Summary
Les auteurs décrivent un protocole de chirurgie stéréotaxique avec un dispositif de tête-correction faite maison pour microinjecting réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Cette technique permet des manipulations génétiques dans les cellules neuronales de régions précises du cerveau de souris néonatales.
Abstract
Plusieurs gènes sont exprimés dans le cerveau embryonnaire, et certains d'entre eux s’expriment en permanence dans le cerveau après la naissance. Pour ces gènes avec persistance, ils peuvent fonctionner pour réglementer le processus de développement et/ou de la fonction physiologique dans le cerveau néonatal. Pour étudier les fonctions neurobiologiques de gènes spécifiques dans le cerveau, il est essentiel pour inactiver les gènes dans le cerveau. Nous décrivons ici une simple méthode stéréotaxique pour inactiver l’expression des gènes dans le striatum des souris transgéniques à des fenêtres temporelles néonatale. Les virus AAV-eGFP-Cre ont été micro dans le striatum de souris de gène pour le journaliste Ai14 jours après la naissance (P) 2 par chirurgie stéréotaxique cérébrale. L’expression du gène rapporteur tdTomato a été détectée dans le striatum P14, suggérant une Cre-loxP réussie médiée par recombinaison de l’ADN dans les cellules transduites AAV striatal. Plus loin, nous avons validé cette technique par microinjecting virus AAV-eGFP-Cre en souris P2Foxp2fl/fl . Double marquage de GFP et Foxp2, a montré que les cellules positives GFP manquaient immunoréactivité Foxp2 dans le striatum P9, suggérant la perte de Foxp2 protéine dans les cellules striatal AAV-eGFP-Cre transduite. Globalement, ces résultats démontrent une délétion génétique efficace par les virus AAV-eGFP-Cre stereotaxically micro-injection dans certaines populations neuronales dans le cerveau néonatal de souris transgéniques floxed. En conclusion, notre technique stéréotaxique fournit une plate-forme facile et simple pour des manipulations génétiques dans les cerveaux de souris néonatales. La technique peut non seulement être utilisée pour supprimer les gènes dans des régions précises du cerveau néonatal, mais il peut également être utilisé pour s’injectent des drogues pharmacologiques, traceurs neuronales, optogenetics génétiquement modifiés et chemogenetics des protéines, des indicateurs de l’activité neuronale et les autres réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales.
Introduction
Les études modernes sur la structure et la fonction du cerveau exigent habituellement une manipulation génétique de gènes spécifiques dans les cellules neuronales. Pour sonder les fonctions des différents gènes, les souris transgéniques porteuses d’allèles mutants, y compris la knockout et knock-in allèles ont été systématiquement générés. Chirurgie du cerveau stéréotaxique pour rongeurs adultes est une méthode standard pour offrir localement des médicaments, des virus, des traceurs et des autres réactifs à des régions spécifiques du cerveau rongeurs1,2. Appliquant la chirurgie stéréotaxique de cerveau de souris transgéniques permet de manipuler génétiquement la fonction et l’activité neuronale dans certaines populations neuronales du cerveau de souris. La manipulation spécifique au type de cellule fournit une approche puissante pour déchiffrer les fonctions neuronales dans les circuits neurones complexes du cerveau3,4,5.
Développement neurologique du système nerveux débute aux premiers stades embryonnaires, et les processus de développement continuent après la naissance jusqu'à la période juvénile. La maturation postnatale du système nerveux incluant le câblage synaptique précis des circuits neuraux, qui est essentiel pour les fonctions physiologiques et cognitives du cerveau6. Par conséquent, étudier des événements développementaux qui se produisent dans des fenêtres temporelles néonatale est important non seulement pour comprendre le développement neural normal, mais il peut aussi donner un aperçu de la pathogenèse du développement neurologique et maladies neuropsychiatriques7 ,,8. Bien que les méthodes de chirurgie stéréotaxique cérébrale pour rongeurs adultes sont facilement disponibles2,9, quelques protocoles sont disponibles sur l’internet pour la chirurgie stéréotaxique cerveau souris néonatales10,11. En fait, des microinjections stéréotaxiques de réactifs dans le cerveau des souriceaux nouveau-nés sont difficiles, car la tête du chiot nouveau-né est trop fragile pour être fixé à l’appareil stéréotaxique standard. Néanmoins, l’application de la chirurgie stéréotaxique cerveau de souris transgéniques est faisable pour souris néonatales12. Nous décrivons ici une méthode simple avec l’installation de maison à effectuer une chirurgie stéréotaxique cerveau dans des souriceaux nouveau-nés. Nous démontrons que cette technique permet de supprimer sous condition floxed gènes par microinjecting recombinase exprimant l’AAV Cre ADN dans le striatum de souris de gène de journaliste et conditionnellement floxed souris transgéniques. Cette technique est également applicable pour livrer des réactifs dans le striatum neonatal de souris de type sauvage.
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Protocol
Les protocoles animaux décrits ici ont été approuvés par l’utilisation comités d’Université nationale de Yang-Ming et animalier.
1. préparation du titulaire pour les chiots nouveau-nés dans l’appareil stéréotaxique
- Faire le plateau de tête : couper le fond d’un tube de centrifugation de 1,5 mL (15 mm de long) dans la forme qui correspond à la tête des ratons nouveau-nés en enlevant 1/5 de la paroi du tube.
- Prendre une boîte de pointe de pipette avec la bonne taille qui s’inscrit dans le socle de l’appareil stéréotaxique et retirer le couvercle supérieur. Fixer le plateau tête préparé à l’étape 1.1 et une cassette d’incorporation de tissu sur la base du plateau de pointe avec de la colle à chaud-fonte. La hauteur de la cassette d’encastrement tissu est de 7 mm, qui sert à soutenir le cou et le corps du chiot en position fixe à la tête.
- Mettre l’installation entière dans un appareil stéréotaxique standard.
2. préparation des aiguilles en acier inoxydable à Injection 30G
- Nettoyage préalable des aiguilles de seringue 30 G en les trempant dans du chloroforme pendant 3 jours.
- Utiliser forceps prudemment et lentement sortir l’aiguille de son hub de polypropylène sous une hotte chimique.
- Laver les aiguilles avec de l’éthanol absolu pendant 20 min, suivie de rinçages éthanol 70 % pour 3 x 10 min sur un agitateur à 50 tr/min. Laisser l’air aiguilles sécher et mettre les aiguilles nettoyés dans une boîte propre à température ambiante (RT) jusqu'à utilisation.
3. Préparez un adaptateur pour les tuyaux de Microinjection
- Connecter la seringue microlitre d’une aiguille d’injection de 30G avec un tube de polyéthylène PE10 (PE10 tube). Préparer un adaptateur de tube (tube PE20) de polyéthylène PE20 pour combler l’aiguille d’injection et la seringue de microlitre. L’utilisation de l’adaptateur est nécessaire, car le diamètre du tube PE10 est beaucoup plus petit que celle de l’aiguille de la seringue de microlitre de 26G.
- Préparer le tube de la seringue de microlitre : connecter l’aiguille d’injection de 30 G préalablement nettoyé avec 5 cm de tube PE20 et sceller la jonction avec la colle instantanée. Cet adaptateur de tube est réutilisable.
Remarque : Si l’aiguille de la seringue de microinjection est 30G, la préparation (étape 3.1) et l’utilisation (étape 3.3) de cet adaptateur n’est pas nécessaire. - Branchez l’adaptateur de tuyau (préparé à l’étape 3.1) avec une seringue de microlitre (10 µL).
- Branchez une extrémité du tube PE10 (pas plu de 60 cm) sur l’aiguille de 30G de l’adaptateur de tuyau PE20. Monter une nouvelle aiguille d’injection de 30G à l’autre extrémité du tube PE10.
4. Chargez le Tube de Microinjection avec eau distillée autoclavé, colorant et virus
- Retirer le piston de la seringue de microlitre. Utiliser une seringue de 25G pour charger la seringue microlitre et son tube PE connecté avec de l’eau distillée autoclavé pour chasser l’air du circuit respiratoire.
- Placer le piston vers la seringue microlitre et pousser le piston jusqu'à 2 µL de résidus d’eau distillée dans le Canon. Ne laissez pas le volume d’eau distillée devenir inférieure à 2 µL.
- Monter soigneusement la seringue de microlitre sur le pousse-seringue flux micro taux.
- Distribuer de petites quantités de colorant vert rapide de 0,1 % (préparé en solution saline à 0,9 % et filtrée avec 0,22 µm filtre) et les liquides de virus à un morceau de parafilm.
- Retirer une petite quantité d’air pour faire une bulle d’air visible à la jonction entre l’aiguille d’injection de 30G et tube PE10 suivie de chargement 0.7 µL de vert rapide filtré dans le tube pour tester l’écoulement des fluides dans les tubes de microinjection.
- Retirer une autre petite quantité d’air pour faire une deuxième bulle d’air puis en chargeant les liquides de virus dans le tube de microinjection.
- Fixez et fixez l’aiguille 30G de microinjection au bras de l’appareil stéréotaxique.
5. anesthésie de souris néonatales par hypothermie
- Placez le chiot dans un manchon de gant en latex et l’immerger dans de la glace pilée jusqu’au cou pendant 5 min.
- Pincer les pieds le chiot avec une pince pour ne s’assurer aucune réponse de retrait de ses pieds.
- Placez le chiot avec manchon de gant en latex dans le bac principal et mettre la glace concassée dans le manchon de latex pour le maintenir froid pour l’anesthésiologie en hypothermie.
- Pommade de vétérinaire sur les yeux du pup pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie si possible.
6. microinjection
- Préparer une chirurgie stérile en essuyant l’instrument stéréotaxique soigneusement avec l’éthanol à 70 %. Stériliser l’instrument chirurgical en l’immergeant dans l’éthanol à 70 %.
- Frotter la tête du chiot avec l’éthanol à 70 %. Localiser le lambda de point de repère sur le crâne et marquez le lambda avec un marqueur. Viser la pointe de l’aiguille pour le lambda et l’antéro-postérieur (AP) et les coordonnées de medial-latérale (ML) comme zéro.
- Déplacez le bras d’injection vers le site cible selon les coordonnées X et Y de l’emplacement de la cible. Pour le striatum de jour après la naissance (P) 2 chiots, les coordonnées sont : AP, +2,4 mm devant le lambda ; ML, ± 1,0 mm latéral de la ligne médiane ; dorsale-ventral (DV), −1, 7 mm sur le crâne. Marquez la position en PE10 tube de colorant vert rapide avec un stylo.
- Faire baisser l’aiguille d’injection de 30G lentement à traverser la peau et le crâne et ensuite mettre en place la pointe de l’aiguille jusqu'à ce qu’il s’arrête à la surface du crâne. Définir la coordonnée DV comme zéro.
- Faire baisser l’aiguille d’injection de 30G lentement jusqu'à ce qu’il atteigne la coordonnée DV du site cible. Attendre 1 min permettre le parenchyme reprendre sa forme normale. Exécutez le programme de microinjection (100 nL/min).
- Assurez-vous que la marque de colorant vert rapide se déplace dans le tube PE afin de s’assurer que le liquide de virus est injecté dans le cerveau.
- Attendre 1 min après la cessation de la microinjection et ensuite lentement et progressivement mettre en place l’aiguille à hauteur de 1/2 de profondeur DV dans les 30 s. Après 30 s, retirer doucement l’aiguille de la tête du chiot.
- Répétez l’étape 6.2 à 6.7 jusqu'à ce que les microinjections de tous les sites visés sont terminées.
7. après une chirurgie récupération du chiot
- Réchauffer le chiot pendant 20 min dans un incubateur à 33 ° C. Vérifier la récupération du chiot de l’anesthésie de l’hypothermie toutes les 5 min jusqu'à ce que le chiot a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
- Retourner le chiot vers le barrage après que le chiot est complètement rétabli.
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Representative Results
Pour la première série d’expérience, nous micro 200 nL des AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, dilution au 1/10 dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) qui expriment la recombinase Cre ADN fusionnées avec GFP P2 striatum de souris Ai14. Les souris Ai14 expriment le gène rapporteur tdTomato à Cre-mediated suppression des flancs loxP (floxed) STOP cassette (Figure 2F). Les cerveaux ont été récoltés à P14 pour immunostaining des GFP et tdTomato. AAV nombreux transduites cellules GFP-positives ont été présents tout au long du striatum (Figure 2 a, C), indiquant une infection étendue de cellules striatales par d’éventuels virus AAV-eGFP-Cre. Semblable expression étendue de tdTomato a été également trouvée dans le striatum (Figure 2 b, C). Après examen au microscope à fort grossissement, nous avons constaté que presque toutes les cellules striatal de GFP-positives expriment conjointement le gène rapporteur tdTomato (Figure 2 a'-C'). En outre, tdTomato signaux ont été détectés chez vraisemblablement les terminaisons axonales dans le globus pallidus (Figure 2D) et la substantia nigra pars reticulata (Figure 2E), les régions cibles de neurones de projection nigrostriés et striatopallidale 13. ces résultats suggèrent une Cre-loxP réussie médiée par recombinaison de l’ADN induite par l’AAV médiée par expression de l’activité de la Cre dans les neurones striataux néonatale.
Pour la deuxième série d’expérience, nous micro 50 nL du virus AAV-eGFP-Cre dans le striatum de Foxp2fl/fl souris porteuses d’allèles de Foxp2 loxP-flanqué à P2 (Figure 3 a- C, F) et récolté le cerveau à P9. Aucun Foxp2+; GFP+ marqués au double cellules ont été trouvées dans le striatum, i.e., protéine Foxp2 était absent dans des cellules positives GFP (Figure 3 a'-C'). Dans des expériences de contrôle, Foxp2+; Les cellules marquées double GFP+ étaient présents dans le striatum de souris Foxp2fl/fl avec les virus AAV-eGFP contrôle (Figure 3D) et dans le striatum des hétérozygotes Foxp2fl / + souris avec AAV-eGFP-Cre virus (Figure 3E). Ces résultats indiquent que gène Foxp2 est spécifiquement supprimé dans les cellules d’AAV-eGFP-Cre transduite du striatum néonatale.
Globalement les résultats de AAV-eGFP-Cre ; Ai14 et AAV-eGFP-Cre ; Foxp2fl/fl souris, la technique de chirurgie stéréotaxique cérébrale néonatale que nous avons développés se prête pour conditionnellement suppression de gènes dans des régions précises du cerveau de souris néonatales.
Figure 1. Appareil stéréotaxique et porte-tête-correction fait maison pour souris néonatales. (A) le système d’injection stéréotaxiques comprend les appareils suivants : pompe à seringue i. (contrôleur) ; II. pousse-seringue (motorisée). III. microlitre seringue (10 µL) ; adaptateur de tuyau PE20 IV. ; v. PE10 tube ; aiguille d’injection VI. 30G ; VII. stéréotaxiques appareils ; VIII. une boîte de pointes de pipette converti en plate-forme pour les chiots nouveau-nés ; XI : glace pilée. (B) la hauteur de la cassette d’encastrement tissu est d’environ 7 mm. Le bouton du tube à centrifuger de 1,5 mL est environ 15 mm de long. (C) le dessus de la souris est fixé dans le support de tête-correction faite maison. La flèche indique le lambda de point de repère dans la tête de souris néonatales. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Expression de tdTomato dans le striatum de souris P14 Ai14 après AAV-eGFP-Cre médiée par recombinaison de l’ADN de Cre-loxP. Les virus AAV-eGFP-Cre étaient sterotaxically injecté dans P2 striatum de souris Ai14. Le cerveau a été analysé à P14. (A) plusieurs cellules de GFP-positives sont présents partout dans le striatum (Str). (B) nombreuses cellules tdTomato positives sont également présents dans le striatum. (C) les images fusionnées montrent une vaste co-localisation des GFP et tdTomato dans le striatum. Images confocales des régions en boîte en A-C sont indiquées à fort grossissement dans A "-C", respectivement. Toutes les cellules de GFP-positives (verts) expriment co tdTomato (rouge) dans le striatum. (D, E) Les signaux de tdTomato sont détectés dans les régions cibles de neurones de projection striatale, y compris le globus pallidus (GP ; D) et la substantia nigra pars reticulata (SNr ; E). (F) des schémas de constructions transgéniques AAV-eGFP-Cre et Ai14. CTX : cortex ; Sep : cloison ; Hipp : Hippocampe ; MB : mésencéphale. Barre d’échelle en A (A-C), 200 µm ; A' (a '-C "), 10 µm ; D (pour D et E), 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Suppression conditionnelle du gène Foxp2 dans le striatum néonatal par intrastriatale injecions du virus AAV-eGFP-Cre. Intrastriatale injections de virus AAV-eGFP-Cre ont été réalisées en P2 Foxp2fl/fl (A-C ") et Foxp2fl / +souris (E). Les cerveaux ont été analysées à P9. (A-C) Des cellules positives GFP (A, C, vert) n’ont pas l’immunoréactivité Foxp2 (B, C, rouge) dans le striatum de souris Foxp2fl/fl avec virus AAV-eGFP-Cre. Les régions en boîte en A-C sont affichées à fort grossissement dans A "-C", respectivement. (D) les cellules Striatal express co GFP et Foxp2 sont présentes dans le striatum qui a été injecté avec des virus AAV-eGFP contrôle. (E) des cellules positives GFP expriment co Foxp2 (pointes de flèche) sont présents dans le striatum de Foxp2fl / + souris avec virus AAV-eGFP-Cre. (F) des schémas du virus AAV-eGFP-Cre et Foxp2fl/fl souris transgéniques. Barre d’échelle en A (A-C), 200 µm ; A' (a '-C', D et E), 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans la présente étude, nous démontrons une méthode stéréotaxique simple et fiable permettant d’injecter les virus AAV dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Nous micro virus AAV-eGFP-Cre dans le striatum de souris journaliste Ai14 à P2 et ensuite analysé l’expression du gène rapporteur à P14. Nous avons trouvé QU'AAV transduites cellules GFP-positives dans le striatum Rostro niveaux. En outre, presque toutes les cellules de GFP-positives expriment conjointement le gène rapporteur de tdTomato dans les cellules striatal, suggérant une succès induite par l’AAV médiée par expression de l’activité de la Cre de la recombinaison de l’ADN de Cre-loxP. Nous avons confirmé davantage l’efficacité de cette approche en microinjections de AAV-eGFP-Cre dans les striatum Foxp2fl/fl souris à P2. Un double marquage a montré que plusieurs cellules transduites AAVs GFP-positif n’avait pas l’immunoréactivité Foxp2 dans le striatum P9, suggérant une suppression conditionnelle avec succès du gène Foxp2 dans le striatum néonatale. Les volumes de micro-injection AAVs sont corrélées avec la taille des régions de cerveau infecté. Avec 200 nL du volume injecté, cellules GFP positives trouvées abondamment dans le striatum néonatal, et quelques cellules positives à GFP épars étaient également présents dans le cortex adjacent dans le striatum. Avec 50 nL du volume injecté, cellules GFP-positives ont été localement restreintes dans le striatum néonatal. Titrage des volumes de AAVs injectées est donc importante pour la transduction optimale des populations de neurones dans certaines régions du cerveau. En outre, le taux de transduction est également déterminé par le titre de préparation virale. Il est concevable que les types de cellule spécifique ciblage précis peuvent être atteint en utilisant des souris transgéniques avec des promoteurs différents.
Il y a plusieurs conseils chirurgicaux pour succès AAVs injection pour les régions du cerveau concernées. Tout d’abord, en raison de l’exiguïté des souriceaux et la difficulté à obtenir la position de la tête de la souris avec les mains pendant la chirurgie, il est difficile d’effectuer une chirurgie stéréotaxique cerveau en souris néonatales10. Bien qu’une étude précédente a démontré néonatale chirurgie stéréotaxique, mais il faut deux personnes effectuer la microinjection pendant la chirurgie11. Nous avons surmonté ces problèmes en mettant au point un dispositif sur mesure tête-correction pouvant garantir fermement la tête de chiot au cours de la chirurgie du cerveau. Les procédures entières peuvent être réalisées par une seule personne. Les tailles de cerveau de souris néonatales sont variées en raison de différents fonds génétiques, soins à la mère et l’âge des chiots. Un avantage de notre dispositif fait maison, c’est qu’il permet une fixation douce mais garantie de tête de souris néonatales qui est indispensable pour effectuer la chirurgie stéréotaxique cerveau haute précision. Deuxièmement, en raison de l’élasticité de la peau douce et la fine paroi de crâne, incision cutanée suivie de crâne dans la tête de forage est difficile à réaliser chez les chiots nouveau-nés. Pour surmonter ce problème, il est nécessaire de faire une perforation de la peau et le crâne avec une pointe de l’aiguille avant l’abaissement de l’aiguille d’injection à la région du cerveau ciblées. En troisième lieu, il est important de vérifier le débit de colorant visible dans le tuyau PE pour s’assurer que la microinjection est en progression au cours de l’injection. Si la teinture ne se déplace pas dans le tube PE, des efforts devraient être prises pour tirer d’ennui les problèmes, y compris une éventuelle fuite de liquide dans le tube et bouchent les aiguilles. Notez que cette méthode s’applique pour les chiots nouveau-nés dont lambda sont visibles à travers la peau avant P5. Pour les petits plus de P5, il peut avoir besoin d’une incision dans la peau d’exposer la lambda. Notez que lumière éclairage sur têtes de souris P4 et P5 peut aider à localiser le lambda de point de repère. Bien que nous n’avons pas réalisé cette technique de chirurgie stéréotaxique chez les rats néonatals, nous supposons que la technique est applicable aux ratons avec quelques modifications.
L’apparition et l’expression maximale des virus portant l’expression des gènes de prennent plusieurs jours ou plusieurs semaines après les injections dans les cerveaux14,15. Dans la présente étude, nous avons constaté que la recombinaison de l’ADN de Cre-loxP induite par le virus AAV-eGFP-Cre dans les neurones striataux néonatale s’est produite dès 8 jours après la transduction virale. La précédente étude a signalé que l’activité induite par l’AAV Cre-dépendante journaliste peut être détectée dans le bulbe olfactif des souriceaux nouveau-nés dès 3 jours après l’injection en vrac de AAVs15. Il est concevable que l’apparition précoce de l’activité génétique induite par l’AAV est un avantage pour l’étude des événements développementaux qui se produisent en permanence dans le cerveau après la naissance.
En résumé, la technique stéréotaxique néonatale que nous avons développés n’est pas seulement pour conditionnellement supprimer gènes dans certaines régions du cerveau, mais elle est également prête à injecter des réactifs pharmacologiques et traceurs neuronales pour certaines régions du cerveau chez les souris néonatales. Bien que nous avons formulé microinjections dans le striatum néonatale dans la présente étude, en principe, notre chirurgie stéréotaxique cérébrale néonatale peut être appliquée à des régions spécifiques du cerveau cible si les coordonnées des régions spécifiques du cerveau néonatal sont disponibles. Compte tenu de la variabilité de la taille des cerveaux de souris néonatales avec différents fonds génétiques à différents stades, il est essentiel de déterminer empiriquement les coordonnées précises des sites ciblés par les enquêteurs. Enfin, par microinjections stéréotaxiques de AAVs exprimant génétiquement modifiés optogenetic3 et chemogenetic protéines4 et indicateurs de l’activité neuronale5 dans certaines régions du cerveau, on peut explorer le rôle des neurones activité sur le développement postnatal du cerveau à la résolution des niveaux de cellule spécifique au type et au circuit.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et technologie accorde MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, les instituts nationaux de recherche de santé accorde INRH-EX106-10429NI et le programme de centre de recherche espaces recommandés subvention du le ministère de l’éducation par le biais de Brain Research Center, Université nationale de Yang-Ming à Taïwan, et bourse de recherche postdoctorale accorde MOST106-2811-B-010-031 (Y.C.-S.), MOST105-2811-B-010-036 et MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000 |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
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