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Neuroscience

नवजात माउस दिमाग के Striatal कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर के लिए Stereotaxic सर्जरी

doi: 10.3791/57270 Published: July 10, 2018

Summary

हम एक घर का बना सिर के साथ stereotaxic सर्जरी के एक प्रोटोकॉल का वर्णन-नवजात माउस दिमाग के striatum में microinjecting रिएजेंट के लिए फिक्स्ड डिवाइस । इस तकनीक नवजात माउस दिमाग के विशिष्ट क्षेत्रों के ंयूरॉन कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति देता है ।

Abstract

कई जीन भ्रूण दिमाग में व्यक्त कर रहे हैं, और उनमें से कुछ लगातार जंम के बाद मस्तिष्क में व्यक्त कर रहे हैं । इस तरह के लगातार जीन व्यक्त के लिए, वे विकास प्रक्रिया और नवजात दिमाग में शारीरिक समारोह को विनियमित करने के लिए कार्य कर सकते हैं । मस्तिष्क में विशिष्ट जीन के neurobiological कार्यों की जाँच करने के लिए, यह मस्तिष्क में जीन को निष्क्रिय करने के लिए आवश्यक है. यहां, हम नवजात समय खिड़कियों पर ट्रांसजेनिक चूहों के striatum में जीन अभिव्यक्ति को निष्क्रिय करने के लिए एक सरल stereotaxic विधि का वर्णन । AAV-eGFP-Cre विषाणु striatum दिवस (पी) 2 Ai14 ब्रेन सर्जरी द्वारा जन्मोत्तर रिपोर्टर जीन चूहों के stereotaxic में microinjected थे । tdTomato रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति P14 striatum में पाया गया था, loxP-AAV transduced कोशिकाओं में एक सफल Cre-striatal मध्यस्थता डीएनए पुनर्संयोजन का सुझाव. हम आगे microinjecting AAV द्वारा इस तकनीक को मांय-eGFP-Cre वायरस P2Foxp2fl/fl चूहों में । GFP और Foxp2 के डबल लेबलिंग से पता चला कि GFP-पॉजिटिव कोशिकाओं में immunoreactivity P9 में Foxp2 striatum का अभाव था, Foxp2-AAV-eGFP Cre transduced कोशिकाओं में striatal प्रोटीन के नुकसान का सुझाव देते हैं । एक साथ ले लिया, इन परिणामों Cre floxed चूहों के नवजात दिमाग में विशिष्ट ंयूरॉंस आबादी में stereotaxically microinjected AAV-eGFP-ट्रांसजेनिक वायरस द्वारा एक प्रभावी आनुवंशिक विलोपन प्रदर्शित करता है । अंत में, हमारे stereotaxic तकनीक नवजात माउस दिमाग में आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक आसान और सरल मंच प्रदान करता है । तकनीक केवल नवजात दिमाग के विशिष्ट क्षेत्रों में जीन को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह भी औषधीय दवाओं, न्यूरॉन अनुरेखक, आनुवंशिक रूप से संशोधित optogenetics और chemogenetics प्रोटीन, न्यूरॉनिक गतिविधि संकेतकों इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता और नवजात चूहे के दिमाग के striatum में अन्य रिएजेंट.

Introduction

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संरचना और मस्तिष्क के समारोह के आधुनिक अध्ययन आम तौर पर ंयूरॉन कोशिकाओं में विशिष्ट जीन के आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है । विभिंन जीन के कार्यों की जांच करने के लिए, ट्रांसजेनिक को नॉकआउट और नॉकआउट सहित उत्परिवर्ती alleles, ले जाने वाले चूहों को नियमित रूप से उत्पंन किया गया है । Stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी वयस्क कुतर के लिए एक मानक विधि स्थानीय रूप से कुतर दिमाग के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए दवाओं, वायरस, अनुरेखकों और अन्य रिएजेंटों उद्धार करने के लिए1,2. ट्रांसजेनिक चूहों को stereotaxic ब्रेन सर्जरी लागू करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से जीन समारोह और माउस मस्तिष्क के विशिष्ट न्यूरॉन आबादी में न्यूरॉन गतिविधि में हेरफेर करने के लिए अनुमति देता है. सेल प्रकार-विशिष्ट हेरफेर मस्तिष्क3,4,5के जटिल तंत्रिका सर्किट में ंयूरॉन कार्यों को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

तंत्रिका तंत्र का विकास जल्दी भ्रूण चरणों में शुरू होता है, और विकास प्रक्रियाओं किशोर अवधि तक जन्म के बाद जारी है । तंत्रिका तंत्र के जन्मोत्तर परिपक्वता तंत्रिका सर्किट की सटीक synaptic तारों, जो6मस्तिष्क के शारीरिक और संज्ञानात्मक कार्यों के लिए आवश्यक है शामिल हैं । इसलिए, नवजात समय खिड़कियों में होने वाले विकास की घटनाओं का अध्ययन न केवल सामान्य तंत्रिका विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी neurodevelopmental और neuropsychiatric विकारों के रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं7 ,8. हालांकि वयस्क कुतर के लिए stereotaxic ब्रेन सर्जरी के तरीके आसानी से उपलब्ध हैं2,9, कुछ प्रोटोकॉल नवजात चूहों में stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी के लिए इंटरनेट पर उपलब्ध हैं10,11. वास्तव में, नवजात माउस पिल्ले के दिमाग में रिएजेंट के stereotaxic microinjections मुश्किल है, क्योंकि नवजात पिल्ला के सिर भी मानक stereotaxic तंत्र में तय किया जा करने के लिए नाजुक है । फिर भी, ट्रांसजेनिक चूहों को stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी के आवेदन नवजात चूहों12के लिए व्यवहार्य है. यहां, हम नवजात माउस पिल्ले में stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए एक घर का सेटअप के साथ एक सरल विधि का वर्णन । हम प्रदर्शित करते है कि इस तकनीक को सशर्त एक microinjecting AAV द्वारा floxed जीन को हटाने के लिए रिपोर्टर जीन चूहों और सशर्त recombinase striatum चूहों के floxed में Cre डीएनए ट्रांसजेनिक व्यक्त की अनुमति देता है । यह तकनीक जंगली प्रकार के चूहों के नवजात striatum में रिएजेंट देने के लिए भी लागू है.

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Protocol

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यहां वर्णित पशु प्रोटोकॉल राष्ट्रीय यांग-मिंग विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किए गए हैं ।

1. Stereotaxic तंत्र में नवजात पिल्ले के लिए धारक की तैयारी

  1. सिर ट्रे बनाओ: एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब के तल में कटौती (15 मिमी लंबे) आकार में है कि ट्यूब की दीवार के 1/5 को हटाने के द्वारा नवजात पिल्ले के सिर फिट बैठता है ।
  2. stereotaxic तंत्र की कुरसी के साथ फिट बैठता है कि सही आकार के साथ एक पिपेट टिप बॉक्स ले लो, और शीर्ष कवर हटा दें । सिर १.१ कदम में तैयार की ट्रे और एक ऊतक गर्म पिघलने चिपकने के साथ टिप ट्रे के आधार पर कैसेट एंबेडिंग । ऊतक embedding कैसेट की ऊंचाई 7 मिमी है, जो सिर में पिल्ला की गर्दन और शरीर को तय स्थिति का समर्थन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  3. एक मानक stereotaxic उपकरण में पूरे सेटअप प्लेस ।

2.30G इंजेक्शन स्टेनलेस स्टील सुई की तैयारी

  1. 3 दिनों के लिए क्लोरोफॉर्म में भिगोने से पूर्व साफ 30G सिरिंज सुई ।
  2. सावधानी से संदंश का प्रयोग करें और धीरे से सुई बाहर खींच एक रासायनिक हुड में अपने के केंद्र से ।
  3. धो 20 ५० rpm पर एक शेखर पर 3 × 10 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल कुल्ला के बाद मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल के साथ सुई । सुई हवा सूखी चलो, और कमरे के तापमान पर एक साफ बॉक्स में साफ सुइयों की दुकान (आरटी) उपयोग तक ।

3. Microinjection टयूबिंग के लिए एक एडाप्टर तैयार

  1. एक PE10 पॉलीथीन ट्यूब (PE10 ट्यूब) के साथ एक 30G इंजेक्शन सुई करने के लिए microliter सिरिंज कनेक्ट. इंजेक्शन सुई और microliter सिरिंज को पाटने के लिए एक PE20 पॉलीथीन टयूबिंग (PE20 ट्यूब) अनुकूलक तैयार करें । एडेप्टर का उपयोग आवश्यक है, क्योंकि PE10 ट्यूब का व्यास 26G microliter सिरिंज की सुई की तुलना में बहुत छोटा है.
  2. microliter सिरिंज के लिए टयूबिंग तैयार: PE20 ट्यूब के 5 सेमी के साथ पूर्व साफ 30G इंजेक्शन सुई कनेक्ट, और तत्काल गोंद के साथ जंक्शन सील. इस टयूबिंग एडेप्टर पुन: प्रयोज्य है ।
    नोट: microinjection सिरिंज की सुई 30G है, तो तैयारी (चरण ३.१) और इस एडेप्टर के उपयोग (चरण ३.३) आवश्यक नहीं है ।
  3. टयूबिंग अनुकूलक कनेक्ट (चरण ३.१ में तैयार) एक microliter सिरिंज (10 µ एल) के साथ.
  4. PE20 टयूबिंग अनुकूलक के 30G सुई पर PE10 ट्यूब के एक छोर (अब से ६० सेमी) कनेक्ट । PE10 ट्यूब के दूसरे छोर पर एक नया 30G इंजेक्शन सुई माउंट ।

4. Autoclaved आसुत जल, डाई और वायरस के साथ Microinjection ट्यूब लोड

  1. microliter सिरिंज के गोताख़ोर को निकाल दें । एक 25G सिरिंज का उपयोग करने के लिए ट्यूबिंग से हवा को दूर करने के लिए autoclaved आसुत जल के साथ microliter सिरिंज और उसके जुड़े पीई ट्यूब लोड.
  2. microliter सिरिंज के लिए वापस गोताख़ोर प्लेस, और आसुत जल के 2 µ एल जब तक गोताख़ोर धक्का बैरल में रहता है । आसुत जल की मात्रा 2 µ से कम हो जाने न दें l
  3. ध्यान से माउंट माइक्रो फ्लो दर सिरिंज पंप पर microliter सिरिंज ।
  4. पिपेट ०.१% फास्ट ग्रीन डाई की छोटी मात्रा (०.९% खारा में तैयार है और ०.२२ µm फिल्टर के साथ फ़िल्टर) और parafilm का एक टुकड़ा करने के लिए वायरस तरल पदार्थ ।
  5. हवा की एक छोटी राशि को वापस लेने के लिए 30G इंजेक्शन सुई और PE10 ट्यूब के बीच जंक्शन पर दिखाई ०.७ µ एल लोड करने के बाद एक हवा बुलबुला ट्यूब में microinjection टयूबिंग में तरल पदार्थ के प्रवाह का परीक्षण करने के लिए तेजी से हरे रंग की ।
  6. हवा की एक और छोटी राशि को वापस लेने के लिए एक दूसरे हवा microinjection टयूबिंग में वायरस तरल पदार्थ लदान के बाद बुलबुला बनाने के लिए ।
  7. संलग्न और stereotaxic तंत्र के हाथ में 30G microinjection सुई सुरक्षित ।

5. नवजात चूहों की हाइपोथर्मिया द्वारा संज्ञाहरण

  1. एक लेटेक्स दस्ताने आस्तीन में पिल्ला प्लेस और कुचल बर्फ में यह 5 मिनट के लिए गर्दन को विसर्जित कर दिया ।
  2. अपने पैरों की कोई वापसी प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए संदंश के साथ पिल्ला के पैर चुटकी ।
  3. सिर ट्रे में लेटेक्स दस्ताने आस्तीन के साथ पिल्ला प्लेस और लेटेक्स आस्तीन के चारों ओर कुछ कुचल बर्फ डाल करने के लिए यह हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण के लिए ठंडा रखने के लिए ।
  4. पिल्ला आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें जबकि संज्ञाहरण के तहत यदि संभव हो तो सूखापन को रोकने के लिए ।

6. Microinjection

  1. ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से stereotaxic साधन पोंछते द्वारा बाँझ सर्जरी तैयार करें । उंहें ७०% इथेनॉल में विसर्जित करके शल्य चिकित्सा उपकरण निष्फल ।
  2. हाथ धोने ७०% इथेनॉल के साथ है पिल्ला सिर । खोपड़ी पर मील का पत्थर लैंब्डा का पता लगाने और एक मार्कर पेन के साथ लैंब्डा निशान । लैंब्डा के लिए सुई टिप उद्देश्य, और पूर्वकाल-पीछे (एपी) सेट और औसत दर्जे का (एमएल) शूंय के रूप में निर्देशांक ।
  3. लक्ष्य साइट के X और Y निर्देशांकों के अनुसार लक्ष्य साइट के लिए इंजेक्शन बांह ले जाएँ. जन्मोत्तर दिवस (पी) 2 पिल्ले के striatum के लिए, निर्देशांक हैं: एपी, + २.४ मिमी लैंब्डा को पूर्वकाल; एमएल, ± १.० मिमी midline से पार्श्व; पृष्ठीय-ventral (DV), − १.७ mm खोपड़ी से । PE10 ट्यूब में फास्ट ग्रीन डाई की स्थिति को पेन से मार्क करें ।
  4. 30G इंजेक्शन सुई धीरे त्वचा और खोपड़ी के माध्यम से घुसना करने के लिए नीचे लाने के लिए, और फिर यह खोपड़ी की सतह पर बंद हो जाता है जब तक सुई टिप लाने के लिए । DV निर्देशांक को शूंय के रूप में सेट करें ।
  5. 30G इंजेक्शन सुई धीरे नीचे लाने जब तक यह लक्ष्य साइट के डीवी समंवय तक पहुंचता है । 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए पैरेन्काइमा अपनी सामांय आकार शुरू करने की अनुमति । चलाएं microinjection प्रोग्राम (१०० nL/मिनट) ।
  6. सुनिश्चित करें कि फास्ट ग्रीन डाई के निशान पीई ट्यूब में बढ़ रहा है सुनिश्चित करने के लिए वायरस तरल मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाता है ।
  7. microinjection की समाप्ति के बाद 1 मिनट के लिए रुको, और फिर धीरे और उत्तरोत्तर डीवी गहराई के 1/2 ऊंचाई के लिए सुई लाने के 30 एस के भीतर । 30 एस के बाद, धीरे से पिल्ला के सिर से सुई वापस ले लो ।
  8. सभी लक्षित साइटों की microinjections पूरा कर रहे है जब तक ६.२ चरण ६.७ करने के लिए दोहराएँ ।

7. बाद पिल्ला के सर्जिकल वसूली

  1. एक ३३ डिग्री सेल्सियस मशीन में 20 मिनट के लिए गर्म पिल्ला । हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण से पिल्ला की वसूली हर 5 मिनट की जांच जब तक पिल्ला पर्याप्त चेतना को कड़ी recumbency बनाए रखने के लिए आ गया है ।
  2. वापस पिल्ला बांध के बाद पिल्ला पूरी तरह से बरामद किया गया है ।

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Representative Results

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प्रयोग के पहले सेट के लिए, हम AAV9 के २०० nL microinjected. hSynapsin. HI. eGFP-Cre. WPRE. SV40 वायरस (AAV-eGFP-Cre, 1/10 Dulbecco के फास्फेट में कमजोर पड़ने बफर खारा) Cre डीएनए recombinase चूहों के P2 GFP में striatum के साथ जुड़े हुए कि एक्सप्रेस । Ai14 चूहों एक्सप्रेस tdTomato रिपोर्टर जीन पर Cre-loxP की मध्यस्थता विलोपन-(floxed) कैसेट रोक (चित्रा 2F) । GFP और tdTomato के immunostaining के लिए P14 पर दिमाग काटा गया. striatal-AAV-eGFP विषाणुओं द्वारा Cre कोशिकाओं के व्यापक संक्रमण का संकेत देते हुए कई AAV transduced GFP-पॉजिटिव कोशिकाएं striatum (चित्रा 2a, सी) भर में मौजूद थीं । tdTomato की इसी तरह व्यापक अभिव्यक्ति भी striatum में पाया गया था (चित्रा बी, सी) । उच्च आवर्धन पर सूक्ष्म परीक्षा पर, हमने पाया है कि लगभग सभी GFP-सकारात्मक striatal कोशिकाओं सह tdTomato रिपोर्टर जीन (चित्रा 2a'-सी ') व्यक्त किया । इसके अलावा, tdTomato संकेतों globus pallidus (चित्रा 2d) और substantia नाइग्रा pars रेटिकुलाटा (चित्रा 2E), striatonigral और striatopallidal प्रक्षेपण ंयूरॉंस के लक्ष्य क्षेत्रों में संभवतः axon टर्मिनलों में पाया गया 13. इन परिणामों में नवजात striatal न्यूरॉन्स में Cre गतिविधि की AAV मध्यस्थता अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित एक सफल Cre-loxP मध्यस्थता डीएनए पुनर्संयोजन का सुझाव.

प्रयोग के दूसरे सेट के लिए, हम Cre fl के striatum में AAV-eGFP-Foxp2 वायरस के ५० nL microinjected-loxP (3 ए आंकड़ा-सी, एफ) P2 पर Foxp2 alleles-पार्श्वित और P9 में मस्तिष्क काटा । न Foxp2+; GFP+ डबल-लेबल्ड कोशिकाएं striatum में पाई गईं, यानी, Foxp2 प्रोटीन GFP-पॉजिटिव कोशिकाओं (फिगर 3ए '-सी ') में नदारद था । नियंत्रण प्रयोगों में, Foxp2+; GFP+ डबल-लेबल कोशिकाओं AAV-eGFP नियंत्रण वायरस (चित्रा 3d) के साथ Foxp2fl/fl चूहों के striatum में मौजूद थे और striatum heterozygous fl के Foxp2 में/+ चूहों के साथ AAV-eGFP-Cre वायरस (figure 3E). इन परिणामों से संकेत मिलता है कि नवजात transduced के AAV-eGFP-Cre striatum कोशिकाओं में Foxp2 जीन को विशेष रूप से नष्ट कर दिया जाता है.

AAV-eGFP-Cre के परिणामों को एक साथ लिया गया ; Ai14 तथा AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/fl चूहों, stereotaxic नवजात मस्तिष्क सर्जरी की तकनीक है कि हम विकसित वातानुकूलित नवजात माउस दिमाग के विशिष्ट क्षेत्रों में जीन हटाने के लिए उत्तरदायी है.

Figure 1
चित्र 1. Stereotaxic तंत्र और घर का बना सिर-नवजात चूहों के लिए फिक्स्ड धारक । (क) stereotaxic इंजेक्शन प्रणाली निम्नलिखित उपकरणों के होते हैं: i. सिरिंज पंप (नियंत्रक); ii. सिरिंज पंप (ड्राइव यूनिट); iii. microliter सिरिंज (10 µ एल); iv. PE20 टयूबिंग अनुकूलक; v. PE10 ट्यूब; vi. 30G इंजेक्शन सुई; vii. stereotaxic तंत्र; viii. एक पिपेट युक्तियां बॉक्स नवजात पिल्ले के लिए मंच परिवर्तित; xi: कुचल बर्फ । (ख) ऊतक embedding कैसेट की ऊँचाई लगभग ७ मि. ग्रा. १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के बटन के बारे में 15 मिमी लंबा है । (ग) माउस सिर घर में सिर फिक्स्ड धारक में सुरक्षित है । तीर नवजात चूहों के सिर में मील का पत्थर लैंब्डा इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. P14 Ai14 चूहों के striatum में tdTomato की अभिव्यक्ति के बाद AAV-eGFP-Cre मध्यस्थता Cre-loxP डीएनए पुनर्संयोजन. AAV-eGFP-Cre वायरस striatum चूहों के P2 Ai14 में इंजेक्शन sterotaxically थे. P14 पर मस्तिष्क का विश्लेषण किया गया । (एक) कई GFP-सकारात्मक कोशिकाओं striatum (एसटीआर) भर में मौजूद हैं । (ख) striatum में अनेक tdTomato-धनात्मक कोशिकाएँ भी विद्यमान हैं. (ग) मर्ज की गई छवियां striatum में GFP और tdTomato का एक व्यापक सह-स्थानीयकरण दर्शाती हैं । एक-सी में बॉक्स्ड क्षेत्रों की फोकल छवियां A'-c ', क्रमशः में उच्च आवर्धन पर दिखाए जाते हैं । striatum में सभी GFP-पॉजिटिव सेल (green) सह-एक्सप्रेस tdTomato (red) । (डी, ई) striatal प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स के लक्षित क्षेत्रों में tdTomato संकेतों का पता लगाया जाता है, जिनमें globus pallidus (GP; घ) और substantia नाइग्रा pars रेटिकुलाटा (SNr; ङ). (च) योजनाबद्ध चित्र AAV-eGFP-Cre आणि Ai14 ट्रांसजेनिक construction. Ctx: प्रांतस्था; Sep: पट; Hipp: हिप्पोकैम्पस; MB: midbrain. एक (ए सी के लिए), २०० µm में स्केल बार; A ' (for A'-C '), 10 µm; डी (डी और ई के लिए), १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्र 3. AAV-eGFP-Cre वायरस के intrastriatal injecions द्वारा नवजात striatum में Foxp2 जीन की सशर्त विलोपन । AAV-eGFP-Cre वायरस के Intrastriatal इंजेक्शन P2 Foxp2 fl में प्रदर्शन किया गया था /fl (ए-सी ') और Foxp2fl/+(ई) चूहों. दिमाग P9 पर विश्लेषण किया गया । (A-C) GFP-सकारात्मक कोशिकाओं (ए, सी, ग्रीन) Foxp2-AAV-eGFP वायरस के साथ Crefl/fl चूहों के striatum में immunoreactivity (बी, सी, लाल) कमी Foxp2. ए-सी में बॉक्स्ड क्षेत्र क्रमशः A'-c ' में उच्च आवर्धन पर दिखाए जाते हैं । (घ) Striatal कोशिकाएं सह-व्यक्त GFP और Foxp2 striatum में विद्यमान हैं जिन्हें AAV-eGFP नियंत्रण विषाणुओं के साथ इंजेक्ट किया गया था. (ङ) GFP-धनात्मक कोशिकाएं सह-व्यक्त Foxp2 (ऐरोहेड) Foxp2-AAV-eGFP वायरस वाले चूहों के striatum के Crefl/+ में मौजूद हैं. (च) AAV-eGFP-Cre वायरस और Foxp2fl/fl ट्रांसजेनिक चूहों की योजनाबद्ध चित्र. एक (ए सी के लिए), २०० µm में स्केल बार; a ' (for A'-C ', D and E), 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

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वर्तमान अध्ययन में, हम नवजात माउस दिमाग के striatum में AAV वायरस इंजेक्शन के लिए एक सरल और विश्वसनीय stereotaxic विधि प्रदर्शित करता है । हम P2 पर striatum रिपोर्टर चूहों के Ai14 में AAV-eGFP-Cre वायरस microinjected और फिर P14 पर रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया । हम rostrocaudal के स्तर पर striatum भर में AAV transduced GFP-सकारात्मक कोशिकाओं पाया । इसके अलावा, लगभग सभी GFP-सकारात्मक कोशिकाओं striatal कोशिकाओं में tdTomato रिपोर्टर जीन व्यक्त, loxP गतिविधि की मध्यस्थता अभिव्यक्ति AAV द्वारा प्रेरित एक सफल Cre-Cre डीएनए पुनर्संयोजन का सुझाव. हम आगे P2 पर striatum Foxp2fl/fl चूहों में AAV-eGFP-Cre के microinjections द्वारा इस दृष्टिकोण की प्रभावकारिता की पुष्टि की । डबल लेबलिंग से पता चला है कि कई AAVs-transduced GFP-सकारात्मक कोशिकाओं immunoreactivity P9 में Foxp2 striatum कमी आई, नवजात Foxp2 में striatum जीन की एक सफलतापूर्वक सशर्त विलोपन का सुझाव । microinjected AAVs की मात्रा संक्रमित मस्तिष्क क्षेत्रों के आकार के साथ संबंधित हैं । इंजेक्शन की मात्रा के २०० nL के साथ, GFP-सकारात्मक कोशिकाओं नवजात striatum भर में बड़े पैमाने पर पाया गया, और प्रांतस्था के निकटवर्ती striatum में कुछ बिखरे हुए GFP-सकारात्मक कोशिकाओं को भी मौजूद थे. इंजेक्शन मात्रा के ५० nL के साथ, GFP पॉजिटिव कोशिकाओं को स्थानीय रूप से नवजात striatum के लिए प्रतिबंधित किया गया था । इसलिए, titrating AAVs इंजेक्शन की मात्रा विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में ंयूरॉन आबादी के इष्टतम transduction के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा transduction रेट वायरल की तैयारी के titer से भी तय होता है । यह कल्पना है कि सटीक लक्ष्यीकरण विशिष्ट कोशिका प्रकार के विभिंन प्रवर्तकों के साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है ।

रुचि मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए सफल इंजेक्शन AAVs के लिए कई शल्य युक्तियां हैं । माउस पिल्ले के छोटे आकार और सर्जरी के दौरान हाथों से माउस सिर की स्थिति को सुरक्षित करने में कठिनाई के कारण सबसे पहले, यह नवजात चूहों10में stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है । हालांकि एक पिछले अध्ययन नवजात stereotaxic सर्जरी का प्रदर्शन किया है, लेकिन यह दो लोगों को11सर्जरी के दौरान microinjection प्रदर्शन करने की आवश्यकता है । हम एक कस्टम निर्मित सिर-फिक्स्ड डिवाइस है कि दृढ़ता से मस्तिष्क सर्जरी के दौरान पिल्ला सिर सुरक्षित कर सकते है विकसित करके इन समस्याओं को दूर किया है । पूरी प्रक्रिया एक ही व्यक्ति द्वारा किया जा सकता है । नवजात चूहों के मस्तिष्क के आकार विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, मातृ देखभाल और पिल्ले की उम्र के कारण विविध रहे हैं । हमारे घर का बना डिवाइस का एक लाभ यह है कि यह नवजात माउस सिर, जो उच्च परिशुद्धता stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी प्रदर्शन के लिए आवश्यक है की एक कोमल लेकिन सुरक्षित निर्धारण की अनुमति देता है । दूसरा, मुलायम त्वचा की लोच और खोपड़ी की पतली दीवार के कारण, त्वचा सिर में खोपड़ी ड्रिलिंग के बाद चीरा नवजात पिल्ले में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है । इस समस्या को दूर करने के लिए, यह एक सुई टिप के साथ त्वचा और खोपड़ी के एक पंचर बनाने के लिए आवश्यक है करने के लिए लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र के लिए इंजेक्शन सुई कम करने से पहले । तीसरा, यह microinjection इंजेक्शन के दौरान प्रगति में है सुनिश्चित करने के लिए पीई ट्यूब में दिखाई डाई के प्रवाह की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । अगर डाई पीई ट्यूब में कदम नहीं है, प्रयासों को मुसीबत टयूबिंग और भरा सुइयों में तरल पदार्थ का एक संभावित रिसाव सहित समस्याओं को गोली मार करने के लिए लिया जाना चाहिए । ध्यान दें कि इस विधि नवजात पिल्ले जिसका लैंब्डा P5 से पहले त्वचा के माध्यम से दिखाई दे रहे है पर लागू होता है । P5 से पुराने पिल्ले के लिए, यह लैंब्डा को बेनकाब करने के लिए त्वचा में एक चीरा की जरूरत हो सकती है । ध्यान दें कि प्रकाश पी 4 और P5 माउस सिर पर मदद कर सकता है ऐतिहासिक लैंब्डा का पता लगाने । हालांकि हम नवजात चूहों में stereotaxic सर्जरी के इस तकनीक का प्रदर्शन नहीं किया है, हम मानते है कि तकनीक कुछ संशोधनों के साथ चूहे पिल्ले के लिए लागू है ।

शुरुआत और जीन अभिव्यक्ति ले जाने वाले वायरस के अधिक से अधिक अभिव्यक्ति14,15दिमाग में इंजेक्शन के बाद कई दिनों या हफ्तों लग । वर्तमान अध्ययन में, हमने पाया है कि AAV-eGFP-Cre विषाणुओं मध्यस्थता Cre-loxP नवजात striatal न्यूरॉन्स में डीएनए पुनर्संयोजन वायरल transduction के बाद के रूप में के रूप में जल्दी 8 दिनों के रूप में हुई. पिछले अध्ययन में बताया गया है कि AAV-मध्यस्थता Cre-निर्भर रिपोर्टर गतिविधि AAVs15के थोक इंजेक्शन के बाद 3 दिनों के रूप में जल्दी के रूप में नवजात माउस पिल्ले के घ्राण बल्ब में पता लगाया जा सकता है । यह AAV की मध्यस्थता आनुवंशिक गतिविधि की प्रारंभिक शुरुआत है कि लगातार जन्मोत्तर दिमाग में होते हैं कि विकासात्मक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक लाभ है कि कल्पना है ।

संक्षेप में, नवजात stereotaxic तकनीक है कि हम विकसित केवल सशर्त विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में जीन हटाने के लिए नहीं है, लेकिन यह भी नवजात चूहों में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए औषधीय reagents और न्यूरॉन्स tracers सुई करने के लिए उत्तरदायी है. हालांकि हम केवल वर्तमान अध्ययन में नवजात striatum में microinjections बनाया, सिद्धांत रूप में, हमारे stereotaxic नवजात मस्तिष्क सर्जरी विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों लक्ष्य के लिए लागू किया जा सकता है अगर नवजात दिमाग में विशिष्ट क्षेत्रों के निर्देशांक उपलब्ध हैं. विभिंन चरणों में अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ नवजात माउस दिमाग के आकार में परिवर्तनशीलता को देखते हुए, यह empirically के लिए आवश्यक है जांच के द्वारा लक्षित साइटों की सटीक निर्देशांक निर्धारित करते हैं । अंत में, stereotaxic microinjections द्वारा AAVs के आनुवंशिक रूप से संशोधित optogenetic3 और chemogenetic प्रोटीन4 और विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में ंयूरॉन गतिविधि संकेतक5 व्यक्त, एक न्यूरॉन की भूमिका का पता लगाने सकता है कोशिका प्रकार-और सर्किट विशेष स्तर के संकल्प पर मस्तिष्क के जन्मोत्तर विकास पर गतिविधि.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया अनुदान MOST104-2311-b-010-010-MY3, MOST106-2321-b-010-012, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों अनुदान NHRI-EX106-10429NI, और विशेष रुप से प्रदर्शित क्षेत्रों अनुसंधान केंद्र कार्यक्रम अनुदान से मस्तिष्क अनुसंधान केंद्र, ताइवान में राष्ट्रीय यांग-मिंग विश्वविद्यालय के माध्यम से शिक्षा मंत्रालय, और Postdoctoral फैलोशिप अनुदान MOST106-2811-बी-010-031 (एस.-Y.C.), MOST105-2811-बी-010-036 और MOST106-2811-बी-010-030 (एच.-Y.K.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G PrecisionGlide Needle Becton Dickinson REF 305106
Chloroform JT Baker 9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe Hamilton  80300 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20 Becton Dickinson 427406
Polyethylene tubing PE10 Becton Dickinson 427401
Micro Flow Rate Syringe Pump Longer Precision Pump Co. TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe Becton Dickinson REF 302105
Fast green Sigma-Aldrich F-7252 0.1%
Standard Stereotaxic Instruments RWD Life Science 68037 Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody Abcam ab16046 Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody Abcam ab65856 Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope Olympus BX63
LSM 880 confocal microscope Zeiss LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. 111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Penn Vector Core AV-9-PV1848 Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan N/A 1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Labtorary  007914 Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ The Jackson Labtorary  026259 Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline Corning cellgro 21-030-CVR

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References

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नवजात माउस दिमाग के Striatal कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर के लिए Stereotaxic सर्जरी
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Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).More

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).

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