Summary
Onomkeerbare electroporation (IRE) is een niet-thermische ablatie techniek die wordt gebruikt voor de behandeling van lokaal Geavanceerd alvleesklierkanker. Een relatief nieuwe techniek zijn, de effecten van IRE op de tumorgroei slecht begrepen. We hebben een syngeneic muismodel ontwikkeld dat vergemakkelijkt bestudeert de effecten van IRE op alvleesklierkanker.
Abstract
Alvleesklierkanker (PC), een ziekte die ongeveer 40.000 patiënten elk jaar in de VS doodt, heeft met succes verschillende therapeutische benaderingen, met inbegrip van de veelbelovende immunotherapeutische strategieën vermeden. Onomkeerbare electroporation (IRE) is een niet-thermische ablatie techniek die tumor celdood zonder vernietiging van aangrenzende collagene structuren induceert, waardoor de procedure die moet worden uitgevoerd in tumoren zeer dicht bij de bloedvaten. In tegenstelling tot thermische ablatie technieken, IRE leidt tot geleidelijke apoptotic celdood, samen met onmiddellijke ablatie geïnduceerde necrose, en is momenteel in klinische gebruik voor geselecteerde patiënten met lokaal gevorderde PC. Een ablative, de specifieke procedure van de niet-doelsoorten zoals IRE kan leiden tot een groot aantal reacties in de communicatie van de tumor. Een paar studies de effecten van IRE op tumorgroei in andersoortige tumor hebben aangepakt, maar geen hebben gericht op de PC. Wij hebben een syngeneic muismodel van PC waarin subcutaan (SQ) en orthotopic tumoren kunnen succesvol worden behandeld met IRE in een sterk gecontroleerde omgeving, vergemakkelijken van verschillende longitudinaal onderzoek post procedure ontwikkeld. Deze diermodel fungeert als een robuust systeem te bestuderen van de effecten van IRE en manieren ter verbetering van de klinische werkzaamheid van IRE.
Introduction
Alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PC) naar verwachting de tweede belangrijke doodsoorzaak kanker in de VS rond 20201geworden. De overgrote meerderheid van de patiënten gediagnosticeerd met PC zal uiteindelijk sterven van verre gemetastaseerde ziekte2. De PC-communicatie is notoir immunosuppressieve en chemoresistant. Haar desmoplastic stroma bevat een schaarste van effector (anti-tumor) T-cellen en een prominentie van immunosuppressieve leukocyten, met inbegrip van tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs), myeloïde afgeleide suppressor cellen (MDSCs) en regelgevende T cellen (Tregs)3 . Deze liggen ten grondslag aan de noodzaak te ontwikkelen van multimodale strategieën die deze van de communicatie gevolgen.
IRE is ontwikkeld als een niet-thermische methode van tumor ablatie. In tegenstelling tot thermische ablatie technieken, IRE veroorzaakt geen snelle coagulative necrose, maar in plaats daarvan leidt tot geleidelijke apoptotic cellen dood4. Vooral voor alvleesklier tumoren, IRE is niet kwetsbaar voor "heat sink" effecten en vlakbij bloedvaten5kan worden uitgevoerd. Deze technologie heeft 510(k) clearance van de FDA-6 en klinisch, momenteel voor geselecteerde patiënten met lokaal gevorderde of borderline resectable pancreatic kanker wordt gebruikt. Ongeveer in de grootste gepubliceerde reeks van IRE voor PC7was de mediane overleving van patiënten die een IRE dubbele de overleving van patiënten behandeld met moderne chemotherapie alleen zonder resectie8,9.
Verschillende studies hebben aangetoond dat thermische ablatie induceert een systemische immuunrespons bij andere typen van de tumor (herzien in Chu et al. 10). RadioFrequente ablatie (RFA) in dierlijke tumor modellen leidt tot een verhoogde T cel infiltreert11,12, waaronder een verhoging in geactiveerde natural killer (NK) cellen van hepatocellulaire kanker patiënten13, 14, en een afname van de immunosuppressieve Tregs in long kanker patiënten15. Een veel kleiner aantal studies hebben onderzocht immuun, microenvironmental, en schade reacties op IRE16. IRE is aangetoond dat het stimuleren van een systemische immuunrespons bij immunocompetent Muismodellen waarin de groei van secundaire (contralaterale) renaal cel allografts was verminderd of voorkomen door het IRE van een primaire tumor twee weken eerder17. Zij ook opgemerkt dat immunocompetent muizen minder spanning voor volledige regressie vereist dan deed immuungecompromitteerde muizen. Het heeft zijn veronderstelde dat IRE in betere antigeen presentatie in vergelijking met de coagulative necrose van thermische ablatie resulteren kan, maar dit is niet specifiek bestudeerd.
Hebben we een syngeneic muismodel van PC van de KPC-Luc 4580 cellijn (geschenk van J.J. Yeh aan de Universiteit van North Carolina), die was afgeleid van een tumor die ontwikkeld in een mannelijke LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + muis, de lokale en systemische effecten van IRE18,19te bestuderen. Deze cellijn luciferase-uiten is immunogeen en ook tumorigene in immunocompetent C57BL/6 muizen wanneer geïnjecteerd SQ of orthotopically en betrouwbaar lever metastasen produceert wanneer geïnjecteerd in de milt. We hebben gebruikt een programmeerbare blokgolf-puls generator om te leveren 100-µs pulsen van elektriciteit op een spanning/afstand ratio van 1.500 V/cm met behulp van een twee-naald matrix sonde (gescheiden door 5 mm) of platina pincetten-trodes aan SQ of orthotopic tumors, respectievelijk, in muizen voor het model van de gevolgen van IRE in een klein dier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven uitgevoerd na die dit protocol moet worden goedgekeurd door het respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Alle procedures die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door IACUC UCSD.
1. aanschaffen van geadresseerden dieren
Opmerking: De KPC-Luc 4580 cellijn werd opgericht uit een tumor die zich voordoen in een LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + muis (KPC), die een genetisch gemanipuleerde model van PC op een achtergrond van C57BL/6 is. Het voordeel van deze cel regel is dat het constitutively spreekt luciferase-enabling tumor toezicht op orthotopic modellen. Andere cellijnen kunnen echter ook worden gebruikt, zolang zij verenigbaar met de genetische achtergrond van de ontvangende muizen zijn.
- Vooraf bepalen van de experimentele groepen en het aantal dieren per groep.
- Kies de leeftijd (6 - 10 - weken oude muizen aanbevolen) en geslacht van de dieren wordt gebruikt volgens de hypothese en de cellijn gebruikt.
2. cultuur cellen
- Gebruik Dulbecco gewijzigd van eagle medium (DMEM): nutriënten mengsel F12 (50:50) media dat 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine antibioticum (volledige groei media) om te groeien van KPC-Luc 4580 cellen bevat.
- Indien bevroren, Ontdooi de cellen 4 dagen voorafgaand aan de implantatie van de tumor.
- Groeien de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% vochtigheid onder aseptische condities.
- Trypsinize van de cellen met 0,25% trypsine gedurende 5 minuten bij 37 ° C voordat ze bereiken > 80% confluentie en neutraliseren van de trypsine door tweemaal de omvang van de volledige groei media toe te voegen.
Opmerking: Deze cellen niet stel tumoren efficiënt in muizen als ze worden gebruikt bij 100% confluentie of als ze zijn gepasseerd voor meer dan 12 keer. Daarom is het aan te raden om de cellen bij eerdere passages onder optimale confluentie bevriezen. - Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en ga verder met tumor-inductie als adequate nummers aanwezig zijn (0.5 - 1 x 106 cellen/muis). Als dat niet het geval is, vouwt u de cellen voor één meer passage uit totdat voldoende cel nummers worden verkregen.
3. de inductie van SQ tumoren
- Voorbereiding van de benodigde materialen: P1000 en P100 pipetten en tips, 1 mL spuit, 25G naalden, kelder membraan matrix (BMM), DMEM basale media, 1.5-mL Centrifugeer buizen. Houd alle materialen, steriele en koud (4 ° C) tot het einde van de procedure. Ook houden Tondeuses en alcohol swabs dierlijke gebruiksklaar.
- Trypsinize (per stap 2.4) en de cellen tellen en resuspendeer hen bij een concentratie van 2-4 x 107 cellen/mL koude DMEM.
- Voeg een gelijk volume van 100% BMM te maken van een definitieve celsuspensie in 50% BMM. Het eindvolume moet bedragen 50 µL celsuspensie voor elke muis nodig. Bereiden van 10% in overmaat aan de dode ruimte in de spuit en voor eventuele pipetting fouten.
- Aliquot de schorsing in 550 µL volumes in 1,5 mL centrifuge buizen geplaatst in ijs.
- Beperken van de dieren (6 - weken oude mannelijke C57BL/6 muizen) met behulp van een afdekking of handmatig.
Opmerking: U kunt ook muizen kunnen worden verdoofd met 2,5% Isofluraan in zuurstof gas bij een debiet van 2 L/min met behulp van een vaporizer precisie. - Scheren van de plaats van injectie, die bij voorkeur op een flank boven een been, met behulp van een klipper. Met behulp van een alcohol doekje, reinig de plaats van injectie tweemaal.
- 250 µL celsuspensie tekenen op een eindconcentratie van 1-2 x 107 cellen/mL in een koude spuit van 1 mL en eventuele luchtbellen te verwijderen door de zuiger op en neer te bewegen. Hechten van een 25G naald op de spuit en zorg ervoor dat de ruimte binnen de naald te vullen.
- Steek voorzichtig de naald onder de huid in een hoek van 30° naar het lichaam in de buurt van de flanken, ervoor te zorgen dat de naald niet de peritoneale holte of de spieren van de ledematen doorboren doet.
- De naald evenwijdig aan het lichaam plat en afvlakken van rimpels op de huid. Langzaam injecteren 50 µL celsuspensie. Houd de naald op de plaats van injectie voor 10 s tot het toestaan van de BMM te stollen ter voorkoming van lekkages.
- Langzaam trekt de naald parallel zonder een zijwaartse beweging te houden. Zachtjes de plaats van injectie met een alcohol doekje schoon en laat de muisknop los om de behuizing.
Opmerking: Als de muis was verdoofd tijdens de procedure, volgen het dier totdat het herwint zijn restarmen reflexen. - Toezicht op de groei van de tumor die regelmatig met remklauwen totdat zij 5 mm in diameter tot.
4. de inductie van Orthotopic tumoren
- Voorbereiding van de benodigde materialen. Autoclaaf de chirurgische hulpmiddelen zoals scharen, scalpels, naald chauffeurs, en wees en flat-tipped pincet. Houd handig steriele hechtingen (absorbeerbare 6-0 en niet-absorbeerbare 4-0), alcohol swabs, tondeuses, ontharende room, oog smeermiddel, katoenen gaas, 10% Povidon jodiumoplossing, afdeklakens, verwarmingskussens, buprenorfine, en verdoving agenten.
- Euthanaseren van een donor-muis (bij voorkeur van de zelfde achtergrond nodig voor het orthotopic-model) dragen een tumor van de SQ KPC met behulp van een langzame vulling CO2 -kamer. Accijnzen de SQ tumor zorgvuldig onder steriele omstandigheden in een BSL-2 kap met steriel pincet en microscissors kort voor orthotopic implantatie. Tijdens de tumor excisie oppassen niet doorprikken de peritoneale Holte en wassen van de tumor onmiddellijk met 2 uitwisseling van steriele PBS.
- Met behulp van steriele scalpels, mince de verwijderde tumor in 1 mm3 stukjes, leg ze op een petrischaal met koude steriele DMEM basale media en bewaren in de ijskast tot implantatie.
- Beheren van de ontvangende muis 0,05 - 1 mg/kg buprenorfine pijnstiller SQ, 30 min. vóór de ingreep.
- Anesthetize de geadresseerden muizen met 2-3% Isofluraan in zuurstof (2 L/min) met behulp van een vaporizer precisie (of andere verdoving agenten). Muizen op een 37 ° C houden en verwarming pad voor het geheel van de procedure. Toepassing smeermiddel op de ogen ter voorkoming van uitdroging. Testen van de diepte van de verdoving door gebrek aan verrassende reflex in eerste instantie, en bevestig chirurgische vliegtuig verdoving door het ontbreken van pedaal reflex naar een snuifje zachte teen. De narcose handhaven gedurende de gehele chirurgische procedure.
- Plaatst u de muisaanwijzer op zijn rug en zet hem voorzichtig aan de rechterkant zodat de linkerkant van de buik is blootgesteld. Verwijder het buikhaar van de muis met behulp van ontharende room en reinig met gaas om ervoor te zorgen dat geen gratis haar treedt de buik post incisie. De linker buik voorbereiden op operatie met behulp van 3 cycli van 10% Povidon jodium gevolgd door alcohol doekjes desinfecteren van de huid.
- Met een steriel scalpel, maken een 1,5 cm dwars- of schuine snede in de huid, 1 cm aan de linkerkant van de middellijn, onder de ribbenkast, iets mediaal aan de milt. Vervolgens de incisie door de abdominale spieren, spiegeling van de bovenliggende oppervlakkige incisie uitbreiden
- Zoek de milt met platte getipt pincet en voorzichtig het belichamen van de buikholte. Intrekken van de milt met behulp van een steriele katoen-applicator, en vinden de staart van de pancreas gekoppeld aan de onderkant van de milt.
- Met behulp van flat-tipped pincet, trekken de staart van de pancreas lateraal.
- Een fijn gehakt tumor stuk Pick-up van de muis van de donor met het puntje van een boete (6-0) steriele hechten naald en plaats met behulp van steriele pincet.
- Terwijl zachtjes keuzemenu de staart/body van de alvleesklier lateraal, plaatst u de naald van de hechtdraad met tumor fragment in de staart van de pancreas. Het doorgeven van de hechtdraad langzaam door het weefsel, houden van de tumor in contact met de alvleesklier staart. Toepassing van één of twee extra hechtingen afhankelijk van het fragment van oriëntatie ten opzichte van het weefsel.
- Verwijder de naald volledig uit het weefsel en houd de alvleesklier/milt externalized voor een extra 60 s terwijl het inspecteren op eventuele tekenen van bloeding of lekkage. Vervolgens internaliseren hen zachtjes in de buikholte met behulp van botte pincet.
- Sluit de abdominale spieren met behulp van een 6-0 absorbeerbare hechtdraad met ofwel een doorlopend of onderbroken steek, en sluit de bovenliggende huid met behulp van een 3-0 en 6-0 niet-absorbeerbare onderbroken hechtdraad. Op dit punt te stoppen met de narcose.
- Laat de muis om te herstellen in zijn kooi met gratis toegang tot voedsel en water. Plaats de kooi op een verwarming pad om terugwinning te vergemakkelijken. Het bewaken van vitale functies zoals ademhaling, perfusie, etc., tijdens het herstelproces.
- Bevestig de tekenen van de wetswijziging van reflex, zodra de muis herstelt, en vervolgens terug de kooi kan tot reguliere huisvesting.
- Beheren van buprenorfine 0.05 - 0.1 mg/kg 8-12 h na de operatie, en elke 8-12 h na de procedure zo nodig voor tekenen van pijn.
- Controleren van de tumorgroei met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem (Zie de Tabel van de materialen).
- Volg tumorgroei door imaging beginnen op dag 4 na orthotopic implantatie en imaging tweemaal per week uit te voeren.
- Op de dag voor imaging, beheren (intraperitoneale injectie) 30 mg/kg D-luciferine tot een narcose (2-3% Isofluraan in zuurstof (2 L/min)) ontvangende muis 10 min voorafgaand aan de beeldvorming.
- Afbeelding voor luciferase activiteit met de luminescentie instelling zonder geen emissie filters voor een minimum van 5 s blootstelling in een luminescentie imager met auto-fluorescentie gratis verwarmd fase en terwijl nog het handhaven van de verdoving voor de muizen.
5. IRE van SQ tumoren
- Voorbereiding van de benodigde materialen: vierkant Golf electroporator, veiligheid voetschakelaar, elektroden (naald array versus pincetten-trode) en adapters. Steriele hechtingen (niet-absorbeerbare 4-0), alcohol swabs tondeuses, ontharende room, oog smeermiddel, katoenen gaas, buprenorfine en verdoving houden ook in de buurt.
- Steriliseer de pincet of naald matrix elektroden met behulp van gas sterilisatie. Autoclaaf wordt niet aanbevolen. Met een glazen kraal sterilisator kunt steriliseren van de elektroden tussen dieren.
- Beheren van buprenorfine 0.05 - 0.1 mg/Kg tot de tumor-dragende muizen 30 min. vóór de ingreep.
- Volg stappen 4.4-4.5 voor met succes het induceren van verdoving in muizen zodra het implantaat SQ tumor 5 mm doorsnede tot.
- Plaats de narcose muis op zijn kant tot de SQ tumor op de flank. Verwijder de haren met behulp van de tondeuse en schone huid met behulp van een alcohol doekje.
- Gebruik 2-naald matrix elektroden voor SQ tumoren. De huid direct onder de tumor-site met behulp van de verlostang verheffen en voeg de elektroden via de huid die evenwijdig aan het lichaam ervoor te zorgen dat ze doen niet doordringen tot de peritoneale holte. Eenmaal via de huid, positie van de elektroden op zodanige wijze dat ze de tumor beugel.
- Het programma van de electroporator te leveren 100 µs pulsen met een frequentie van 1 Hz bij 1.500 V/cm voor een totaal van 150 pulsen. Leveren de pulsen met behulp van het voetpedaal. Elke set van 10 pulsen scheiden door 10 s, om te zorgen voor warmteafvoer en bevestigen van de juiste positie van de elektroden.
Opmerking: Zonder het gebruik van PARALYTISCHE (kinderverlamming) agenten, de muizen beleeft spiercontracties met IRE die leiden tot verplaatsing van de elektroden, kunnen tenzij handmatig beveiligd zijn. - Verwijder de elektroden na volledige dosering, die mag niet groter zijn dan 200 s. Record de werkelijke spanning geleverd, die wordt weergegeven op de electroporator. Laat de muizen te herstellen na IRE per stappen 4.14-4.16.
6. IRE van Orthotopic tumoren
Opmerking: IRE van orthotopic tumoren impliceert een tweede operatie van het overleven op de dezelfde muis dus het vereisen van speciale goedkeuring van lokale IACUC vóór begin.
- Voorbereiden van benodigde materialen: autoclaaf de chirurgische hulpmiddelen zoals schaar, scalpels, chauffeurs van de naald, pincet wees, en plat getipt pincet. Houd het volgende in de buurt zo goed: steriele hechtingen (absorbeerbare 6-0 en niet-absorbeerbare 4-0) alcohol swabs, tondeuses, ontharende room, oog smeermiddel, katoenen gaas, 10% Povidon jodiumoplossing, afdeklakens, verwarmingskussens, blokgolf electroporator, veiligheid voetschakelaar, elektroden en hun adapters buprenorfine en anesthetica.
- Beoordelen van de muizen voor orthotopic tumorgroei door in vivo imaging (zie stap 4.17) door het injecteren van 30 mg/kg D-luciferine intraperitoneally.
Opmerking: De orthotopic tumoren zijn ideaal voor IRE behandeling 8 tot 10 dagen post implantatie wanneer de tumoren zijn duidelijk zichtbaar en nog steeds beperkt tot de alvleesklier zoals kan worden gezien op de Luciferase luminescentie beelden (Zie de Vertegenwoordiger resultaten). - Volg stappen 4.4-4.9, voor het zoeken van de geïmplanteerde tumor. Als de tumor niet gemakkelijk is te vinden, gebruikt u blunt-nosed tang te verplaatsen van de maag en de milt zachtjes te identificeren van de tumor.
- Belichamen van de tumor met een botte nosed tang en vastleggen van de tumor strak met de platina-elektroden voor de pincetten-trode. Leveren de electroporation pulsen zoals geprogrammeerd in stap 5.7 met behulp van de blokgolf-electroporator in sets van 10 pulsen gecontroleerd door de voetschakelaar.
- Houd de tumor externalized voor ten minste 60 s post IRE om te controleren op tekenen van bloeding. Plaats van de tumor terug in de buikholte en sluit de insnijding als beschreven eerdere (stappen 4.13-4.16) en volgen van de muis totdat het herstelt.
- Monitoren van de effecten van IRE op tumorgroei met behulp van in vivo imaging-luciferase per stap 4.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We volgde de procedure hierboven beschreven en SQ tumoren gegenereerd op 5-6 week oude wild type C57BL/6 muizen met 1 x 106 cellen met 50 geënt % BMM. Wanneer de grootte van de tumor bereikt 5-6 mm diameter, een paar van de muizen waren euthanized, hun tumoren waren weggesneden, en orthotopically in een ontvangende C57BL/6 muizen geïmplanteerd. IRE was uitgevoerd 10 dagen post implantatie zoals weergegeven in de tijdlijn op Figuur 1. IRE werd uitgevoerd op de resterende muizen die SQ tumoren.
In SQ tumoren, de IRE spanning en pulsstand duur werden constant gehouden op 1.500 V/cm en 100 µs, respectievelijk, maar het aantal pulsen gevarieerd. Figuur 2 toont dat de SQ tumoren in een paar muizen na 150 pulsen van IRE, maar niet zo goed met 75 pulsen volledig is achteruitgegaan. In totaal 4 van 9 muizen bleek volledig tumor regressie na 150 pulsen van IRE. Histologische analyse van tumor weefsel 1 week post IRE toonde grote gebieden van centraal tumor necrose die niet werden gezien in controle van onbehandelde tumoren. Deze necrotische kern werd geflankeerd door levende tumor weefsel in geval van onvolledige tumor regressie (Figuur 3). Geslaagde implantatie van een orthotopic tumor was ook bereikt, en de groei werd gecontroleerd met behulp van in vivo bioluminescentie imaging tumor tonen op dag 10 en dag 15 (Figuur 4) na implantatie. IRE op 150 pulsen ook bewezen effectief te zijn in orthotopic tumoren (Figuur 5) tonen verminderd tumor volumes. Over het geheel genomen, deze resultaten tonen aan het vermogen van dit model te simuleren van de effecten van IRE in een immunocompetent muismodel, waardoor een platform om verschillende IRE voorwaarden en combinaties voor de behandeling van PC te testen.
Figuur 1 : Schematische weergave toont de tijdsverloop van tumor implantatie en IRE. Voor SQ tumoren, wordt IRE uitgevoerd zodra de tumor 5-6 mm diameter bereikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Luciferase-bioluminescentie imaging geeft een vermindering in de tumor groei post IRE in vierkante model. KPC-Luc cellijn spreekt constitutively luciferase waardoor het haalbaar is om de tumorgroei in reactie op IRE in real-time controleren. Dag 14 bioluminescentie imaging post die IRE de volledige regressie van de tumor in een van de muizen toont behandeld met 150 pulsen van IRE, overwegende dat onvolledige regressie werd gezien met 75 pulsen van IRE in vergelijking met de onbehandeld controlegewas. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Haematoxyline en eosine kleuring van tumor weefsel ziet u de wijzigingen in de architectuur van het weefsel post IRE. SQ tumoren blootgesteld aan IRE toonde grote gebieden van necrose centraal, omgeven door gebieden van levend weefsel die ontoereikende IRE dekking in sommige gevallen aangeeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Bioluminescentie imaging toont de geslaagde implantatie van orthotopic tumor en haar groei na verloop van tijd. Beelden werden genomen met behulp van een commerciële bioluminescentie imaging instrument met de luminescentie gevangen bij 1 min blootstelling. De muizen waren geïnjecteerd met 30 mg/kg D-luciferine oplossing intraperitoneally 10 minuten vóór imaging. Muizen hielden verdoofd met behulp van 2% Isofluraan tijdens de procedure. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : IRE induceert vermindering van de groei van de tumor in orthotopic PC tumoren. (A) Bioluminescecnce beelden van muizen herbergen orthotopic PC toonde verminderde luciferase signaal 7 dagen na IRE in vergelijking met sham chirurgie suggereren verminderd live tumor lasten als gevolg van het IRE. (B) gemiddelde hoeveelheid verwijderde orthotopic tumoren (+ standaardfout) in controle muizen vs. muizen die onderging IRE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we een immunocompetent muismodel aangetoond voor PC die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van IRE op de tumorgroei. IRE wordt momenteel gebruikt als een niet-thermische ablatie techniek alleen in zeer geselecteerde lokaal gevorderde PC-patiënten die niet over de progressie van de verre ziekte na maanden van preoperatieve therapie beschikken. Het gebruik ervan is derhalve beperkt omdat de meeste patiënten met lokaal gevorderde PC ontwikkelen verre gemetastaseerde ziekte20. Dit model zal dienen als een basis voor studies om te evalueren van de effecten van IRE op PC met behulp van verschillende parameters van de uitgebreide behandeling en combinaties.
De meest belangrijke ding om te overwegen tijdens het protocol is de grootte van de tumor waartegen IRE wordt uitgevoerd. De verkrijgbare sondes voor muizen modellen zijn beperkt door hun elektrode afstand (5-10 mm). Vandaar, tumoren aanzienlijk groter is dan de elektrode afstand, onvolledige ablatie plaatsvindt. Voor SQ tumoren, wordt het gebruik van 2-naald matrix elektroden over pincetten-trodes aanbevolen als de huid rond de tumor de weerstand om de stroom van huidige in pincetten-trodes verhoogt. De beperking van de grootte van de elektroden 2-naald array kan worden overwonnen door het uitvoeren van het IRE op verschillende diepten en hoeken in de dezelfde tumor; Deze aanpak maakt het echter moeilijk te behandelen van tumoren uniform. U kunt ook voor grotere tumoren (tot 10 mm), een snede gemaakt kan worden op de huid onder de tumor op een lengte iets langer dan de diameter van de tumor. De tumor kan vervolgens worden externalized via de incisie door het omkeren van de bovenliggende huid met behulp van de verlostang. De tumor kan vervolgens worden behandeld met pincetten-trodes, vergelijkbaar met de hierboven beschreven orthotopic-tumoren. De electroporated-tumor kan dan opnieuw worden opgenomen onder de huid en de huid met een 4-0 van niet-absorbeerbare hechtdraad als een onderbroken steek ingehecht. Echter, de effecten van de incisie kunnen de effecten van IRE beschamen, en we hebben gevonden dat uitvoeren IRE wanneer de tumoren binnen de afstand van de twee-naald matrix-elektroden zijn (~ 5-6 mm) biedt de beste standaardisatie.
Ongeacht de benadering moet het aantal pulsen empirisch worden vastgesteld afhankelijk van het type van de tumor. Gepubliceerde studies hebben gebruikt tussen 150-300 pulsen op deze spanning17. Echter vastbesloten wij het optimale aantal pulsen in een voorlopige dosis-respons-experiment. Er zijn modellen om te voorspellen van de zone van volledige ablatie op basis van spanning en elektrode afstand, maar tumor typen kunnen sterk variëren in vasculariteit en fibrose, die gevolgen voor de reactie op electroporation21 hebben kan.
Elke set van 10 pulsen werd gescheiden door 10 s om te voorkomen dat de verwarming-effecten die optreden als teveel pulsen te snel worden geleverd. Overmatige behandeling kan resulteren in thermische ablatie, waardoor nauwkeurige karakterisering van de gevolgen van niet-thermische IRE kan. De 10 s interval ook stelt ons in staat om te vaak bevestigen elektrode plaatsing nauwkeurig omdat spiercontracties elektrode verplaatsing kunnen veroorzaken. Onze IACUC heeft nog niet het gebruik van PARALYTISCHE (kinderverlamming) agenten in kleine dieren, die sterk spiercontracties tijdens IRE verminderen kunnen toegestaan. In het geval van orthotopic tumoren, de pincetten-trodes laat ons toe om de tumoren strak te houden en hebben een grotere elektrode oppervlakte in vergelijking met de naald elektrode.
Hoewel IRE momenteel slechts gebruikt als een ablatieve procedure in de klinische setting, electroporation in het algemeen heeft een breed spectrum van toepassingen variërend van zenuw en spier activeringen tot levering van verschillende drugs en oligonucleotides. Door het zorgvuldig analyseren de pathofysiologische veranderingen tijdens en na het IRE met behulp van dit model, is het mogelijk om talloze therapeutische strategieën voor PC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante financiële informatie.
Acknowledgments
RRW heeft steun gekregen voor dit werk een collaboratieve translationeel onderzoek verlenen, gefinancierd door de San Diego C3 Padres pedaal de oorzaak (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013. , http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/ (1975).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation. Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).
- Charpentier, K. P. Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet? Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).
- Narayanan, G. Irreversible Electroporation. Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).
- Martin, R. C. 2nd Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy. Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).
- Belfiore, M. P., et al. Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience. Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).
- Belfiore, G., et al. Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer. Med Oncol. 34 (3), 38 (2017).
- Chu, K. F., Dupuy, D. E. Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy. Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).
- Wissniowski, T. T., et al. Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).
- Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma. Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).
- Zerbini, A., et al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).
- Ali, M. Y., et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).
- Fietta, A. M., et al. Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer. Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).
- Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy. IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).
- Neal, R. E. 2nd, et al. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS One. 8 (5), e64559 (2013).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Safran, M., et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination. Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).
- Martin, R. C. 2nd, McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival. Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).
- Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).
