתחותי אידיאלי היה הגורם המכריע ביותר בהכנת פרוטופלאסט סויה. היא קובעת לא רק תשואות של protoplasts, אבל איכות המשפיעה על שינוי ה-DNA עוקבות. חשוב תמיד לגדל צמחים סויה בסביבה קבוע מן הלחץ, כגון הבצורת, הצפה, טמפרטורות קיצוניות או מזיקים. הגבוהה פרוטופלאסט התשואה וטרנספורמציה היעילות יכולה להיות מושגת באמצעות עלים unifoliate רק המורחב של השתילים. למתחילים, הוא הציע להשתמש עלים unifoliate בשלבים התפתחותיים שונים ולעשות השוואה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
פרוטופלאסט/DNA יחס הוא גורם חשוב עבור יעילות אופטימלית טרנספורמציה. מומלץ בדרך כלל להתחיל עם היחס של 2 x 104 protoplasts/10-20 µg ה-DNA, אבל אופטימיזציה של היחס על מבנים בודדים מומלצת25. השימוש באיכות גבוהה DNA מתקבל על ידי ערכת טיהור DNA מומלץ מאוד.
הבחירה של וקטורים להבעה ארעית protoplasts, מספר גבוה-העתק ווקטורים בגודל קטן עדיפים בדרך כלל. למרות בינארי המומנט עבור Agrobacterium tumefaciens-שינוי בתיווך של צמחים יכול לשמש לשינוי פרוטופלאסט, גודלו של וקטורים אלה עלול לגרום פחות יעילות אופטימלית טרנספורמציה. ביטוי חלבון ה-GFP-fusion, אנו משתמשים בדרך כלל הווקטורים לא ניחנת סמן הבחירה ובכך קטן יחסית צמחים והם (6-7 קילו), כגון p2GWF7 ו- p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
וקטורים מרובים יכול לשמש כדי להפוך protoplasts בו זמנית. . הייתה לנו הצלחה לבטא BiFC וקטורים לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, כמו גם מספר חלבונים פלורסנט אברון, תיוג subcellular ב protoplasts סויה... יתר על כן, פשטות, תשואות גדולות בשיטה שלנו מציעה מערכת אידיאלית עבור בחינת רגולטוריות ואירועים הביוכימי, פילוח ג'ין עיצוב וקטור, בידוד של transiently ביטוי החלבונים, החלבונים, ולטיהור ספציפי אברון כמו גרעינים, הפעלת יישומים נוספים המתעוררים גנומית, פרוטיאומיה מבנית מתקרב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי צמח הגנום תוכנית מחקר של הקרן הלאומית למדע (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
