Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

doi: 10.3791/57270 Published: July 10, 2018

Summary

אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

Abstract

גנים רבים באים לידי ביטוי מוח עובריים, חלק מהם מתבטאים באופן רציף במוח לאחר הלידה. עבור גנים ביטוי בהתמדה כאלה, הם עשויים לפעול כדי לווסת את תהליך התפתחותי ו/או תפקיד פיזיולוגי במוח neonatal. לחקור פונקציות הנוירוביולוגי של גנים ספציפיים במוח, זה חיוני כדי להשבית את הגנים במוח. כאן, אנו מתארים שיטה stereotaxic פשוטה כדי להשבית ביטוי גנים ב סטריאטום של העכברים הטרנסגניים ב windows בפעם neonatal. וירוסים AAV-eGFP-Cre היו microinjected לתוך סטריאטום Ai14 כתב ג'ין עכברים ביום כמחנכת (P) 2 באמצעות ניתוח מוח stereotaxic. בביטוי הגן כתב tdTomato זוהה סטריאטום P14, רומז ש-cre-loxP מוצלח מתווכת רקומבינציה DNA בתאים AAV transduced striatal. אנחנו עוד יותר תוקף טכניקה זו על-ידי microinjecting וירוסים AAV-eGFP-Cre לתוך P2Foxp2חליל/חליל עכברים. תיוג הכפול של ה-GFP, Foxp2 הראה כי תאים GFP-חיוביות חסרה Foxp2 immunoreactivity ב סטריאטום P9, רומז על אובדן Foxp2 החלבון בתאים striatal AAV-eGFP-Cre transduced. יחדיו, תוצאות אלו מדגימות של מחיקה גנטי אפקטיבי על ידי וירוסים stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre באוכלוסיות עצביים מסוימים במוחם neonatal של העכברים הטרנסגניים floxed. לסיכום, הטכניקה stereotaxic שלנו מספק פלטפורמה פשוטה וקלה עבור הנדסה גנטית במוח העכבר neonatal. הטכניקה לא ניתן להשתמש רק כדי למחוק גנים באזורים ספציפיים של המוח neonatal, אבל זה גם יכול לשמש כדי להזריק סמים תרופתי, המשדרים עצביים, optogenetics מהונדסים, chemogenetics חלבונים, אינדיקטורים פעילות. עצבית ו ריאגנטים אחרים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקרים מודרניים של המבנה והתפקוד של המוח בדרך כלל דורשים מניפולציה גנטית של גנים ספציפיים בתוך תאים עצביים. כדי לחקור את הפונקציות של גנים שונים, העכברים הטרנסגניים נושאת אללים mutant, כולל נוק אאוט, טוק-in אללים באופן שגרתי נוצרו. ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים היא שיטה סטנדרטית מקומית לספק סמים, וירוסים, המשדרים, אחרים אזורים ספציפיים של המוח מכרסמים1,2. החלת ניתוח מוח stereotaxic את העכברים הטרנסגניים מתיר אחד גנטית לתפעל את תפקוד הגן ואת פעילות. עצבית באוכלוסיות ספציפיות עצביים במוח העכבר. המניפולציה ייחודיים לסוג התא מספקת גישה רב-עוצמה לפענח עצביים פונקציות מורכבות את המעגלים העצביים של המוח3,4,5.

התפתחות עצבית של מערכת העצבים מתחילה אצל בשלבים עובריים מוקדמים ולהמשיך התהליכים התפתחותית לאחר הלידה עד תקופת ילדותי. כמחנכת ההבשלה של מערכת העצבים כולל את החיווט סינפטית מדויק של המעגלים העצביים, שהוא חיוני עבור פונקציות פיזיולוגיים, קוגניטיביים של המוח6. לכן, לימוד התפתחותית אירועים שמתרחשים בחלונות זמן neonatal חשוב לא רק להבנת התפתחות עצבית רגילה, אך זה עשויים גם כן לספק תובנות בפתוגנזה של התפתחותיות והפרעות מנוטלי7 ,8. למרות שיטות ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים הם זמינים2,9, כמה פרוטוקולים זמינים באינטרנט עבור ניתוח מוח stereotaxic עכברים neonatal10,11. למעשה, microinjections stereotaxic של ריאגנטים לתוך מוחותיהם של העכבר neonatal הגורים קשים, כי ראשו של הגור neonatal חלש מכדי להיות קבוע במנגנון stereotaxic רגיל. עם זאת, היישום של ניתוח מוח stereotaxic העכברים הטרנסגניים הוא ריאלי עבור עכברים neonatal12. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עם מלכודת תוצרת בית כדי לבצע ניתוח מוח stereotaxic ב העכבר היילוד הגורים. נדגים כי טכניקה זו מאפשרת למחיקת מותנית גנים floxed על ידי microinjecting recombinase לבטא AAV Cre DNA לתוך סטריאטום של הכתב ג'ין עכברים, מותנה העכברים הטרנסגניים floxed. טכניקה זו ישימה גם כדי לספק ריאגנטים לתוך סטריאטום neonatal של פראי-סוג עכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקולים בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של נבחרת יאנג מינג אוניברסיטת.

1. הכנה של בעל הגורים Neonatal במנגנון Stereotaxic

  1. להפוך את המגש בראש: לחתוך התחתון של שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL (15 מ מ אורך) לתוך הצורה שמתאימה לראש של הגורים neonatal על-ידי הסרת 1/5 של הקיר של הצינור.
  2. קח קופסא עצה פיפטה עם הגודל הנכון שמתאים בעזרת המעמד של המנגנון stereotaxic, להסיר את המכסה העליון. מוספית את מגש ראש המבושלות שלב 1.1 וקלטת ההטבעה רקמות על גבי הבסיס של עצה מגש עם דבק חם נמס. הגובה בקלטת ההטבעה הרקמה הוא 7 מ מ, אשר נמצא בשימוש כדי לתמוך הצוואר וגוף של הכלבלב בתפקיד ראש-קבוע.
  3. מקם את כל ההתארגנות מנגנון stereotaxic רגיל.

2. הכנת 30G מחטים הזרקת פלדת אל-חלד

  1. מחטים נקיות מראש של מזרק 30 G בהשריה ב כלורופורם 3 ימים.
  2. להשתמש מלקחיים לסגת לאט ובזהירות את המחט מ שלה רכזת פוליפרופילן ברדס כימי.
  3. לשטוף את המחטים עם אתנול מוחלטת במשך 20 דקות ולאחריו שטיפות אתנול 70% 3 × 10 דקות על מטרף ב-50 סל ד. תנו לאוויר מחטים יבש, ולאחסן את המחטים נקי בתוך קופסה נקיים בטמפרטורת החדר (RT) עד השימוש.

3. מכינים את מתאם עבור צינורות Microinjection

  1. לחבר את המזרק microliter מחט ההזרקה 30G עם צינור פוליאתילן PE10 (PE10 tube). היכונו גישור המחט הזרקת ואת המזרק microliter מתאם אבובים (PE20 tube) PE20 פוליאתילן. השימוש המתאם הכרחי, מכיוון הקוטר של הצינור PE10 הוא קטן בהרבה מזה של המחט של המזרק microliter 26 גרם.
  2. להכין את הצנרור על המזרק microliter: לחבר את המחט הזרקת 30 G מראש נקי עם 5 ס מ PE20 צינור, ויסגור לצומת עם ודבק. מתאם אבובים הזה הוא לשימוש חוזר.
    הערה: אם המחט של מזרק microinjection 30 גרם, הכנה (שלב 3.1) והשימוש (שלב 3.3) מתאם זה אין צורך.
  3. םאתמה תא אבובים (להכין בשלב 3.1) בעזרת מזרק microliter (10 µL).
  4. חבר קצה אחד של הרכבת התחתית PE10 (לא יותר מ- 60 ס מ) על המחט 30 גרם של מתאם אבובים PE20. הר מחט ההזרקה 30G החדש אל הקצה השני של הצינור PE10.

4. לטעון את הצינור Microinjection עם מים מזוקקים בלוק, צבען ווירוסים

  1. הסר את הבוכנה של המזרק microliter. השתמש מזרק 25 גרם כדי לטעון את המזרק microliter ושפופרת שלה מחובר PE עם מים מזוקקים בלוק להסיר את האוויר הצנרת.
  2. מקם את הבוכנה בחזרה אל המזרק microliter ולאחר ללחוץ על הבוכנה עד µL 2 שרידי מים מזוקקים בקנה. אל תתנו הנפח של מים מזוקקים הפך נמוך יותר 2 µL.
  3. הר בקפידה את המזרק microliter אל משאבת מזרק קצב זרימת מיקרו.
  4. פיפטה כמויות קטנות של צבען 0.1% ירוק (מוכן ב- saline 0.9% וסינון במסנן מיקרומטר 0.22) ונוזלים וירוס בחתיכת עץ על מצלמות-מיקרוסקופים.
  5. תיסוג כמות קטנה של אוויר לחשיפה בועת אוויר בצומת בין מחט הזריקה 30 גרם שפופרת PE10 ואחריה טעינה 0.7 µL של ירוק מהיר המסונן לאמבטיה כדי לבדוק את זרימת הנוזלים על הצנרת microinjection.
  6. לסגת עוד כמות קטנה של אוויר כדי להפוך את בועת האוויר השני ואחריו העמסת נוזלים וירוס לתוך הצנרת microinjection.
  7. לצרף ולאבטח את המחט microinjection 30G את הזרוע של המנגנון stereotaxic.

5. הרדמה של עכברים Neonatal מאת היפותרמיה

  1. למקם את הכלבלב בשרוול כפפת לייטקס, לטבול אותו בקרח כתוש עד הצוואר למשך 5 דקות.
  2. לצבוט הרגליים של הכלבלב עם מלקחיים כדי לוודא כי אין תגובה משיכה של הרגליים.
  3. למקם את הגור עם כפפת לייטקס שרוול במגש הראשי, לשים קרח כתוש סביב שרוול גומי כדי לשמור אותה בקירור של היפותרמיה הרדמה.
  4. הוטרינר משחה למרוח את העיניים של גור למניעת יובש תוך בהרדמה במידת האפשר.

6. microinjection

  1. הכן ניתוח סטרילי על ידי ניגוב המכשיר stereotaxic ביסודיות עם 70% אתנול. לחטא את כלי כירורגי במועט אותם 70% אתנול.
  2. לנקות את הראש של הכלבלב עם 70% אתנול. לאתר של למדא ציון על הגולגולת ולסמן את למבדה עם עט מרקר. לכוון את מחט למדא, והגדר את הקדמי-אחוריים (AP) והקואורדינטות המדיאלי-לרוחב (ML) כאפס.
  3. להזיז את היד הזרקת לאתר היעד על פי הקואורדינטות X ו- Y של אתר היעד. עבור סטריאטום יום לאחר הלידה (P) 2 גורים, הקואורדינטות הן: AP, +2.4 מ מ, והשתרשה עמוק בלבה למדא; מל ', ±1.0 מ מ לרוחב מן האמצע; הגבי-הגחוני / (DV), −1.7 מ מ הגולגולת. לסמן את המיקום של צבע ירוק PE10 צינור עם עט.
  4. להפיל את המחט הזרקת 30G לאט לחדור דרך העור הגולגולת ולאחר מכן להעלות קצה המחט עד לעצירתו על פני השטח של הגולגולת. הגדר הקואורדינטה DV כאפס.
  5. להפיל את המחט הזרקת 30G באיטיות עד שהוא מגיע הקואורדינטה DV אתר היעד. המתן 1 דקות לאפשר parenchyma חידוש צורתו נורמלי. הפעל את התוכנית microinjection (nL 100 לדקה).
  6. ודא כי הסימן של צבע ירוק הוא נע צינור PE כדי להבטיח שהנוזל הוירוס מוזרק לתוך המוח.
  7. המתן 1 דקות םכסהה microinjection, ולאחר מכן לאט, בהדרגה להעלות את המחט לגובה 1/2 של DV עומק בתוך 30 s. לאחר 30 s, לאט לאט למשוך את המחט מהראש של הגורים.
  8. חזור על שלב 6.2 ל 6.7 עד השלמת את microinjections של כל אתרי יישוב.

7. ההחלמה שלאחר הניתוח של הכלבלב

  1. לחמם הגורים למשך 20 דקות בחממה 33 מעלות. בדוק את ההתאוששות של הכלבלב מהרדמה היפותרמיה כל 5 דקות עד הכלבלב שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
  2. להחזיר את הכלבלב בחזרה אל הסכר אחרי הכלבלב הוא התאושש לחלוטין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

על הסט הראשון של הניסוי, אנחנו microinjected 200 nL של וירוסים AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (AAV-eGFP-Cre, 1/10 דילול בתוך תמיסת מלח של Dulbecco פוספט buffered) המבטאים את recombinase Cre DNA התמזגו עם GFP לתוך סטריאטום P2 של עכברים Ai14. העכברים Ai14 אקספרס tdTomato מדווח על בתיווך Cre מחיקה של מלון loxP (floxed) עצור קלטת (איור 2F). המוח נבצרו ב P14 עבור immunostaining של ה-GFP, tdTomato. AAV רבים transduced תאים GFP-חיוביות היו המתנה לאורך סטריאטום (איור 2 א, ג), המציין זיהום נרחב של תאים striatal על ידי וירוסים AAV-eGFP-Cre. ביטוי נרחב דומה של tdTomato נמצאה גם סטריאטום (איור 2B, ג). על בדיקה מיקרוסקופית בהגדלה, מצאנו כי כמעט כל התאים striatal GFP-חיובית משותפת הביע הגן כתב tdTomato (איור 2 א'-סי '). יתר על כן, tdTomato אותות אותרו מסופי האקסון ככל הנראה את globus pallidus (איור דו-ממדי) והאזורים של הסובסטנציה ניגרה pars reticulata (2E איור), את היעד של נוירונים הקרנה של striatonigral ו- striatopallidal- 13. תוצאות אלה מציעים מוצלחת Cre-loxP מתווכת רקומבינציה DNA הנגרם על ידי ביטוי בתיווך AAV Cre פעילות בנוירונים neonatal striatal.

על הסט השני של הניסוי, אנחנו microinjected 50 nL AAV-eGFP-Cre וירוסים לתוך סטריאטום של עכברים Foxp2חליל/חליל נושאים loxP מלון אללים Foxp2 -P2 (איור 3 א- ג, נ), וקצרו את המוח-P9. אין Foxp2+; GFP+ התווית על-ידי שני תאים נמצאו סטריאטום, כלומר., חלבון Foxp2 נעדר בתאים GFP-חיוביות (איור 3 א'-C'). בניסויים שליטה, Foxp2+; GFP+ התווית על-ידי שני תאים נכחו את סטריאטום של עכברים Foxp2חליל/חליל עם AAV-eGFP לשלוט וירוסים (דמות תלת-ממד), את סטריאטום של משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים Foxp2חליל / + עכברים עם AAV-eGFP-Cre וירוסים (איור 3E). תוצאות אלו מצביעות על ג'ין Foxp2 נמחקת באופן ספציפי בתאים AAV-eGFP-Cre transduced של סטריאטום neonatal.

יחדיו את התוצאות של AAV-eGFP-Cre; Ai14 , AAV-eGFP-Cre; Foxp2חליל/חליל עכברים, בטכניקה של ניתוח מוח neonatal stereotaxic שפיתחנו הוא לשכנוע מותנית מחק גנים באזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

Figure 1
איור 1. מכשיר stereotaxic, מחזיק את הראש-קבוע תוצרת בית עכברים neonatal. (א) מערכת הזרקת stereotaxic מורכב של ההתקנים הבאים: משאבת מזרק ט (בקר); ii. מזרק משאבה (יחידת הכונן); iii. microliter מזרק (10 µL); iv. PE20 אבובים מתאם; (פ') PE10 צינור; vi. 30G מחט הזריקה; מכשיר stereotaxic ז.; viii. תיבה טיפים פיפטה המרה פלטפורמה עבור הגורים neonatal; xi: קרח כתוש. (B) גובה הקלטת ההטבעה של הרקמה הוא בערך 7 מ מ. הלחצן 1.5 mL צנטריפוגה צינור הוא בערך 15 מ"מ. (ג) ראש עכבר מאובטח בבעל ראש-קבוע תוצרת בית. החץ מצביע על למדא ציון בראש של עכברים neonatal. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. הביטוי של tdTomato ב סטריאטום של עכברים P14 Ai14 לאחר AAV-eGFP-Cre מתווכת רקומבינציה Cre-loxP DNA- וירוסים AAV-eGFP-Cre היו sterotaxically מוזרק סטריאטום P2 של עכברים Ai14. המוח ניתחנו את P14. (א) תאים GFP-חיוביים רבים שנמצאים לאורך סטריאטום (Str). (B) תאים tdTomato-חיוביים רבים נמצאים גם סטריאטום. (ג) התמונות הממוזגות מראים על לוקליזציה שיתוף נרחב של ה-GFP, tdTomato סטריאטום. תמונות קונאפוקלית של האזורים מסגרת ב A-C מוצגים בהגדלה א' '-ג ', בהתאמה. כל התאים GFP-חיוביות (ירוק) מבטאים משותפת tdTomato (אדום) סטריאטום. (יח, E) אותות tdTomato מזוהים באזורי יעד striatal הקרנה הנוירונים, כולל את globus pallidus (GP; D) ו- reticulata pars על הסובסטנציה ניגרה (SNr; ה)- (נ) ציורים סכמטי של בונה הטרנסגניים AAV-eGFP-Cre ו- Ai14. אקס: קליפת; ספטמבר: מחצה; Hipp: ההיפוקמפוס; מגה: המוח האמצעי. סרגל קנה מידה A (for A-C), מיקרומטר 200; A' (עבור A'-ג' '), 10 מיקרומטר; D (עבור D ו- E), 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. מחיקת מותנה Foxp2 ג'ין ב סטריאטום neonatal מאת intrastriatal injecions של וירוסים AAV-eGFP-Cre. Intrastriatal זריקות של וירוסים AAV-eGFP-Cre בוצעו P2 Foxp2חליל/חליל (A-C "), Foxp2חליל / +(E) עכברים. המוח נותחו-P9. (א-ג) GFP-חיוביות תאים (A, C, ירוק) חוסר immunoreactivity Foxp2 (B, C, אדום) ב- סטריאטום של עכברים Foxp2חליל/חליל עם וירוסים AAV-eGFP-Cre. האזורים מסגרת ב A-C מוצגים בהגדלה א' '-ג ', בהתאמה. (ד) תאים Striatal GFP שיתוף אקספרס ו- Foxp2 נמצאים סטריאטום זה הוזרק עם AAV-eGFP לשלוט וירוסים. (E) GFP-חיוביות תאים שותף אקספרס Foxp2 (חץ) הנמצאים סטריאטום של Foxp2חליל / + עכברים עם וירוסים AAV-eGFP-Cre. (נ) ציורים סכמטי של וירוס AAV-eGFP-Cre העכברים הטרנסגניים Foxp2חליל/חליל . סרגל קנה מידה A (for A-C), מיקרומטר 200; A' (עבור A'-ג ', D ו- E), 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במחקר הנוכחי, נדגים שיטה פשוטה ואמינה stereotaxic עבור הזרקת AAV וירוסים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. אנחנו microinjected AAV-eGFP-Cre וירוסים לתוך סטריאטום של עכברים כתב Ai14-P2 ולאחר מכן נותחו בביטוי הגן כתב ב P14. מצאנו ש-AAV transduced תאים GFP-חיובית לאורך כל סטריאטום ברמות rostrocaudal. יתר על כן, כמעט כל התאים GFP-חיובית משותפת הביע הגן כתב tdTomato בתאים striatal, רומז על רקומבינציה Cre-loxP DNA מוצלחת המושרה על ידי ביטוי בתיווך AAV Cre פעילות. אנחנו עוד יותר לאשר את היעילות של גישה זו microinjections של AAV-eGFP-Cre לתוך העכברים Foxp2חליל/חליל סטריאטום-P2. תיוג זוגי הראה כי תאים AAVs transduced GFP-חיוביות רבות חסרה Foxp2 immunoreactivity ב סטריאטום P9, רומז מחיקה מותנה בהצלחה לייעו Foxp2 ב סטריאטום neonatal. הכרכים של microinjected AAVs נמצאים בקורלציה עם הגודל של האזורים הנגועים המוח. עם 200 nL של אמצעי האחסון מוזרק, תאים GFP-חיוביות נמצאו בהרחבה בכל רחבי סטריאטום neonatal ולאחר כמה תאים GFP-חיוביות פזורים נכחו גם בקליפת הסמוכים סטריאטום. עם 50 nL של אמצעי האחסון מוזרק, התאים GFP-חיובית היה מוגבל באופן מקומי סטריאטום neonatal. לכן, titrating את נפחי AAVs מוזרק חשוב עבור התמרה חושית אופטימלית של אוכלוסיות העצבית באזורים מסוימים במוח. יתר על כן, הקצב התמרה חושית נקבע גם לפי כייל הכנה ויראלי. . זה מתקבל על הדעת כי סוגי תאים מסוים מיקוד מדויק יכולה להיות מושגת באמצעות העכברים הטרנסגניים עם היזמים שונים.

ישנם מספר טיפים מוצלחים שהזרקת AAVs לאזורי המוח מעוניין כירורגי. ראשית, בגלל גודלו הקטן של הגורים העכבר ואת הקושי באבטחת מיקום הראש העכבר עם הידיים במהלך הניתוח, קשה לבצע ניתוח מוח stereotaxic עכברים neonatal10. למרות מחקר קודם הראה neonatal ניתוח stereotaxic, אבל זה דורש שני אנשים לבצע את microinjection במהלך הניתוח11. לנו יש להתגבר על בעיות אלה על ידי פיתוח התקן הראש-קבוע בהזמנה אישית ניתן לאבטח בחוזקה בראשה גור במהלך ניתוח מוח. ניתן לבצע את כל ההליכים על ידי אדם אחד. גודל המוח של עכברים neonatal הן מגוונות כתוצאה מרקע גנטי, טיפול אימהי, הגילאים של הגורים. יתרון של המכשיר תוצרת בית שלנו הוא שהיא מאפשרת אובססיה עדין אך מאובטחת של העכבר neonatal ראש, שהיא הכרחית לביצוע ניתוח מוח stereotaxic ברמת דיוק גבוהה. שנית, בשל את האלסטיות של העור רך לבין קיר דק של הגולגולת, ואחריו הגולגולת קידוח בראש מבצעים חתך קשה לבצע בהגורים neonatal. כדי להתגבר על בעיה זו, יש צורך לעשות נקב של העור הגולגולת עם טיפ המחט לפני הפחתת שהמחט הזרקה לאזור המוח יישוב. שלישית, חשוב לבדוק את הזרימה של צבען גלוי בצינור PE לוודא ש-microinjection הוא בהתקדמות במהלך ההזרקה. אם לצבוע לא זזה בצינור PE, המאמצים לנקוט צרות לירות את הבעיות, כולל של דליפה אפשרית של נוזל הצנרת, סתומות מחטים. שים לב שיטה זו חל על הגורים neonatal למדא אשר מוצגות דרך העור לפני P5. עבור הגורים שגילם P5, זה ייתכן שתצטרך חתך בעור כדי לחשוף את למדא. שימו לב: אור תאורה על גבי P4 ועכבר P5 ראשים עשוי לסייע לאתר את למדא ציון דרך. אמנם לא ערכנו את טכניקת הניתוח stereotaxic בחולדות neonatal, אנו מניחים כי הטכניקה הוא החלים על הגורים עכברוש עם מספר שינויים.

תחילת ואת ביטוי מכסימלי של וירוסים נושאת גנים לקחת כמה ימים או שבועות לאחר זריקות לתוך המוח ה-14,15. במחקר הנוכחי, מצאנו כי AAV-eGFP-Cre בתיווך וירוסים Cre-loxP DNA רקומבינציה בנוירונים neonatal striatal התרחשה מוקדם ככל 8 ימים לאחר התמרה חושית ויראלי. המחקר הקודם דיווחה כי תלויי-Cre בתיווך AAV כתב פעילות ניתן להבחין בתוך פקעת הריח של הגורים העכבר יילוד מוקדם ככל 3 ימים לאחר הזרקת כמות גדולה של AAVs15. . זה מתקבל על הדעת כי תחילת בתיווך AAV פעילות גנטי מוקדם הוא יתרון ללמוד התפתחותית אירועים המתרחשים ללא הרף השכל כמחנכת.

לסיכום, הטכניקה stereotaxic neonatal שפיתחנו היא לא רק עבור מותנית מחק גנים באזורים מסוימים במוח, אך הוא גם נוטה? להזריק ריאגנטים תרופתי, המשדרים עצביים לאזורים מסוימים במוח בעכברים neonatal. למרות שעשינו רק microinjections לתוך סטריאטום neonatal במחקר הנוכחי, באופן עקרוני, ניתן להחיל ניתוח מוח neonatal stereotaxic שלנו לאזורים מסוימים במוח היעד אם הקואורדינטות של אזורים ספציפיים במוח neonatal זמינים. לאור ההשתנות בגודל של מוח העכבר neonatal עם רקע גנטי שונים בשלבים שונים, זה חיוני לקביעת מדעית את הקואורדינטות מדויקת של האתרים ממוקד על ידי החוקרים. בסופו של דבר, מאת microinjections stereotaxic של AAVs לבטא optogenetic מהונדסים3 ו- chemogenetic חלבונים4 ופעילות. עצבית אינדיקטורים5 אזורים ספציפיים במוח, אחד עשוי לחקור את התפקיד של עצביים פעילות על התפתחות המוח ברזולוציה של תאים ספציפיים סוג או מעגל רמות כמחנכת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע ולהעניק טכנולוגיה מעניקה MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, מכוני מחקר הבריאות הלאומי NHRI-EX106-10429NI, התוכנית מרכז מחקר אזורים נבחרים מענק משרד החינוך באמצעות מרכז מחקר המוח, האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג בטייוואן, ומענקים בתר MOST106-2811-B-010-031 (ס-ווי. סי), MOST105-2811-B-010-036, MOST106-2811-B-010-030 (ה-Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G PrecisionGlide Needle Becton Dickinson REF 305106
Chloroform JT Baker 9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe Hamilton  80300 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20 Becton Dickinson 427406
Polyethylene tubing PE10 Becton Dickinson 427401
Micro Flow Rate Syringe Pump Longer Precision Pump Co. TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe Becton Dickinson REF 302105
Fast green Sigma-Aldrich F-7252 0.1%
Standard Stereotaxic Instruments RWD Life Science 68037 Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody Abcam ab16046 Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody Abcam ab65856 Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope Olympus BX63
LSM 880 confocal microscope Zeiss LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. 111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Penn Vector Core AV-9-PV1848 Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan N/A 1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Labtorary  007914 Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ The Jackson Labtorary  026259 Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline Corning cellgro 21-030-CVR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
  2. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89, (4), 683-694 (2016).
  5. Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13, (10), 687-700 (2012).
  6. Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35, (1), 147-168 (2010).
  7. Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21, (1), 197-203 (2011).
  8. Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350, (6263), (2015).
  9. Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
  10. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31, (6), 685-696 (2015).
  11. Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
  12. Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19, (11), 1513-1522 (2016).
  13. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, (18), 6171-6177 (2010).
  15. Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).More

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter