Summary
我们描述了一个立体定向手术的协议, 一个自制的头固定装置 microinjecting 试剂进入新生鼠脑纹状体。这种技术允许在新生小鼠大脑特定区域的神经细胞中进行基因操作。
Abstract
许多基因是在胚胎大脑中表达的, 其中有些是在出生后大脑中不断表达的。对于这种持续表达的基因, 它们可以调节新生儿大脑的发育过程和/或生理功能。为了研究大脑中特定基因的神经生物学功能, 在脑中灭活基因是必不可少的。在这里, 我们描述了一个简单的立体定向的方法, 以灭活基因表达在转基因小鼠在新生儿时间窗口。AAV eGFP 病毒通过立体定向脑外科术, 杏仁于产后 (P) 2 Ai14 报告基因小鼠纹状体。在 P14 纹状体中检测到 tdTomato 报告基因表达, 提示 AAV 转基因细胞中成功的 loxP 介导的 DNA 重组。我们进一步验证了这一技术, 通过 microinjecting AAV eGFP 病毒的 P2Foxp2佛罗里达州/佛罗里达州小鼠。荧光蛋白和 Foxp2 的双重标记表明, gfp 阳性细胞在 P9 纹状体中缺乏 Foxp2 免疫反应, 提示 AAV eGFP 细胞 Foxp2 蛋白质的丢失。这些结果表明, 在 floxed 转基因小鼠的新生儿脑中, stereotaxically 杏仁 AAV eGFP 病毒对特定神经元群有有效的遗传缺失。总之, 我们的立体定向技术为新生小鼠大脑中的基因操作提供了一个简单的平台。该技术不仅可以用于删除新生儿大脑特定区域的基因, 而且还可用于注射药理药物、神经元示踪剂、基因修饰光遗传学和 chemogenetics 蛋白、神经元活动指标和其他试剂进入新生鼠脑纹状体。
Introduction
现代对大脑结构和功能的研究通常需要神经元细胞中特定基因的基因调控。为了探讨不同基因的功能, 转基因小鼠携带突变等位基因, 包括敲除和敲入的基因, 已被常规生成。成人啮齿动物立体定向脑外科是一种标准的方法, 当地提供药物, 病毒, 示踪剂和其他试剂到特定区域的啮齿动物大脑1,2。将立体定向脑外科应用于转基因小鼠, 允许基因调控小鼠大脑特定神经元群中的基因功能和神经元活动。细胞类型特定的操作提供了一个强大的方法来破译神经元功能的复杂神经回路的大脑3,4,5。
神经系统的神经发育始于早期胚胎阶段, 发育过程在出生后持续到幼年期。神经系统的产后成熟包括神经回路的精确突触布线, 这对于大脑6的生理和认知功能是必不可少的。因此, 研究新生儿时间窗发生的发育事件, 不仅对了解正常的神经发育有重要意义, 而且还可以为神经发育和精神疾病的发病机制提供深入的认识7 ,8。虽然成人啮齿目动物的立体定向脑外科手术方法29, 但在互联网上有少量的协议可供新生小鼠10,11的立体定向脑外科手术使用。事实上, 在新生小鼠幼崽的大脑中对试剂进行立体定向 microinjections 是困难的, 因为新生儿幼犬的头部太脆弱, 无法固定在标准的立体定向设备中。然而, 在转基因小鼠中应用立体定向脑手术是可行的12。在这里, 我们描述了一个简单的方法, 自制的设置, 进行立体定向脑外科手术的新生鼠幼崽。我们证明, 这种技术允许一个有条件地删除 floxed 基因 microinjecting AAV 表达的 DNA recombinase 到报告基因小鼠纹状体和有条件 floxed 转基因小鼠。该技术也适用于向野生型小鼠的新生纹状体提供试剂。
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Protocol
这里所描述的动物协议已经得到国立阳明大学动物保育委员会的批准。
1. 在立体定向装置中制备新生儿幼崽的支架
- 制作头托盘: 将1.5 毫升离心管 (15 毫米长) 的底部切割成适合新生儿幼崽头部的形状, 并除去1/5 的管壁。
- 取一个合适大小的吸管尖盒, 适合于立体定向设备的底座, 并取下顶盖。将步骤1.1 中的头托盘和组织嵌入盒贴在热熔胶粘剂的刀尖托盘底座上。组织嵌入盒的高度为7毫米, 用于支撑幼犬的颈部和身体在头部固定位置。
- 将整个设置放置在标准的立体定向设备中。
2. 30G 注射用不锈钢针的制备
- 用氯仿浸泡3天前清洁30G 注射器针。
- 使用镊子小心, 慢慢地从它的聚丙烯轮毂在一个化学罩拔出针。
- 用绝对乙醇清洗针头20分钟后, 70% 乙醇漂洗 3 x 10 分钟在一个振动筛在 50 rpm。让针头风干, 并将清洗过的针头储存在室温 (RT) 的清洁箱中, 直到使用。
3. 准备用于微注射油管的适配器
- 用 PE10 聚乙烯管 (PE10 管) 将微升注射器连接到30G 注射针。准备一 PE20 聚乙烯油管 (PE20 管) 适配器, 用于连接注射针和微升注射器。使用适配器是必要的, 因为 PE10 管的直径比26G 微升注射器的针头小得多。
- 准备微升注射器的油管: 用5厘米的 PE20 管连接预清洗的30G 注射针, 并用即时胶水密封接头。这种油管适配器是可重用的。
注: 如果注射注射器的针头为 30G, 则不需要此适配器的准备 (步骤 3.1) 和使用 (步骤 3.3)。 - 用微升注射器 (10 µL) 将油管适配器 (在步骤3.1 中制备) 连接起来。
- 将 PE10 管的一端连接在 PE20 油管适配器的30G 针上 (不超过60厘米)。将新的30G 注射针安装到 PE10 管的另一端。
4. 用蒸压蒸馏水、染料和病毒装载微注射管
- 取出微升注射器的柱塞。使用25G 注射器加载微升注射器及其连接的 PE 管与蒸压蒸馏水, 以消除空气从油管。
- 将柱塞放回微升注射器, 并推入柱塞直到2µL 的蒸馏水留在桶中。不要让蒸馏水的体积低于2µL。
- 小心地将微升注射器安装在微流速注射器泵上。
- 吸管少量0.1% 快速绿色染料 (准备在0.9% 盐水和过滤与0.22 µm 过滤器) 和病毒液体到一块 parafilm。
- 提取少量空气, 使气泡在30G 注射针和 PE10 管之间的连接处可见, 然后将0.7 µL 过滤后的快速绿色装入管内, 以测试微注射油管中的流体流动。
- 取出另一小部分空气, 使第二个气泡接着将病毒液体装入微注射油管。
- 将30G 显微注射针固定在立体定向装置的手臂上。
5. 低温对新生小鼠的麻醉作用
- 把小狗放在乳胶手套袖子里, 把它浸泡在被粉碎的冰上, 脖子上5分钟。
- 用镊子捏住幼崽的脚, 以确保它的脚没有退缩反应。
- 将小狗与乳胶手套套放在头托盘, 并在乳胶套周围放置一些粉碎冰, 以保持它冷低温麻醉。
- 在小狗眼中应用兽医软膏, 以防麻醉时的干燥, 如果可能的话。
6. 显微注射
- 用70% 乙醇彻底擦拭立体定向仪, 制备无菌手术。将手术器械浸泡在70% 乙醇中消毒。
- 用70% 乙醇擦洗幼崽的头部。找到头骨上的地标 lambda 并用标记笔标记 lambda。将针尖对准 lambda, 将前后 (AP) 和内侧侧 (ML) 坐标设置为零。
- 根据目标站点的 X 和 Y 坐标将注射臂移动到目标站点。对于产后日 (P) 2 只幼崽的纹状体, 其座标为: AP, +2.4 毫米前的 lambda;ML, ±1.0 毫米侧向中线;背腹 (DV), −1.7 毫米从头骨。用钢笔标记 PE10 管内快速绿色染料的位置。
- 把30G 注射针慢慢地穿透皮肤和头骨, 然后把针尖拉起来, 直到它在头骨的表面停止。将 DV 坐标设置为零。
- 慢慢降低30G 注射针, 直到到达目标站点的 DV 坐标。等待1分钟, 让实质恢复其正常形状。运行微注射程序 (100 nL/分钟)。
- 确保快速绿色染料的标记在 PE 管中移动, 以确保病毒液体注入大脑。
- 在微注射结束后等待1分钟, 然后慢慢地将针从1/2 高的 DV 深度上升到三十年代以内。三十年代以后, 慢慢地从幼崽的头上取出针头。
- 重复步骤6.2 至 6.7, 直到所有目标站点的 microinjections 完成。
7. 幼犬术后恢复
- 在33摄氏度孵化器中热身20分钟的幼崽。检查幼犬从低温麻醉中恢复每5分钟, 直到幼犬恢复足够的意识, 以维持胸骨卧床。
- 幼崽完全恢复后, 把幼崽送回大坝。
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Representative Results
在第一组实验中, 我们杏仁了 200 AAV9 的 hSynapsin. eGFP WPRE SV40 病毒 (AAV eGFP, 1/10 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水稀释), 表达了与 GFP 的 DNA recombinase 与绿色荧光蛋白融合为 P2 小鼠的 Ai14 纹状体。Ai14 小鼠在 tdTomato 的 loxP 侧 (floxed) 停止盒 (图 2F) 的基础上, 表达了对该基因的报道。大脑是在 P14 染色的 GFP 和 tdTomato 中收获的。许多 AAV 转基因 GFP 阳性细胞存在于整个纹状体 (图 2A, C), 表明广泛感染的巴细胞 AAV-eGFP 病毒。类似的广泛表达 tdTomato 也发现在纹状体 (图 2B, C)。经显微检查, 在高倍率, 我们发现几乎所有 GFP 阳性巴细胞共同表达的 tdTomato 报告基因 (图 2A'-C ')。此外, 在苍白 (图 2D) 和黑质柑橘 (图 2E)、striatonigral 和 striatopallidal 投影神经元的目标区域中, 在推测的轴突终端中检测到 tdTomato 信号。13. 这些结果表明成功的 loxP 介导的 DNA 重组是由 AAV 介导的新生儿巴神经元中的疫苗活性表达引起的。
在第二组实验中, 我们将50杏仁的 AAV eGFP 病毒转化为Foxp2fl/fl 小鼠的纹状体, 在 loxP (图 3A-C, F) 上携带 Foxp2 侧的等位基因, 并在 P2 捕获大脑. 无 Foxp2+;gfp+双标记细胞在纹状体中发现, Foxp2 蛋白在 GFP 阳性细胞中缺失 (图 3A'-C ')。在控制实验中, Foxp2+;GFP+双标记细胞存在于Foxp2 AAV-eGFP 控制病毒 (图 3D) 的纹状体和异型Foxp2fl 小鼠纹状体 AAV-eGFP病毒 (图 3E)。结果表明, Foxp2基因在新生儿纹状体 AAV eGFP 转基因细胞中被明确删除。
综合AAV-eGFP 的结果;Ai14和AAV-eGFP;Foxp2 的小鼠, 我们开发的脑立体定向手术技术, 适于在新生小鼠大脑特定区域有条件地删除基因。
图1。新生小鼠的立体定位仪和自制头固定支架。(A)立体定向注射系统由以下设备组成: i. 注射器泵 (控制器);二、注射器泵 (驱动单元);iii. 微升注射器 (10 µL);四、PE20 油管适配器;五、PE10 管;六、30G 注射针;七、立体定向装置;八. 吸管提示盒转换的新生儿幼崽平台;西: 冰被压碎了。(B)组织嵌入盒的高度约为7毫米。1.5 毫升离心管的按钮长约15毫米。(C)鼠标头是固定在自制的头固持有人。箭头表示新生小鼠头部的标志性 lambda。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。P14 Ai14 小鼠纹状体中 tdTomato 在 AAV eGFP DNA 重组后的表达.AAV eGFP 病毒被 sterotaxically 注射到 Ai14 小鼠 P2 纹状体中。P14 对大脑进行了分析。(A)在纹状体 (Str) 中存在许多 GFP 阳性细胞。(B)纹状体中也存在许多 tdTomato 阳性细胞。(C)合并图像显示了荧光蛋白和 tdTomato 在纹状体中的广泛联合定位。c 中盒装区域的共焦图像分别以 "-c" 的高放大倍数显示。所有 GFP 阳性细胞 (绿色) 共同表达 tdTomato (红色) 在纹状体。(D、E)在巴投射神经元的靶区内检测到 tdTomato 信号, 包括球苍白 (GP;D) 和黑质柑橘 (信噪比;E). (F) AAV eGFP 和 Ai14 转基因结构的示意图。Ctx: 皮质;9月: 隔膜;Hipp: 海马;MB: 中脑。刻度条在 a (C), 200 µm;a ' (为 '-C '), 10 µm;d (d 和 E), 100 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图3。AAV eGFP 病毒 intrastriatal injecions 对新生儿纹状体中Foxp2基因的有条件删除.Intrastriatal 注射 AAV eGFP 病毒是在 P2 Foxp2佛罗里达州/佛罗里达州 (C ') 和Foxp2fl(E) 小鼠进行的。P9 对大脑进行了分析。(丙)GFP 阳性细胞 (A, c, 绿色) 缺乏 Foxp2 免疫反应 (B, c, 红色) 的纹状体的Foxp2fl/佛罗里达州小鼠与 AAV eGFP 病毒。c 中的盒装区域分别以 "-c" 的高放大倍数显示。(D)巴细胞共表达 GFP 和 Foxp2 是存在的纹状体, 注射 AAV eGFP 控制病毒。(E) GFP 阳性细胞共表达 Foxp2 (箭头) 存在于Foxp2 鼠的纹状体中, AAV eGFP 病毒。(F) AAV eGFP 病毒和Foxp2 的转基因小鼠的示意图。刻度条在 a (C), 200 µm;a ' (为 '-C ', D 和 E), 20 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在本研究中, 我们展示了一种简单可靠的立体定向方法, 将 AAV 病毒注入新生小鼠脑纹状体。在 P2, 我们将 AAV eGFP 病毒杏仁 Ai14 小鼠纹状体中, 然后分析了 P14 的报告基因表达。我们发现 AAV 转基因 GFP 阳性细胞在整个纹状体 rostrocaudal 水平。此外, 几乎所有的 GFP 阳性细胞都在巴细胞中共同表达了 tdTomato 报告基因, 这表明 loxP DNA 重组是由 AAV 介导的。我们进一步证实了这种方法的有效性, 通过 microinjections AAV eGFP 的纹状体Foxp2佛罗里达州/佛罗里达州小鼠 P2。双重标记表明, 许多自动增值服务转基因 GFP 阳性细胞缺乏 Foxp2 免疫反应在 P9 纹状体, 表明成功的条件删除Foxp2基因的新生儿纹状体。杏仁自动增值服务的体积与受感染脑区的大小相关。随着注入量的 200 nL, gfp 阳性细胞广泛发现在整个新生儿纹状体, 和一些分散的 gfp 阳性细胞也存在于周围的皮层纹状体。随着注入量的 50 nL, GFP 阳性细胞局部被限制在新生儿纹状体。因此, 滴定注射自动增值服务的体积对脑区神经元种群的最佳传导具有重要意义。此外, 转导率也取决于病毒制剂的效价。可以想象, 使用不同启动子的转基因小鼠可实现精确靶向特定细胞类型。
有几个外科技巧成功注射自动增值服务到感兴趣的大脑区域。首先, 由于小鼠幼崽的大小和在手术中用手固定鼠标头位置的困难,10的新生小鼠很难进行立体定向脑手术。虽然先前的研究表明新生儿立体定向手术, 但它需要两个人进行显微注射在手术期间11。我们克服了这些问题, 开发了一个定制的头部固定装置, 可以在脑外科手术中牢固地保护幼头。整个过程可以由一个人来执行。新生小鼠的脑大小因不同的遗传背景、产妇护理和幼崽的年龄而变化。我们自制的设备的优点是, 它允许一个温和但固定的新生鼠头, 这是执行高精度立体定向脑外科手术的关键。其次, 由于软皮肤的弹性和颅骨的薄壁, 在新生幼崽中, 头部的颅骨钻削后的皮肤切口很难进行。为了克服这个问题, 有必要在将注射针降低到目标脑区之前, 用针尖刺穿皮肤和头骨。第三, 检查 PE 管内可见染料的流动, 确保注射过程中微量注射的进展。如果染料不在 PE 管中移动, 应努力解决问题, 包括油管内的流体可能泄漏和堵塞的针头。请注意, 此方法适用于在 P5 前通过皮肤可见的新生幼崽。对于年龄超过 P5 的幼崽, 它可能需要在皮肤上切开以暴露 lambda。注意, 光照到 P4 和 P5 的鼠标头可能有助于找到地标 lambda。虽然我们还没有在新生大鼠中进行立体定向手术, 但我们认为该技术适用于大鼠幼崽的某些修饰。
携带基因表达的病毒的发病和最大表达在注射入大脑14、15后需要数天或几周。在本研究中, 我们发现 AAV eGFP 病毒介导的 loxP DNA 重组的新生儿巴神经元发生早在8天后病毒传导。前一项研究报告说, AAV 介导的在新生鼠幼崽的嗅球中可以检测到3天后, 自动增值服务15的散装注射。可以想象, 早期的 AAV 介导的基因活动是一个优势, 研究发展事件, 不断发生在产后大脑。
总之, 我们开发的新生儿立体定向技术不仅用于有条件地删除特定脑区的基因, 而且还可以向新生小鼠的特定脑区注入药理试剂和神经元示踪剂。虽然我们只做了 microinjections 的新生儿纹状体在本研究中, 原则上, 我们的立体定向新生儿脑外科可以应用于特定的大脑区域, 如果特定区域的坐标, 新生儿大脑可用。考虑到不同阶段的不同遗传背景的新生小鼠大脑大小的变异性, 研究人员必须通过经验主义地确定靶点的精确坐标。最后, 通过立体定向 microinjections 自动增值服务表达基因修饰 optogenetic3和 chemogenetic 蛋白4和神经元活动指标5进入特定脑区, 可以探讨神经元的作用。活动对脑后发育的大脑在细胞类型和电路特定水平的分辨率。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了科学和技术部的支持, MOST104-2311-B-010-010-MY3、MOST106-2321-B-010-012、国家卫生研究所赠款 NHRI-EX106-10429NI 和特色领域研究中心方案赠款来自教育部通过台湾国立阳明大学脑研究中心和博士后奖学金授予 MOST106-2811-B-010-031 (Y.C.)、MOST105-2811-B-010-036 和 MOST106-2811-B-010-030 (H 张佑启)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000 |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
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