Summary
Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente per la preparazione di grandi quantità di protoplasti di soia studiare i complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule vive.
Abstract
Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una specie di coltura importante ed è diventato un modello di legumi per gli studi delle vie genetiche e biochimiche. Pertanto, è importante stabilire un sistema di espressione genica transitoria efficiente in soia. Qui, segnaliamo un semplice protocollo per la preparazione dei protoplasti di soia e la sua applicazione per l'analisi funzionale transitorie. Abbiamo trovato che le foglie giovani unifoliate da piantine di soia ha provocato grandi quantità di protoplasti di alta qualità. Grazie all'ottimizzazione di un metodo di trasformazione PEG-calcio-mediata, abbiamo raggiunto l'efficienza di trasformazione alta utilizzando protoplasti unifoliate soia. Questo sistema fornisce un modello efficiente e versatile per l'esame dei complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule di soia dal vivo e può aiutare per meglio comprendere diversi processi cellulari, inerente allo sviluppo e fisiologici dei legumi.
Introduction
Protoplasti sono cellule vegetali che hanno rimosse le pareti cellulari. Come mantengono la maggior parte delle caratteristiche e attività di cellule vegetali, protoplasti sono un sistema di buon modello di osservare e valutare diversi eventi cellulari e sono strumenti preziosi per studiare ibridazione somatica1 e impianto di rigenerazione2. Protoplasti sono stati anche ampiamente utilizzati per impianto trasformazione3,4,5, poiché le pareti cellulari altrimenti bloccherebbe il passaggio del DNA nella cellula. Protoplasti possiedono alcune delle risposte fisiologiche e processi cellulari di piante intatte, offrendo quindi un valore fondamentale nella ricerca di base per lo studio di proteine sottocellulari localizzazione6,7,8, interazioni proteina-proteina9,10e promotore attività11,12,13 in cellule vive.
L'isolamento di protoplasti di pianta in primo luogo è stato segnalato nel 196014 e i protocolli per l'isolamento e la trasformazione dei protoplasti sono stati sviluppati e ottimizzati. Una procedura standard di isolamento del protoplasto comporta il taglio delle foglie e la digestione enzimatica delle pareti cellulari, seguita dalla separazione dei protoplasti rilasciati da detriti del tessuto non digerito. Strategie di trasformazione include elettroporazione15,16, microinjection17,18e base di polietilenglicole (PEG)4,5,19 metodi. Una vasta gamma di specie sono stati segnalati successo per l'isolamento di protoplasti, compresi agrumi20, Brassica21, Solanaceae22 e altre piante ornamentali famiglie23,24. Mentre i tipi di tessuti diversi sono utilizzati in varie specie, un sistema di espressione transiente in protoplasti di Arabidopsis mesofillo (TEAMP) isolato dalle foglie della pianta modello Arabidopsis thaliana è stato affermata25 e ampiamente adottato per diverse applicazioni.
Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una delle proteine più importanti e olio colture26. A differenza di Arabidopsis e riso, ottenimento di piante di soia transgenica è noto per essere piuttosto difficile e basso rendimento. Agrobacterium tumefaciens-mediata infiltrazione è stato popolarmente utilizzato per studi di espressione transiente in cellule epidermiche in tabacco27 e piantine in Arabidopsis28,29, considerando che Agrobacterium rhizogenes è stato utilizzato per la trasformazione delle radici pelosi in soia30. Approcci di silenziamento genica indotta da virus sono stati utilizzati per downregulation di destinazione geni31,32 e transitori espressione33 in maniera sistematica. Protoplasti forniscono una preziosa e versatile alternativa a questi approcci. Protoplasti possono essere ottenuti da materiali aboveground di soia e consentono l'espressione del transgene rapido e sincronizzato. Tuttavia, poiché l'isolamento iniziale successo dei protoplasti di soia nel 198334, ci sono stati rapporti limitati sull'applicazione dei protoplasti in soia35,36,37, 38, principalmente a causa della relativamente basse rese dei protoplasti di soia.
Qui, descriviamo un protocollo semplice ed efficiente per l'isolamento di protoplasti di soia e la sua applicazione per studi di espressione genica transitoria. Utilizzando foglie giovani unifoliate da piantine di soia, siamo stati in grado di ottenere grandi quantità di protoplasti vitali entro poche ore. Inoltre, abbiamo ottimizzato un metodo di trasformazione di PEG-calcio-mediata che è semplice e a basso costo per trasportare DNA in protoplasti di soia con alta efficienza.
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Protocol
1. la crescita delle piante
- Seminare i semi di soia 5-10 (Williams 82) in un vaso di 13 cm in serra in condizioni di giorno lungo (16 h luce alle 1.500 µmol m-2 s-1) a 25 ° C sul mix di terreno personalizzato per la soia (1:1:1 rapporto di sabbia del suolo, la perlite e la torpedine).
2. preparazione del DNA del plasmide
- Utilizzando una pipetta sterile o uno stuzzicadenti, scegli una singola Colonia o glicerolo congelati stock di e. coli che trasportano il plasmide contenente il gene di interesse e inoculare esso in 20 mL di terreno liquido di Luria-Bertani (LB) con gli antibiotici adatti in un pallone da 50 mL.
- Incubare la beuta a 37 ° C durante la notte su un agitatore. Raccogliere i batteri da centrifugazione la sospensione a 12.000 x g a temperatura ambiente per 5 minuti e scartare il surnatante. Estrarre e purificare il plasmide seguendo la procedura del produttore di un kit di preparazione del plasmide.
3. isolamento di protoplasti
- Tagliare foglie unifoliate recentemente ampliate da piantine di soia 10 - giorno di vita (Figura 1).
Nota: Selezione di foglie in una fase inerente allo sviluppo appropriata è la chiave per il successo per la preparazione di protoplasti di soia. Utilizzare solo foglie appena ampliati alle prime fasi dello sviluppo. Come lascia maturo, pareti cellulari diventano più difficile da digerire. - Con una lama di rasoio fresca, togliere la foglia unifoliata e quindi tagliare i resti in 0,5-1 mm strisce la nervatura centrale.
Nota: Due foglie unifoliate digeriti in 10 mL di soluzione di enzima darà protoplasti sufficienti per più di 10 trasformazioni. - Usando un paio di pinze, trasferimento la foglia strisce immediatamente e delicatamente in 10 mL di soluzione enzimatica preparata al momento (tabella 1) in una provetta da 15 mL. Vuoto si infiltra in foglia strisce per 15 min a temperatura ambiente.
- Incubare le strisce di foglia nella soluzione enzimatica con agitazione delicata (40 giri) sotto luce bassa per 4-6 h a temperatura ambiente. Assicurarsi che la soluzione di enzima diventa giallo-verde come protoplasti vengono rilasciati. Verificare la soluzione di enzima/protoplasti al microscopio (X10).
Nota: I protoplasti rilasciati sono sferici a forma, mentre le cellule non digerite hanno forma ovale o irregolare. - Trasferire i 10 mL di soluzione di enzima/protoplasti in una provetta da 50 mL versando delicatamente e aggiungere 10 mL di soluzione di W5 (tabella 1) a temperatura ambiente per interrompere la digestione. Capovolgere delicatamente la provetta un paio di volte. Versare delicatamente la soluzione enzima/protoplasti su una maglia di nylon pulito 75 µm posizionata sopra un tubo da 50 mL per rimuovere i tessuti della foglia non digerito.
- Centrifugare la soluzione di flusso continuo enzima/protoplasti a 100 x g nel tubo 50 mL per 1-2 min a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il supernatante utilizzando una pipetta sierologica 10ml senza disturbare il pellet di protoplasti.
- Risospendere i protoplasti e contando il numero di protoplasti su un emocitometro sotto il microscopio (x10), diluire ad una concentrazione di 2 x 105 mL-1 in soluzione di W5 refrigerati a 4 ° C. Mantenere i protoplasti su ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare la sospensione a 100 x g per 1-2 min a temperatura ambiente e rimuovere delicatamente la soluzione W5 utilizzando una pipetta da 1 mL senza disturbare il pellet di protoplasti. Risospendere i protoplasti nella soluzione MMG (tabella 1) ad una concentrazione di 2 x 105 mL-1 a temperatura ambiente.
4. trasformazione di protoplasti
- Fai aliquote di 100 µ l dei protoplasti (2 x 104 protoplasti a 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL bassa adesione per microcentrifuga utilizzando puntali per pipette uncut 200 µ l. Mettere un'aliquota da parte per servire come controllo negativo. Aggiungere 10 µ l di plasmide (10-20 µ g) in ciascuna dell'aliquota resto dei protoplasti.
- Aggiungere lentamente 110 µ l di soluzione preparata di PEG (tabella 1) sulla parete interna del tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e quindi capovolgere delicatamente e ruotare il tubo fino a quando la soluzione diventa omogenea.
- Incubare la miscela di trasformazione a temperatura ambiente per 15 min.
- Per fermare la trasformazione, lentamente aggiungere 400 µ l di soluzione di W5 per la provetta da 1,5 mL a temperatura ambiente e capovolgere delicatamente la provetta fino a quando la soluzione diventa omogenea. Centrifugare la provetta a 100 g per 1-2 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante con una pipetta.
- Aggiungere 1 mL di soluzione WI (tabella 1) al tubo e risospendere pipettando delicatamente 1 - 2 volte. Aggiungere 1 mL di siero di vitello sterile (vol/vol) 5% in ogni pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti per rivestire la superficie ed evitare i protoplasti di attaccarsi alla piastra.
- Dopo pochi secondi, scartare il siero di vitello utilizzando una pipetta. Trasferire i protoplasti sedimento in un pozzetto della piastra di coltura. Coprire la piastra con un coperchio.
5. protoplasti incubazione e raccolta
- Incubare i protoplasti a temperatura ambiente per 1-2 giorni al buio.
Nota: Abbiamo trovato che due-giorni di incubazione produce più forte segnale di proteina fluorescente in generale rispetto ad un giorno incubazione, e che il segnale di proteina fluorescente può durare fino a 3-4 giorni. - Trasferire la soluzione di protoplasti di un tubo del microcentrifuge bassa adesione di 1,5 mL. Centrifugare la provetta a 100 x g per 1-2 min a temperatura ambiente per raccogliere protoplasti. Rimuovere il surnatante con una pipetta e trasferire 10 protoplasti µ l su una lastra di vetro.
- Osservare il segnale fluorescente sotto fluorescenza o microscopia confocale. Utilizzare non trasformate protoplasti come controllo negativo (non dovrebbe essere osservato nessun segnale).
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Representative Results
Diversi organi di soia 10 - giorno-vecchio sono stati testati per la preparazione del protoplasto (Figura 1) e i rendimenti sono stati osservati al microscopio (Figura 2). Pareti cellulari da ipocotile ed epicotyl erano appena digeriti, e alcune cellule siamo stati attaccati alla vicenda (Figura 2B, 2C). Nel cotiledone (Figura 2D) e radice (Figura 2A), pareti cellulari sono stati rimossi solo in una piccola porzione delle cellule. Al contrario, un gran numero di protoplasti sono stato osservato quando unifoliate è stato utilizzato (Figura 2E-G). Unifoliate foglie alle varie fasi di sviluppo sono stati ulteriormente esaminati (Figura 2 H). Mentre le foglie di unifoliate non espansi e appena espanse ha provocato alti rendimenti dei protoplasti, la dimensione dei protoplasti da appena espansa unifoliata erano più uniforme (Figura 2F) rispetto al non espansi unifoliate (Figura 2E). Per completamente espanso unifoliate, le pareti cellulari erano ancora intatte nella maggior parte delle cellule (Figura 2). Abbiamo testato gli enzimi della parete cellulare-digestione da tre diversi produttori e ottenuto risultati comparabili come descritto sopra. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo concluso che la selezione dei materiali vegetali era un fattore cruciale e che appena espanse unifoliate foglie da piantine giovani soia erano il miglior materiale per la preparazione del protoplasto.
Una gamma di diverse quantità di plasmide DNA (0.1 µ g, 1 µ g, 5 µ g e 20 µ g) è stata testata per l'efficienza di trasformazione ottimale dei protoplasti unifoliate soia (Figura 3A-D). 20 µ g plasmide DNA ha mostrato la massima efficienza di trasformazione con più di tasso di trasformazione del 50% (Figura 3D), mentre 0,1 µ g ha mostrato il più basso (meno dell'1%) (Figura 3A). Abbiamo ottenuto l'efficienza di trasformazione paragonabile utilizzando diversi kit di purificazione del DNA da tre produttori. Questo risultato suggerisce che grandi quantità di DNA plasmidico sarebbe di grande aiuto per aumentare l'efficienza di trasformazione.
Nella figura 4 è immagini confocal di protoplasti di soia trasformati con costrutto p2GWF7-E1, che esprime GFP fuse al legume specifico gene E1 (Glyma.06G207800), guidato da promotore CaMV 35S nel p2GWF7 di vettore 39. proteina di fusione GFP-E1 Mostra la localizzazione nucleare in protoplasti di soia, che è coerente con uno studio precedente utilizzando il sistema protoplasti di Arabidopsis40. Dato che E1 è un gene specifico di legume, il nostro risultato utilizzando il sistema di protoplasti di soia fornisce un'analisi conclusiva la localizzazione subcellulare delle proteine E1.
Figura 1. L'illustrazione Mostra gli organi di un semenzale di soia che sono testati per la preparazione del protoplasto in questo studio, tra cui radice, ipocotile, cotiledone, epicotyl e unifoliate. Dopo un paio di foglie unifoliate, piantine di soia sviluppano foglie trifogliate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Cellule di protoplasti preparate da diversi organi e fasi di sviluppo delle piantine di soia. (A-D) Le cellule preparati da diversi organi di 10 - giorno-vecchio piantine di soia: radice (A), ipocotile (B), epicotyl (C), cotiledone (D). (E-G) Cellule di protoplasti preparate da foglie unifoliate a diversi stadi di sviluppo: non espansi (E), appena ampliato (F) e completamente espansi (G) unifoliate, corrispondenti per le piantine di soia in (H) a sinistra, centro e destra, rispettivamente. La barra della scala è di 25 µm (A-G) o 25 mm (H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagini confocal mostrando efficienza di trasformazione di soia unifoliati protoplasti con diverse quantità di DNA plasmidico. Immagini di GFP (rappresentato in verde) e luminoso campo (grigio) vengono unite. Protoplasti sono stati trasformati con diverse quantità del plasmide p2GWF7-E1: 0,1 µ g (A), 1 µ g (B), 5 µ g (C) e 20 µ g (D). Segnale di fluorescenza della GFP è stato monitorato 24 ore dopo la trasformazione nell'ambito di microscopia. La barra della scala nera è 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Immagini confocal mostrando la localizzazione subcellulare di E1-GFP nel nucleo di soia protoplasti unifoliati. Il plasmide p2GWF7-E1 è stato utilizzato per la trasformazione. Immagini di GFP (rappresentato in verde) e luminoso campo (grigio) vengono unite. Segnale di fluorescenza della GFP è stato monitorato 24 ore dopo la trasformazione. La barra della scala nera è 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione enzimatica (preparata) | |
| MES, pH 5.7 | 20mM |
| Cellulasi CELF | 2% (p/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0,1% (p/v) |
| Mannitolo | 0,75 M |
| CaCl2 | 0,2 mM |
| BSA | 0,1% (p/v) |
| DTT | 0,5 mM |
| W5 soluzione | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5.7 | 2 mM |
| Soluzione di MMg | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Mannitolo | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| Soluzione di PEG (preparata) | |
| PEG4000 | 20% (p/v) |
| Mannitolo | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| Soluzione WI | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Mannitolo | 0,5 M |
| KCl | 20 mM |
Tabella 1. Soluzioni utilizzate per la trasformazione e l'isolamento di protoplasti di soia.
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Discussion
Questo protocollo per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di studi di espressione transitoria è stato accuratamente testato e funziona molto bene nel nostro laboratorio. Le procedure sono semplici e facili e richiedono apparecchiature ordinarie e minimo costo. Il nostro protocollo produce grandi quantità di protoplasti di uniforme, di alta qualità rispetto ai metodi precedentemente segnalati34,35,36,37,38. Tuttavia, poiché ci sono molti fattori che influenzano i protoplasti rendimenti e tassi di trasformazione, si raccomanda vivamente per i ricercatori ottimizzare le condizioni secondo le loro condizioni sperimentali, risultati desiderabili e materiali utilizzati. Mentre questo sistema è estremamente utile per l'esame di immediata eventi normativi e biochimici nelle cellule vegetali, non è adatto per l'osservazione dei processi cellulari a lungo termine e gli eventi che si verificano a livello del tessuto o organismal.
Abbiamo trovato che la selezione di crescere vigorosamente materiali vegetali in una fase inerente allo sviluppo ideale era il fattore più importante nella preparazione di protoplasti di soia. Esso determina non solo rese di protoplasti, ma qualità che colpisce la successiva trasformazione del DNA. È importante sempre crescere piante di soia in un ambiente costante lontano da qualsiasi stress, come siccità, inondazioni, temperature estreme o parassiti. La massima efficienza di rendimento e trasformazione del protoplasto può essere raggiunto utilizzando foglie appena espanse unifoliate dai giovani semenzali. Per i principianti, si consiglia di utilizzare foglie unifoliate a diversi stadi di sviluppo e fare un confronto per ottenere i migliori risultati.
Rapporto di protoplasti/DNA è un fattore importante per l'efficienza ottimale trasformazione. È solitamente meglio iniziare con il rapporto di 2 x 104 protoplasti/10-20 µ g del DNA, ma ottimizzazione del rapporto per i costrutti individuali è consigliato25. Si raccomanda fortemente l'uso di alta qualità il DNA ottenuto tramite un kit di purificazione di DNA.
Per la scelta dei vettori di espressione transiente in protoplasti, alta-copia numero e vettori di piccole dimensioni sono generalmente preferiti. Anche se i vettori di binario per Agrobacterium tumefaciens-mediata trasformazione delle piante può essere utilizzato per la trasformazione di protoplasti, le grandi dimensioni di questi vettori possono provocare meno efficienza di trasformazione ottimale. Per espressione della proteina GFP-fusione, che di solito uso vettori che non possiedono un indicatore di selezione per piante e sono quindi relativamente piccolo (6-7kb), ad esempio p2GWF7 e p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Vettori multipli possono essere utilizzate per trasformare protoplasti simultaneamente. Abbiamo avuto successo nell'esprimere BiFC vettori per il test di interazioni proteina-proteina, come pure più proteine fluorescenti per organello ed etichettatura subcellulare in protoplasti di soia. Inoltre, la semplicità e grandi rendimenti del nostro metodo offre un sistema ideale per gli esami di eventi normativi e biochimici, gene-targeting vector design, isolamento delle proteine espresse transitoriamente e complesso proteico e purificazione di specifici si avvicina l'organello come nuclei, consentendo ulteriori applicazioni emergenti genomica e proteomica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca del genoma di pianta dalla National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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