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Neuroscience

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

doi: 10.3791/57270 Published: July 10, 2018

Summary

우리는 신생아 마우스 두뇌의가에 microinjecting 시 약에 대 한 수 제 머리 고정 장치 stereotaxic 수술의 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 신생아 마우스 두뇌의 특정 영역의 신경 세포에서 유전자 조작 가능

Abstract

많은 유전자는 미 발달 머리에 표현 하 고 그들 중 일부는 지속적으로 출생 후 뇌에 표현. 이러한 지속적으로 표현한 유전자에 대 한 그들은 발달 과정 및 신생아 두뇌의 생리 기능을 조절 하 작동 수 있습니다. 두뇌에 있는 특정 유전자의 neurobiological 기능 조사, 두뇌에서 유전자를 비활성화 필수적 이다. 여기, 우리 신생아 시간 창에서 유전자 변형 생쥐의 고가에 유전자 발현을 비활성화 하는 간단한 stereotaxic 방법을 설명 합니다. AAV eGFP Cre 바이러스는 출생 후 하루 (P) stereotaxic 뇌 수술에 의해 2에서 Ai14 기자 유전자 쥐가 microinjected 했다. TdTomato 기자 유전자 발현 P14가, 성공적인 Cre loxP 중재 DNA 재조합 AAV 불리고 striatal 셀에 제안에 발견 되었다. 우리는 더 AAV eGFP Cre 바이러스 P2Foxp2fl/플로리다 쥐로 microinjecting에 의해이 기술을 검증. GFP의 Foxp2 더블 라벨 GFP-긍정적인 세포 Foxp2 immunoreactivity P9가, AAV-eGFP-Cre 불리고 striatal 셀에서 Foxp2 단백질의 손실을 제안에 부족을 보여주었다. 함께 찍은, 이러한 결과 floxed 유전자 변형 생쥐의 신생아 두뇌에 있는 특정 신경 인구에 있는 stereotaxically microinjected AAV eGFP Cre 바이러스에 의해 효과적인 유전자 삭제를 보여 줍니다. 결론적으로, 우리의 stereotaxic 기술 신생아 마우스 두뇌에서 유전자 조작에 대 한는 쉽고 간단한 플랫폼을 제공합니다. 기술만 사용할 수 없는 신생아 두뇌의 특정 지구에 있는 유전자를 삭제 하 하지만 또한 사용할 수 있습니다 약물 약물, 신경 추적기, 유전자 변형된 optogenetics 및 chemogenetics 단백질, 신경 활동 지표를 삽입 하 고 신생아 마우스 두뇌의가에 다른 시 약.

Introduction

현대 연구의 구조와 뇌의 기능 일반적으로 신경 세포에 특정 유전자의 유전자 조작이 필요합니다. 다른 유전자, 돌연변이 체 대립 유전자를 포함 하 여 운반 하는 유전자 변형 마우스의 기능을 녹아웃와 대립 노크에서 정기적으로 생성. Stereotaxic 뇌 수술 성인 설치류에 대 한 로컬 설치류 두뇌1,2의 특정 지역에 약물, 바이러스, 추적기 및 다른 시 약을 제공 하는 표준 방법입니다. 유전자 변형 마우스 stereotaxic 뇌 수술을 적용 한 유전자 조작 유전자 기능과 마우스 뇌의 특정 신경 인구에 신경 활동을 허용 합니다. 셀 형식 관련 조작 두뇌3,,45의 복잡 한 신경 회로에 신경 기능을 해독 하는 강력한 접근 방식을 제공 합니다.

신 경계의 신경 개발 초기 배아 단계에서 시작 하 고 개발 프로세스 청소년 기간까지 출산 후 계속. 신경 시스템의 출생 후 성숙 뇌6의 생리 및 인지 기능을 위한 필수적인 신경 회로의 정확한 시 냅 스 배선 포함 되어 있습니다. 따라서, 신생아 시간 윈도우에서 발생 하는 개발 이벤트를 공부 뿐만 아니라 정상적인 신경 발달을 이해 하는 데 중요 하지만 neurodevelopmental과7 정신병 무질서의 병 인에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. ,8. 성인 설치류 stereotaxic 뇌 수술의 방법으로는 쉽게 사용할 수 있는2,9, 비록 몇 가지 프로토콜 신생아 쥐10,11stereotaxic 뇌 수술에 대 한 인터넷에서 사용할 수 있습니다. 사실, 신생아 마우스 새끼의 두뇌에 약의 stereotaxic microinjections는 어렵다, 신생아 강아지의 머리는 너무 연약한 표준 stereotaxic 장치에 고정 하기 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 유전자 변형 마우스 stereotaxic 뇌 수술의 응용 프로그램은 신생아 쥐12가능 합니다. 여기, 우리가 만든 설치 신생아 마우스 새끼 stereotaxic 뇌 수술을 수행 하는 간단한 방법 설명. 이 기술은 허용 하나 조건부로 AAV 표현 Cre DNA recombinase 기자 진 마우스와 조건에 따라 floxed 유전자 변형 쥐가 microinjecting floxed 유전자 삭제를 보여 줍니다. 이 기술은 또한 야생-타입 마우스의 신생아가에 시 약을 제공에 적용 됩니다.

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Protocol

여기에 설명 된 동물 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회의 국립 양 밍 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 신생아 강아지 Stereotaxic 장치에 대 한 소유자의 준비

  1. 머리 트레이 만들기: 1.5 mL 원심 분리기 튜브 (길이 15 m m)의 하단 튜브의 벽의 1/5를 제거 하 여 신생아 강아지의 머리에 맞는 모양으로 잘라.
  2. 피 펫 팁 상자 stereotaxic 기구의 받침대와 맞는 적당 한 크기와 고 상단 덮개를 제거. 머리 트레이 단계 1.1 및 뜨거운 용 해 접착제로 팁 쟁반의 기지에 조직 포함 카세트에 부착 조직 포함 카세트의 높이 7 m m, 머리 고정 위치에서 강아지의 목과 시체를 지 원하는 데 사용 되는입니다.
  3. 표준 stereotaxic 장치에 전체 설치를 넣습니다.

2. 30 G 주입 스테인리스 바늘의 준비

  1. 전 3 일 동안 클로 프롬에서 그들을 몸을 담글 하 여 30 G 주사기 바늘을 청소.
  2. 집게를 사용 하 여 신중 하 고 천천히 당겨 바늘 화학 후드에서 폴 리 프로필 렌 그것의 허브에서.
  3. 20 분 50 rpm에서 통에 70% 에탄올 린스 3 × 10 분 뒤 절대 에탄올과 바늘을 씻어. 사용까지 바늘 공기 건조, 그리고 청소 바늘 실 온 (RT)에서 깨끗 한 상자에서 저장을 하자.

3. Microinjection 튜브 어댑터 준비

  1. PE10 폴 리 에틸렌 튜브 (PE10 튜브) 30g 주사 바늘에 microliter 주사기를 연결 합니다. 브리징 microliter 주사기와 주사 바늘에 대 한 PE20 폴 리 에틸렌 튜브 (PE20 튜브) 어댑터를 준비 합니다. 어댑터의 사용 때문에 필요, PE10 튜브의 직경 26 G microliter 주사기의 바늘의 그것 보다 훨씬 작습니다.
  2. Microliter 주사기에 대 한 튜브를 준비: PE20 튜브 5 cm와 미리 청소 30g 주사 바늘을 연결 하 고 인스턴트 접착제로 접합 인감. 이 튜브 어댑터는 재사용 가능한.
    참고: microinjection 주사기의 바늘 30 G 이면 준비 (3.1 단계) 및이 어댑터의 사용 (단계 3.3) 필요 하지 않습니다.
  3. Microliter 주사기 (10 µ L) (3.1 단계에서 준비) 튜브 어댑터를 연결 합니다.
  4. PE20 튜브 어댑터의 30 G 바늘에 (더 이상 60 cm) PE10 튜브의 한쪽 끝을 연결 합니다. PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 새로운 30 G의 주사 바늘을 탑재 합니다.

4. 부하 압력가 증류수, 염료와 바이러스 Microinjection 튜브

  1. Microliter 주사기의 플런저를 제거 합니다. 25 G 주사기를 사용 하 여 로드 microliter 주사기 및 압력가 증류수는 배관에서 공기를 제거 하는 연결 된 PE 튜브.
  2. 플런저 microliter 주사기를 다시 놓고 배럴에 증류수 남아 2 µ L까지 플런저를 밀어. 양의 증류수 2 µ L 보다 낮은 되 게 하지 마십시오.
  3. 신중 하 게 마이크로 흐름 속도 주사기 펌프에 microliter 주사기를 탑재 합니다.
  4. 적은 양의 0.1% 빠른 녹색 염료 (0.9% 식 염 수에 준비와 0.22 μ m 필터 필터링)와 parafilm 조각에 바이러스 액체 플라스틱
  5. Microinjection 튜브에 체액의 흐름을 테스트 하려면 30 G 주입 바늘과 튜브에 필터링 된 빠른 그린의 0.7 µ L을 로드 하 여 다음 PE10 튜브 사이 공기 방울이 볼 수 있도록 공기의 작은 금액을 철회 한다.
  6. 또 다른 작은 양의 바이러스 액체 microinjection 튜브에 로드 하 여 다음 두 번째 공기 거품을 만들기 위해 공기를 철회 한다.
  7. 연결 하 고 30 G microinjection 바늘 stereotaxic 기구의 팔을 확보.

5입니다. 저체온증에 의해 신생아 쥐의 마 취

  1. 라텍스 장갑 소매에 강아지를 놓고 5 분 목까지 얼음에 몰두 합니다.
  2. 되도록 그의 철수 응답 집게로 강아지의 발을 꼬집어.
  3. 라텍스 장갑 소매와 강아지를 머리 트레이에 놓고 저 체온 마 취에 대 한 차가운 유지에 라텍스 슬리브 주위 일부 얼음을 넣어.
  4. 가능 하면 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 강아지의 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.

6입니다. microinjection

  1. 70% 에탄올으로 깨끗이 stereotaxic 악기를 닦아 하 여 불 임 수술을 준비 합니다. 70% 에탄올에 그들을 immersing 하 여 외과 기구를 소독.
  2. 70% 에탄올과 강아지의 머리를 제거 하십시오. 두개골에 랜드마크 람다를 찾아서 람다 마커 펜으로 표시 합니다. 람다에 바늘 끝을 조 준 하 고 0으로 이전 후부 (AP) 및 중간 옆 (ML) 좌표를 설정 합니다.
  3. 대상 사이트의 대상 사이트의 X 및 Y 좌표에 따라 주입 팔을 이동 합니다. 출생 후 하루 (P) 2의가 대 한 강아지, 좌표는: AP, 람다; 앞쪽 +2.4 m m ML, ± 1.0 mm; 중간에서 측면 등-복 부 (DV), 두개골에서 −1.7 m m. 펜으로 PE10 관에서 빠른 녹색 염료의 위치를 표시 합니다.
  4. 30g 주사 바늘 아래로 천천히 두개골, 피부를 통해 침투 하 가져오고 두개골의 표면에서 멈출 때까지 다음 바늘 팁을가지고. 0으로 DV 좌표를 설정 합니다.
  5. 내릴 30 G 주입 바늘 천천히 대상 사이트의 DV 좌표에 도달할 때까지. 실질 정상적인 모양을 다시 시작 수 있도록 1 분 기다립니다. Microinjection 프로그램 (100 nL/min)를 실행 합니다.
  6. 빠른 녹색 염료의 마크는 바이러스 액체 두뇌에 주입 되도록 PE 튜브에 움직이는 다는 것을 확인 하십시오.
  7. Microinjection, 종료 후 1 분 동안 대기 그리고 다음 천천히 그리고 점진적으로 30 DV 깊이의 1/2 높이에 바늘을가지고 s. 30 후 s, 천천히 강아지의 머리에서 바늘을 철회.
  8. 모든 타겟된 사이트의 microinjections는 완료 될 때까지 단계 6.2 6.7를 반복 합니다.

7. 강아지의 포스트 외과 복구

  1. 33 ° C 배양 기에 20 분 동안 강아지를 따뜻한. 강아지 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 저 체온 마 취 매 5 분에서에서 강아지의 복구를 확인 하십시오.
  2. 강아지는 완 치 후에을 다시 강아지를 반환 합니다.

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Representative Results

실험의 첫 번째 집합에 대 한 우리 200 microinjected AAV9.hSynapsin.HI.eGFP Cre.WPRE.SV40 바이러스 (AAV-eGFP-Cre, Dulbecco의 버퍼링 인산 염 분에 1/10 희석) Cre DNA recombinase 표현의 nL Ai14 쥐의 P2가 GFP 융합. Ai14 마우스 loxP 형벌 (floxed) 정지 카세트 (그림 2F)의 Cre 중재 삭제 시 tdTomato 취재 원 유전자를 표현 한다. 두뇌는 GFP와 tdTomato의 immunostaining에 대 한 P14에서 수확 했다. 많은 AAV 불리고 GFP-긍정적인 세포 (그림 2A, C)가 걸쳐 현재 AAV eGFP Cre 바이러스에 의해 striatal 세포의 광범위 한 감염을 나타내는 했다. TdTomato의 비슷한 광범위 한 식이 (그림 2B, C)에서 또한 발견 되었다. 높은 확대에 현미경 검사, 우리는 거의 모든 GFP-긍정적인 striatal 셀 공동 tdTomato 취재 원 유전자 표현 발견 (그림 2A'-C'). 또한, tdTomato 신호 globus pallidus (그림 2D)와 substantia nigra 동위 reticulata (그림 2E), striatonigral 및 striatopallidal 프로젝션 뉴런 의 대상 지역에서 아마도 축 삭 맨끝에서 발견 되었습니다. 13.이 결과 성공적인 Cre loxP 중재 DNA 재조합 AAV 중재 표현 Cre 신생아 striatal 신경에 있는 활동에 의해 유도 된 것이 좋습니다.

실험의 두 번째 집합에 대 한 우리 50 microinjected P2 loxP 형벌 Foxp2 대립 들고 Foxp2fl/플로리다 쥐가 AAV eGFP Cre 바이러스의 nL (그림 3A-C, F), P9에서 뇌를 수확. 아니 Foxp2+; GFP+ 더블 라는 세포가, i.e에서 발견 됐다., Foxp2 단백질 결 석 했다 GFP-긍정적인 세포 (그림 3A'-C'). 제어 실험, Foxp2+; GFP+ 더블 표시 셀 AAV eGFP 제어 바이러스 (그림 3D) Foxp2fl/플로리다 쥐가 heterozygous의 했다 Foxp2fl / + AAV eGFP Cre와 쥐 바이러스 (그림 3E)입니다. 이러한 결과 Foxp2 유전자의 신생아가 AAV eGFP Cre 불리고 셀에 특별히 삭제 됩니다 나타냅니다.

AAV-eGFP-Cre;의 결과 함께 찍은 Ai14AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/플로리다 마우스, 우리 개발 stereotaxic 신생아 뇌 수술의 기술은 이다 신생아 마우스 두뇌의 특정 지역에서 조건부 삭제 유전자에 대 한 의무가.

Figure 1
그림 1입니다. Stereotaxic 기구 그리고 신생아 쥐에 대 한 수 제 머리 고정 홀더. (A) stereotaxic 분사 시스템의 다음 장치 구성: i. 주사기 펌프 (컨트롤러); ii. 주사기 펌프 (드라이브 단위); iii. microliter 주사기 (10 µ L); iv. PE20 튜브 어댑터; v. PE10 튜브; 6. 30 G 주입 바늘; 7. stereotaxic 장치; viii. 피 펫 팁 상자 변환 신생아 강아지;에 대 한 플랫폼 xi: 얼음 짓 눌린. (B) 조직 포함 카세트의 높이 약 7 m m 이다. 버튼을 1.5 mL 원심 분리기 튜브의 길이가 약 15 mm 이다. (C) 마우스 머리에 수 제 머리 고정 홀더 확보 된다. 화살표는 신생아 쥐의 머리에 랜드마크 람다를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. P14 Ai14 마우스 AAV eGFP Cre 중재 Cre loxP DNA 재결합 후의 tdTomato의 식. AAV eGFP Cre 바이러스 sterotaxically Ai14 쥐의 P2가 주입 했다. 두뇌는 P14에서 분석 했다. (A) 많은 GFP-긍정적인 세포가 (Str)에 걸쳐 존재 하는. (B) 많은 tdTomato 양성 세포는가 있습니다. (C) 병합 된 이미지는가에 GFP와 tdTomato의 광범위 한 공동 지역화를 표시합니다. A에 높은 확대에 A-c에서 박스형 영역의 confocal 이미지 표시 됩니다 '-C', 각각. 모든 GFP-긍정적인 세포 (녹색) tdTomato (빨간색)는가 표현 하는 공동. (D, E) TdTomato 신호 striatal 프로젝션 뉴런, globus pallidus (GP;를 포함 하 여의 대상 지역에서 검색 D)와 substantia nigra 동위 reticulata (SNr; E). AAV eGFP Cre 및 Ai14 유전자 변형 구문 (F) 회로도 도면. Ctx: 피 질; 9 월: 심장; 힙: 해 마; MB: midbrain. (A-C)에 대 한 A에서 눈금 막대, 200 µ m; A' (a '-C'), 10 µ m; D (D 및 E) 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. AAV eGFP Cre 바이러스의 intrastriatal injecions에 의해 신생아가 있는 Foxp2 유전자의 조건부 삭제. AAV eGFP Cre 바이러스의 Intrastriatal 주사 P2 Foxp2fl/플로리다 에서 수행 되었다 (A-C')와 Foxp2fl / +(E) 쥐. 두뇌는 P9에서 분석 되었다. (A-C) GFP-긍정적인 세포 (A, C, 녹색) 부족에서 AAV eGFP Cre 바이러스 Foxp2fl/플로리다 쥐가 Foxp2 immunoreactivity (B, C, 빨간색). A-c에서 박스형된 지역 A에 높은 확대 표시 됩니다 '-C', 각각. (D) 공동 익스프레스 GFP와 Foxp2 Striatal 세포는 AAV eGFP 제어 바이러스 주사가. (E) GFP-긍정적인 세포 공동 Foxp2 익스프레스 (화살촉)의 있는 Foxp2fl / + AAV eGFP Cre 바이러스와 생쥐. (F) AAV eGFP Cre 바이러스와 플로리다/플로리다 Foxp2 유전자 변형 생쥐의 구조도 드로잉. (A-C)에 대 한 A에서 눈금 막대, 200 µ m; A' (a '-C', D 및 E), 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

현재 연구에서 신생아 마우스 두뇌가 AAV 바이러스 주입에 대 한 간단 하 고 안정적인 stereotaxic 방법을 보여 줍니다. 우리는 p 2에서 Ai14 기자 쥐가 AAV eGFP Cre 바이러스 microinjected 하 고 P14에서 리포터 유전자 발현 분석. 우리는 AAV 불리고 GFP-긍정적인 세포가 rostrocaudal 수준에 걸쳐 발견. 또한, 거의 모든 GFP-긍정적인 세포 공동 tdTomato 기자 유전자 striatal 셀에 제안 하는 성공적인 Cre loxP DNA 재조합 AAV 중재 표현 Cre 활동에 의해 유도 된 표현. 우리는 더 p 2에서가 Foxp2fl/플로리다 쥐로 AAV eGFP Cre의 microinjections에 의해이 접근 방법의 효능을 확인 했다. 이중 라벨 많은 AAVs 불리고 GFP-긍정적인 세포 Foxp2 immunoreactivity P9가, 신생아가 있는 Foxp2 유전자의 성공적으로 조건부 삭제 제안에 부족을 보여주었다. Microinjected AAVs의 볼륨은 감염 된 뇌 영역의 크기와 상관 된다. 200는 주입 된 볼륨의 nL, GFP-긍정적인 세포 신생아가 걸쳐 광범위 하 게 발견 했다 및 일부 흩어져 GFP-긍정적인 세포는가에 인접 한 피 질에 존재 했다. 50는 주입 된 볼륨의 nL, GFP-긍정적인 세포 로컬로 신생아가 제한 되었습니다. 따라서, titrating의 주입된 AAVs 볼륨 특정 뇌 영역에 신경 인구의 최적의 변환에 대 한 중요 하다. 또한, 변환 속도 또한 준비 바이러스 titer에 의해 결정 됩니다. 그것은 생각할 수 있는 정확한 타겟팅 특정 세포 유형 다른 발기인 유전자 변형 쥐를 사용 하 여 달성 될 수 있다입니다.

성공적인 주입 AAVs 관심된 뇌 영역에 대 한 여러 외과 팁을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 마우스 강아지와 수술 중 손으로 마우스 머리의 위치를 확보에 어려움의 작은 크기 때문에 그건 신생아 쥐10stereotaxic 뇌 수술을 수행 하기 어려운. 이전 연구는 신생아 stereotaxic 수술 시연 하고있다 하지만 수술11동안 microinjection를 수행 하기 위해 두 사람이 필요 합니다. 우리는 뇌 수술 하는 동안 강아지 머리를 보호할 수 있습니다 단단히 한 주문 품 머리 고정 장치를 개발 하 여 이러한 문제를 극복 했다. 전체 절차는 한 사람에 의해 수행할 수 있습니다. 신생아 쥐의 두뇌 크기는 다른 유전 배경, 산 모 관리와 강아지의 나 변화 된다. 우리의 집에서 만드는 장치의 장점은 높은 정밀도 stereotaxic 뇌 수술을 수행 하기 위한 필수적 이다 신생아 마우스 머리의 부드러운 하지만 보안 고정 수 있다는. 둘째, 때문에 부드러운 피부의 탄력 및 두개골의 얇은 벽, 두개골 머리에 드릴링 뒤 피부 절 개 신생아 강아지에서 수행 하기 어려운입니다. 이 문제를 해결 하려면 그것은 피부와 바늘 팁 대상된 뇌 영역에 주사 바늘을 낮추기 전에 두개골의 펑크를 만들 필요가 있다. 셋째, 그것은 진행 주입 동안에 microinjection가 되도록 PE 튜브에 보이는 염료의 흐름을 확인 하는 것이 중요. 염료 PE 튜브에 이동 하지 않으면, 노력 해야 될 문제가 촬영 튜브에 액체의 가능한 누설을 포함 한 문제 그리고 바늘 막힌. 참고가이 방법은 신생아 강아지에 누구의 람다 적용 P5 전에 피부를 통해 볼 수 있습니다. 강아지 P5 보다 오래 된에 대 한 그것은 람다 노출에 피부에 절 개를 할 수 있습니다. P4에 조명 빛과 P5 마우스 머리 도움이 될 수 있습니다 랜드마크 람다를 찾습니다. 비록 우리는 수행 하지 stereotaxic 수술의이 기술은 신생아 쥐에 있는 기술은 쥐 새끼 몇 가지 수정에 적용 됩니다 가정 합니다.

발병 하 고 바이러스 유전자 발현을 들고 최대한 표현 몇 일 또는 주 두뇌14,15에 주사 후 걸릴. 현재 연구에서 우리는 AAV eGFP Cre 바이러스 중재 Cre loxP DNA 재조합 신생아 striatal 신경에 발생 한 바이러스 성 변환 후 8 일 다는 것을 발견. 이전 연구는 AAV 중재 Cre 종속 기자 활동 검출 될 수 있다 신생아 마우스 강아지의 후 각 전구에 AAVs15의 대량 주입 후 3 일 보도 했다. 그것은 생각할 수 있는 중재 하는 AAV 유전자 활동의 초기 증상 공부 지속적으로 출생 후 뇌에서 발생 하는 개발 이벤트에 대 한 장점입니다.

요약 하자면, 신생아 stereotaxic 기술 개발은 특정 한 두뇌 지역, 조건부 삭제 유전자에만 하지만 그것도 약리 시 약 및 신생아 쥐에 있는 특정 한 두뇌 지역에 신경 추적기 주사 의무가. 비록 우리가 원칙적으로, 현재 연구에서 신생아가에 microinjections를 만들어 우리의 stereotaxic 신생아 뇌 수술 신생아 두뇌에서 특정 영역의 좌표를 사용할 수 있는 경우 대상 특정 뇌 영역에 적용할 수 있습니다. 여러 단계에서 서로 다른 유전적 배경 가진 신생아 마우스 두뇌의 크기에 가변성을 주어, 경험적으로 조사 하 여 대상된 사이트의 정확한 좌표를 결정에 필수적 이다. 마지막으로, 특정 뇌 영역으로 유전자 변형된 optogenetic3 , chemogenetic 단백질4 및 신경 활동 지표5 표현 AAVs의 stereotaxic microinjections에 의해 한 신경의 역할 찾아보기 수 있습니다. 세포 유형 및 회로 특정 레벨의 해상도에서 뇌의 출생 후 개발에 활동.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 과학의 부에 의해 지원 되었다 및 기술 부여 MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, 국립 건강 연구소 부여 NHRI-EX106-10429NI, 및 추천된 지역 연구 센터 프로그램 부여 뇌 연구 센터, 대만에서 국립 양 밍 대학 교육부의 박사 친목 부여 MOST106-2811-B-010-031 (S. Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 및 MOST106-2811-B-010-030 (헤-영 규 과장).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G PrecisionGlide Needle Becton Dickinson REF 305106
Chloroform JT Baker 9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe Hamilton  80300 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20 Becton Dickinson 427406
Polyethylene tubing PE10 Becton Dickinson 427401
Micro Flow Rate Syringe Pump Longer Precision Pump Co. TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe Becton Dickinson REF 302105
Fast green Sigma-Aldrich F-7252 0.1%
Standard Stereotaxic Instruments RWD Life Science 68037 Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody Abcam ab16046 Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody Abcam ab65856 Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope Olympus BX63
LSM 880 confocal microscope Zeiss LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. 111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Penn Vector Core AV-9-PV1848 Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan N/A 1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Labtorary  007914 Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ The Jackson Labtorary  026259 Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline Corning cellgro 21-030-CVR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술
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Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).More

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).

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