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Biology

सोयाबीन Protoplasts और क्षणिक जीन अभिव्यक्ति के लिए आवेदन के अलगाव के लिए एक सरल तरीका विश्लेषण

Published: January 25, 2018 doi: 10.3791/57258
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, California State University, Northridge

Summary

हम जी कोशिकाओं में जटिल विनियामक और संकेत तंत्र का अध्ययन करने के लिए सोयाबीन protoplasts की बड़ी मात्रा की तैयारी के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल विकसित की है ।

Abstract

सोयाबीन (Glycine max (एल.) Merr.) एक महत्वपूर्ण फसल प्रजातियों है और आनुवंशिक और जैव रासायनिक रास्ते के अध्ययन के लिए एक फली मॉडल बन गया है । इसलिए सोयाबीन में दक्ष क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली स्थापित करना जरूरी है. यहां, हम सोयाबीन protoplasts की तैयारी और क्षणिक कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अपने आवेदन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । हमने पाया कि सोयाबीन अंकुर से युवा unifoliate पत्तियों उच्च गुणवत्ता protoplasts की बड़ी मात्रा में हुई । एक खूंटी-कैल्शियम मध्यस्थता परिवर्तन विधि का अनुकूलन करके, हम सोयाबीन unifoliate protoplasts का उपयोग कर उच्च परिवर्तन दक्षता हासिल की । इस प्रणाली के रहने वाले सोयाबीन कोशिकाओं में जटिल विनियामक और संकेत तंत्र की परीक्षा के लिए एक कुशल और बहुमुखी मॉडल प्रदान करता है और बेहतर विविध सेलुलर, विकास और फलियां की शारीरिक प्रक्रियाओं को समझने में मदद कर सकते हैं ।

Introduction

Protoplasts सेल दीवारों हटा दिया है कि संयंत्र कोशिकाओं रहे हैं । के रूप में वे सुविधाओं और संयंत्र कोशिकाओं की गतिविधियों के सबसे बनाए रखने, protoplasts एक अच्छा मॉडल प्रणाली का पालन करने और विविध सेलुलर घटनाओं का मूल्यांकन कर रहे हैं, और मूल्यवान उपकरण के लिए दैहिक hybridisation1 और संयंत्र पुनर्जनन2अध्ययन कर रहे हैं । Protoplasts भी व्यापक रूप से संयंत्र परिवर्तन3,4,5के लिए उपयोग किया गया है, क्योंकि सेल दीवारों अंयथा सेल में डीएनए के पारित होने रोकेंगे । Protoplasts शारीरिक प्रतिक्रियाओं और बरकरार पौधों की सेलुलर प्रक्रियाओं के कुछ अधिकारी, इसलिए बुनियादी अनुसंधान में मौलिक मूल्य की पेशकश करने के लिए सेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण अध्ययन6,7,8, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन9,10, और प्रमोटर गतिविधि11,12,13 लाइव सेल में ।

संयंत्र protoplasts के अलगाव पहले १९६० में रिपोर्ट की गई थी14 और दोनों अलगाव और protoplasts के परिवर्तन के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया गया है और अनुकूलित । protoplast अलगाव की एक मानक प्रक्रिया पत्तियों के काटने और कोशिका दीवारों के एंजाइमी पाचन, गैर पचा ऊतक मलबे से जारी protoplasts की जुदाई के बाद शामिल है । परिवर्तन रणनीतियों electroporation15,16, microinjection17,18, और पॉलीथीन ग्लाइकोल आधारित (खूंटी)4,5,19 तरीकों शामिल हैं । प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला protoplast अलगाव के लिए सफल बताया गया है, खट्टे20, ब्रेसिका21, Solanaceae22 और अंय सजावटी संयंत्र परिवार23,24शामिल हैं । जबकि विविध ऊतक प्रकार विभिंन प्रजातियों में उपयोग किया जाता है, Arabidopsis mesophyll protoplast (TEAMP) मॉडल संयंत्र Arabidopsis थालियाना की पत्तियों से अलग में क्षणिक अभिव्यक्ति की एक प्रणाली अच्छी तरह से स्थापित किया गया है25 और व्यापक रूप से विविध अनुप्रयोगों के लिए अपनाया ।

सोयाबीन (Glycine max (एल.) Merr.) सबसे महत्वपूर्ण प्रोटीन और तेल फसलों में से एक है26। Arabidopsis और चावल के विपरीत, ट्रांसजेनिक सोयाबीन संयंत्रों प्राप्त करने के बजाय मुश्किल और कम दक्षता जाना जाता है । एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens-मध्यस्थता घुसपैठ लोकप्रिय27 और अंकुर में Arabidopsis28,29में तंबाकू में एपिडर्मल कोशिकाओं में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि एग्रोबेक्टीरियम rhizogenes 30सोयाबीन में बालों की जड़ों के परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया गया है । वायरस प्रेरित जीन मुंह दृष्टिकोण एक प्रणालीगत तरीके से लक्ष्य जीन31,३२ और क्षणिक अभिव्यक्ति३३ के downregulation के लिए उपयोग किया गया है । Protoplasts इन तरीकों के लिए एक मूल्यवान और बहुमुखी विकल्प प्रदान करते हैं । Protoplasts सोयाबीन की aboveground सामग्रियों से प्राप्त किया जा सकता है और त्वरित और सिंक्रनाइज़ transgene अभिव्यक्ति की अनुमति है । हालांकि, १९८३३४में सोयाबीन protoplasts के प्रारंभिक सफल अलगाव के बाद से, वहां सोयाबीन३५,३६,३७में protoplasts के आवेदन पर सीमित रिपोर्ट कर दिया गया है, ३८, मुख्यतः सोयाबीन protoplasts की अपेक्षाकृत कम पैदावार के कारण.

यहां, हम सोयाबीन protoplasts और क्षणिक जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए अपने आवेदन के अलगाव के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन । सोयाबीन अंकुर से युवा unifoliate पत्तियों का प्रयोग, हम कुछ ही घंटों के भीतर महत्वपूर्ण protoplasts की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने में सक्षम थे । इसके अलावा, हम एक खूंटी कैल्शियम मध्यस्थता परिवर्तन विधि है कि सरल और कम लागत के लिए उच्च दक्षता के साथ सोयाबीन protoplasts में डीएनए देने के लिए अनुकूलित है ।

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Protocol

1. पौधों की वृद्धि

  1. बोना 5-10 सोयाबीन बीज (विलियंस ८२) ग्रीनहाउस में एक 13 सेमी पॉट में लंबे समय तक की स्थिति के तहत (16 ज लाइट १,५०० µmolm -2s-1) पर 25 ° c पर सोयाबीन के लिए कस्टम मिट्टी मिश्रण पर (1:1:1 मिट्टी के अनुपात, perlite और टारपीडो रेत) ।

2. प्लाज्मिड डीएनए की तैयारी

  1. एक बाँझ पिपेट टिप या दंर्तखोदनी का उपयोग करना, एक एकल कॉलोनी या जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक लेने के ई. कोलाई ब्याज की जीन युक्त प्लाज्मिड और यह लगाना में 20 मिलीलीटर Luria-Bertani (पौंड) तरल माध्यम से एक ५० मिलीलीटर कुप्पी में उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ले ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर पर रात भर कुप्पी गर्मी । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १२,००० x g पर निलंबन केंद्रापसारक द्वारा बैक्टीरिया को इकट्ठा करने और supernatant त्याग । निकालें और एक प्लाज्मिड तैयारी किट के निर्माता की प्रक्रिया के बाद प्लाज्मिड शुद्ध ।

3. Protoplast अलगाव

  1. 10 दिन पुराने सोयाबीन अंकुर (चित्रा 1) से नव विस्तारित unifoliate पत्तियों में कटौती ।
    नोट: एक उचित विकासात्मक चरण में पत्तियों का चयन सोयाबीन protoplast तैयारी के लिए सफलता की कुंजी है । केवल जल्दी विकास के चरणों में सिर्फ विस्तारित पत्तियों का उपयोग करें । के रूप में परिपक्व पत्तियां, कोशिका दीवारों को पचाने में कठिन हो जाते हैं ।
  2. एक ताजा उस्तरा ब्लेड के साथ, unifoliate पत्ती से मध्यशिरा निकालें और फिर 0.5 में अवशेष काट-1 मिमी स्ट्रिप्स ।
    नोट: दो unifoliate 10 मिलीलीटर एंजाइम समाधान में पचा पत्तियों 10 से अधिक परिवर्तनों के लिए पर्याप्त protoplasts दे देंगे ।
  3. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, पत्ती स्ट्रिप्स तुरंत हस्तांतरण और धीरे से 10 मिलीलीटर में नए सिरे से तैयार एंजाइम समाधान (तालिका 1) 15 मिलीलीटर ट्यूब में । वैक्यूम कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पत्ती स्ट्रिप्स घुसपैठ ।
  4. कमरे के तापमान पर 4-6 एच के लिए कम रोशनी के तहत कोमल आंदोलन (४० rpm) के साथ एंजाइम समाधान में पत्ती स्ट्रिप्स गर्मी । सुनिश्चित करें कि एंजाइम समाधान पीले-हरे रंग के रूप में protoplasts जारी कर रहे है बदल जाता है । माइक्रोस्कोप (X10) के अंतर्गत एंजाइम/protoplasts समाधान की जांच करें ।
    नोट: स्पर्म protoplasts गोलाकार आकार के होते हैं, जबकि बदहजमी वाली कोशिकाओं में अनियमित या अंडाकार आकृति होती है ।
  5. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एंजाइम/protoplast समाधान के 10 मिलीलीटर धीरे डालने के द्वारा स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर W5 समाधान (तालिका 1) के 10 मिलीलीटर जोड़ें पाचन को रोकने के लिए । धीरे ट्यूब उलटा कई बार । एक साफ ७५ µm नायलॉन जाल पर एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर रखा अपच पत्ती ऊतकों को हटाने के लिए धीरे एंजाइम/protoplasts समाधान डालो ।
  6. १०० x g पर ५० एमएल ट्यूब में कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए प्रवाह के माध्यम से-एंजाइम/protoplasts समाधान । धीरे protoplast गोली परेशान बिना एक 10 मिलीलीटर सीरम पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें ।
  7. protoplasts reसस्पेंड और माइक्रोस्कोपी (x10) के तहत एक hemacytometer पर protoplast संख्या की गिनती से 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा W5 समाधान में 2 x 105 मिलीलीटर-1 के एक एकाग्रता के लिए पतला । 30 मिनट के लिए बर्फ पर protoplasts रखें ।
  8. कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए १०० x g पर निलंबन केंद्रापसारक और धीरे protoplast गोली परेशान बिना एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर W5 समाधान निकालें । MMG समाधान (तालिका 1) में protoplasts को 2 x 105 मिलीलीटर-1 के कमरे के तापमान पर पुनर्स्थगित करना ।

4. Protoplast परिवर्तन

  1. बना १०० µ l aliquots के protoplasts (2 x 104 protoplasts पर 2 x 105 एमएल-1) में १.५ मिलीलीटर कम आसंजन microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग बिना खतना के २०० µ l पिपेट टिप्स. एक aliquot अलग रखो नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा । protoplasts के बाकी aliquot में से प्रत्येक में प्लाज्मिड (10-20 µ g) के 10 µ l को जोड़ें ।
  2. धीरे से १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के भीतरी दीवार पर हौसले से तैयार खूंटी समाधान (तालिका 1) के ११० µ एल जोड़ें, और फिर धीरे पलटना और जब तक समाधान सजातीय हो जाता है ट्यूब घुमाएं ।
  3. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर परिवर्तन मिश्रण की मशीन ।
  4. परिवर्तन को रोकने के लिए, धीरे से कमरे के तापमान पर १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए W5 समाधान के ४०० µ एल जोड़ें और धीरे ट्यूब पलटना जब तक समाधान सजातीय हो जाता है । कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए १०० g पर ट्यूब केंद्रापसारक और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant त्यागें ।
  5. ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर वाई समाधान (तालिका 1) जोड़ें और धीरे से pipetting 1-2 बार reसस्पेंड । जोड़ें 1 5% की मिलीलीटर (vol/6-well टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुआं में बाँझ बछड़ा सीरम सतह कोट और प्लेट को चिपके से protoplasts को रोकने के लिए ।
  6. कुछ सेकंड के बाद, एक पिपेट का उपयोग कर बछड़ा सीरम त्यागें । reसस्पैंड protoplasts संस्कृति की थाली के एक कुआं में स्थानांतरण । एक ढक्कन के साथ थाली कवर ।

5. Protoplast और संचयन

  1. अंधेरे में 1-2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर protoplasts की मशीन ।
    नोट: हमने पाया है कि दो दिन की गर्मी में एक दिन की गर्मी की तुलना में सामांय में मजबूत फ्लोरोसेंट प्रोटीन संकेत पैदावार, और है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन संकेत अप करने के लिए पिछले कर सकते है 3-4 दिन ।
  2. एक १.५ मिलीलीटर कम आसंजन microcentrifuge ट्यूब के लिए protoplast समाधान स्थानांतरण । protoplasts फसल के लिए कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए १०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । एक पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें और एक गिलास स्लाइड पर 10 µ l protoplasts हस्तांतरण.
  3. प्रतिदीप्ति या फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत फ्लोरोसेंट संकेत का निरीक्षण । गैर-रूपांतरित protoplasts नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें (कोई संकेत नहीं देखा जाना चाहिए) ।

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Representative Results

10 दिन पुराने सोयाबीन के विभिंन अंगों protoplast तैयारी (चित्रा 1) और पैदावार माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के तहत मनाया गया के लिए परीक्षण किया गया । hypocotyl और epicotyl से कोशिका दीवारें शायद ही पच जाती थीं, और कुछ कोशिकाएं एक-दूसरे से जुड़ी रहती थीं (चित्र 2, 2c) । cotyledon (चित्र 2d) और रूट (चित्र 2a) में, कक्ष की दीवारें केवल कक्षों के एक छोटे हिस्से में निकाली गई थीं । इसके विपरीत, जब unifoliate (चित्रा 2E-जी) का प्रयोग किया गया तो बड़ी संख्या में protoplasts मनाया गया । विभिंन विकासात्मक चरणों में Unifoliate पत्ते (चित्रा 2H) की जांच की गई । जबकि दोनों का विस्तार किया और सिर्फ विस्तारित unifoliate पत्तियों protoplasts की उच्च पैदावार में परिणाम, बस विस्तार unifoliate से protoplasts के आकार अधिक समान थे (चित्रा 2F) की तुलना में विस्तार unifoliate (चित्रा 2E) । पूरी तरह से विस्तारित unifoliate के लिए, सेल की दीवारें अभी भी ज्यादातर कोशिकाओं (चित्रा 2g) में बरकरार थीं । हम तीन अलग निर्माताओं से सेल दीवार पाचन एंजाइमों का परीक्षण किया और ऊपर वर्णित के रूप में तुलनीय परिणाम प्राप्त किया । इन टिप्पणियों के आधार पर, हम संयंत्र सामग्री का चयन एक महत्वपूर्ण कारक था कि निष्कर्ष निकाला और है कि सिर्फ युवा सोयाबीन अंकुर से unifoliate पत्तियों का विस्तार protoplast तैयारी के लिए सबसे अच्छी सामग्री थे ।

प्लाज्मिड डीएनए (०.१ µ g, 1 µ g, 5 µ g और 20 µ g) के विभिंन मात्राओं की श्रेणी का सोयाबीन unifoliate protoplasts (चित्र 3-डी) के इष्टतम रूपांतरण दक्षता के लिए परीक्षण किया गया । 20 µ g प्लाज्मिड डीएनए में ५०% से अधिक रूपांतरण दर (चित्रा 3d) के साथ उच्चतम रूपांतरण दक्षता दिखाई गई, जबकि ०.१ µ g को सबसे कम दिखाया गया (1%) (चित्र 3ए) । हम तीन निर्माताओं से अलग डीएनए शोधन किट का उपयोग तुलनीय परिवर्तन दक्षता प्राप्त की । इस परिणाम से पता चलता है कि प्लाज्मिड डीएनए की बड़ी मात्रा काफी परिवर्तन दक्षता बढ़ाने में मदद मिलेगी ।

चित्रा 4 का निर्माण p2GWF7-e1, जो GFP फली-विशिष्ट जीन E1 (Glyma. 06G207800), CaMV 35S प्रवर्तक द्वारा संचालित वेक्टर में से जुड़े व्यक्त के साथ तब्दील सोयाबीन protoplasts की फोकल छवियों है p2GWF7 ३९. E1-GFP फ्यूजन प्रोटीन सोयाबीन protoplasts, जो Arabidopsis protoplast प्रणाली४०का उपयोग कर पिछले एक अध्ययन के अनुरूप है में परमाणु स्थानीयकरण से पता चलता है । यह देखते हुए कि e1 एक फली-विशिष्ट जीन है, सोयाबीन protoplast प्रणाली का उपयोग कर हमारे परिणाम E1 प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण में एक निर्णायक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्र 1. एक सोयाबीन अंकुर कि जड़, hypocotyl, cotyledon, epicotyl और unifoliate सहित इस अध्ययन में protoplast तैयारी के लिए परीक्षण कर रहे है के अंगों दिखा चित्रण । unifoliate पत्तियों की एक जोड़ी के बाद, सोयाबीन अंकुरों त्रिकोणीय पत्तियों का विकास । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. विभिन्न अंगों और सोयाबीन अंकुर के विकासात्मक चरणों से तैयार Protoplast कोशिकाओं । (A-D) 10 दिन पुराने सोयाबीन अंकुर के विभिंन अंगों से तैयार कोशिकाओं: रूट (A), hypocotyl (B), epicotyl (C), cotyledon (D) । (E-G) Protoplast unifoliate से तैयार कोशिकाओं को अलग विकास के चरणों में छोड़ देता है: विस्तार (ई), बस विस्तारित (एफ), और पूरी तरह से विस्तारित (जी) unifoliate, में सोयाबीन अंकुरों के लिए इसी (एच) बाएं, मध्य और दाएं, क्रमशः । स्केल बार 25 µm (A-G) या 25 mm (H) है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. फोकल प्लाज्मिड डीएनए की अलग मात्रा के साथ सोयाबीन unifoliate protoplasts की परिवर्तन दक्षता दिखा छवियां । GFP की छवियां (हरे रंग में प्रतिनिधित्व) और उज्ज्वल क्षेत्र (ग्रे) विलय कर रहे हैं । Protoplasts की विभिन्न मात्राओं के साथ रूपांतरित किए गए थे प्लाज्मिड p2GWF7-E1:०.१ µ g (A), 1 µ g (B), 5 µ g (C) और 20 µ g (D). GFP के प्रतिदीप्ति सिग्नल माइक्रोस्कोपी के तहत परिवर्तन के 24 घंटे के बाद निगरानी की गई । ब्लैक स्केल बार ५० µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. फोकल चित्र सोयाबीन unifoliate protoplasts के नाभिक में E1-GFP का उपसेलुलर स्थानीयकरण दिखा । प्लाज्मिड p2GWF7-E1 परिवर्तन के लिए उपयोग किया गया था । GFP की छवियां (हरे रंग में प्रतिनिधित्व) और उज्ज्वल क्षेत्र (ग्रे) विलय कर रहे हैं । परिवर्तन के 24 घंटे बाद GFP के प्रतिदीप्ति सिग्नल की निगरानी की गई । ब्लैक स्केल बार 5 µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एंजाइम समाधान (हौसले से तैयार)
एमईएस, पीएच ५.७ 20mm
Cellulase CELF 2% (w/
Pectolyase वाय-२३ ०.१% (डब्ल्यू/
mannitol ०.७५ मीटर
CaCl2 ०.२ एमएम
bsa ०.१% (डब्ल्यू/
डीटीटी ०.५ एमएम
W5 समाधान
nacl १५४ एमएम
CaCl2 १२५ एमएम
kcl 5 मिमी
एमईएस, पीएच ५.७ 2 मिमी
MMg समाधान
एमईएस, पीएच ५.७ 4 मिमी
mannitol ४०० एमएम
MgCl2 15 एमएम
खूंटी समाधान (हौसले से तैयार)
PEG4000 20% (w/
mannitol २०० एमएम
CaCl2 १०० एमएम
वाई समाधान
एमईएस, पीएच ५.७ 4 मिमी
mannitol ०.५ मीटर
kcl 20 एमएम

तालिका 1. सोयाबीन protoplast अलगाव और परिवर्तन के लिए इस्तेमाल समाधान ।

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Discussion

सोयाबीन protoplasts और क्षणिक अभिव्यक्ति अध्ययन करने के लिए आवेदन के अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल अच्छी तरह से परीक्षण किया गया है और हमारी प्रयोगशाला में बहुत अच्छा काम करता है । प्रक्रियाओं सरल और आसान कर रहे है और साधारण उपकरण और ंयूनतम लागत की आवश्यकता है । हमारे प्रोटोकॉल पैदावार बड़ी मात्रा में वर्दी, उच्च गुणवत्ता protoplasts की तुलना में पहले की रिपोर्ट विधियों३४,३५,३६,३७,३८। हालांकि, के बाद से वहां कई कारकों है कि protoplast पैदावार और परिवर्तन की दर को प्रभावित कर रहे हैं, यह दृढ़ता से शोधकर्ताओं के लिए सिफारिश की है अपने प्रयोगात्मक शर्तों के अनुसार शर्तों का अनुकूलन, वांछनीय परिणाम और सामग्री का इस्तेमाल किया । हालांकि यह प्रणाली संयंत्र कोशिकाओं में तत्काल विनियामक और जैव रासायनिक घटनाओं की परीक्षा के लिए अत्यंत उपयोगी है, यह दीर्घकालिक सेलुलर प्रक्रियाओं और ऊतक या जीव स्तर पर होने वाली घटनाओं के अवलोकन के लिए उपयुक्त नहीं है ।

हमने पाया है कि एक आदर्श विकासात्मक चरण में तेजी से बढ़ रही संयंत्र सामग्री का चयन सोयाबीन protoplast तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कारक था । यह protoplasts की न केवल पैदावार निर्धारित करता है, लेकिन गुणवत्ता है कि बाद में डीएनए परिवर्तन को प्रभावित करता है । सूखा, बाढ़, अति तापमान या कीट जैसे किसी भी तनाव से दूर रहकर निरंतर वातावरण में हमेशा सोयाबीन के पौधे उगाना जरूरी है । उच्चतम protoplast उपज और परिवर्तन दक्षता युवा अंकुरों से सिर्फ विस्तारित unifoliate पत्तियों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । beginners के लिए, यह विभिंन विकासात्मक चरणों में unifoliate पत्तियों का उपयोग करें और एक तुलना करने के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने का सुझाव दिया है ।

Protoplast/डीएनए अनुपात इष्टतम परिवर्तन दक्षता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । यह आमतौर पर सबसे अच्छा है 2 x 104 protoplasts/10-20 µ जी डीएनए के अनुपात के साथ शुरू करने के लिए, लेकिन व्यक्तिगत निर्माण के लिए अनुपात का अनुकूलन25की सिफारिश की है । डीएनए शुद्धिकरण किट द्वारा प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए का उपयोग दृढ़ता से अनुशंसित है ।

protoplasts में क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए वैक्टर के चयन के लिए, उच्च प्रतिलिपि संख्या और छोटे आकार के वैक्टर आम तौर पर पसंद कर रहे हैं । हालांकि एग्रोबेक्टीरियम tumefaciensके लिए द्विआधारी वैक्टर-पौधों की मध्यस्थता परिवर्तन protoplast परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इन वैक्टर के बड़े आकार कम इष्टतम परिवर्तन दक्षता में परिणाम हो सकता है । GFP-फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, हम आमतौर पर वैक्टर कि पौधों के लिए एक चयन मार्कर के अधिकारी नहीं है और इस तरह के p2GWF7 और p2FGW7३९ (https://gateway.psb.ugent.be) जैसे अपेक्षाकृत छोटे (6-7kb), का उपयोग करें ।

एकाधिक वैक्टर एक साथ protoplasts को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत के परीक्षण के लिए BiFC वैक्टर व्यक्त करने में सफलता मिली है, साथ ही सोयाबीन protoplasts में organelle और सेलुलर लेबलिंग के लिए कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन । इसके अलावा, सादगी और हमारी विधि की बड़ी पैदावार विनियामक और जैव रासायनिक घटनाओं, जीन लक्ष्यीकरण वेक्टर डिजाइन, क्षणिक प्रोटीन और प्रोटीन जटिल व्यक्त की अलगाव की परीक्षा के लिए एक आदर्श प्रणाली प्रदान करता है, और विशिष्ट की शुद्धि organelle ऐसे नाभिक के रूप में, उभरते जीनोमिक और proteomic दृष्टिकोण के लिए आगे अनुप्रयोगों को सक्षम करने ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF-PGRP-IOS-१३३९३८८) से प्लांट जीनोम रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MES Sigma Aldrich M8250-100G
Cellulase CELF Worthington Biological Corporation LS002611
Pectolyase Y-23 BioWorld 9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10 yakult 10g
MACEROZYME R-10 yakult 10g
Mannitol ICN Biomedicals 152540
CaCl2 Fisher C79-500g
BSA NEB R3535S
DTT Sigma Aldrich D5545-5G
NaCl Sigma Aldrich S7653-1kg
KCl Fisher P217-500g
MgCl2 Sigma Aldrich M8266-100g
PEG4000 Fluka 81240
nylon mesh carolina 652222N
Tissue Culture Plates USA Scientific CC7682-7506
Razor Blades Fisher 12-640
hemacytometer hausserscientific 1483
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
EZNA plasmid miniprep kit Omega D6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Thermo Scientific K0502
Centrifuge 5810 eppendorf 5811000827
Centrifuge 5424 eppendorf 22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet Controller Jencons 14526-202
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss N/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450
15 mL Centrifuge Tubes Denville C1018-P
50 mL Centrifuge Tubes Denville C1060-P
Newborn Calf Serum Thermo Scientific 16010159
Soil Ingram's Nursery
perlite Vigoro 100521091
Torpedo Sand JKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder) Fisher BP1427-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक १३१ Protoplast सोयाबीन Glycine मैक्स unifoliate क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रोटीन स्थानीयकरण
सोयाबीन Protoplasts और क्षणिक जीन अभिव्यक्ति के लिए आवेदन के अलगाव के लिए एक सरल तरीका विश्लेषण
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Wu, F., Hanzawa, Y. A Simple Method… More

Wu, F., Hanzawa, Y. A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses. J. Vis. Exp. (131), e57258, doi:10.3791/57258 (2018).

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