Summary
Descreveremos um protocolo de cirurgia estereotáxica com um dispositivo caseiro de cabeça-corrigido para reagentes microinjecting para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Esta técnica permite a manipulação genética em células neuronais de regiões específicas do cérebro de rato neonatal.
Abstract
Muitos genes são expressos no cérebro embrionário, e alguns deles são continuamente expressas no cérebro após o nascimento. Para tais genes persistentemente expressos, eles podem funcionar para regular o processo de desenvolvimento e/ou função fisiológica no cérebro neonatal. Para investigar as funções neurobiológicas de genes específicos no cérebro, é essencial para inativar genes no cérebro. Aqui, descrevemos um método simples estereotáxica para inactivar a expressão gênica no corpo estriado de ratos transgênicos em janelas de tempo neonatal. O vírus AAV-eGFP-Cre foram injetado para o corpo estriado de ratos de gene repórter Ai14 em dia pós-natal (P) 2 por cirurgia cerebral estereotáxica. A expressão do gene repórter tdTomato foi detectada no corpo estriado de P14, sugerindo um sucesso Cre-loxP mediada por recombinação de DNA em células transfectadas-AAV striatal. Nós validado ainda mais esta técnica por microinjecting o vírus AAV-eGFP-Cre em camundongos P2Foxp2fl/fl . Dupla rotulagem de GFP e Foxp2 mostrou que as células GFP-positivo faltavam Foxp2 imunorreatividade no corpo estriado P9, sugerindo que a perda de proteína Foxp2 em AAV-eGFP-Cre transfectada striatal células. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram uma exclusão genética eficaz por stereotaxically microinjected vírus AAV-eGFP-Cre em específicas populações neuronais no cérebro neonatal de floxed ratos transgénicos. Em conclusão, nossa técnica estereotáxica fornece uma plataforma simples e fácil para manipulação genética em cérebro de rato neonatal. A técnica não pode somente ser usada para excluir genes em regiões específicas do cérebro neonatal, mas também pode ser usada para injetar drogas farmacológicas, marcadores neuronais, optogenetics geneticamente modificados e chemogenetics proteínas, indicadores de atividade neuronal e outros reagentes para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal.
Introduction
Estudos modernos da estrutura e função do cérebro normalmente requerem manipulação genética de genes específicos nas células neuronais. Para sondar as funções dos genes diferentes, ratos transgénicos carregando alelos mutantes, incluindo foram rotineiramente gerados nocaute e bater-em alelos. Cirurgia cerebral estereotáxica para roedores adultos é um método padrão para localmente entregar drogas, vírus, marcadores e outros reagentes para regiões específicas do cérebro de roedor1,2. Aplicando a cirurgia estereotáxica cerebral de ratos transgénicos permite um de manipular geneticamente a função dos genes e a atividade neuronal em específicas populações neuronais do cérebro do rato. A manipulação do tipo específico de célula fornece uma poderosa abordagem para decifrar funções neuronais em complexos circuitos neurais do cérebro3,,4,5.
Desenvolvimento neural do sistema nervoso começa em estágios embrionários iniciais, e os processos de desenvolvimento continuam após o nascimento, até o período juvenil. Maturação pós-natal do sistema nervoso inclui a fiação sináptica precisa de circuitos neurais, que é essencial para funções fisiológicas e cognitivas do cérebro6. Portanto, estudar o desenvolvimento eventos que ocorrem em janelas de tempo neonatal é importante não só para compreender o desenvolvimento neural normal, mas também pode fornecer insights sobre a patogênese do desenvolvimento neurológico e transtornos neuropsiquiátricos7 ,8. Embora os métodos de cirurgia cerebral estereotáxica para roedores adultos estão prontamente disponíveis2,9, alguns protocolos estão disponíveis na internet para uma cirurgia estereotáxica cerebral em ratos neonatal10,11. Na verdade, estereotáxicos microinjeções de reagentes no cérebro de filhotes de rato neonatal são difíceis, porque a cabeça do filhote neonatal é demasiado frágil para ser fixada no aparelho estereotáxica padrão. No entanto, a aplicação da cirurgia estereotáxica cerebral de ratos transgênicos é viável para ratos neonatal12. Aqui, descrevemos um método simples com uma armadilha caseira para realizar cirurgia cerebral estereotáxica em filhotes de rato recém-nascido. Vamos demonstrar que essa técnica permite excluir condicionalmente genes de floxed por microinjecting recombinase AAV-expressando Cre DNA para o corpo estriado de ratos de gene repórter e condicionalmente floxed ratos transgénicos. Esta técnica também é aplicável para entregar os reagentes para o neonatal corpo estriado de ratos tipo selvagem.
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Protocol
Os protocolos de animais descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal e uso comissões da Universidade Nacional de Yang-Ming.
1. preparação do titular para filhotes Neonatal no aparato estereotáxica
- Fazer a cabeça da bandeja: cortar o fundo de um tubo de centrífuga de 1,5 mL (15 mm de comprimento) na forma que se encaixa a cabeça dos filhotes neonatais através da remoção de 1/5 da parede do tubo.
- Pegue uma caixa de ponta de pipeta com o tamanho certo que se encaixa com o pedestal de aparelhos estereotáxicos e remover a tampa superior. Fixe a cabeça bandeja preparada no passo 1.1 e um estojo de incorporação de tecido na base da bandeja de ponta com adesivo dederretimento. A altura da fita tecido incorporação é de 7 mm, que é usado para suportar do filhote pescoço e corpo na posição de cabeça-corrigido.
- Coloque toda a configuração em um aparelho padrão estereotáxica.
2. preparação de agulhas de aço inoxidável de injeção 30g
- Limpeza prévia 30 agulhas de seringa G embebendo-os no clorofórmio durante 3 dias.
- Use fórceps para lentamente e com cuidado retire a agulha do seu hub de polipropileno em uma capa de química.
- Lave as agulhas com etanol absoluto por 20 min, seguido de lavagens de etanol 70% para 3 × 10 min num agitador a 50 rpm. Deixe o ar de agulhas para secar e armazenar as agulhas limpas em uma caixa limpa, à temperatura ambiente (RT) até o uso.
3. prepare um adaptador para tubos de Microinjection
- Conecte a seringa de microlitro de uma agulha de injeção de 30G com um tubo de polietileno PE10 (PE10 tubo). Prepare um adaptador de tubo (tubo PE20) PE20 polietileno para colmatar a agulha e a seringa microlitro. O uso do adaptador é necessário, porque o diâmetro do tubo PE10 é muito menor do que a agulha da seringa microlitro 26G.
- Preparar o tubo para a seringa de microlitro: Conecte a agulha de injeção de 30g previamente limpos com 5 cm de tubo PE20 e selar a junção com cola instantânea. Este adaptador de tubo é reutilizável.
Nota: Se a agulha da seringa de microinjeção 30G, a preparação (passo 3.1) e o uso (passo 3.3) deste adaptador não é necessário. - Conecte o adaptador de tubo (preparado no passo 3.1) com uma seringa de microlitro (10 µ l).
- Conecte uma extremidade do tubo PE10 (não mais de 60 cm) sobre a agulha 30G do adaptador de tubo PE20. Monte uma nova agulha de injeção de 30g na outra extremidade do tubo PE10.
4. carregar o Microinjection tubo com água destilada esterilizada, corante e vírus
- Remova o êmbolo da seringa microlitro. Use uma seringa 25g para carregar a seringa microlitro e seu tubo PE conectado com água destilada esterilizada para remover o ar do tubo.
- Coloque o êmbolo volta à seringa microlitro e empurrar o êmbolo até 2 µ l de água destilada permanece no cano. Não deixe que o volume de água destilada, tornar-se inferior a 2 µ l.
- Monte cuidadosamente a seringa microlitro para a bomba de seringa de taxa de fluxo micro.
- Pipetar pequenas quantidades de corante rápido verde de 0.1% (preparada em soro fisiológico a 0,9% e filtrada com filtro de 0,22 µm) e os líquidos de vírus para um pedaço de parafilme.
- Retire uma pequena quantidade de ar tornar visível uma bolha de ar na junção entre a agulha de injeção de 30g e PE10 tubo seguido por 0,7 µ l de filtrado verde rápido a carregar para dentro do tubo para testar o fluxo de fluidos em tubulação microinjeção.
- Retire outra pequena quantidade de ar para fazer uma bolha de ar segunda seguida por carregar os líquidos de vírus para o tubo de microinjeção.
- Anexar e fixe a agulha de microinjeção de 30g para o braço do aparelho estereotáxica.
5. anestesia de ratos Neonatal por hipotermia
- Coloque o filhote em uma luva de látex da luva e mergulhe-a em gelo picado até o pescoço por 5 min.
- Belisca os pés do filhote com fórceps para certificar-se de não resposta de retirada de seus pés.
- Coloque o filhote com luva de látex luva na bandeja da cabeça e Coloque gelo triturado em torno a luva de látex para mantê-lo frio para anestesia de hipotermia.
- Aplica o vet pomada nos olhos do filhote para evitar ressecamento enquanto sob anestesia, se possível.
6. microinjection
- Prepare a cirurgia estéril limpando o instrumento estereotáxica com etanol a 70%. Esterilize o instrumento cirúrgico imergindo-os em etanol a 70%.
- Esfrega a cabeça do filhote com 70% de etanol. Localizar o lambda de marco no crânio e marcar o lambda com uma caneta. Aponte a ponta da agulha para o lambda e definir o ântero-posterior (AP) e médio-lateral (ML) coordenadas como zero.
- Mova o braço para injeções no site de destino de acordo com as coordenadas X e Y do local de destino. Para o corpo estriado do dia pós-natal (P) 2 filhotes, as coordenadas são: AP, +2,4 mm anterior o lambda; ML, 1,0 milímetros lateral da linha média; dorso-ventral (DV), −1.7 mm do crânio. Marca a posição de corante verde rápido em PE10 tubo com uma caneta.
- Trazer a agulha de injeção de 30g lentamente penetrar através da pele e o crânio e então trazer a ponta da agulha até que ele para na superfície do crânio. Defina a coordenada DV como zero.
- Derrubar a agulha 30G lentamente até atingir a coordenada DV do local de destino. Espere 1 min permitir que o parênquima, retomando a sua forma normal. Execute o programa de microinjeção (100 nL/min).
- Certifique-se de que a marca da tintura verde rápido está se movendo no tubo de PE, para garantir que o líquido do vírus é injetado no cérebro.
- Aguardar 1 min após o término da microinjeção e então lentamente e progressivamente trazer a agulha até a altura de 1/2 de profundidade DV dentro de 30 s. Após 30 s, lentamente, retirar a agulha da cabeça do filhote.
- Repita o passo 6.2 a 6.7 até os alevinos de todos os sites alvo sejam concluídos.
7. pós-cirúrgica recuperação do filhote
- Aquecer o filhote por 20 min em uma incubadora de 33 ° C. Verificar a recuperação do filhote da anestesia hipotermia cada 5 min até que o filhote recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
- Retorna o filhote para a barragem, depois que o filhote está totalmente recuperado.
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Representative Results
Para o primeiro conjunto de experiência, nós injetadas 200 nL de AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 vírus (AAV-eGFP-Cre, diluição de 1/10 em solução salina de tampão fosfato de Dulbecco) que expressam a recombinase Cre DNA fundidos com GFP em P2 corpo estriado de ratos Ai14. Os ratos Ai14 expressam tdTomato gene repórter sobre exclusão Cre-mediada de loxP-flanqueado (floxed) STOP gaveta (Figura 2F). Os cérebros foram colhidos no P14 para imunocoloração de GFP e tdTomato. Muitos AAV transfectadas células GFP-positivo estava presente em todo o corpo estriado (Figura 2A, C), indicando uma infecção extensa de células estriadas por vírus AAV-eGFP-Cre. Semelhante expressão extensa de tdTomato também foi encontrado no striatum (Figura 2B, C). Ao exame microscópico em alta ampliação, descobrimos que quase todas as células de striatal GFP-positivo co expressaram o gene repórter tdTomato (Figura 2A'-C'). Além disso, detectou sinais de tdTomato em presumivelmente axônio terminal no globus pallidus (Figura 2D) e a substância negra pars reticulata (Figura 2E), as regiões de destino dos neurônios de projeção Estriatonigral e striatopallidal 13. estes resultados sugerem uma bem sucedida Cre-loxP mediada por recombinação de DNA induzida pela expressão mediada por vírus adeno-associados do Cre atividade nos neurônios striatal neonatal.
Para o segundo conjunto de experiência, nós injetadas 50 nL de vírus AAV-eGFP-Cre para o corpo estriado de ratos Foxp2fl/fl carregando loxP-flancos Foxp2 alelos em P2 (Figura 3A- C, F) e colhido o cérebro no P9. Não Foxp2+; Células de duplo-rotulado de GFP+ foram encontradas no striatum, i. e., proteína Foxp2 estava ausente nas células GFP-positivo (Figura 3A'-C'). Em experimentos de controle, Foxp2+; Células de duplo-rotulado de GFP+ estavam presentes o corpo estriado de ratos Foxp2fl/fl com vírus de controle AAV-eGFP (Figura 3D) e o corpo estriado de heterozigotos Foxp2fl / + ratos com AAV-eGFP-Cre vírus (Figura 3E). Estes resultados indicam que gene Foxp2 é excluído especificamente em células de AAV-eGFP-Cre transfectada do striatum neonatal.
Tomados em conjunto os resultados de AAV-eGFP-Cre; Ai14 e AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/fl ratos, a técnica de cirurgia estereotáxica cerebral neonatal que desenvolvemos é favorável para condicionalmente excluir genes em regiões específicas do cérebro de rato neonatal.
Figura 1. Aparelho estereotáxica e titular da cabeça-corrigido caseiro para ratos neonatais. (A) o sistema de injeção estereotáxica consiste dos seguintes dispositivos: bomba de seringa de i. (controlador); bomba de seringa II. (unidade de movimentação); III. microlitro seringa (10 µ l); IV. PE20 adaptador de tubo; v. PE10 tubo; agulha de injeção vi. 30G; VII. estereotáxicos aparelhos; VIII. uma caixa de pontas de pipeta convertido plataforma para filhotes Neonatais; XI: gelo picado. (B) a altura da fita tecido incorporação é de cerca de 7 mm. O botão do tubo de centrífuga de 1,5 mL é cerca de 15 mm de comprimento. (C) a cabeça de rato é protegida no suporte de cabeça-corrigido caseiro. A seta indica o lambda de Marco na cabeça dos ratos neonatais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Expressão de tdTomato no corpo estriado de ratos Ai14 P14 depois AAV-eGFP-Cre mediada por recombinação de DNA Cre-loxP. O vírus AAV-eGFP-Cre foram sterotaxically injetado P2 corpo estriado de ratos Ai14. O cérebro foi analisado no P14. (A) muitas células GFP-positivo estão presentes em todo o corpo estriado (Str). (B) muitas células de tdTomato-positivas também estão presentes no striatum. (C) as imagens mescladas mostram uma extensa localização co de GFP e tdTomato no striatum. Alta ampliação na, são mostradas imagens confocal das regiões Box A-C'-C', respectivamente. Todas as células GFP-positivo (verdes) expressam co tdTomato (vermelho) no corpo do estriado. (D, E) Os sinais tdTomato são detectados nas regiões alvo de neurônios de projeção striatal, incluindo o globus pallidus (GP; D) e a substância negra pars reticulata (SNr; E). (F) desenhos esquemáticos das construções transgênicas AAV-eGFP-Cre e Ai14. CTX: córtex; Setembro: septo; Hipp: Hipocampo; MB: mesencéfalo. Barra de escala em lá (para A C), 200 µm; A' (para A'-C'), 10 µm; D (para D e E), 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Exclusão condicional do gene Foxp2 no striatum neonatal por intrastriatal injecions de vírus AAV-Cre-eGFP. Intrastriatal injeções de vírus AAV-eGFP-Cre foram realizadas em P2 Foxp2fl/fl (A-C') e Foxp2fl / +ratos (E). Os cérebros foram analisados no P9. (A-C) Células GFP-positivo (A, C, verde) faltam Foxp2 imunorreatividade (B, C, vermelho) no corpo estriado de ratos Foxp2fl/fl com vírus AAV-eGFP-Cre. As regiões Box A C são mostradas em alta ampliação na '-C', respectivamente. (D) células Striatal express co GFP e Foxp2 estão presentes no striatum que foi injetado com vírus de controle AAV-eGFP. Células de GFP-positivo (E) co expressam Foxp2 (setas) estão presentes no striatum de Foxp2fl / + ratos com o vírus AAV-eGFP-Cre. (F) desenhos esquemáticos de vírus AAV-eGFP-Cre e ratos transgénicos Foxp2fl/fl . Barra de escala em lá (para A C), 200 µm; A' (para um '-C', D e E), 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No presente estudo, vamos demonstrar um método simples e confiável de estereotáxica para injetar o vírus AAV para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Nós injetadas vírus AAV-eGFP-Cre para o corpo estriado de ratos de repórter Ai14 em P2 e então analisados a expressão do gene repórter no P14. Nós encontramos que AAV transfectadas células GFP-positivo em todo o corpo estriado em níveis rostrocaudal. Além disso, quase todas as células GFP-positivo co expressaram o gene do repórter de tdTomato nas células estriadas, sugerindo uma recombinação de DNA Cre-loxP sucesso induzida pela expressão mediada por vírus adeno-associados do Cre atividade. Confirmamos ainda mais a eficácia desta abordagem por microinjeções de AAV-eGFP-Cre nos striatum Foxp2fl/fl ratos em P2. Dupla rotulagem mostrou que muitas células transfectadas AAVs GFP-positivo faltavam Foxp2 imunorreatividade no corpo estriado P9, sugerindo uma exclusão condicional com êxito do gene Foxp2 no corpo estriado neonatal. Os volumes de microinjected AAVs estão correlacionados com o tamanho das regiões cerebrais infectados. Com 200 nL do volume injetado, células GFP positivas foram encontradas extensivamente em todo o corpo estriado neonatal, e algumas células dispersas de GFP-positivo também estavam presentes no córtex adjacente para o corpo estriado. Com 50 nL do volume injetado, células GFP-positivos foram localmente restritas para o striatum neonatal. Portanto, titulada os volumes de AAVs injetados é importante para a transdução ideal das populações neuronais em regiões específicas do cérebro. Além disso, a taxa de transdução também é determinada pelo título de preparação viral. É concebível que tipos de célula específica direcionamento preciso podem ser alcançados usando ratos transgénicos com promotores diferentes.
Existem várias dicas cirúrgicas para AAVs injetar bem sucedidas para as regiões do cérebro interessados. Primeiro, por causa do pequeno tamanho de filhotes de rato e a dificuldade em fixar a posição da cabeça do rato com as mãos durante a cirurgia, é difícil realizar cirurgia estereotáxica cerebral em ratos neonatal10. Embora um estudo anterior demonstrou neonatal cirurgia estereotáxica, mas requer duas pessoas realizar a microinjeção durante a cirurgia11. Podemos ter superar estes problemas através do desenvolvimento de um dispositivo feito por medida de cabeça-fixo que pode prenda firmemente a cabeça do filhote durante uma cirurgia cerebral. Os procedimentos todo podem ser realizados por uma única pessoa. Os tamanhos de cérebro de ratos neonatais são variados devido a diferentes origens genéticas, cuidados maternos e a idade dos filhotes. Uma vantagem de nosso dispositivo caseiro é que permite uma fixação suave mas segura de cabeça de rato neonatal, que é essencial para a realização de cirurgia estereotáxica cerebral de alta precisão. Em segundo lugar, devido a elasticidade da pele macia e fina parede do crânio, incisão da pele, seguido de crânio de perfuração na cabeça é difícil de executar em filhotes neonatais. Para superar esse problema, é necessário fazer uma punção da pele e o crânio com uma ponta de agulha antes de abaixar a agulha de injeção para a região específica do cérebro. Em terceiro lugar, é importante verificar o fluxo de tinta visível no tubo de PE para se certificar que da microinjeção está em progressão durante a injeção. Se o corante não se move no tubo de PE, esforços devem ser tomados para disparar problemas os problemas, incluindo um possível vazamento de fluido na tubulação e entupido agulhas. Observe que esse método se aplica para os filhotes neonatais cujo lambda são visíveis através da pele antes de P5. Para filhotes de cachorro mais velhos que P5, talvez precise de uma incisão na pele para expor a lambda. Note que a iluminação sobre cabeças de rato P4 e P5 pode ajudar a localizar o lambda de Marco. Apesar de que não temos realizado esta técnica de cirurgia estereotáxica em ratos neonatais, supomos que a técnica é aplicável para filhotes com algumas modificações.
O início e a máxima expressão de vírus carregando expressão gênica levar vários dias ou semanas após as injeções no cérebro14,15. No presente estudo, encontramos que a AAV-eGFP-Cre recombinação de DNA Cre-loxP mediada por vírus nos neurônios striatal neonatal ocorreu logo em 8 dias após transdução viral. O estudo anterior relatou que atividade de repórter de Cre-dependente mediada por vírus adeno-associados pode ser detectada no bulbo olfatório dos filhotes de rato recém-nascido logo em 3 dias após a injeção de massa de AAVs15. É concebível que o início precoce da atividade genética mediada por AAV é uma vantagem para o estudo do desenvolvimento eventos que ocorrem continuamente no cérebro pós-natal.
Em resumo, a técnica estereotáxica neonatal que desenvolvemos não é somente para condicionalmente excluir genes em regiões específicas do cérebro, mas também é passível de injetar reagentes farmacológicos e traçadores neuronais para regiões específicas do cérebro em ratos neonatais. Embora só fizemos alevinos para o striatum neonatal no presente estudo, em princípio, nossa cirurgia estereotáxica cerebral neonatal pode ser aplicada a regiões específicas do cérebro-alvo se as coordenadas de regiões específicas no cérebro neonatal estão disponíveis. Dada a variabilidade no tamanho do cérebro de rato neonatal com diferentes origens genéticas em diferentes fases, é essencial para determinar empiricamente as coordenadas precisas dos sites direcionados pelos investigadores. Finalmente, por estereotáxicos microinjeções de AAVs expressando geneticamente modificados optogenetic3 e chemogenetic proteínas4 e de indicadores de atividade neuronal5 em regiões específicas do cérebro, um pode explorar o papel do neuronal atividade sobre o desenvolvimento pós-natal do cérebro para a resolução dos níveis e circuito-específicas do tipo de célula.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia concede MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, os institutos de pesquisa de saúde nacional conceder INDH-EX106-10429NI e programa de centro de pesquisa de áreas Indicados: concessão de o Ministério da educação, através do centro de pesquisa do cérebro, National Yang-Ming University, em Taiwan, e pós-doutorado concede MOST106-2811-B-010-031 (S.-Yc), MOST105-2811-B-010-036 e MOST106-2811-B-010-030 (YK-H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000 |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
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