Summary
Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.
Abstract
Soya (Glycine max (L.) Merr'e.) bir önemli bitki türü ve genetik ve biyokimyasal yolları araştırmalar baklagil modeli haline geldi. Bu nedenle, soya içinde bir verimli geçici gen ifade sistemi kurmak önemlidir. Burada, soya önceki hazırlanması için basit bir protokol ve geçici işlevsel analizleri için uygulama raporu. Bulduk soya fidan genç unifoliate yaprakları kaliteli önceki büyük miktarlarda sonuçlandı. PEG-kalsiyum-aracılı dönüşüm yöntemi optimize ederek, soya unifoliate önceki kullanarak yüksek dönüşüm verimliliği elde etti. Bu sistem etkin ve çok yönlü modeli karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelenmesi canlı soya hücrelerdeki için sağlar ve Bakliyat çeşitli hücresel, gelişimsel ve fizyolojik süreçleri anlamak zorunda yardım için daha iyi.
Introduction
Önceki hücre duvarlarının kaldırılması içeren bitki hücreleri vardır. Onlar özelliklerin çoğunu ve bitki hücreleri faaliyetlerinin sürdürdükçe, önceki gözlemlemek ve çeşitli hücresel olaylar değerlendirmek için bir iyi model sistemi vardır ve somatik melezleştirme1 çalışma ve rejenerasyon2bitki değerli araçlardır. Hücre duvarları aksi halde DNA hücre içine geçişini engellemek istiyorsunuz bu yana önceki bitki dönüşümü3,4,5için aynı zamanda yaygın olarak kullanılan. Önceki bazı fizyolojik tepkilerin ve dolayısıyla hücre altı protein Yerelleştirme6,7,8çalışmaya temel araştırma temel değeri sunan sağlam bitkilerin hücresel süreçler sahip, protein-protein etkileşimleri9,10ve organizatörü etkinliği11,12,13 ' te hücreleri yaşıyor.
Bitki önceki yalıtım ilk 196014 ' te bildirildi ve protokolleri yalıtım ve önceki dönüşümü için geliştirilen ve en iyi duruma getirilmiş. Standart bir prosedür protoplast tecrit yaprakların kesme ve Enzimatik sindirim yayımlanan önceki ayrılması tarafından sindirilmiş sigara doku enkazı takip hücre duvarlarının içerir. Dönüşüm stratejileri elektroporasyon15,16, mikroenjeksiyon17,18ve polietilen glikol tabanlı (PEG)4,5,19 yöntemleri içerir. Türlerin geniş bildirilmiştir protoplast yalıtımı, narenciye20, Brassica21, Solanaceae22 ve diğer süs bitki aileler23,24gibi başarılı. Çeşitli doku tipleri çeşitli türler ise, Arabidopsis mesophyll işgal (TEAMP) geçici ifade Arabidopsis thaliana modeli bitki yapraklarından izole bir sistem iyi kurulmuş25 oldu ve çeşitli uygulamalar için yaygın olarak kabul edilen.
Soya (Glycine max (L.) Merr'e.) bir en önemli protein ve yağ26kırpar. Arabidopsis ve pirinç aksine, transgenik soya bitkiler elde etmek oldukça zor ve düşük verimlilik olduğu bilinmektedir. Agrobacterium tumefaciens-aracılı infiltrasyon halk kullanılan tütün27 ' deki epidermal hücrelerin ve fidan Arabidopsis28,29, geçici gen ifade araştırmaları için ise Agrobacterium rhizogenes kıllı soya30kökleri dönüştürme için kullanılmıştır. Virüs kaynaklı gene yaklaşımlar susturmak için hedef genlerin31,32 ve geçici ifade33 downregülasyon sistemik bir şekilde kullanılmıştır. Önceki bu yaklaşımlar için değerli ve çok yönlü bir alternatif sağlar. Önceki soya'nın yerüstü malzemelerden elde edilebilir ve hızlı ve senkronize transgene ifade sağlar. Ancak, soya önceki341983 yılından bu yana ilk başarılı yalıtım sınırlı rapor edilmiştir önceki soya35,36,37, ve uygulamaya 38, öncelikle soya önceki nispeten düşük verimleri nedeniyle.
Burada, soya önceki yalıtım için basit ve etkili iletişim kuralı ve uygulama geçici gen ifade Etütler açıklayın. Soya fidan genç unifoliate yaprakları kullanarak, biz büyük miktarda hayati önceki birkaç saat içinde elde edebildik. Buna ek olarak, basit ve düşük maliyetli DNA soya önceki yüksek verimlilik ile teslim etmek PEG-kalsiyum-aracılı dönüşüm yöntemi optimize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bitkilerin büyüme
- 5-10 soya tohumları (Williams 82) özel toprak karışımı üzerinde 25 ° c (16 h 1500 µmol m-2 s-1ışık) uzun günlük koşullarda sera içinde 13 cm tencerede soya için ekmek (1:1:1 oran toprak, perlit ve torpido kum).
2. plazmid DNA hazırlanması
- Steril pipet ucu veya kürdan kullanarak, bir koloni veya faiz gen içeren plazmid taşıyan E. coli donmuş gliserol hisse senedi almak ve 20 mL Luria-Bertani (LB) sıvı ortamda bir 50 mL şişe olarak uygun antibiyotik aşılamak.
- Gecede bir shaker olarak 37 ° C'de şişeye kuluçkaya. Bakteri süspansiyon 12.000 x g 5 min için oda sıcaklığında, centrifuging ve süpernatant atarak toplamak. Hulâsa ve plazmid hazırlık seti üreticinin prosedürü takip plazmid arındırmak.
3. protoplast yalıtım
- 10 - gün eski soya fidan (şekil 1) yeni genişletilmiş unifoliate yaprakları kesti.
Not: Yaprakları uygun bir gelişimsel aşamada başarının anahtarı soya protoplast hazırlık için seçimdir. Sadece sadece genişletilmiş yaprakları aşamalarında erken gelişimsel kullanın. Olgun yaprakları, hücre duvarları daha zor sindirmek için hale gelir. - Taze bir tıraş bıçağı ile midrib unifoliate yaprak ve kalıntıları içine 0,5-1 mm şeritler kes çıkarın.
Not: iki unifoliate yaprakları 10 mL enzim çözümde sindirmek için 10'dan fazla dönüşümleri yeterli önceki verecektir. - Forseps, transfer bir çift kullanarak yaprak 10 mL taze hazırlanmış enzim çözeltisi (Tablo 1) bir 15 mL tüp içine hemen ve yavaşça şeritler. Vakum infiltrat yaprak 15 dakika oda sıcaklığında şeritler.
- Yaprak şeritler ile nazik ajitasyon (40 d/d) düşük ışık altında oda sıcaklığında 4-6 h için enzim çözümde kuluçkaya. Önceki yayımlanan olarak enzim çözüm sarı-yeşil döner emin olun. Enzim/önceki çözüm (X10) mikroskop altında denetleyin.
Not: Yayımlanan önceki küresel şeklinde, sindirilmemiş hücreler düzensiz veya oval şekli varken. - Yavaşça dökerek enzim/protoplast çözüm bir 50 mL tüp 10 mL transfer ve hazım durdurmak için oda sıcaklığında 10 mL W5 çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça tüp birkaç kez tersine çevirin. Yavaşça sindirilmemiş yaprak dokuları kaldırmak için 50 mL tüp üzerine yerleştirilen bir temiz 75 µm naylon mesh üzerinde enzim/önceki solüsyonu dökün.
- 100 x g oda sıcaklığında 1-2 dk 50 mL tüp, akışı sayesinde enzim/önceki çözüm santrifüj kapasitesi. Yavaşça protoplast Pelet bozmadan bir 10 mL serolojik pipet kullanarak süpernatant çıkarın.
- Önceki resuspend ve (x10) mikroskop altında bir hemacytometer numaralı protoplast sayarak 2 x 105 mL-1 4 ° C'de soğutulmuş W5 çözümde bir konsantrasyon sulandırmak. Önceki 30 dk için buz üzerinde tutun.
- 100 x g oda sıcaklığında 1-2 min için de süspansiyon santrifüj kapasitesi ve 1 mL pipet protoplast Pelet bozmadan kullanarak W5 çözüm yavaşça çıkarın. 2 x 105 mL-1 oda sıcaklığında bir konsantrasyon, MMG çözüm (Tablo 1) önceki resuspend.
4. protoplast dönüştürme
- 100 µL aliquots önceki (2 x 104 önceki vasıl 2 x 105 mL-1), 1.5 mL düşük yapışma microcentrifuge tüplere kesilmemiş 200 µL pipet ipuçlarını kullanarak olun. Negatif denetimi hizmet için bir aliquot bir kenara koyun. Plazmid (10-20 µg) 10 µL her önceki dinlenme aliquot içine ekleyin.
- Yavaş taze hazırlanmış PEG çözüm (Tablo 1) 110 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp iç duvarında ekleyin ve sonra yavaşça tersine çevirin ve çözüm homojen hale gelinceye kadar tüp döndürün.
- Dönüştürme karışımı 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Dönüşümün durdurmak için yavaş yavaş 1,5 mL tüp, oda sıcaklığında 400 µL W5 çözüm ekleyin ve çözüm homojen hale gelinceye kadar tüpü yavaşça tersine çevirin. Tüp 100 gr oda sıcaklığında 1-2 min için santrifüj kapasitesi ve bir pipet kullanarak süpernatant atın.
- WI çözüm (Tablo 1) 1 mL tüp ekleyin ve hafifçe 1 - 2 defa pipetting tarafından resuspend. 1 mL % 5 (vol/vol) steril buzağı serum her şey yüzey kat ve önceki plakasına yapışmasını önlemek için 6-iyi doku kültürü plaka ekleyin.
- Birkaç saniye sonra bir pipet kullanarak buzağı serum atmak. Resuspended önceki kültür plaka bir kuyunun içine aktarın. Bir kapak ile plaka kapak.
5. protoplast kuluçka ve hasat
- 1-2 gün içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında önceki kuluçkaya.
Not: Bulduğumuz iki günde kuluçka genel olarak bir günlük kuluçka için karşılaştırıldığında güçlü floresan protein sinyali verir ve floresan protein sinyal 3-4 güne kadar sürebilir. - Protoplast çözüm 1.5 mL düşük yapışma microcentrifuge tüp aktarın. Önceki hasat için oda sıcaklığında 1-2 min için 100 x g de tüp santrifüj kapasitesi. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve 10 µL önceki bir cam slayt üzerine aktarın.
- Floresan veya confocal mikroskobu altında floresan sinyal gözlemlemek. Sigara dönüştürülmüş önceki (sinyal yok dikkat edilmelidir) negatif kontrol kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 - gün eski soya fasulyesi farklı organları işgal hazırlık (şekil 1) için test edildi ve verimleri (Şekil 2) mikroskop altında gözlendi. Hücre duvarları hypocotyl ve epicotyl zor sindirmek ve bazı hücreler birbirine (2B şekil, 2 C) bağlı kaldı. Cotyledon (şekil 2B) ve kök (şekil 2A), hücre duvarları küçük bir hücre bölümünde kaldırıldı. Unifoliate yaşındayken buna ek olarak, çok sayıda önceki gözlendi (şekil 2E-G) kullanılır. Farklı gelişim aşamalarında unifoliate yaprakları daha fazla muayene (Şekil 2 H) olduğunu. Her iki genişletilmemiş ve sadece genişletilmiş unifoliate yaprakları önceki yüksek verim içinde sonuçlandı iken, sadece genişletilmiş üzerinden önceki boyutu unifoliate daha fazla üniforma (şekil 2F) genişletilmemiş unifoliate (şekil 2E) daha. Tam olarak genişletilmiş için unifoliate, hücre duvarları içinde (Şekil 2 g) hücrelerin çoğu hala sağlam idi. Hücre duvarı-sindirim enzimleri üç farklı üreticilerin test ve yukarıda açıklandığı gibi benzer sonuçlar elde. Bu gözlem dayalı, biz bitki malzeme seçimi çok önemli bir faktör oldu ve genç soya fidan sadece genişletilmiş unifoliate yapraklarından protoplast hazırlık için en iyi malzeme olduğunu sonucuna vardı.
Plazmid DNA (0.1 µg, 1 µg, 5 µg ve 20 µg) farklı miktarda bir dizi soya unifoliate önceki (şekil 3A-B) en iyi dönüşüm verimliliği için test edildi. en yüksek dönüşüm verimliliği daha fazla % 50 dönüşüm oranı (şekil 3D), 0.1 µg en düşük gösterdi gösterdi 20 µg plazmid DNA (az % 1) (Şekil 3A). Biz üç üreticilerin farklı DNA arıtma Kitleri kullanarak benzer dönüşüm verimliliği elde. Bu sonuç plazmid DNA daha büyük miktarlarda büyük ölçüde dönüşüm verimliliği artırmak için yardımcı olacak göstermektedir.
Şekil 4 confocal ile yapı p2GWF7-baklagil özel gen CaMV 35S organizatörü olarak vektör p2GWF7 tarafından tahrik E1 (Glyma.06G207800), erimiş GFP ifade E1, dönüştürülmüş soya önceki görüntülerini olduğunu 39. E1-GFP füzyon protein Arabidopsis protoplast sistem40kullanarak bir önceki çalışma ile tutarlı olan soya önceki nükleer yerelleştirme gösterir. E1 bir baklagil özel gen olduğunu göz önüne alındığında, soya protoplast sistemi kullanarak bizim sonucu E1 proteinin hücre altı yerelleştirme kesin bir bakış açısı sağlar.
Şekil 1. Test edilen organların soya fide protoplast hazırlık için kök, hypocotyl, cotyledon, epicotyl de dahil olmak üzere bu çalışmada, gösteren çizim ve unifoliate. Unifoliate yaprakları bir çift sonra soya fidan trifoliate yaprakları geliştirmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Protoplast hücreler farklı organ ve soya fidan gelişim aşamalarında hazır. (A-D) Hücreleri hazırlanan 10 - eski gün farklı organları soya fidan: kök (A), hypocotyl (B), epicotyl (C), cotyledon (D). (E-G) Unifoliate yapraklarından farklı gelişim dönemleri hazırlanan protoplast hücreleri: genişletilmemiş (E), (F) genişletilmiş ve tam olarak genişletilmiş (G) unifoliate, (h) soya fidan sol, orta ve sağ, sırasıyla karşılık gelen. Ölçek çubuğu 25 µm (A-G) veya 25 mm (H) olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Unifoliate önceki plazmid DNA'sı farklı miktarda soya dönüşüm verimliliği gösterilen confocal görüntüleri. Görüntüleri (yeşil renkle gösterilen) GFP ve parlak alan (gri) birleştirilir. Önceki plazmid p2GWF7-E1 farklı miktarda ile dönüştürülmüş: 0.1 µg (A), (B) 1 µg, 5 µg (C) ve 20 µg (D). GFP Floresans sinyalinin dönüşüm mikroskobu altında sonraki 24 saat takip. Siyah ölçek çubuğu 50 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. E1-GFP hücre altı lokalizasyonu soya çekirdeğinde unifoliate önceki gösterilen confocal görüntüleri. Plazmid p2GWF7-E1 dönüşüm için kullanıldı. Görüntüleri (yeşil renkle gösterilen) GFP ve parlak alan (gri) birleştirilir. GFP Floresans sinyalinin dönüşüm sonra 24 saat takip. Siyah ölçek çubuğu 5 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Enzim çözüm (taze hazırlanmış) | |
| MES, pH 5,7 | 20mM |
| Cellulase CELF | %2 (w/v) |
| Pectolyase Y-23 | %0,1 (w/v) |
| Mannitol | 0,75 M |
| CaCl2 | 0.2 mM |
| BSA | %0,1 (w/v) |
| DTT | 0,5 mM |
| W5 çözüm | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5,7 | 2 mM |
| MMg çözüm | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Mannitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| PEG çözüm (taze hazırlanmış) | |
| PEG4000 | %20 (w/v) |
| Mannitol | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| WI çözüm | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Mannitol | 0,5 M |
| KCl | 20 mM |
Tablo 1. Soya protoplast yalıtım ve dönüştürme için kullanılan çözümler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı soya önceki ve geçici ifade çalışmaları uygulama yalıtım için kapsamlı biçimde sınanmış ve çok iyi bizim laboratuarında çalışıyor. Yordamlar basit ve kolay ve sıradan ekipman ve minimum maliyet gerektirir. Bizim protokol Tekdüzen, yüksek kaliteli önceki daha önce bildirilen yöntemler34,35,36,37,38için karşılaştırıldığında büyük miktarlarda üretir. Protoplast verimleri ve dönüşüm oranları etkileyen pek çok faktör olduğundan, ancak, araştırmacılar koşulları deneysel koşullar, arzu edilen sonuçları ve kullanılan malzemelerin göre en iyi duruma getirmek için önerilir. Bu sistem bitki hücreleri hemen düzenleyici ve biyokimyasal olayların sınavı için son derece yararlı olsa da, uzun vadede hücresel süreçler ve doku veya organizma düzeyleri meydana gelen olayları gözlem için uygun değildir.
Biz şiddetle büyüyen bitki malzeme ideal bir gelişimsel aşamada seçimi soya protoplast hazırlanmasında en önemli faktör olduğunu ortaya koymuştur. Sadece verimleri önceki, ama sonraki DNA dönüştürme etkiler kalitesi belirler. Her zaman uzak herhangi bir stres, kuraklık, sel, aşırı sıcaklıklara veya zararlıları gibi sabit bir ortamda soya bitkiler büyümek önemlidir. En yüksek protoplast verim ve dönüşüm verimliliği genç fidan sadece genişletilmiş unifoliate yaprakları kullanılarak elde edilebilir. Yeni başlayanlar için bu unifoliate yaprakları farklı gelişim dönemleri kullanın ve en iyi sonuçları elde etmek için bir karşılaştırma yapmak için önerilmektedir.
Protoplast/DNA oranı en iyi dönüşüm verimliliği için önemli bir faktördür. 2 x 104 önceki/10-20 µg DNA oranı, ama bireysel yapıları için oranı optimizasyonu25ile başlamak önerilir en iyisidir. Yüksek kaliteli bir DNA arıtma paketi tarafından elde edilen DNA kullanımı önerilir.
Vektörel çizimler için geçici önceki ifadede seçimi için yüksek-kopya numarası ve küçük boyutlu vektörler genellikle tercih edilir. Her ne kadar ikili Agrobacterium tumefaciensiçin vektörler-aracılı dönüştürme bitkilerin protoplast dönüştürme için kullanılabilir, bu vektörel çizimler büyük boyutunu daha az uygun dönüşüm verimliliği neden olabilir. GFP-füzyon protein ifade için genellikle bir seçim işaretçisi bitki ve vardır böylece nispeten küçük (6-7 kb), p2GWF7 ve p2FGW739 gibi (https://gateway.psb.ugent.be) sahip olmayan vektörel çizimler kullanın.
Birden fazla vektörü önceki aynı anda dönüştürmek için kullanılabilir. BiFC vektörel çizimler protein-protein etkileşimlerinin yanı sıra birden çok floresan proteinler organel ve soya önceki hücre altı etiketleme için sınama ifade başarı oldu. Ayrıca, sadeliği ve bizim yöntem büyük verim sunar düzenleyici ve biyokimyasal olaylar, gen hedefleme vektör tasarımı, yalıtım geçici ifade protein ve protein kompleksi incelenmesi ve özel arıtma için ideal bir sistemdir Organel çekirdeği, ortaya çıkan genomik ve proteomik daha fazla uygulamaları etkinleştirme gibi yaklaşıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser bitki genom araştırma programı Ulusal Bilim Vakfı (NSF-PGRP-IOS-1339388) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
