Summary
Vi beskriver en protokol af stereotaxisk kirurgi med en hjemmelavet hoved-fast enhed for microinjecting reagenser i striatum af neonatal mus hjerner. Denne teknik gør det muligt for genmanipulation neuronale celler i bestemte regioner af neonatal mus hjerner.
Abstract
Mange gener er udtrykt i embryonale hjerner, og nogle af dem er løbende udtrykt i hjernen efter fødslen. For sådanne vedvarende udtrykte gener, kan de fungere for at regulere den udviklingsmæssige proces og/eller fysiologiske funktion i neonatal hjerner. For at undersøge neurobiologiske funktioner af specifikke gener i hjernen, er det vigtigt at inaktivere gener i hjernen. Her, beskriver vi en simpel stereotaxisk metode til at inaktivere genekspression i striatum af Transgene mus på neonatal tidsvinduer. AAV-eGFP-Cre virus var microinjected i striatum af Ai14 reporter gen mus på postnatal dag (P) 2 af stereotaxisk hjernekirurgi. TdTomato reporter gen expression blev opdaget i P14 striatum, hvilket tyder på en vellykket Cre-loxP medieret DNA rekombination i AAV-transduced striatal celler. Vi yderligere valideret denne teknik ved microinjecting AAV-eGFP-Cre vira til P2Foxp2fl/fl mus. Dobbelt mærkning af normal god landbrugspraksis og Foxp2 viste, at normal god landbrugspraksis-positive celler manglede Foxp2 immunoreactivity i P9 striatum, hvilket tyder på tabet af Foxp2 protein i AAV-eGFP-Cre transduced striatal celler. Taget sammen, viser disse resultater en effektiv genetiske sletning af stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre vira i specifikke neuronal populationer i neonatal hjerner af floxed Transgene mus. Afslutningsvis, giver vores stereotaxisk teknik en nem og simpel platform for genmanipulation i neonatal mus hjerner. Teknikken kan ikke kun bruges til at slette gener i specifikke regioner af neonatal hjerner, men det kan også bruges til at injicere farmakologiske stoffer, neuronal røbestoffer, genetisk modificerede optogenetics og chemogenetics proteiner, neuronal aktivitet indikatorer og andre reagenser i striatum af neonatal mus hjerner.
Introduction
Moderne studier af struktur og funktion af hjernen kræver normalt genmanipulation af specifikke gener i neuronale celler. For at sonde funktioner af forskellige gener, Transgene mus transporterer mutante alleler, herunder er knockout og knock-i alleler rutinemæssigt genereret. Stereotaxisk hjerneoperation for voksen gnavere er en standardmetode til lokalt levere narkotika, vira, sporstoffer og andre reagenser til bestemte områder af gnaver hjerner1,2. Anvendelse af stereotaxisk hjerneoperation Transgene mus tillader en at genmanipulere genfunktioner og neuronal aktivitet i specifikke neuronal populationer af musen hjernen. Celle type-specifikke manipulation giver en kraftfuld tilgang for at dechifrere neuronal funktioner i komplekse neurale kredsløb i hjernen3,4,5.
Neurale udvikling af nervesystemet begynder på tidlige vorden, og de udviklingsmæssige processer fortsætter efter fødslen indtil den juvenile periode. Postnatal modning af nervesystemet omfatter den præcise synaptic ledninger af neurale kredsløb, der er afgørende for fysiologiske og kognitive funktioner i hjernen6. Derfor, at studere udviklingsmæssige begivenheder, der opstår i neonatal tiden vinduer er vigtigt ikke kun for at forstå normal neurale udvikling, men det kan også give indsigt i patogenesen af udviklingsforstyrrelser og neuropsykiatriske lidelser7 ,8. Selv om metoder af stereotaxisk hjerneoperation for voksen gnavere er let tilgængelige2,9, er par protokoller tilgængelige på internettet for stereotaxisk hjerneoperation i neonatal mus10,11. Faktisk er stereotaxisk microinjections af reagenser i hjerner af neonatal mus unger vanskeligt, fordi overhoved neonatale pup er for skrøbelige til at blive fast i den standard stereotaxisk apparatur. Ikke desto mindre er anvendelsen af stereotaxisk hjerneoperation på Transgene mus muligt for neonatal mus12. Her, beskriver vi en enkel metode med en hjemmelavet setup til at udføre stereotaxisk hjerneoperation i nyfødte mus unger. Vi demonstrere, at denne teknik giver mulighed for en betinget slette floxed gener af microinjecting AAV-udtrykker Cre DNA recombinase i striatum reporter gen mus og betinget floxed Transgene mus. Denne teknik gælder også levere reagenser i wild-type mus neonatal striatum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De animalske protokoller er beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug udvalgene af nationale Yang-Ming Universitet.
1. forberedelse af indehaveren til Neonatal unger i den stereotaxisk apparatur
- Gøre bakken hoved: skær bunden af en 1,5 mL centrifugeglas (15 mm lange) i den form, der passer til overhoved neonatale unger ved at fjerne 1/5 af mur af røret.
- Tag en pipette tip box med den rigtige størrelse, der passer med piedestalen af stereotaxisk apparatur, og fjern topdækslet. Anbringe hoved bakken udarbejdet i trin 1.1 og et væv indlejring kassette på soklen af tip bakke med hot-smeltende klæbemiddel. Højden af væv indlejring kassetten er 7 mm, som bruges til at understøtte pup hals og krop i den hoved-fast holdning.
- Placere hele opsætningen i en standard stereotaxisk apparatur.
2. forberedelse af 30G injektion rustfrit stål nåle
- Pre ren 30 G sprøjte nåle af iblødsætning dem i chloroform i 3 dage.
- Bruge tang til at forsigtigt og langsomt trække nålen fra sin polypropylen hub i en kemisk hætte.
- Vask nåle med absolut ethanol i 20 min. efterfulgt af 70% ethanol skylninger for 3 × 10 min på en shaker på 50 rpm. Lad nåle luften tør, og opbevar de rensede nåle i en ren boks ved stuetemperatur (RT) indtil brug.
3. Forbered en Adapter for mikroinjektion slanger
- Tilslut microliter sprøjte til en 30G injektion nål med en PE10 polyethylen rør (PE10 rør). Forberede en PE20 polyethylen slanger (PE20 rør) adapter bridging injektion nålen og microliter sprøjte. Brugen af adapteren er nødvendige, fordi diameteren af PE10 tube er meget mindre end 26G microliter sprøjte nål.
- Forberede slangen for microliter sprøjte: Tilslut pre renset 30 G injektion nålen med 5 cm af PE20 rør, og forsegle krydset med instant lim. Denne slange adapter er genanvendelige.
Bemærk: Hvis nålen mikroinjektion sprøjte er 30G, forberedelse (trin 3.1) og forbrug (trin 3.3) af denne adapter er ikke nødvendige. - Tilslut slangen adapter (udarbejdet i trin 3.1) med en microliter sprøjte (10 µL).
- Tilslut den ene ende af PE10 tube (længere end 60 cm) på 30G nålen af PE20 slanger adapter. Montere en ny 30G injektion nål ind på anden enden af PE10 rør.
4. Læg mikroinjektion Tube med autoklaveres destilleret vand, farvestof og vira
- Fjerne stemplet microliter sprøjte. Bruge en 25G sprøjte til at indlæse microliter sprøjte og dens tilsluttede PE rør med autoklaveres destilleret vand for at fjerne luft fra slangen.
- Placere stemplet tilbage til microliter sprøjte, og skubbe stemplet indtil 2 µL af destilleret vand forbliver i tønden. Lad ikke mængden destilleret vand bliver lavere end 2 µL.
- Monter omhyggeligt microliter sprøjten på mikro flow sats sprøjten pumpe.
- Der afpipetteres små mængder af 0,1% hurtigt grønne farvestof (forberedt i 0,9% saltvand og filtreret med 0,22 µm filter) og virus væsker til et stykke af parafilm.
- Trække en lille mængde luft til at synliggøre en luftboble i krydset mellem 30G injektion nål og PE10 tube efterfulgt af lastning 0,7 µL af filtrerede hurtigt grønt ind i røret til at teste strømmen af væsker i mikroinjektion slangen.
- Trække en anden lille mængde luft til at gøre en anden luftboble efterfulgt af indlæsning virus væsker i mikroinjektion slangen.
- Vedhæfte og sikre 30G mikroinjektion nål til arm af stereotaxisk apparatur.
5. anæstesi af Neonatal mus af hypotermi
- Placere pup i en latex handske ærme og fordybe den i knust is op til halsen i 5 min.
- Knib den pup fødder med pincet for at sikre ingen tilbagetrækning svar på sine fødder.
- Placer pup med latex handske ærme i bakken hoved og sætte nogle knust is omkring en latex ærme til at holde det koldt til hypotermi anæstesi.
- Anvende vet salve på hvalps øjne til at forhindre tørhed mens under bedøvelse, hvis muligt.
6. mikroinjektion
- Forbered sterile kirurgi ved aftørring af stereotaxisk instrument grundigt med 70% ethanol. Sterilisere den kirurgisk instrument ved at nedsænke dem i 70% ethanol.
- Skrub den pup hoved med 70% ethanol. Find landmark lambda på kraniet og markere lambda med en tusch. Målet nålen tip til lambda, og Indstil anterior-posterior (AP) og medial-lateral (ML) koordinerer som nul.
- Flytte injektion arm til mål-webstedet ifølge X og Y-koordinaterne på destinationsstedet. For striatum postnatal dag (P) 2 unger, er koordinaterne: AP, +2.4 mm foran lambda; ML, ±1.0 mm lateral fra midterlinjen; dorsal-ventral (DV), −1.7 mm fra kraniet. Mark positionen af hurtigt grønne farvestof i PE10 rør med en pen.
- Nedbringe 30G injektion nål langsomt at trænge ind gennem huden og kraniet, og derefter bringe op nål-spids, indtil det stopper på overfladen af kraniet. Sæt DV-koordinaten som nul.
- Nedbringe 30G injektion nål langsomt indtil den når DV koordinaten på destinationsstedet. Vente 1 min til at tillade parenkym genoptage sin normale form. Køre programmet mikroinjektion (100 nL/min).
- Sørg for, at mark hurtigt grønne farvestof er bevæger sig i PE rør til at sikre virus væsken sprøjtes ind i hjernen.
- Vente 1 min efter afslutning af mikroinjektion, og derefter langsomt og gradvis opdrage nål til 1/2 højde af DV dybde inden for 30 s. Efter 30 s, langsomt trække nålen fra den pup hoved.
- Gentag trin 6.2 til 6.7 microinjections af alle målrettede websteder er fuldført.
7. postoperative genopretning af Pup
- Varm op pup i 20 min. i en 33 ° C inkubator. Check inddrivelse af hvalpen fra hypotermi anæstesi hvert 5 min, indtil pup har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
- Vende pup tilbage til dæmningen, efter at pup er fuldt tilbagebetalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første eksperiment, vi microinjected 200 nL af AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 vira (AAV-eGFP-Cre, 1/10 fortynding i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning), der udtrykker Cre DNA recombinase sammenvokset med normal god landbrugspraksis i P2 striatum af Ai14 mus. Ai14 mus express tdTomato reporter gen ved Cre-medieret sletning af loxP-flankeret (floxed) STOP kassette (figur 2F). Hjerner er høstet på P14 for immunfarvning af normal god landbrugspraksis og tdTomato. Mange AAV transduced normal god landbrugspraksis-positive celler var øjeblikket hele striatum (figur 2A, C), idet en omfattende infektion af striatal celler ved AAV-eGFP-Cre vira. Lignende omfattende udtryk for tdTomato blev også fundet i striatum (figur 2B, C). Ved mikroskopisk undersøgelse på høj forstørrelse, fandt vi, at næsten alle normal god landbrugspraksis-positive striatal celler Co udtrykt tdTomato reporter gen (figur 2A'-C'). Desuden blev tdTomato signaler opdaget i formentlig axon terminaler i globus pallidus (figur 2D) og substantia nigra pars reticulata (figur 2E), målområder af striatonigral og striatopallidal projektion neuroner 13. disse resultater tyder på en vellykket Cre-loxP medieret DNA rekombination induceret af AAV-medieret udtryk for Cre aktivitet i neonatal striatal neuroner.
For det andet sæt af forsøg, vi microinjected 50 nL AAV-eGFP-Cre vira i striatum af Foxp2fl/fl mus transporterer loxP-flankeret Foxp2 alleler på P2 (figur 3A- C, F), og høstet hjernen på P9. Ingen Foxp2+; Normal god landbrugspraksis+ dobbelt-mærket celler blev fundet i striatum, dvs., Foxp2 protein var fraværende i normal god landbrugspraksis-positive celler (figur 3A'-C'). I kontrol eksperimenter, Foxp2+; Normal god landbrugspraksis+ dobbelt-mærket celler var til stede i striatum af Foxp2fl/fl mus med AAV-eGFP kontrol virus (figur 3D) og i striatum af heterozygous Foxp2fl / + mus med AAV-eGFP-Cre vira (figur 3). Disse resultater viser, at Foxp2 gen specielt slettes i AAV-eGFP-Cre transduced celler af neonatal striatum.
Tilsammen resultaterne af AAV-eGFP-Cre; Ai14 og AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/fl mus, stereotaxisk neonatal hjernekirurgi, som vi udviklede teknik er modtagelig for betinget slet gener i specifikke regioner af neonatal mus hjerner.
Figur 1. Stereotaxisk apparatur og hjemmelavet hoved-fast holder til neonatal mus. (A) stereotaxisk indsprøjtningssystem består af følgende enheder: i. sprøjten pumpe (controller); II. sprøjten pumpe (drivaggregat); III. microliter sprøjte (10 µL); IV. PE20 slanger adapter; v. PE10 rør; Vi. 30G injektion nål; VII. stereotaxisk apparatur VIII. en pipette tips box konverteret platform for neonatal unger; XI: knust is. (B) højden af væv indlejring kassetten er omkring 7 mm. Knappen i 1,5 mL centrifugeglas er ca 15 mm lange. (C) musen hovedet er sikret i den hjemmelavede hoved-fast holder. Pilen angiver landmark lambda i overhoved neonatale mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Udtryk for tdTomato i striatum af P14 Ai14 mus efter AAV-eGFP-Cre medieret Cre-loxP DNA rekombination. AAV-eGFP-Cre virus var sterotaxically injiceres P2 striatum af Ai14 mus. Hjernen blev analyseret på P14. (A) mange normal god landbrugspraksis-positive celler er til stede i hele striatum (Str). (B) mange tdTomato-positive celler er også til stede i striatum. (C) de flettede billeder viser en omfattende Co lokalisering af normal god landbrugspraksis og tdTomato i striatum. Konfokal billeder af regionerne boxed i A-C er vist på høj forstørrelse i A'-C', henholdsvis. Alle normal god landbrugspraksis-positive celler (grønne) express Co tdTomato (rød) i striatum. (D, E) TdTomato-signaler registreres i målområder af striatal projektion neuroner, herunder globus pallidus (GP; D) og substantia nigra pars reticulata (SNr; E). (F) skematiske tegninger af AAV-eGFP-Cre og Ai14 transgene konstruktioner. Ctx: cortex; Sep: septum; Hipp: Hippocampus; MB: midthjernen. Skalalinjen i A (for A-C), 200 µm; A' (for A'-C'), 10 µm; D (for D og E), 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Betinget sletning af Foxp2 gen i neonatal striatum ved intrastriatal injecions af AAV-eGFP-Cre vira. Intrastriatal injektioner af AAV-eGFP-Cre virus blev udført i P2 Foxp2fl/fl (A-C') og Foxp2fl / +(E) mus. Hjerner blev analyseret på P9. (A-C) Normal god landbrugspraksis-positive celler (A, C, grøn) mangler Foxp2 immunoreactivity (B, C, rød) i striatum af Foxp2fl/fl mus med AAV-eGFP-Cre vira. Regionerne boxed i A-C er vist på høj forstørrelse i A'-C', henholdsvis. (D) Striatal celler Co express normal god landbrugspraksis og Foxp2 er til stede i striatum, der blev sprøjtet med AAV-eGFP kontrol virus. (E) NGL-positive celler Co express Foxp2 (pilespidser) er til stede i striatum af Foxp2fl / + mus med AAV-eGFP-Cre vira. (F) skematiske tegninger af AAV-eGFP-Cre virus og Foxp2fl/fl Transgene mus. Skalalinjen i A (for A-C), 200 µm; A' (for A'-C', D og E), 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den foreliggende undersøgelse viser vi en enkel og pålidelig stereotaxisk metode til indsprøjtning AAV vira i striatum af neonatal mus hjerner. Vi microinjected AAV-eGFP-Cre vira i striatum af Ai14 reporter mus på P2 og derefter analyseret reporter gen expression på P14. Vi fandt AAV transduced normal god landbrugspraksis-positive celler i hele striatum på rostrocaudal niveauer. Desuden, næsten alle normal god landbrugspraksis-positive celler Co udtrykt tdTomato reporter gen i striatal celler, hvilket tyder på en vellykket Cre-loxP DNA rekombination induceret af AAV-medieret udtryk for Cre aktivitet. Vi yderligere bekræftet effektiviteten af denne metode af microinjections af AAV-eGFP-Cre i striatum Foxp2fl/fl mus på P2. Dobbelt mærkning viste, at mange AAVs-transduced normal god landbrugspraksis-positive celler manglede Foxp2 immunoreactivity i P9 striatum, tyder på en vellykket betinget sletning af Foxp2 gen i neonatal striatum. Bind af microinjected AAVs er korreleret med størrelsen af de inficerede hjerneregioner. Med 200 nL af den injicerede volumen, normal god landbrugspraksis-positive celler blev fundet omfattende hele neonatal striatum, og nogle spredte normal god landbrugspraksis-positive celler var også til stede i cortex støder op til striatum. Med 50 nL af den injicerede volumen, normal god landbrugspraksis-positive celler var lokalt begrænset til neonatal striatum. Derfor er tilsætningen mængder af indsprøjtet AAVs vigtige for optimal transduktion af neuronal populationer i specifikke hjerneregioner. Derudover bestemmes transduktion også af titer af viral forberedelse. Det er tænkeligt, at præcis målretning specifikke celletyper kan opnås ved hjælp af Transgene mus med forskellige projektledere.
Der er flere kirurgiske tips til vellykket indsprøjtning AAVs til interesserede hjerneregioner. For det første på grund af den lille størrelse af musen unger og vanskelighederne ved at sikre placeringen af musen hovedet med hænderne under operationen, er det vanskeligt at udføre stereotaxisk hjerneoperation i neonatal mus10. Selv om en tidligere undersøgelse har påvist neonatal stereotaxisk kirurgi, men det kræver to personer til at udføre mikroinjektion under kirurgi11. Vi har overvundet disse problemer ved at udvikle en skræddersyet hoved-fast enhed, der kan fast sikre pup hovedet under hjernekirurgi. De hele procedurer kan udføres af en enkelt person. Hjernen størrelser af neonatal mus er forskellige på grund af forskellige genetiske baggrunde, moderens omsorg og aldre af unger. En fordel ved vores hjemmelavede enhed er, at det giver en blid, men sikrede fiksering af neonatal mus hoved, som er afgørende for udfører høj præcision stereotaxisk hjernekirurgi. Andet, på grund af elasticitet af den bløde hud og den tynde væg i kraniet, hud indsnit efterfulgt af kraniet boring i hovedet er vanskelig at udføre i neonatal unger. For at løse dette problem, er det nødvendigt at gøre en punktering af huden og kraniet med en nål tip inden sænke injektion nålen til målrettede hjernen regionen. For det tredje er det vigtigt at kontrollere strømmen af synlige farvestof i PE rør for at sikre mikroinjektion er i progression under injektion. Hvis farvestoffet ikke bevæger sig i PE-rør, bestræbelser bør tages til problemer med at skyde problemer, herunder en eventuel lækage af væske i slangen og tilstoppet nåle. Bemærk, at denne metode gælder for neonatal hvalpene hvis lambda er synlige gennem huden før P5. For hvalpe ældre end P5, skal den muligvis et snit i huden til at udsætte lambda. Bemærk, at lys belysning på P4 og P5 mus hoveder kan hjælpe med at finde landmark lambda. Selv om vi ikke har udført denne teknik af stereotaxisk kirurgi i neonatal rotter, antager vi, at teknikken er gældende til rotte unger med nogle ændringer.
Debut og maksimal udtryk for virus regnskabsmæssige genekspression tage flere dage eller uger efter injektioner i hjerner14,15. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at AAV-eGFP-Cre virus-medieret Cre-loxP DNA rekombination i neonatal striatal neuroner opstod allerede i 8 dage efter viral transduktion. Den forrige undersøgelse har rapporteret, at AAV-medieret Cre-afhængige reporter aktivitet kan påvises i den olfaktoriske pære af nyfødte mus hvalpe så tidligt som 3 dage efter bulk injektion af AAVs15. Det er tænkeligt, at den tidlige start af AAV-medieret genetiske aktivitet er en fordel for at studere udviklingsmæssige begivenheder, der løbende finder sted i de postnatale hjerner.
I Resumé, neonatal stereotaxisk teknikken, som vi udviklede er ikke kun for betinget slet gener i specifikke hjerneregioner, men det er også indstillet til at injicere farmakologiske reagenser og neuronal røbestoffer til specifikke hjerneregioner i neonatal mus. Selv om vi kun gjort microinjections i neonatal striatum i den nuværende undersøgelse, i princippet, kan vores stereotaxisk neonatal hjerneoperation anvendes til at målrette specifikke hjerneregioner, hvis koordinaterne for bestemte regioner i neonatal hjerner er tilgængelige. Givet variationen i størrelsen af neonatal mus hjerner med forskellige genetiske baggrunde i forskellige faser, er det vigtigt at empirisk fastslå de præcise koordinater af de målrettede websteder af efterforskerne. Endelig, af stereotaxisk microinjections af AAVs udtryk for genetisk modificerede optogenetic3 og chemogenetic proteiner4 og neuronal aktivitet indikatorer5 i specifikke hjerneregioner, kan man udforske rollen af neuronal aktivitet på den postnatale udvikling af hjernen på løsningen af celle og kredsløb-typespecifikke niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for videnskab og teknologi giver MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, de nationale sundheds-forskningsinstitutter give NHRI-EX106-10429NI, og de fremhævede områder Research Center Program tilskud fra Undervisningsministeriet gennem Brain Forskningscenter, nationale Yang-Ming universitetet i Taiwan, og postdoc stipendium giver MOST106-2811-B-010-031 (S.-YC), MOST105-2811-B-010-036 og MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000 |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
