Summary
İpucu büyüyen bitki hücreleri polen tüpler, kök tüyleri, dahil olmak üzere, kapasitesini araştırmak ve protonemata son derece dar geçitlerden (~ 1 µm) uzamış, bir mikrosıvısal cihazda moss bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Vivo, ipucu büyüyen bitki hücreleri fiziksel engeller bir dizi aşmak gerekir; Ancak, araştırmacılar bu kısıtlayıcı koşullarda hücresel davranış görselleştirmek için metodoloji eksikliği. Bu sorunu gidermek için biz bir poli-dimethylsiloxane (PDMS) substrat büyüme salonları dar, mikro fabrikasyon boşluklar (~ 1 µm) bir dizi içeren ipucu büyüyen bitki hücreleri için geliştirdik. Bu şeffaf malzeme ipucu uzama işlemlerde tek tek hücreler tarafından hızlandırılmış görüntüleme microgap penetrasyon sırasında izlemek için kullanıcı sağlar. Onlar microgap nüfuz olarak deneysel bu platformu kullanarak, biz polen tüpler morfolojik değişimler görülmektedir. Bu işlem sırasında fluorescently etiketli bir bitkisel çekirdek şeklinde dinamik değişiklikler ve sperm hücresi bir polen tüp ele geçirdi. Ayrıca, kök tüyleri ve yosun protonemata 1 µm Aralık nüfuz yeteneğini gösterdi. Bu vitro platform nasıl tek tek hücreleri yanıt fiziksel olarak kısıtlı alanlarda çalışmak için kullanılan ve anlayışlar ipucu-büyüme mekanizmaları içerebilir.
Introduction
Polen taneleri üzerinde bir leke çimlenme sonra her tahıl sperm hücresi yumurta ve çift döllenme için ovule merkezi hücreye taşır tek bir polen tüp üretir. Polen tüpler tarzı uzamış ve sonunda birden çok kılavuz ipuçları onların yolu1boyunca algılama tarafından ovule ulaşmak. Uzama sırasında polen tüpler fiziksel engeller bir dizi karşılaşırsanız; verici parça hücreleri ile doldurulur ve polen tüpler onların hedef (Şekil 1A)2ulaşmak için ovule dakika micropylar açılışı girmeniz gerekir. Bu nedenle, polen tüpler çevreleri basınç stresten tolere ederken fiziksel engeller, nüfuz yeteneği olması gerekir. Kök tüyleri ortamında paketlenmiş toprak parçacıklar (Şekil 1B) şeklinde fiziksel engelleri dayanmak zorundadır ipucu büyüyen bitki hücre başka bir türüdür.
Turgor basıncı ve yeni başlayan plasmolysis Yöntem3,4 ve hücresel kuvvet mikroskobu kullanılarak ölçülebilir hücre apikal bölgede sertliği de dahil olmak üzere çeşitli mekanik özelliklerini polen tüpü incelenmiştir (CFM) 5 , 6, anılan sıraya göre. Ancak, bu yöntemlerin yalnız polen tüpler aracılığıyla onların büyüme yol üzerindeki fiziksel engeller elongating yeteneğine sahip olup olmadığını ortaya çıkarmak değil. İzlenen vivo içinde olmak polen tüpü uzaması sağlayan bir alternatif iki foton mikroskobu7tekniğidir. Ancak, bu yöntemle, bireysel polen tüpler morfolojik değişimler gözlemlemek zor öyle içten içe ovule doku. Ayrıca, toprakta kök saç büyüme x-ışını bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG)8, kullanarak düşük çözünürlüklü de olsa görüntülenmeyecektir. Burada, bir hücrenin deformasyon işlemi geleneksel mikroskop yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için kullanılan bir yöntem mevcut.
Burada açıklanan yöntemi genel amacı ipucu büyüyen bitki hücreleri polen tüpler, kök tüyleri, dahil olmak üzere, uzama kapasitesini görselleştirmek ve protonemata, son derece küçük alanlarda moss etmektir. Bu el yazması sunulan poli-dimethylsiloxane (PDMS) microdevices optik şeffaf ve hava geçirgen, biz canlı hücreler cihazın içinde kültür ve büyüme davranışları bir mikroskop altında gözlemlemek. Ayrıca mikro oluşturmak mümkündür ~ nanometre ölçek alanlarda kalıpları kullanımı ile yumuşak litografi tekniği9 . Bu özellikler bize ipucu büyüyen bitki hücreleri fiziksel olarak kapalı bir ortamda uzama yeteneğini çalışmaya olanak sağlar.
Bu çalışmada, 1 µm geniş boşluklar (yüksekliği 4 µm) mikrosıvısal cihazlarda inşa ve silindirik polen tüpü (yaklaşık 8 µm) çapından küçüktür bu yapay engelleri nüfuz yeteneği polen tüplerinin muayene etti. Bu deneysel platform polen tüpü yanıt-e doğru microgaps görselleştirmek ve hücrenin deformasyon işlemi izlemek belgili tanımlık yanıt, hızlandırılmış görüntülerini yakalamak bize sağlar. Ayrıca cihazın penetrasyon özelliği kök tüyleri ve yosun protonemata araştırmak için kullanılan microdevices geliştirdi. Birkaç microdevices bitki kök10,11,12,13 ve yosun protonemata14 büyüme yüksek çözünürlükte görselleştirme etkinleştirme tarihi bildirilmiştir. Bizim cihaz kök saç büyüme kanalları bir dizi dik bir kök büyüme odasına bağlı ve bireysel kök tüyleri (çapı yaklaşık 7 µm) geniş bir boşluk 1 µm ile sıvı kanallara yönlendirilir. Biz de yosun kültürlü protonemata (çapı yaklaşık 20 µm) Bu fiziksel engellerin yanıtlarını incelemek için microgaps içeren bir microdevice içinde. Önerilen mikrosıvısal dayalı yaklaşım çeşitli ipucu büyüyen bitki hücreleri aracılığıyla herhangi bir mevcut diğer yöntemle incelendiğinde çok küçük alanlarda uzamış yeteneği keşfetmek için bize izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. polen tüpler büyüyen incelemek için PDMS Microdevice imalatı ve yosun Protonemata
Not: Silikon gofret üzerinde PDMS kalıpları hazırlamak için bir maskless fotolitografi aleti kullanılmış. Sistemin çalışması ile ilgili detayları bu el yazması göz ardı edilir. Bir photomask kullanarak bir standart fotolitografi teknik9 bu el yazması açıklanan PDMS kalıpları oluşturmak için de kullanılabilir.
- 11 g ön polimer PDMS karışımı dökün (elastomer temel: Ajan 10:1 oranında kür) her 4 inçlik kalıp içine.
- Adım 1.1 vakum odasında 20 dakika için hazırlanan kalıp degas.
- Bir sigara konveksiyon fırın içinde 90 dk 65 ° C'de kür sonra PDMS katman kalıp kapalı soyma ve biyopsi yumruklar kullanarak sıvı kanallarına erişim delikler.
Not: polen tüpü aygıt için deliğin boyutunu pistil çapını yansıtacak şekilde ayarlanması gerekir. Bu değer bu nedenle türler tarafından değişir. Bu deneyde, pistil alıcılar için 1 mm delik ve sıvı orta rezervuarlar için 1.5 mm delik yumruk attı. Yosun protonemata aygıt için 4 mm delik örnek rezervuar için kullanıldı. - Plazma 50 için hava için PDMS katmanı ve bir cam alt çanak (3.5-5 cm çapında) maruz s.
- PDMS katman cam alt çanak ve 65 ° C ısıda 30 dk içinde tamamen mikrosıvısal ağ oturumunu kapatma imzalamaya bir sigara konveksiyon fırın için basın.
2. kök tüyleri için PDMS Microdevice imalatı
- 1.1-1.3 kök ve kök saç microdevices için iki PDMS katman hazırlamak için kalıpları kullanarak adımları yineleyin.
Not: Biz kök microdevice sıvı orta rezervuar 2 mm delik kullandık. - Plazma 50 için hava ile her iki PDMS katmanı açığa s.
- Özel yapım bir masaüstü aligner kullanarak bir stereomicroscope altında iki PDMS katmanları birleştirin.
Not: Bu PDMS katmanlardaki mikro birbirine yüz gerekir. Montaj önce her iki katmanı hizalama izleri aynı olmasına dikkat edin. - 30 dk içinde tamamen mikrosıvısal ağ oturumunu kapatma imzalamaya bir sigara konveksiyon fırın için 65 ° C'de ısı.
- Kapak notu inşa microdevice çıkarın ve cihazın 5 cm çapında bir cam alt yemek üzerine yerleştirin.
3. Hazırlık In Vitro hücre kültür orta polen tüpler (Torenia fournieri)
- 15 ve basınçlı kap daha önce açıklandığı gibi değiştirilmiş Nitsch'ın orta orta 121 ° C'de 20 min için hazır olun.
Not: NH4modifed Nitsch'ın orta bileşimi olduğunu KNO3 (125 mg/L)3 (80 mg/L), Ca (NO3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L) Na2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L) sukroz (50.000 mg/L) ve kazein (500 mg/L). Hazır orta 4 ° C'de en az 4 ay depolanabilir. - % 26 (w/v) Polietilen glikol autoclaved deiyonize su kullanarak hazırlamak ve çözüm 0.3 µm gözenek filtre ile filtre.
Not: Hazırlanan orta 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır. - Adım 3.1 ve 3.2 1:1 (v/v) oranında hazırlanan reaktifler karıştırın.
Not: Bu orta her kullanım için taze hazırlanmalıdır.
4. kök tüyleri (Arabidopsis thaliana) için hazırlık In Vitro hücre kültür orta
- %0.215 (w/v) Murashige & Skoog orta, % 0.05 (w/v) MES, %1 (w/v) sükroz ve %1 (w/v) agar deiyonize su çözeltisi hazırlamak. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de çözüm.
5. Hazırlık In Vitro hücre kültür orta olarak Moss Protonemata (Physcomitrella patens)
- Yosun protonemata BCDAT orta16 bir petri içinde önceden kuluçkaya.
Not: BCDAT orta kompozisyon ise 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1.8 mM KH2PO4 (pH) 6.5 KOH ile düzeltilmiş, trace öğe çözüm (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 3, 0,1 µM Na2MoO4, 2 µM MnCl2, 0,23 µM CoCl2ve 0.17 µM KI), 1 mM CaCl2ve 5 mM diammonium (+)-tartarat. - Kültür microdevice BCDATG orta olarak moss.
Not: %0,5 (w/v) glikoz ile BCDAT orta BCDATG ortamdır. Hazır orta 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
6. T. fournieri polen tüplerinin Microdevice in Vitro Culturing
- 20 dakikadır degas ve polen tüpü microdevice bir vakum odasında yerleştirin.
- Microdevice vakum odasından kaldırın ve bir micropipette ile çok iyi bir ipucu kullanarak pistil giriş büyüme orta tanıtmak. Üst kısımları için kalan wells ile aynı orta doldurun. Tüm mikro mikro içinde oluşturulan vakum tarafından orta ile doldurulur kadar birkaç dakika bekleyin.
- Bazı ıslak kağıt havlu çanak nem korumak için cam alt çanak yerleştirin.
- Polen taneleri vahşi türünden aktarım T. fournieri 'mavi ve beyaz' çiçek diseksiyon iğne kullanarak onun stigma için.
Not: Biz de bu transgenik T. fournieri ile deney ( RPS5Ap::H2B-tdTomato hattı17) 'mor taç' çiçek, polen fluorescently etiketli sperm hücresi ve bitkisel çekirdek içeren tüpler. - Kesim tozlanan stil (1 cm uzunluğunda) bir bıçak kullanarak.
- Kesim tarzı cihazın giriş Şekil 2' de gösterildiği gibi yerleştirin.
- Çanak üzerinde bir kapak koyun ve bant ile kapatın.
- Aygıt için 5-6 h 28 ° C'de bir kuluçka karanlıkta yerleştirin.
7. A. thaliana kök kıllar Microdevice in Vitro Culturing
Not: Adımları 7.1-7,9 (7,3 ve 7,5 dışında) bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
- A. thaliana Columbia (Col-0) tohumlarından sterilize ve transgenik (floresan nükleer işaretçiyi içeren) UBQ10pro::H2B-kes satır 5 min için steril sıvı (%5 (v/v) ev çamaşır suyu ve %0.02 (v/v) Triton X-100) içinde ıslatarak.
- İyice sterilize tohum autoclaved su ile durulayın.
- Durulanır tohumları suda 4 ° C'de 2 gün boyunca karanlıkta saklayın.
- UV ışığı altında microdevice gecede sterilize.
- 20 dakikadır degas ve microdevice bir vakum odasında yerleştirin.
- Büyüme orta wells için yapılan bir micropipette kullanarak aygıtı tanıtmak. Orta ile tüm mikro vakum doldurur kadar birkaç dakika bekleyin.
- Autoclaved ıslak kağıt havlu çanak nem korumak için cam alt çanak yerleştirin.
- Steril bir tohum cihazın giriş aktarın.
- Çanak üzerinde bir kapak koyun ve bant ile kapatın.
- Cihazın bir kuluçka 22 ° c sürekli beyaz ışık altında dikey olarak yerleştirin.
- Kök saç büyüme kuluçka 4-10 gün sonra kontrol edin. Parlak alan ve floresan görüntüleri ters bir mikroskop kullanarak elde edilir.
8. P. patens (moss) mikrosıvısal cihazın Protonemata in Vitro Culturing
Not: Adımları 8.2-8,6 (8.3 dışında) bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
- P. patens gerilme Gransden 200418 25 ° C'de sürekli beyaz ışık altında bir hafta bir petri selofan kaplı BCDAT orta preculture
- Microdevice gecede bir laminar akış başlıklı UV ışık altında sterilize.
- 20 dakikadır degas ve microdevice bir vakum odasında yerleştirin.
- Büyüme orta bir micropipette kullanarak wells tanıtmak. Orta ile tüm mikro vakum doldurur kadar birkaç dakika bekleyin.
- Autoclaved su çanak nem korumak için microdevice çevreleyen çanak içine ekleyin.
- Yosun protonemata doku küçük bir parça microdevice koya aktarmak ve sürekli beyaz ışık altında 25 ° C'de bir kuluçka doku kültür.
- Yosun protonemata büyüme kuluçka 2-3 hafta sonra kontrol edin. Parlak alan görüntü bir mikroskop kullanarak elde.
9. T. fournieri polen tüpü büyüme hızlandırılmış görüntüleme
- Microdevice görüntü edinme donanım ile donatılmış bir ters floresans mikroskobu yerleştirin (Örn., CCD kamera) ve yazılım. Microgap yerleri bulabilirsiniz.
Not: görüntü alma yazılımı, biz ticari bir ürün (Tablo reçetesi) kullanılır. Açık kaynak mikroskopi µManager gibi aynı zamanda kullanılabilir çevrimiçi (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) yazılımdır. Bunun bir mikroskop kondansatör yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için mikroskobunun yüklemeniz önerilir. - Parlak alan her 10 çekim s mikroskop görüntü alma yazılımı kullanarak.
- Fluorescently etiketli sperm hücresi ve polen tüpü RPS5Ap::H2B-tdTomato satırının bitkisel çekirdeğinde gözlemlemek için numune 561 nm lazer ile ışınlatayım ve bant optik filtre kullanın (578/105 nm).
Not: her ne kadar polen tüpü büyüme hızlandırılmış görüntülerini sık sık ele geçirildi, görüntüleme büyüme etkilemeye görünmedi. Ancak, her zaman lazer yoğunluğu, çekim hızı ve hızlandırılmış aralığı fototoksisite ve fluorophore photobleaching en aza indirmek için en aza indirmek için tavsiye edilir. - Parlaklık ve kontrast görüntülerin ve ImageJ yazılımı (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanarak bir video dosyasını hazırlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1' de gösterildiği gibi onların büyüme yolları içinde vivoboyunca fiziksel engeller bir dizi ipucu büyüyen bitki hücreleri karşılaşma. Bu çalışmada sunulan mikrosıvısal vitro hücre kültür platformlar muayene etkin ipucu büyüyen bitki hücreleri (polen tüpler, kök tüyleri ve yosun protonemata) arasındaki 1 µm yapay geçitlerden (Şekil 3, üç tür süreç Şekil 4, Şekil 5). Polen tüpü çalışma için canlı hücre görüntüleme polen tüpler yanı sıra bitkisel çekirdek apikal bölgede morfolojik değişiklikler ve sperm hücreleri son derece küçük bir boşluk (Tamamlayıcı film 1 ve 2) karşılaşma için yanıt olarak izlemek için kullanıldı.
Microgaps çoğu başarılı bir şekilde burada açıklanan yöntemi kullanarak fabrikasyon rağmen birkaç tanesi tamamen olduğunu fark ettim (Şekil 6) kapalı. Silikon kalıp üzerinde oluşturulan 1 µm geniş kanal kırılgan olduğu için bu kalıp tekrarlanan kullanımı PDMS katmanda engelleme boşluk önde gelen boşluklar, zarar verebilir. Bu nedenle, deneme yapmadan önce bu PDMS microgaps eksiksiz olduğunu kontrol etmek önemlidir.
Şekil 1: penetrasyon ipucu büyüyen bitki hücreleri fiziksel olarak kısıtlı alanlarda. (A) bir ovule giderken birkaç fiziksel engeller üzerinden polen tüpü elongating. Engelleri stil ve micropyle çevreleyen integuments yolu doku vericisi içerir. (B) kök tüyleri ile yoğun toprak delici. (A) ve (B) insets büyütme kutulu bölgeleri göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Özellikleri microdevices T. fournieri polen tüpler, A. thaliana kök tüyleri ve P. patens protonemata çalışırdım. Mikro şematik çizimler bir örnek bir yıldız işaretiyle (*) belirtilen konumda yerleştirilmiş olması. Microchannel tasarımlar, her aygıt, kanal yapıları ve hücre kültürü çalışmalarının dönemleri fotoğrafları özetlenir. Bu rakam Yanagisawa ve arkizni ile değiştirildi. 201719. Ölçek bar, 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: T. fournieri polen tüpü uzama 1 µm Aralık ile. (A) polen tüpü 1 µm geniş ve 4 µm yüksek boşluk geçen. Hızlandırılmış parlak alan görüntüleri bir iplik-disk confocal sistemi ile donatılmıştır ters bir mikroskop kullanarak ele geçirildi. Ölçek çubuğu, 20 µm. (B) zaman atlamalı fotoğraf fluorescently etiketli bir bitkisel çekirdek ve sperm hücresi olan RPS5Ap::H2B-tdTomato bir polen tüpünde microgap geçiş hattı. Ölçek çubuğu, 20 µm. Şekil (A) ve (B) izniyle Yanagisawa ve arkdeğiştirilmiştir. 201719. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. A. thaliana kök saç uzama 1 µm Aralık ile. (A) kök ve kök saç büyüme microdevice. Microgaps (1 µm genişliği) ve yüksekliği 4 µm kök büyüme kanal sol tarafında yer alır. Sağ tarafta mikro microgaps içermez ve bir denetim kullanılabilir. Ölçek çubuğu, 100 µm. (B) parlak alan, floresan (C) ve (D) kök tüyleri microgaps geçen görüntülerini birleştirilir. Kök tüyleri çekirdeklerin fluorescently UBQ10pro::H2B-kes satırında etiketlenir. Her kök saç ucunu bir okla belirtilir. Ölçek çubuğu, 30 µm. Bu rakamlar Yanagisawa ve arkizni ile değiştirildi. 201719. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. P. patens protonemata uzama 1 µm Aralık ile. Protonemata hücre protonemata turgor basıncı nedeniyle genişletilmiştir 1 µm Aralık (yüksekliği 4 µm), ile geçiş moss. Ölçek çubuğu, 20 µm. Rakam Yanagisawa ve arkizni ile değiştirildi. 201719. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. Kapalı microgaps. SEM görüntü 1 µm gap bölgesi. Sağ microgap tamamen kapalı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Takıma giren film 1. Polen tüpü büyüme ile bir 1 µm boşluk. Hızlandırılmış parlak alan görüntü yakalanan edildi her 10 dönen disk confocal mikroskop ile donatılmış bir ters mikroskop kullanarak s. Ölçek bar, 20 µm. bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Takıma giren film 2. Penetrasyon bitkisel çekirdek ve sperm hücreleri ile bir 1 µm boşluk. Hızlandırılmış parlak alan ve floresan görüntü yakalanan edildi her 20 bir ters floresan mikroskop kullanarak s. Ölçek bar, 20 µm. bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol birkaç kritik adımda tam olarak yukarıda sunulan sonuçlar elde etmek için takip edilmesi gerekiyor. İlk olarak, katman ve cam alt çanak PDMS yüzeyler her ikisi de plazma ile yapıştırma önce yeterli süreyi için tedavi edilmelidir. Aksi takdirde, ipucu büyüyen hücreler microgaps geçiş yaparken PDMS katman yerel olarak cam yüzeyinden ayırmak. Başka bir önemli kök saç ve yosun protonemata protokol microdevice sterilizasyon adımdır. Normalde, kök tüyleri ve yosun protonemata hücreleri birkaç hafta içinde microdevice kültürlü olması gerekir. Cihazın sterilizasyon olmadan, mikroorganizmalar, hangi bu ipucu büyüyen hücrelerinin büyümesini etkileyebilecek güzelleşmek. Deneme içinde yarım gün bitmiştir beri polen tüpü cihazın sterilizasyon gibi kritik değildir. Polen tüpü cihaz sterilizasyon olmadan düzenli olarak kullandım ve herhangi bir istenmeyen etkisi deneme sırasında gözlemlemek değil.
Microchannel tasarım faiz hücreleri göre değiştirilmesi gerekir. Çalışmamızda, A. thaliana kök saç deneme için kullanılan kanal tasarım T. fournieri polen tüpü ve P. patens protonemata deneyler için kullanılan olandan farklı. Çünkü örnekleri farklı boyutları farklı cihazlar gereklidir; Örneğin, kök tüyleri polen tüpler ve yosun protonemata çok daha kısa. Bu nedenle, microgap bölgeleri ana kök kanalına bitişik öyle ki bizim kök saç aygıt tasarlanmıştır. Kanal tasarım yanı sıra kök saç aygıt hazırlanıyor yordamı da polen tüpler veya yosun protonemata için kullanılan yordamlar değişir. Polen tüp ve yosun protonemata çalışmalar için biz bir cam alt çanak karşı kapalı mikro ile tek bir PDMS katman içeren bir microdevice kullanılır. Ancak, iki PDMS katmanları kök tüyleri çalışmak için kullanılan bir aygıttan oluşur: bir microchannel ile üst tabaka (Derinlik: 200 µm) ana kök alt tabaka karşı kapalı için mikro içeren (Derinlik: 4 µm) kök tüyleri için. Silikon kalıp imal etmek istihdam edildi standart fotolitografi tekniği çevresinde 5:1 en-boy oranı sınırlıdır. Bu nedenle, geniş bir boşluk 1 µm oluşturmak için kanal yüksekliği için yaklaşık 5 mikron sınırlı olacaktır. Ayrıca teknik olarak tam olarak derin bir kanal hizalamak için zorlu 's (Örn., 200 µm) yakınındaki bir silikon kalıp üzerinde 1 µm geniş boşluk. Bu nedenle, biz ayrı PDMS katmanlar ana kök ve kök tüyleri için hazırlanan ve cihazın onları birlikte mühürleme tarafından inşa.
Bu iletişim kuralı başarıyla işlem polen tüplerinin microgaps (Tamamlayıcı film 1 ve 2), kök saç Imaging hızlandırılmış aracılığıyla büyüyen ipucu görselleştirmek için kullanıldı ve microgap bölge yosun protonemata uzama-cekti var olmak daha fazla zorlu bir iş. A. thaliana kök tüyleri kültürü için kullanılan microdevice içinde microgaps bulunduğu (4 µm) nerede yan kanallar yüksekliğini kök büyüme odası (200 µm), çok sığ bu nedenle çoğu kök tüyleri yan kanallarına devam edemiyor. Kök tüyleri yan kanal giriş bulsanız bile girdiklerinde tahmin etmek zordur. Microgap adlı kök saç büyüme hızlandırılmış görüntüleri yakalamak için resim alma için çoklu konumlarda yer alan için programlanmış otomatik bir sahne ile donatılmış bir mikroskop kullanarak öneririz. Bu tür araçları kullanılamaz duruma geldiğinde, yan kanalları girmiş, ancak henüz microgaps geçti değil kök tüyleri arama öneririz. A. thaliana kök saç büyüme hızının çok daha yavaş olduğu için (genellikle 1-2.5 µm/dak20) bundan T. fournieri polen tüplerinin (genellikle 22-23 µm/dk.19), o kök kıllar hızlandırılmış görüntülerini yakalamak mümkün olabilir Bu microgaps hakkında geçmeye vardır. Öte yandan, bir uzun süreli gözlem süresi yavaş büyüme oranı nedeniyle gerekli olduğu için yosun protonemata gözlemler sadece bu çalışma için kullanılabilir bir zaman hata sistemi gerektirir.
Burada sunulan mikrosıvısal yaklaşım bize ipucu büyüyen bitki hücreleri son derece dar alanlarda uzamış yeteneği çalışmaya olanak sağlayan ilk yöntemdir. Bu microdevices hücre duvarı sentezi ve ipucu büyüyen bütünlüğü ile ilişkili genlerin fonksiyonlarını araştırmak deneyleri eleme için yararlı olabilir onların penetrasyon yeteneği ile hücreleri. Ayrıca, Denais ve ark. 21 son zamanlarda bir nükleer zarf kopma gösterdi ve onarım mekanizması tarafından hazırlanan bir mikrosıvısal aygıt ve bu sınırlı bir alan üzerinden bir kanser hücresi sıkma polen kullanarak tüplerde benzer bir mekanizma var olup olmadığını incelemek mümkün olabilir bizim aygıt. Yeni geliştirilen bu deneysel platformu nasıl tek tek hücreler araştırmak için kullanılabilir için fiziksel olarak kısıtlı alanlarda cevap ve böylece bizim anlayışı ipucu-büyüme mekanizmaları geliştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Biz H. Tsutsui ve ö. Kurihara T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato hattı ve A. thaliana UBQ10pro::H2B-kes hattı, sırasıyla gibi transgenik bitkiler ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser Enstitüsü, dönüştürücü biyo-moleküller tarafından Nagoya Üniversitesi ve Japonya gelişmiş bitki bilim ağ destek verdi. Bu eser için mali destek sağlanan hibe tarafından Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (ERATO proje vermek yok. T.H. için JPMJER1004), yenilikçi alanlar ('ları üzerinde bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid JP16H06465 ve JP16H06464 T.H. için) ve Japonya toplum için zorlu araştırmacı araştırma (hibe No 26600061 için N.Y. ve grant NOS 25650075 ve 15 K 14542 YS için) promosyon bilim (JSP'ler) Grants-in-Aid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
