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Neuroscience

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

doi: 10.3791/57270 Published: July 10, 2018

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll der stereotaktischen Operation mit einer hausgemachten Kopf fixiert Vorrichtung zur microinjecting Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Diese Technik ermöglicht Genmanipulation in neuronalen Zellen bestimmter Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.

Abstract

Viele Gene werden im embryonalen Gehirn exprimiert, und einige von ihnen werden kontinuierlich in das Gehirn nach der Geburt ausgedrückt. Für solche anhaltend exprimierten Gene können sie Funktion, um den Entwicklungsprozess und/oder physiologische Funktion im neonatalen Gehirn regulieren. Um neurobiologische Funktionen bestimmter Gene im Gehirn zu untersuchen, ist es unerlässlich, Gene im Gehirn zu inaktivieren. Hier beschreiben wir eine einfache stereotaktischen Methode um gen-Expression im Striatum von transgenen Mäusen bei Neugeborenen Zeitfenster zu inaktivieren. AAV-eGFP-Cre Viren wurden in das Striatum Ai14 Reporter-gen Mäuse an postnatalen Tag (P) 2 von stereotaktischen Gehirnchirurgie mikroinjiziert. Die TdTomato-Reporter-gen-Expression wurde im P14 Striatum, was darauf hindeutet, dass eine erfolgreiche Cre-LoxP vermittelte DNA Rekombination in AAV ausgestrahlt Striatale Zellen erkannt. Wir weiter validiert diese Technik durch microinjecting Viren AAV-eGFP-Cre in P2Foxp2fl/fl -Mäuse. Doppelte Kennzeichnung der GFP und Foxp2 zeigte, dass die GFP-positiven Zellen Foxp2-Immunoreactivity in P9 Striatum, was den Verlust des Foxp2-Proteins in AAV-eGFP-Cre ausgestrahlt Striatale Zellen fehlte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eine wirksame genetische Löschung durch stereotaxically mikroinjiziert AAV-eGFP-Cre-Viren in bestimmten neuronalen Populationen im neonatalen Gehirn von transgenen Mäusen Floxed. Abschließend bietet unsere stereotaktischen Technik eine einfache Plattform für Genmanipulation in Neugeborenen mäusegehirnen. Die Technik kann nicht nur Gene in bestimmten Regionen des neonatalen Gehirn Löschen verwendet werden, aber es kann auch verwendet werden, um pharmakologische Medikamente, neuronaler Tracer, gentechnisch veränderten optogenetik und Chemogenetics Proteine, neuronaler Aktivität Indikatoren zu injizieren und anderen Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen.

Introduction

Moderne Studien der Struktur und Funktion des Gehirns erfordern in der Regel genetische Manipulation bestimmter Gene in neuronalen Zellen. Um die Funktionen der verschiedenen Gene, Transgene Mäuse tragen mutierten Allele, einschließlich Sonde wurden routinemäßig Knockout und Knock-in Allele generiert. Stereotaktischen Gehirnchirurgie für Erwachsene Nager ist eine Standardmethode zu liefern lokal Medikamente, Viren, Tracer und andere Reagenzien auf bestimmte Regionen von Nagetier Gehirne1,2. Anwendung der stereotaktischen Gehirnchirurgie mit transgenen Mäusen erlaubt, die Genfunktion und neuronale Aktivität in bestimmten neuronalen Populationen des Mäusegehirns genetisch zu manipulieren. Die Zelle typspezifische Manipulation bietet einen leistungsfähigen Ansatz um neuronale Funktionen in komplexen neuronalen Schaltkreise des Gehirns3,4,5zu entschlüsseln.

Neurale Entwicklung des Nervensystems beginnt am frühen embryonalen Stadien und Entwicklungsprozesse weiter nach der Geburt bis zur juvenile Periode. Postnatale Reifung des Nervensystems beinhaltet die genaue synaptische Verdrahtung der neuronalen Schaltkreise, die für physiologische und kognitive Funktionen des Gehirns6erforderlich ist. Daher studieren Entwicklungsstörungen Ereignisse, die in Neugeborenen Zeitfenstern auftreten ist wichtig nicht nur für normale neurale Entwicklung zu verstehen, aber es kann auch Einblicke in die Pathogenese von Entwicklungsstörungen und neuropsychiatrische Störungen7 ,8. Obwohl die Methoden der stereotaktischen Gehirnchirurgie für Erwachsene Nager verfügbar2,9, sind einige Protokolle im Internet für stereotaktischen Gehirnoperation bei Neugeborenen Mäusen10,11. Stereotaktischen Mikroinjektionen von Reagenzien in die Gehirne von Neugeborenen Maus Welpen sind in der Tat schwierig, denn den Kopf des Neugeborenen Welpen zu empfindlich, um in den standard stereotaktischen Apparat fixiert werden. Dennoch ist die Anwendung der stereotaktischen Gehirnchirurgie mit transgenen Mäusen für Neugeborene Mäuse12machbar. Hier beschreiben wir eine einfache Methode mit einem hausgemachten Setup stereotaktischen Gehirnchirurgie in Neugeborenen Maus Welpen durchführen. Wir zeigen, dass diese Technik ermöglicht eine bedingt Floxed Gene microinjecting DNA AAV exprimierenden Cre-Rekombinase in das Striatum von Reporter-gen-Mäusen und bedingt Floxed Transgene Mäuse zu löschen. Dieses Verfahren gilt auch für Reagenzien in der neonatalen Striatum von Wildtyp Mäusen zu liefern.

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Protocol

Die tierischen Protokolle, die hier beschrieben wurden von Animal Care und Nutzung Ausschüsse der National Yang-Ming University genehmigt.

1. Vorbereitung des Inhabers für die Neugeborenen Welpen in der stereotaktischen Vorrichtung

  1. Der Kopf Fach zu machen: Schneiden Sie unten eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen (15 mm lang) in die Form, die den Kopf des Neugeborenen Welpen passt durch Entfernen von 1/5 der Wand des Rohres.
  2. Nehmen Sie eine Pipette Tip Box mit der richtigen Größe, die mit dem Sockel des stereotaktischen Apparats passt, und entfernen Sie die obere Abdeckung. Befestigen Sie das Kopf Tablett in Schritt 1.1 und eine Gewebe Einbetten von Kassette auf der Basis des Tipp-Tablett mit heiß-schmelzen Kleber vorbereitet. Die Höhe der Gewebe einbetten Kassette beträgt 7 mm, die verwendet wird, um Hals und Körper der Welpe in der Kopf-feste Position zu unterstützen.
  3. Legen Sie das ganze Setup in einem standard stereotaktischen Apparat.

2. Vorbereitung von Injektionsnadeln Edelstahl 30G

  1. Pre-clean 30 G Spritze Nadeln durch Einweichen in Chloroform für 3 Tage.
  2. Verwenden Sie Zange vorsichtig und langsam die Nadel Herausziehen aus Polypropylen Drehkreuz in einer chemischen Kapuze.
  3. Waschen Sie die Nadeln mit absoluten Ethanol für 20 min, gefolgt von 70 % Ethanol Spülungen für 3 × 10 min auf einen Shaker bei 50 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die Nadeln Luft trocknen, und speichern Sie die gereinigten Nadeln in einer sauberen Box bei Raumtemperatur (RT) bis zur Verwendung.

3. bereiten Sie einen Adapter für die Mikroinjektion Schläuche

  1. Verbinden Sie Mikroliter Spritze mit einer 30G Injektionsnadel mit einer PE10 Polyethylenschlauch (PE10 Rohr). Bereiten Sie einen PE20 Polyethylen Schläuche (PE20 Röhre) Adapter zur Überbrückung der Injektionsnadel und Mikroliter-Spritze. Die Verwendung des Adapters ist notwendig, da der Durchmesser der PE10 Rohr viel kleiner als die Nadel der Spritze 26 G Mikroliter ist.
  2. Bereiten Sie den Schlauch für die Mikroliter-Spritze: die vorgereinigten 30 G Injektionsnadel mit 5 cm PE20 Röhre zu verbinden, und die Kreuzung mit Sekundenkleber versiegeln. Dieser Schlauch-Adapter ist wiederverwendbar.
    Hinweis: Wenn die Nadel der Spritze Mikroinjektion 30 G, die Vorbereitung (Schritt 3.1) und Nutzung (Schritt 3.3) dieser Adapter ist nicht erforderlich.
  3. Verbinden Sie den Schlauch-Adapter (vorbereitet in Schritt 3.1) mit einer Spritze Mikroliter (10 µL).
  4. Schließen Sie ein Ende der PE10 Rohr (nicht länger als 60 cm) auf die 30G Nadel PE20 Schlauch Adapter. Montieren Sie einen neuen 30G Injektionsnadel auf das andere Ende des Schlauches PE10.

4. Laden Sie die Mikroinjektion Tube mit autoklaviert destilliertes Wasser, Farbstoff und Viren

  1. Entfernen Sie den Kolben der Spritze Mikroliter. Verwenden Sie eine 25G Spritze laden die Mikroliter-Spritze und seine angeschlossenen PE-Rohr mit autoklaviert destilliertes Wasser, Luft aus dem Schlauch entfernen.
  2. Legen Sie den Kolben zurück zu den Mikroliter-Spritze, und drücken Sie den Kolben bis 2 µL destilliertes Wasser bleibt im Fass. Lassen Sie sich nicht das Volumen des destillierten Wassers werden niedriger als 2 µL.
  3. Montieren Sie sorgfältig die Mikroliter-Spritze auf der Mikro-Rate Spritze Strömungspumpe.
  4. Kleine Mengen von 0,1 % schnell grüne Farbstoff (in 0,9 % Kochsalzlösung vorbereitet und mit 0,22 µm Filter gefiltert) und die Virus-Flüssigkeiten zu einem Stück Parafilm Pipette.
  5. Ziehen Sie eine kleine Menge an Luft, eine Luftblase an der Kreuzung zwischen 30 G Injektionsnadel und PE10 Schlauch gefolgt von 0,7 µL des gefilterten schnell grün in das Rohr laden testen Sie die Strömung von Flüssigkeiten in der Mikroinjektion Schlauch sichtbar zu machen.
  6. Ziehen Sie eine weitere kleine Menge Luft, eine zweite Luftblase gefolgt von Virus-Flüssigkeiten in der Mikroinjektion Schlauch laden zu machen.
  7. Befestigen Sie und sichern Sie die 30G Mikroinjektion Nadel am Arm des stereotaktischen Apparats.

(5) Anästhesie des Neugeborenen Mäusen durch Unterkühlung

  1. Legen Sie der Welpe in einer Latex-Handschuh-Hülle und Tauchen Sie es in crushed-Ice bis zum Hals für 5 min.
  2. Kneifen Sie die Pup Füße mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass keine Rücknahme Antwort seiner Füße.
  3. Der Welpe mit Latex-Handschuh Ärmel im Kopf Tray legen Sie und einige zerstoßenem Eis um der Latex Hülle, um es für die Hypothermie Anästhesie kalt zu halten.
  4. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Pup es Augen, Trockenheit während der Narkose möglichst zu verhindern.

6. die Mikroinjektion

  1. Bereiten Sie sterile Chirurgie durch Abwischen der stereotaktischen Instruments gründlich mit 70 % Ethanol. Das chirurgische Instrument durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol zu sterilisieren.
  2. Schrubben Sie das Pup Kopf mit 70 % Ethanol. Suchen Sie die Wahrzeichen Lambda auf dem Schädel und markieren Sie der Lambda-Ausdruck mit einem Filzstift. Ziel ist die Spitze der Nadel an der Lambda-Ausdruck, und der anterior-posterioren (AP) und Medial-laterale (ML) Koordinaten als NULL festgelegt.
  3. Bewegen Sie die Injektion-Arm an den Zielstandort nach X und Y-Koordinaten der Ziel-Site. Für das Striatum postnatale Tag (P) 2 Jungtiere, die Koordinaten sind: AP, +2,4 mm anterior des Lambda-Ausdrucks; ML, 1,0 mm seitlich von der Mittellinie; dorsal-Ventral (DV), −1.7 mm aus dem Schädel. Markieren Sie die Position der schnell grünen Farbstoff in PE10 Rohr mit einem Stift.
  4. Bringen Sie die 30G Spritze langsam durchdringen die Haut und Schädel, und heben Sie dann die Spitze der Nadel bis zum Anschlag an der Oberfläche des Schädels. Die DV-Koordinate als NULL festgelegt.
  5. Bringe die 30G Spritze langsam bis sie die DV-Koordinate der Ziel-Site erreicht. Warten Sie 1 Minute um das Parenchym wieder seine normale Form zu ermöglichen. Führen Sie die Mikroinjektion Programm (100 nL/min).
  6. Stellen Sie sicher, dass die Marke schnell grün färben geht in das PE-Rohr um sicherzustellen, dass die Virus Flüssigkeit ins Gehirn injiziert wird.
  7. 1 min nach der Beendigung der Mikroinjektion warten, und langsam und schrittweise heben Sie dann die Nadel bis zu 1/2 Höhe von DV Tiefe innerhalb von 30 s. Nach 30 s, ziehen Sie die Nadel langsam aus der Welpe Kopf.
  8. Wiederholen Sie Schritt 6.2 bis 6.7 bis die Mikroinjektionen aller gezielte Seiten abgeschlossen sind.

7. postoperative Erholung des Welpen

  1. Der Welpe für 20 min in einem Inkubator 33 ° C erwärmen. Überprüfen Sie die Erholung des Welpen von Hypothermie Anästhesie alle 5 min, bis der Welpe ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.
  2. Der Welpe zurück bis zum Staudamm zurück, nachdem der Welpe ist vollständig erholt.

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Representative Results

Für den ersten Satz des Experiments mikroinjiziert wir 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Viren (AAV-eGFP-Cre, 1/10-Verdünnung in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung), die die DNA der Cre-Rekombinase Ausdrücken mit GFP in P2 Striatum von Ai14 Mäusen verschmolzen. Die Ai14 Mäuse express TdTomato-Reporter-gen bei Cre-vermittelten Löschung LoxP flankiert (Floxed) STOP-Kassette (Abbildung 2F). Die Köpfe wurden auf P14 für Immunostaining GFP und TdTomato geerntet. Viele AAV ausgestrahlt GFP-positiven Zellen wurden Gegenwart in das Striatum (Abbildung 2A, C), zeigt eine umfangreiche Infektion Striatale Zellen durch Viren AAV-eGFP-Cre. Ähnlich umfangreiche Ausdruck des TdTomato fand auch in das Striatum (Abb. 2 b, C). Bei der mikroskopischen Untersuchung bei hoher Vergrößerung, fanden wir, dass fast alle GFP-positiven Striatale Zellen der TdTomato Reporter-Gen Co ausgedrückt (Abbildung 2A'-C'). Darüber hinaus wurden TdTomato Signale in vermutlich Axon Terminals in den Globus Pallidus (Abb. 2D) und der Substantia Nigra Pars Reticulata (Abb. 2E), den Zielregionen von Striatonigral und Striatopallidal Projektion Neuronen erkannt. 13. diese Ergebnisse legen nahe, eine erfolgreiche Cre-LoxP vermittelte DNA Rekombination induziert durch AAV-vermittelten Expression von Kre-Aktivität in den Neugeborenen striatalen Neuronen.

Für den zweiten Satz des Experiments mikroinjiziert wir 50 nL AAV-eGFP-Cre Viren in das Striatum von Foxp2fl/fl -Mäuse tragen LoxP-flankiert von Foxp2 -Allele bei P2 (Abb. 3A- C, F), und das Gehirn auf P9 geerntet. Keine Foxp2+; GFP+ Doppel-markierten Zellen fanden sich im Striatum, dh., Foxp2-Protein fehlte in den GFP-positiven Zellen (Abbildung 3A'-C'). In Experimente, Foxp2+; GFP+ Doppel-markierten Zellen waren anwesend im Striatum von Foxp2fl/fl -Mäusen mit AAV-eGFP Kontrolle Viren (Abbildung 3D) und im Striatum von heterozygoten Foxp2fl / + Mäuse mit AAV-eGFP-Cre Viren (Abbildung 3E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Foxp2 -gen gezielt in AAV-eGFP-Cre ausgestrahlt Zellen des Neugeborenen Striatum gelöscht wird.

Die Ergebnisse der AAV-eGFP-Cre zusammengenommen; Ai14 und AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/fl Mäuse, die Technik der stereotaktischen neonatale Gehirnchirurgie, die wir entwickelt ist zugänglich für bedingt löschen Gene in bestimmten Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.

Figure 1
Abbildung 1: Stereotaktischen Apparat und hausgemachte Kopf fixiert Halter für Neugeborene Mäuse. (A) die stereotaktischen Einspritzanlage besteht aus den folgenden Geräten: i. Spritzenpumpe (Controller); II. Spritzenpumpe (Antriebseinheit); III. Mikroliter Spritze (10 µL); IV. PE20 Schlauch Adapter; v. PE10 Rohr; VI. 30G Injektionsnadel; VII. stereotaktischen Apparate; VIII. eine Pipette Tipps Box konvertiert Plattform für die Neugeborenen Welpen; XI: Eis. (B) die Höhe der Gewebe einbetten Kassette beträgt ca. 7 mm. Die Schaltfläche von 1,5 mL Zentrifugenröhrchen ist etwa 15 mm lang. (C) die Maus-Kopf ist in der hausgemachten Kopf fixiert Halterung gesichert. Der Pfeil zeigt die Wahrzeichen Lambda in den Kopf des Neugeborenen Mäusen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Ausdruck des TdTomato im Striatum von P14 Ai14 Mäusen nach AAV-eGFP-Cre Cre-LoxP DNA Rekombination vermittelt. AAV-eGFP-Cre Viren wurden Sterotaxically in P2 Striatum von Ai14 Mäusen injiziert. Das Gehirn war auf P14 analysiert. (A) viele GFP-positiven Zellen in das Striatum (Str) vorhanden sind. (B) viele TdTomato-positiven Zellen sind auch im Striatum. (C) die zusammengeführten Bilder zeigen eine umfangreiche Co Lokalisierung der GFP und TdTomato im Striatum. Konfokale Bilder der Box Regionen A-C bei hoher Vergrößerung in A angezeigt werden "-C", beziehungsweise. Alle GFP-positiven Zellen (grün) Co express TdTomato (rot) im Striatum. (D, E) Die TdTomato Signale werden in den Zielregionen der striatalen Projektion Neuronen, einschließlich der Globus Pallidus (GP; entdeckt. (D) und der Substantia Nigra pars Reticulata (SNr; (E). (F) schematische Zeichnungen der AAV-eGFP-Cre und Ai14 transgene Konstrukte. CTX: Kortex; Sep: Septum; Hipp: Hippocampus; MB: Mittelhirn. Maßstabsleiste in A (für A-C), 200 µm; A "(für A'-C'), 10 µm; D (für D und E), 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Bedingte Löschung des Foxp2 -Gens im Neugeborenen Striatum von Intrastriatal Injecions von Viren AAV-eGFP-Cre. Intrastriatal Injektionen von AAV-eGFP-Cre Viren wurden durchgeführt in P2 Foxp2fl/fl (A-C ") und Foxp2fl / +(E) Mäuse. Die Köpfe wurden in P9 analysiert. (A-C) GFP-positiven Zellen (A, C, grün) fehlen Foxp2-Immunoreactivity (B, C, rot) im Striatum von Foxp2fl/fl -Mäusen mit AAV-eGFP-Cre-Viren. Die geschachtelten Regionen in A-C sind bei hoher Vergrößerung in A gezeigt "-C", beziehungsweise. (D) Striatale Zellen Co Express GFP und Foxp2 befinden sich im Striatum, das mit AAV-eGFP Kontrolle Viren injiziert wurde. (E) GFP-positiven Zellen express Co Foxp2 (Pfeilspitzen) befinden sich im Striatum von Foxp2fl / + Mäuse mit AAV-eGFP-Cre-Viren. (F) schematische Zeichnungen der AAV-eGFP-Cre Virus und transgenen Mäusen Foxp2fl/fl . Maßstabsleiste in A (für A-C), 200 µm; A "(für A'-C', D und E), 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In der vorliegenden Studie zeigen wir Ihnen eine einfache und zuverlässige stereotaktischen Methode zum Einspritzen von AAV Viren in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Wir mikroinjiziert AAV-eGFP-Cre Viren in das Striatum Ai14 Reporter Mäuse bei P2 und dann analysiert die Reporter-gen-Expression bei P14. Wir fanden, dass AAV GFP-positiven Zellen in das Striatum auf Rostrocaudal Ebenen ausgestrahlt. Darüber hinaus Co ausgedrückt fast alle GFP-positiven Zellen TdTomato-Reporter-gen in Striatale Zellen, was auf eine erfolgreiche Cre-LoxP-DNA-Rekombination induziert durch AAV-vermittelten Expression von Kre Aktivität. Wir weiter bestätigt die Wirksamkeit dieses Ansatzes durch Mikroinjektionen von AAV-eGFP-Cre in das Striatum Foxp2fl/fl -Mäuse bei P2. Doppelte Kennzeichnung zeigte, dass viele Flugabwehrpanzer ausgestrahlt GFP-positiven Zellen Foxp2-Immunoreactivity in P9 Striatum, schlägt eine erfolgreich bedingte Löschung des Foxp2 -Gens bei Neugeborenen Striatum fehlte. Die Bände der Flugabwehrpanzer mikroinjiziert werden mit der Größe der infizierten Hirnregionen korreliert. Mit 200 nL des injizierten Volumens, GFP-positiven Zellen wurden ausgiebig in der neonatalen Striatum gefunden, und einige verstreuten GFP-positiven Zellen waren auch in der Rinde angrenzend an das Striatum. Mit 50 nL des injizierten Volumens, GFP-positiven Zellen wurden lokal beschränkt sich auf die neonatale Striatum. Daher ist es wichtig für optimale Transduktion von neuronalen Populationen in bestimmten Gehirnregionen, die Volumen der injizierten Flugabwehrpanzer titrieren. Darüber hinaus richtet sich die Transduktion Rate auch nach der Titer von viralen Vorbereitung. Es ist denkbar, dass präzise gezielt bestimmte Zelltypen erreicht werden können, durch den Einsatz transgener Mäuse mit verschiedenen Promotoren.

Es gibt mehrere chirurgische Tipps für erfolgreiche Injektion Flugabwehrpanzer, den interessierten Gehirnregionen. Erstens ist es wegen der geringen Größe der Maus Welpen und die Schwierigkeiten bei der Sicherung der Position der Maus Kopf mit Händen während der Operation schwierig stereotaktischen Gehirnoperation bei Neugeborenen Mäusen10durchzuführen. Obwohl eine frühere Studie, neonatale stereotaktischen Operation gezeigt hat, aber es zwei Menschen erfordert, die Mikroinjektion während der Chirurgie11durchzuführen. Wir haben diese Probleme überwinden, indem man eine maßgeschneiderte Kopf fixiert-Gerät, das fest der Pup-Kopf während Gehirnchirurgie sichern kann. Die gesamte Verfahren können von einer einzigen Person durchgeführt werden. Die Gehirn-Größen von Neugeborenen Mäusen sind durch verschiedene genetische Hintergründe, mütterliche Fürsorge und das Alter der Welpen vielfältig. Ein Vorteil unserer hausgemachten Vorrichtung ist, dass es eine sanfte aber sichere Fixierung des Neugeborenen Maus Kopf, die für die Durchführung von hoher Präzision stereotaktischen Gehirnchirurgie notwendig ist. Zweitens ist durch die Elastizität der Haut und der dünnen Wand des Schädels, Hautschnitt, gefolgt von Schädel Bohren in den Kopf schwer in Neugeborenen Welpen durchzuführen. Um dieses Problem zu überwinden, ist es notwendig, eine Punktion der Haut und der Schädel mit einer Nadelspitze vor Senkung der Injektionsnadel, die gezielte Hirnregion zu machen. Drittens ist es wichtig, den Fluss der sichtbaren Farbstoff in das PE-Rohr um sicherzustellen, dass die Mikroinjektion in der Progression beim Einspritzen ist zu überprüfen. Bewegt sich der Farbstoff nicht in das PE-Rohr, Bemühungen getroffen werden, um Probleme beim Schießen der Probleme, einschließlich einem möglichen Austritt von Flüssigkeit in den Schlauch und verstopfte Nadeln. Beachten Sie, dass diese Methode für die Neugeborenen Welpen gilt, deren Lambda sind sichtbar durch die Haut vor P5. Für Welpen älter als P5 eventuell er einen Schnitt in der Haut, des Lambda-Ausdrucks verfügbar zu machen. Beachten Sie, dass die Beleuchtung auf P4 und P5 Maus Köpfe Wahrzeichen Lambda auffinden kann. Obwohl wir nicht diese Technik der stereotaktischen Chirurgie bei neugeborenen Ratten durchgeführt haben, gehen wir davon aus, dass die Technik für Ratte Welpen mit einigen Änderungen gilt.

Das auftreten und den maximalen Ausdruck von Viren tragen Genexpression dauern mehrere Tage oder Wochen nach Injektionen in die Gehirne14,15. In der vorliegenden Studie fanden wir, dass AAV-eGFP-Cre Viren-vermittelten Cre-LoxP DNA Rekombination in den Neugeborenen striatalen Neuronen bereits 8 Tage nach virale Transduktion stattgefunden. Die vorherige Studie berichtet, dass AAV-vermittelten Cre-abhängige Reporter Aktivität in den Riechkolben des Neugeborenen Maus Welpen so früh wie 3 Tage nach der Injektion der Masse der Flugabwehrpanzer15nachgewiesen werden kann. Es ist denkbar, dass der frühe Beginn der AAV-vermittelten Genaktivitäten ein Vorteil ist für das Studium Entwicklungsstörungen Ereignisse, die kontinuierlich in den postnatalen Gehirnen auftreten.

Zusammenfassend lässt sich sagen die neonatale stereotaktischen Technik, die wir entwickelt, ist nicht nur für bedingt löschen Gene in bestimmten Gehirnregionen, aber es ist auch offen für pharmakologische Reagenzien und neuronaler Tracer in bestimmten Gehirnregionen bei Neugeborenen Mäusen zu injizieren. Obwohl wir in der vorliegenden Studie, in der Regel nur Mikroinjektionen in die neonatale Striatum gemacht kann unsere stereotaktischen neonatale Gehirnchirurgie in bestimmten Gehirnregionen Ziel angewendet werden, wenn die Koordinaten der einzelnen Regionen im neonatalen Gehirn zur Verfügung stehen. Angesichts die Variabilität in der Größe des Neugeborenen mäusegehirnen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen in verschiedenen Stadien, unbedingt die empirisch bestimmen die genauen Koordinaten des Ziel-Websites von den Ermittlern. Schließlich kann von stereotaktischen Mikroinjektionen der Flugabwehrpanzer gentechnisch veränderten optogenetische3 und Chemogenetic Proteine4 und neuronaler Aktivität Indikatoren5 in bestimmten Gehirnregionen auszudrücken, man die Rolle der neuronalen erkunden Aktivität auf die postnatale Entwicklung des Gehirns bei der Auflösung der Zelle typspezifischen und Schaltung Ebenen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie gewährt MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, den National Health Research Institutes gewähren NMRI-EX106-10429NI und die vorgestellten Bereiche Research Center Program Stipendium Das Bildungsministerium durch Brain Research Center, National Yang-Ming University in Taiwan, und MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C), MOST105-2811-B-010-036 und MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K) Postdoctoral Fellowship-Stipendien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G PrecisionGlide Needle Becton Dickinson REF 305106
Chloroform JT Baker 9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe Hamilton  80300 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20 Becton Dickinson 427406
Polyethylene tubing PE10 Becton Dickinson 427401
Micro Flow Rate Syringe Pump Longer Precision Pump Co. TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe Becton Dickinson REF 302105
Fast green Sigma-Aldrich F-7252 0.1%
Standard Stereotaxic Instruments RWD Life Science 68037 Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody Abcam ab16046 Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody Abcam ab65856 Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope Olympus BX63
LSM 880 confocal microscope Zeiss LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. 111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Penn Vector Core AV-9-PV1848 Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan N/A 1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Labtorary  007914 Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ The Jackson Labtorary  026259 Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline Corning cellgro 21-030-CVR

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References

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Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).More

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).

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