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Biology

एक प्रवाह Cytometry-परख की पहचान करने के लिए यौगिक यौगिकों कि बाधा फ्लोरोसेंट की बाध्यकारी-लेबल CXC Chemokine Ligand 12 करने के लिए CXC Chemokine रिसेप्टर 4

Published: March 10, 2018 doi: 10.3791/57271
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

Summary

एक प्रवाह cytometry-आधारित सेलुलर बाध्यकारी परख वर्णित है कि मुख्य रूप से एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में प्रयोग किया जाता है यौगिकों कि एक फ्लोरोसेंट लेबल CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) CXC chemokine रिसेप्टर 4 (CXCR4) के बंधन को बाधित की पहचान ।

Abstract

जी प्रोटीन के औषधीय लक्ष्यीकरण-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) मानव स्वास्थ्य के लिए बहुत महत्व का है, के रूप में बेकार GPCR-मध्यस्थता संकेत कई रोगों की प्रगति के लिए योगदान देता है. ligand/रिसेप्टर जोड़ी CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine रिसेप्टर 4 (CXCR4) महत्वपूर्ण नैदानिक ब्याज उठाया है, उदाहरण के लिए कैंसर और भड़काऊ रोगों के उपचार के लिए एक संभावित लक्ष्य के रूप में. छोटे अणुओं के रूप में अच्छी तरह से चिकित्सीय एंटीबॉडी कि विशेष रूप से लक्ष्य CXCR4 और रोकना है रिसेप्टर समारोह इसलिए मूल्यवान औषधीय उपकरण माना जाता है । यहां, एक प्रवाह cytometry आधारित सेलुलर परख है कि यौगिकों की पहचान की अनुमति देता है (जैसे, छोटे अणुओं) है कि CXCL12 के लिए बाध्यकारी CXCR4, वर्णन किया गया है । मूलतः, परख फ्लोरोसेंट लेबल CXCL12, CXCR4 के लिए प्राकृतिक chemokine एगोनिस्ट, और unलेबल्ड यौगिकों की एक निश्चित राशि के बीच रिसेप्टर बाइंडिंग के लिए प्रतियोगिता पर निर्भर करता है । इसलिए, रेडियोधर्मी लेबल जांच की अवांछनीय उपयोग इस परख में परहेज है । इसके अलावा, कोशिकाओं के रहने के बजाय कोशिका झिल्ली की तैयारी रिसेप्टर (CXCR4) के स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है । यह एक प्लेट प्रारूप है, जो प्रवाह बढ़ जाती है परख के आसान अनुकूलन की अनुमति देता है । इस परख के लिए एक मूल्यवान जेनेरिक दवा खोज परख CXCR4-लक्ष्यीकरण यौगिकों की पहचान हो दिखाया गया है । प्रोटोकॉल की संभावना अंय GPCRs के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, कम से कम अगर फ्लोरोसेंट लाइगैंडों लेबल उपलब्ध है या उत्पंन किया जा सकता है । intracellular संकेत मार्ग है कि इन GPCRs के सक्रियण पर प्रेरित कर रहे है के विषय में पहले ज्ञान की आवश्यकता नहीं है ।

Introduction

जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) कोशिका की सतह प्रोटीन है कि extracellular लाइगैंडों द्वारा सक्रिय किया जा सकता है (जैसे, पेप्टाइड्स, प्रोटीन हार्मोन, अमीन), जिससे कई शारीरिक और विकासात्मक प्रक्रियाओं को विनियमित1. जब एक एगोनिस्ट अपनी GPCR बाध्यकारी जेब में रह रहे हैं, रिसेप्टर प्रोटीन में प्रेरित गठन परिवर्तन intracellular रिसेप्टर से जुड़े heterotrimeric जी प्रोटीन के बंधन को बढ़ावा देता है, जीα-सकल घरेलू उत्पाद और जीβγ उपइकाईयों से मिलकर । जी प्रोटीन उपइकाईयों (gα-GTP और gβγ) के पृथक्करण में gα उपइकाई परिणामों पर सकल घरेलू उत्पाद के लिए GTP के बाद के आदान-प्रदान कि, बारी में, आगे बहाव सिग्नलिंग रास्ते2,3शुरू होगा । जब जीα-GTP बन hydrolyzed, जीαके पुनः संघ-सकल घरेलू उत्पाद और जीβγ उपइकाईयों जी प्रोटीन वापस अपने आराम राज्य में बदल जाएगा3,4। g प्रोटीन के विशिष्ट प्रकार मौजूद है (gs, gi/o, gq, g12/13), जो अनुक्रम समानता के आधार पर जीα उपइकाई5के साथ वर्गीकृत कर रहे हैं । इन जी प्रोटीन के सभी रिसेप्टर सक्रियण के लिए जैविक प्रतिक्रिया आबाद कि intracellular संकेतन मार्ग परिभाषित प्रेरित. रिसेप्टर सक्रियण के बाद, GPCR kinases (GRKs) intracellular की GPCRs पूंछ phosphorylate, जिससे β-arrestins के साथ बातचीत को बढ़ावा देने । इस प्रक्रिया में जी प्रोटीन संकेतन, रिसेप्टर संवेदीकरण और internalization6की समाप्ति की ओर जाता है । β-arrestins भी बहु-आणविक परिसरों का हिस्सा है कि संकेत कर रहे हैं जी प्रोटीन के स्वतंत्र कैस्केडिंग ट्रिगर7.

GPCRs चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए सबसे मान्य आणविक लक्ष्यों के बीच में हैं, के रूप में विनियमित GPCR-मध्यस्थता संकेतन, उदाहरण के लिए लाभ के कारण के लिए, रिसेप्टर जीन या रिसेप्टर में उत्परिवर्तनों में परिवर्तन समारोह, कई के एटियलजि के लिए योगदान देता है मानव रोगों8. इसलिए, GPCRs दवा उद्योग8,9,10द्वारा जांच लक्ष्यों की सबसे महत्वपूर्ण वर्गों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं । एक नैदानिक प्रासंगिक GPCR का एक महत्वपूर्ण उदाहरण CXC chemokine रिसेप्टर 4 (CXCR4) है, जो एक एकमात्र प्राकृतिक ligand द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11. मानव इम्यूनो वायरस के लिए एक प्रमुख सह रिसेप्टर के रूप में अपनी स्थापित भूमिका के कारण 1 (एचआईवी-1) प्रवेश और अंतर के क्लस्टर में संक्रमण 4 (CD4) सकारात्मक टी-लिम्फोसाइटों12, CXCR4 पहले एक एंटीवायरल दवा लक्ष्य के रूप में जांच की गई थी । CXCL12-अस्थि मज्जा में CXCR4 बातचीत आगे प्रतिधारण और स्टेम और जनक कोशिकाओं के होमिंग को नियंत्रित करता है13. इसके अलावा, कैंसर जीव विज्ञान के कई पहलुओं में अपनी भागीदारी को देखते हुए (जैसे, ट्यूमर सेल अस्तित्व, मेटास्टेसिस, ट्यूमर से संबंधित angiogenesis)14 और कई अंय मानव रोगों (जैसे, भड़काऊ रोगों)15, CXCR4 दवा खोज के लिए एक होनहार लक्ष्य के रूप में महत्वपूर्ण ब्याज उठाया । AMD3100, एक छोटे अणु है कि विशेष रूप से लक्ष्य CXCR4, शुरू में एक विरोधी एचआईवी दवा उंमीदवार16 के रूप में की खोज की थी और अभी भी सबसे शक्तिशाली CXCR4 विरोधी में से एक है17तारीख को वर्णित है । एक एंटीवायरल दवा के रूप में इसका विकास किया गया था, तथापि,18बंद । वर्तमान में इस अणु एकाधिक मायलोमा और लिंफोमा रोगियों के उपचार के दौरान एक स्टेम सेल संघटन एजेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है18. कई अंय रासायनिक असंबंधित छोटे अणुओं और जैव तर्क है कि अलग शक्ति के साथ CXCR4 समारोह को बाधित19वर्णित किया गया है ।

रिसेप्टर बाइंडिंग तरीकों कि सीधे ब्याज की GPCR के साथ बातचीत यौगिकों (जैसे, छोटे अणुओं) की पहचान की अनुमति औषध विज्ञान में मूल्यवान उपकरण हैं. आदेश में बाध्यकारी अध्ययन करने के लिए, वहां पहले intracellular संकेतन गुण या किसी दिए गए GPCR की कार्यक्षमता के विषय में ज्ञान के लिए कोई ज़रूरत नहीं है । हालांकि यह एक लाभ माना जा सकता है, यह तात्पर्य है कि यौगिकों के लिए जो रिसेप्टर बाइंडिंग का प्रदर्शन किया जा सकता है की जरूरत है और उनके संभावित agonistic या विरोधी गतिविधि का मूल्यांकन द्वारा विशेषता है । इस गतिविधि के अध्ययन के तहत GPCR से संबंधित औषधीय या जैविक परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । उनकी गतिविधि प्रोफ़ाइल पर निर्भर है, रिसेप्टर बाइंडिंग अणुओं तो संभवतः पूर्व में जांच के लिए उपंयास का नेतृत्व यौगिकों बन विकसित नैदानिक और नैदानिक अध्ययन । अणुओं है कि विशेष रूप से उच्च संबंध के साथ एक रिसेप्टर को बांध भी पाड़ों के रूप में सेवा कर सकते हैं चिकित्सकीय या नैदानिक उपकरण उत्पन्न करने के लिए, उदाहरण के लिए उन्हें radiolabeling द्वारा vivo इमेजिंग में ट्यूमर कोशिकाओं के20, या क्षमता के रूप में इनवेसिव के लिए 21चिकित्सकीय के लक्षित वितरण के लिए वाहन । CXCR4 के मामले में, ट्यूमर कोशिकाओं के vivo में इमेजिंग पहले से ही माउस मॉडल का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है जिसमें लेबल CXCR4-लक्ष्यीकरण अणुओं मानव कैंसर xenografts के दृश्य की अनुमति दी20,22,23 .

इस रिपोर्ट में, हम एक प्रतियोगिता बाध्यकारी परख कि छोटे अणुओं और जो सीधे एगोनिस्ट (CXCL12) CXCR4 के लिए बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप की पहचान में सक्षम बनाता है के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । परख के बुनियादी सिद्धांत फ्लोरोसेंट लेबल ligand (CXCL12AF647की एक निश्चित राशि के बीच प्रतियोगिता है, सामग्री और reagents की तालिकादेखें) और unलेबल्ड यौगिकों रिसेप्टर प्रोटीन17के लिए बाध्यकारी, 24. लेबल ligand से विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेत एकल CXCR4 व्यक्त कोशिकाओं को बाध्य तो प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया है । इस फ्लोरोसेंट संकेत कम हो जाएगा जब unलेबल्ड छोटे अणुओं CXCL12AF647 और CXCR4 के बीच बातचीत को बाधित । परख गैर-हेरफेर जीवित कोशिकाओं है कि endogenously एक्सप्रेस CXCR4 (यानी, Jurkat कोशिकाओं का उपयोग करता है) । इसलिए, कोई सेल झिल्ली की तैयारी की आवश्यकता है, जो परख सुविधाजनक बनाता है, तेजी से और वृद्धि का प्रवाह के साथ संगत । के बाद से एक फ्लोरोसेंट लेबल ligand प्रयोग किया जाता है, रेडियोधर्मिता से बचा जाता है.

क्योंकि CXCL12 CXCR4 के लिए प्राकृतिक एगोनिस्ट है, छोटे अणु यौगिकों कि CXCL12AF647 परख में बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप की संभावना है orthosteric रिसेप्टर बाइंडिंग साइट के साथ बातचीत (यानी, बंधन प्राकृतिक द्वारा कब्जा साइट एगोनिस्ट) । अणु है कि रिसेप्टर बाइंडिंग orthosteric बंधन साइट से अलग स्थलाकृतिक साइटों के साथ बातचीत नहीं रह पाता है, अगर वे CXCL12 के बंधन को प्रभावित नहीं करते हैं । उदाहरण के लिए, सकारात्मक और नकारात्मक allosteric मॉडुलन, allosteric बंधन साइटों पर अभिनय अणुओं को लक्षित GPCR की एक महत्वपूर्ण और उभरती हुई श्रेणी25, संभवतः इस परख के साथ नहीं उठाया जाएगा । इसके अलावा, चाहे यौगिकों रिसेप्टर विरोधी के रूप में या एगोनिस्ट प्राप्त नहीं किया जा सकता के रूप में इस बाध्यकारी परख समारोह के साथ की पहचान की । अतिरिक्त औषधीय या कार्यात्मक रिसेप्टर संबंधित परख में पहचान यौगिकों की जांच इस प्रकार की आवश्यकता होगी । इन परख (का एक संयोजन) सेलुलर प्रतिदीप्ति शामिल हो सकते है-या luminescence-दूसरा संदेशवाहक (जैसे, Ca2 +, चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर)), phenotypic या जैविक परख और β-arrestin का पता लगाने के लिए परख आधारित भर्ती परख, जो की पसंद अध्ययन के तहत GPCR के विशिष्ट संकेतन संपत्तियों पर निर्भर करता है । इसलिए, प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी परख वर्णित के साथ साथ मुख्य रूप से एक प्रारंभिक जांच परख कि जरूरतों के लिए अंय कोशिका के साथ पूरित किया जा करने के लिए परख आधारित एक में रिसेप्टर बाइंडिंग शक्ति के साथ यौगिकों की गहराई लक्षण वर्णन सक्षम करने के लिए कार्य करता है ।

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Protocol

1. सेल संस्कृति का रखरखाव

नोट: सभी कदम 1 और 2 के तहत वर्णित एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है ।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह में T75 संस्कृति कुप्पी में कोशिकाओं को विकसित एक humidified मशीन में2 ।
    नोट: इस परख में, Jurkat कोशिकाओं (यानी, मानव ल्यूकेमिया से प्रभावित टी लिम्फोसाइट कोशिकाओं है कि endogenously एक्सप्रेसCXCR417) का उपयोग किया जाता है । सेल की सतह पर CXCR4 की अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry के माध्यम से सेल संवर्धन भर में मूल्यांकन किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के दायरे के भीतर नहीं है, हालांकि, सेल सतह पर रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण करने के लिए प्रवाह cytometry प्रक्रिया और रिएजेंट का वर्णन है, लेकिन पहले से17बताया गया है ।
  2. Jurkat कोशिकाओं निलंबन में बढ़ने जब तक वे 80-85% प्रवाह तक पहुंचने दें । एक उपंयास कुप्पी करने के लिए कोशिकाओं passaging से पहले, सभी एजेंट कमरे के तापमान (आरटी) तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. ताजा पूरा विकास मध्यम के 20 मिलीलीटर जोड़ें (RPMI-१६४० मध्यम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी glutamine) एक उपंयास T75 संस्कृति कुप्पी के लिए ।
  4. Jurkat सेल निलंबन के 5 मिलीलीटर मूल T75 कुप्पी (सेल निलंबन के 25 मिलीलीटर से युक्त) से उपंयास T75 संस्कृति कुप्पी के लिए जोड़ें । 37 डिग्री सेल्सियस और 5% एक humidified मशीन में सह2 पर मशीन ।

2. CXCL12, परख बफर की तैयारी, और प्रतियोगिता बाध्यकारी परख के लिए Jurkat कोशिकाओं ।

  1. CXCL12AF647 (20 µ g/mL का स्टॉक समाधान तैयार करें; सामग्री और रिएजेंट की तालिकादेखें) lyophilized रिएजेंट भंग करके (में संग्रहित-80 ° c, अंधेरे में) ultrapure पानी में 0.01% के साथ पूरक (volume/Polysorbate 20 की मात्रा) । इस स्टॉक समाधान से स्टोर एकल उपयोग aliquots-80 ° c, प्रकाश से सुरक्षित ।
  2. 40 मिलीलीटर HEPES (1 एम, 20 मिमी अंतिम एकाग्रता) जोड़कर परख बफर तैयार करने के लिए 200 मिलीलीटर है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS, 10x, phenol लाल और बिना सोडियम बिकारबोनिट, 1x अंतिम एकाग्रता) । 2 एल के अंतिम खंड को प्राप्त करने के लिए ultrapure पानी जोड़ें L 4 g (0.2% वजन/मात्रा) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), और चुंबकीय सरगर्मी के माध्यम से BSA भंग. अंत में, 7.4 करने के लिए पीएच समायोजित (इस के लिए NaOH का उपयोग करें) और 0.2 µm pores के माध्यम से समाधान फ़िल्टर ( सामग्री और रिएजेंट की तालिकादेखें) एक निर्वात कई गुना का उपयोग कर ।
    नोट: यह परख बफर प्रोटोकॉल के सभी आगे कदम में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  3. संख्या और कोशिकाओं की व्यवहार्यता गिनती । इस के लिए, सेल निलंबन का एक नमूना ले लो और यह फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में पतला ।
    नोट: हम नियमित रूप से एक स्वचालित सेल व्यवहार्यता विश्लेषक का उपयोग ( सामग्री और रिएजेंट की मेजदेखें) अलग सांद्रता पर सेल निलंबन की गिनती में सक्षम । सेल की गिनती के लिए, 1.5 मिलीलीटर पंजाबियों में सेल सस्पेंशन के 0.5 मिलीलीटर पतला (अन्य कमजोर पड़ने, जैसे, 1.9 मिलीलीटर पंजाब में 0.1 मिलीलीटर, यह भी संभव है) । इस विधि का उपयोग, जो trypan नीले रंग अपवर्जन पद्धति पर आधारित है, पहले26बताया गया है । कई अंय उपकरणों की गिनती के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है सेल संख्या और व्यवहार्यता कि समान रूप से अच्छी तरह से काम करना चाहिए ।
  4. कोशिकाओं की वांछित संख्या लीजिए (यानी, ~ 24 x 106 कोशिकाओं को एक पूरा 96 के साथ परख चलाने के लिए अच्छी तरह से प्लेट) एक बाँझ 50 मिलीलीटर में ट्यूब के द्वारा केंद्रापसारक ( सामग्री और रिएजेंट की मेज के प्रकार के लिए उपयोग किया जाता है) 400 पर 5 मिनट के लिए एक्स जी भ.
  5. धीरे से सेल गोली परेशान बिना supernatant डालना । ताजा परख बफर जोड़ें (उदा, 20 मिलीलीटर) और धीरे से कोशिकाओं reसस्पेंड ऊपर और नीचे pipetting ।
  6. 5 मिनट के लिए आरटी में 400 x जी पर फिर से कोशिकाओं को केंद्रापसारक ।
  7. बंद supernatant फिर डालो और ताजा परख बफर में सेल गोली reसस्पेंड 5 x 106 कोशिकाओं के घनत्व प्राप्त करने के लिए/

3. प्रतियोगिता बाध्यकारी परख

नोट: वास्तविक प्रतियोगिता बाध्यकारी परख आरटी पर किया जाता है और गैर बाँझ शर्तों के तहत किया जा सकता है ।

  1. परख बफर में जांच के तहत यौगिकों पतला (2.2 देखें) वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । या तो प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए यौगिक की एक निश्चित एकाग्रता तैयार (उदा., 10 µ एम अंतिम एकाग्रता) या, वैकल्पिक रूप से, यौगिकों के अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए सांद्रता के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला (जैसे, एक 1/ 5 कमजोर पड़ने श्रृंखला 1 µ मीटर, अंतिम एकाग्रता पर शुरू) । ध्यान रखें कि यौगिक समाधान अंततः हो जाएगा 2x परख में पतला; इसलिए, एक 2x केंद्रित समाधान तैयार करते हैं ।
  2. एक स्पष्ट 96-अच्छी तरह से गोल नीचे थाली में यौगिक समाधान (2x केंद्रित) के 100 µ एल बांटना ( सामग्री और रिएजेंट की मेजदेखें) के अनुसार एक पूर्व परिभाषित प्रयोगात्मक (जैसे, चित्रा 1C) बाहर करना ।
    नोट: इस स्तर पर, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण नमूने परख में शामिल हैं । नकारात्मक नियंत्रण नमूनामें, 100 µ के एल परख बफर के बजाय 96-खैर प्लेट के कुओं को यौगिक के लिए जोड़ा जाता है । सकारात्मक नियंत्रण नमूनेके लिए, परख बफर भी इस चरण के दौरान जोड़ा जाता है । यह भी एक ठेठ प्रयोगात्मक लेआउट जिसमें कई यौगिकों की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला का परीक्षण किया है के लिए चित्रा 1C देखें ।
  3. सेल निलंबन के 50 µ एल जोड़ें (2.7; 0.25 x 106 कोशिकाओं) एक रिएजेंट जलाशय से 96-अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर प्लेट में । अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए थाली मशीन ।
  4. फ्लोरोसेंट लेबल CXCL12 के 50 µ एल जोड़ें (यानी, परख बफर में CXCL12AF647 के 100 एनजी/एमएल, 4x केंद्रित, 25 एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता) 96 के कुओं के लिए एक ही एजेंट जलाशय से अच्छी तरह से प्लेट । अंधेरे में आर टी में 30 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: ऋणात्मक नियंत्रण नमूनोंके लिए, इसके बजाय परख बफ़र जोड़ें. इसलिए, फ्लोरोसेंट नकारात्मक नियंत्रण के नमूनों में पता चला संकेत फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत (चित्र 1a) के अनुरूप होगा । धनात्मक नियंत्रण नमूनोंके लिए, CXCL12AF647के 50 µ l/ यौगिकों के साथ पूर्व-मशीन द्वारा कोई संभावित संकोच (चित्र 1a) शामिल किया गया था के बाद से पाया सकारात्मक नियंत्रण के नमूने, अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति संकेत उपज होगा.
  5. 400 x जी में 5 मिनट के लिए आर टी पर 96 अच्छी तरह से थाली केंद्रापसारक । प्लेट पर flipping द्वारा छर्रों कोशिकाओं से supernatant निकालें । एक ऊतक पर प्लेट सूखी ।
  6. जोड़ने के 200 µ एल ताजा परख बफर के एक रिएजेंट जलाशय से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर कुओं के लिए । तुरंत आगे बढ़ें ।
  7. 5 मिनट के लिए आर टी में 400 x g पर फिर से थाली केंद्रापसारक प्लेट पर flipping द्वारा supernatant निकालें और फिर यह ऊतक पर सूखी ।
  8. धीरे 1% के 200 µ एल में सेल गोली reसस्पेंड पंजाब में भंग paraformaldehyde । यह चरण कक्षों को ठीक करेगा ।
  9. प्रतिदीप्ति के प्रवाह cytometry द्वारा ठहराव के साथ तुरंत प्रोटोकॉल जारी रखें ।

4. प्रवाह cytometry द्वारा नमूनों का विश्लेषण

CXCL12AF647 दाग और निर्धारण कोशिकाओं अब प्रवाह cytometry का उपयोग कर विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार हैं । प्रवाह cytometers के कई प्रकार के इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन वे सही लेजर (यानी, एक लाल लेजर, उत्तेजना रेंज ~ 630 एनएम) उत्तेजना और fluorophore डिटेक्शन के लिए उपयुक्त फिल्टर (उत्सर्जन फ़िल्टर ~ 660 एनएम) के लिए के साथ सुसज्जित करने की आवश्यकता है । वे एक 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में नमूनों को संभालने में सक्षम होने की जरूरत है । उपयुक्त प्रवाह cytometry उपकरणों के उदाहरण सामग्री और रिएजेंट की तालिकामें दिए गए हैं ।

  1. डिवाइस को स्टार्ट करें और इसी सॉफ्टवेयर को खोलें ( सामग्री और रिएजेंट की तालिकादेखें) ।
  2. एक डॉट दाग प्रारूप में visualized किया जा करने के लिए निम्न सेलुलर पैरामीटर का चयन करें: फॉरवर्ड स्कैटर (FSC), साइड स्कैटर (एसएससी) और fluorophore (CXCL12AF647) का पता लगाने चैनल.
    नोट: FSC पैरामीटर के साथ, कोशिकाओं को उनके आकार के आधार पर भेदभाव कर रहे हैं, के बाद से पता चला प्रकाश अवशोषण कोशिका के व्यास के लिए आनुपातिक है. एसएससी पैरामीटर, एक 90 ° कोण पर प्रकाश बिखरने मापने, कोशिकाओं की दानेदार के बारे में जानकारी प्रदान करता है ।
  3. एक नमूना चुनें (उदाहरण के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना) FSC और एसएससी मापदंडों के आधार पर एक परिभाषित समरूप सेल जनसंख्या के गेटिंग प्रदर्शन करने के लिए.
    1. का चयन करें स्वत: इंजेक्शन के ~ 100 µ एल के इस नकारात्मक नियंत्रण नमूना से निर्धारण कोशिकाओं के प्रवाह cytometer में. इंजेक्शन से पहले "मिश्रण" विकल्प का चयन करें और 1.5 µ एल के एक नमूना प्रवाह दर का उपयोग करें/
    2. "डेटा प्राप्त." का चयन करके इस नमूने को चलाएं इस सैंपल के लिए FSC और एसएससी के पैरामीटर अब स्क्रीन पर दिखाई देंगे ।
    3. सॉफ़्टवेयर के गेटिंग टूल का चयन करें । FSC और एसएससी डॉट दाग दृश्य के आधार पर, पूर्व गेटिंग द्वारा एक समरूप और व्यवहार्य कोशिका आबादी को परिभाषित । ऐसा करने के लिए, (सॉफ़्टवेयर के गेटिंग उपकरण का उपयोग करके) एक बहुभुज बनाएं जिसमें इन दो आयामों के आधार पर homogenously वितरित एकल कक्ष ("ईवेंट्स") शामिल हों ।
      नोट: गेटिंग प्रक्रिया के लिए एक समरूप और व्यवहार्य कोशिका जनसंख्या है कि आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा परिभाषित करना है । गेटिंग धारणा है कि व्यवहार्य कोशिकाओं के बहुमत एक समरूप सेल FSC और एसएससी मापदंडों के आधार पर आबादी के रूप में होगा पर निर्भर करता है । इस कदम के प्रदर्शन से, सेलुलर मलबे, मृत कोशिकाओं, और सेल समुच्चय काफी हद तक आगे विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है । गेटिंग प्रक्रिया का एक उदाहरण चित्र 1bमें दिया गया है ।
  4. प्रति नमूना 20,000 "घटनाओं" (यानी, एकल कोशिकाओं) का विश्लेषण करने के लिए चुनें ।
    नोट: इसका मतलब यह है कि प्रत्येक नमूने के लिए, 20,000 कोशिकाओं है कि पूर्व निर्धारित फाटक के भीतर गिर अंततः विश्लेषण किया जाएगा । प्रत्येक नमूने के लिए डेटा प्राप्ति तब तक जारी रहेगी जब तक इस ईवेंट का विश्लेषण नहीं किया जाता ।
  5. चलाएँ ("रिकॉर्ड डेटा" का चयन करें) प्रारंभ करें । प्रवाह cytometry डिवाइस अब प्रत्येक नमूने के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) रिकॉर्डिंग द्वारा सभी नमूनों एक-एक करके विश्लेषण करेगा । इस MFI मतलब फ्लोरोसेंट संकेत करने के लिए संगत 20,000 कोशिकाओं है कि पूर्व के भीतर गिर फाटक निर्धारित करने के लिए इसी ।

5. डेटा विश्लेषण

सभी आगे की गणना करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए प्राप्त MFI का उपयोग करें. प्रवाह cytometry डेटा का विश्लेषण कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल द्वारा किया जा सकता है ( सामग्री और रिएजेंट की तालिकादेखें) ।

  1. के लिए फ्लोरोसेंट बाध्यकारी संकेत का प्रतिशत निषेध निर्धारित करने के लिए, यौगिक पूर्व की मशीन के परिणामस्वरूप, निंनलिखित फार्मूला लागू:
    Equation 1
    जहां:
    mfiExp = प्रयोगात्मक के mfi (= यौगिक-इलाज) नमूना
    mfiपीसी = सकारात्मक नियंत्रण के mfi
    mfiनेकां = नकारात्मक नियंत्रण के mfi
  2. एक यौगिक के आईसी50 मूल्य निर्धारित करने के लिए (यानी, यौगिक की एकाग्रता है कि 50% द्वारा फ्लोरोसेंट बाध्यकारी संकेत को कम कर सकते हैं, निम्न सूत्र लागू करें:
    Equation 2
    जहां:
    लॉग-2. = यौगिक की एकाग्रता का प्रवेश करें कि पीसी और नेकां के MFI मूल्य के बीच अंतर के कम से 50% संकोच में परिणाम
    लॉग1 = यौगिक की एकाग्रता का प्रवेश करें कि पीसी और नेकां के MFI मूल्य के बीच अंतर के 50% से अधिक संकोच में परिणाम
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अत्यधिक सक्रिय यौगिकों के मामले में, परिमाण के कई लॉग को कवर एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र यौगिक के प्रत्येक परीक्षण एकाग्रता के लिए इसी MFI के आधार पर उत्पन्न किया जा सकता है. गैर रेखीय प्रतिगमन वक्र उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फिटिंग लागू करके ( सामग्री और रिएजेंट की तालिकादेखें), आईसी50 मूल्यों तो उत्पंन घटता से मुजे किया जा सकता है । इस विश्लेषण approach का एक उदाहरण आरेख 3में दिखाया गया है ।

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Representative Results

बाइंडिंग परख के सामांय कार्यप्रवाह चित्र 1aमें प्रस्तुत किया है । एक मानक प्रयोग (यानी, नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण, और प्रयोगात्मक नमूना) में विभिन्न नमूना प्रकार के लिए प्राप्त प्रवाह cytometry डेटा के प्रकार का एक उदाहरण चित्रा 1bमें दर्शाया गया है, और प्रदर्शन करने के लिए एक संभव प्लेट लेआउट 96-वेल प्लेट फार्मेट में परख चित्रा 1Cमें दी गई है । Jurkat कोशिकाओं है, जो endogenously chemokine रिसेप्टर CXCR4 (यानी, इस परख में ब्याज की GPCR) व्यक्त की मशीन, फ्लोरोसेंट लेबल CXCL12 की मात्रा में वृद्धि के साथ (यानी, CXCL12AF647) में वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति का स्तर (चित्रा 2), CXCR4 करने के लिए ligand बंधन के स्तर में वृद्धि को दर्शाती है । CXCL12AF647 बाध्यकारी, एक अच्छी तरह से स्थापित और रिसेप्टर-विशिष्ट CXCR4 विरोधी (छोटे अणु AMD3100) की रिसेप्टर विशिष्टता का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । Jurkat कोशिकाओं पहले पूर्व थे AMD3100 के ०.०६४ एनजी/एमएल से 1,000 एनजी/एमएल, 25 एनजी/एमएल CXCL12AF647 (यानी, लेबल chemokine की निश्चित राशि के साथ एक मशीन के बाद से लेकर 1/5 कमजोर पड़ने की श्रृंखला के साथ मशीन नियमित रूप से परख में इस्तेमाल किया) । उसके बाद, Jurkat कक्षों आगे प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किए गए थे । फ्लोरोसेंट संकेत (मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता, MFI) पूर्व के लिए CXCL12AF647 की निश्चित राशि के अलावा-Jurkat कोशिकाओं गर्मी, सभी नमूनों के लिए प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया गया था । इस फ्लोरोसेंट संकेत लगभग पूरी तरह से मामला Jurkat कोशिकाओं में बाधित हो सकता है पूर्व AMD3100 के उच्चतम एकाग्रता के साथ इलाज किया गया (1,000 एनजी/ इस हालत के तहत, प्रतिदीप्ति के बाधित स्तर Jurkat कोशिकाओं के लिए autofluorescence के स्तर को इसी पृष्ठभूमि स्तर से थोड़ा ऊपर था । अंत में, लागू करने के 25 एनजी/एमएल (अंतिम एकाग्रता) CXCL12 केAF647 में बाध्यकारी परख एक बड़ी फ्लोरोसेंट संकेत विंडो उत्पंन (जब नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में) के साथ एक ंयूनतम अवशिष्ट स्तर के गैर विशिष्ट रिसेप्टर बाइंडिंग ( चित्र 3ए) ।

यह बाध्यकारी परख मुख्य रूप से एक निर्धारित एकाग्रता पर unलेबल्ड यौगिकों के पैनलों में ligand बाध्यकारी बाधित यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए, या सक्रिय यौगिकों के खुराक पर निर्भर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । उत्तरार्द्ध मामले में, लक्ष्य आईसी50 मूल्यों (यानी, यौगिक की एकाग्रता है कि 50%), जो यौगिकों की बाध्यकारी शक्ति को प्रतिबिंबित द्वारा बाध्यकारी संकेत को रोकता है प्राप्त करने के लिए है । चित्रा 3 दिखाता है कैसे इस बाध्यकारी परख के साथ प्राप्त प्रवाह cytometry डेटा निरोधात्मक शक्ति (आईसी50के संदर्भ में) का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है छोटे अणुओं के CXCR4 को CXCL12 के बंधन में खलल न डालें । खुराक पर आधारित CXCL12 केAF647 बाइंडिंग AMD3100 द्वारा बाध्यकारी, आईसी50 मूल्य यहां गैर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण लागू करने से निर्धारित किया गया था । इस उदाहरण में, AMD3100 के लिए परिकलित आईसी50 मान १८.१२ एनजी/एमएल से मेल खाती है । क्योंकि स्क्रीनिंग अभियानों में, बेतरतीब ढंग से चयनित यौगिकों के बहुमत CXCR4+ Jurkat कोशिकाओं के लिए CXCL12AF647 के बंधन को बाधित नहीं की उम्मीद कर रहे हैं, एक निष्क्रिय यौगिक का एक उदाहरण भी इस अध्ययन में शामिल किया गया था. यहां, छोटे अणु maraviroc, जो प्रतिलिपि chemokine रिसेप्टर 5 (CCR5) के लिए एक विशिष्ट प्रतिपक्ष के रूप में अभिनय से शक्तिशाली विरोधी एचआईवी-1 गतिविधि प्रदर्शित27, बाध्यकारी परख में परीक्षण किया गया था । अधिक से अधिक फ्लोरोसेंट बाध्यकारी संकेत का कोई निषेध पूर्व के बाद पता चला था, maravoric के साथ Jurkat कोशिकाओं गर्मी, यहां तक कि उच्चतम एकाग्रता परीक्षण पर (100 एनजी/ चित्र बी) । एक ही प्रयोग में, AMD11070 की एक धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला, AMD3100 से संबंधित एक और छोटा सा अणु, लेकिन सुधार pharmacokinetic गुण के साथ28, शामिल किया गया था । maraviroc के विपरीत, ०.००६४ से 100 एनजी/एमएल से लेकर AMD11070 से 1/5 कमजोर पड़ने श्रृंखला स्पष्ट रूप से और खुराक-निर्भर CXCL12AF647 बाध्यकारी (चित्र बी) बाधित ।

Figure 1
चित्र 1: प्राप्त डेटा के प्रकार के वर्कफ़्लो और चित्रण का ओवरव्यू. (A) । प्रोटोकॉल के मुख्य चरण नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण नमूने, और यौगिक उपचारित नमूनों के लिए schematized हैं । यौगिक पूर्व-मशीन के बिना नमूनों और फ्लोरोसेंट लेबल chemokine (CXCL12AF647) के अलावा बिना पृष्ठभूमि (ऑटो) प्रतिदीप्ति (नकारात्मक नियंत्रण नमूने) निर्धारित करने के लिए शामिल किए गए हैं । यौगिक पूर्व-मशीन के बिना नमूने, लेकिन CXCL12AF647 की एक निश्चित राशि के अलावा के लिए परख (सकारात्मक नियंत्रण नमूनों) में अधिक से अधिक बाध्यकारी संकेत का निर्धारण किया जाता है । यौगिक उपचारित नमूनों में, कक्षों को CXCL12AF647की एक निश्चित मात्रा के अतिरिक्त पहले यौगिक के साथ प्री-मशीनेड किया जाता है । (ख). मतलब फ्लोरोसेंट बाध्यकारी संकेत Jurkat कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है । सभी घटनाओं (यानी, Jurkat कोशिकाओं) से विश्लेषण (बाएं पैनल) केवल कोशिकाओं के एक gated उपजनसंख्या से फ्लोरोसेंट संकेत आगे विश्लेषण (मध्य पैनल) के लिए प्रयोग किया जाता है । छोटे अणुओं के साथ कोशिकाओं की पूर्व-मशीन (जैसे, AMD3100) फ्लोरोसेंट लेबल रिसेप्टर ligand के बंधन को रोकता है और यह अधिक से अधिक बाध्यकारी संकेत (सही पैनल, एक हिस्टोग्राम प्रतिनिधित्व में दिखाया गया है) को कम करेगा । (C). एक संभव प्लेट लेआउट जब एक 96-अच्छी तरह प्लेट प्रारूप में प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी परख प्रदर्शन । इस मामले में, छह विभिंन यौगिकों (सीपीडी 1-6) एक 1/5 धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला में परीक्षण कर रहे है (डुप्लिकेट में) 1,000 एनएम से ०.३२ एनएम के नीचे से लेकर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: Jurkat कक्षों में CXCL12AF647 का बाइंडिंग । Jurkat कोशिकाओं CXCL12AF647की बढ़ती मात्रा के साथ, पूर्व के अभाव में मशीन थे, यौगिक के साथ मशीन । मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI, मनमाने ढंग से प्रकाश इकाइयों में व्यक्त) ± एसडी (n = 2) दिखाया गया है । वक्र फिटिंग रेखीय प्रतिगमन का उपयोग कर एक एक साइट कुल बाध्यकारी मॉडल समीकरण के बाद का उपयोग किया गया

Equation 3

Bअधिकतम (अधिकतम विशिष्ट बाइंडिंग) = १८,३४५ के साथ; Kd = ९२.८ एनजी/ एनएस (विशिष्ट बाइंडिंग की ढलान) = २.१३९; और पृष्ठभूमि = ३३२.६ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सक्रिय और निष्क्रिय यौगिकों द्वारा CXCL12AF647 के बंधन के निषेध । (एक) खुराक-AMD3100 के अतिरिक्त सांद्रता के साथ पूर्व-मशीनिंग कोशिकाओं द्वारा CXCL12AF647 बाध्यकारी के आश्रित संकोच, के अलावा 25 एनजी/एमएल CXCL12AF647। ध्यान दें कि अधिक से अधिक बाधित मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI; मनमाने ढंग से प्रकाश इकाइयों में व्यक्त) अभी भी पृष्ठभूमि (ऑटो) प्रतिदीप्ति Jurkat कोशिकाओं के लिए प्राप्त ऊपर थोड़ा है (± एसडी (एन = 3)) । वक्र फिटिंग गैर रेखीय प्रतिगमन का उपयोग कर एक चर ढलान (चार मापदंडों) के अनुसार किया गया

Equation 4

यहां HillSlope १.३१३ है और परिकलित आईसी50 १८.१२ एनजी/ (ख). खुराक-AMD11070 के आश्रित प्रभाव और maraviroc पर CXCL12AF647 बंधन के लिए CXCR4+ Jurkat कोशिकाओं (MFI ± एसडी (एन = 3)) । AMD11070 प्रतिक्रिया के लिए वक्र फिटिंग इसी तरह १.४५८ की एक HillSlope के साथ प्रदर्शन किया था और एक परिकलित आईसी50 मूल्य के ०.९०५२ एनजी/ maraviroc प्रतिक्रिया के लिए, कोई फिटिंग इस परिसर की गतिविधि की कमी को देखते हुए प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

बाध्यकारी परख के अंय प्रकार (यानी, संतृप्ति बाध्यकारी और काइनेटिक बाध्यकारी प्रयोगों की तुलना में), प्रतियोगिता बाध्यकारी परख सबसे अच्छा स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए उपयुक्त हैं । दरअसल, वे unलेबलेड यौगिकों के बड़े बैचों के मूल्यांकन की अनुमति, उदाहरण के छोटे अणुओं के लिए, एक लेबल रिसेप्टर ligand की एक निश्चित राशि के बंधन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए अपनी क्षमता स्कोरिंग द्वारा. यौगिकों कि लेबल ligand से अंय रिसेप्टर साइटों को बांध परख में पता चला रह सकता है । हालांकि प्रतियोगिता बाध्यकारी प्रयोग यहां वर्णित विशेष रूप से chemokine रिसेप्टर CXCR4 पर केंद्रित है, यह संभावना अंय GPCRs के लिए प्रतियोगिता बाध्यकारी परख के डिजाइन के लिए एक खाका के रूप में अच्छी तरह से सेवा कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, CXC chemokine रिसेप्टर 7 (CXCR7) CXCL12 के लिए एक वैकल्पिक रिसेप्टर के रूप में वर्णित किया गया था, उच्च अपनत्व के साथ CXCL12 बंधन में सक्षम29,30. इसलिए, एक ही लेबल chemokine (CXCL12AF647) के रूप में वर्णित CXCR4 प्रतियोगिता बाध्यकारी परख के लिए इस्तेमाल के लिए CXCR7 बाध्यकारी प्रयोग स्थापित किया जा सकता है । क्योंकि CXCR4 और CXCR7 शेयर CXCL12 एक आम ligand के रूप में, यह सेलुलर मॉडल जिसमें केवल एक दोनों रिसेप्टर्स की कोशिका सतह पर व्यक्त की है के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण होगा, क्रम में विशिष्ट रिसेप्टर बाइंडिंग का मूल्यांकन करने के लिए. हमारे पिछले काम का प्रदर्शन किया है कि Jurkat कोशिकाओं CXCR7 के अंतर्जात अभिव्यक्ति नहीं दिखा17। इस प्रकार, परख में CXCR4 के लिए यहां वर्णित है, CXCR7 के लिए बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप से इंकार किया है ।

कई प्रतियोगिता बाध्यकारी परख की मुख्य विशेषताएं यह एक तेज, प्रारंभिक, स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए छोटे CXCR4 के लिए बाध्यकारी एगोनिस्ट के साथ हस्तक्षेप अणुओं की पहचान करने की अनुमति । है परख प्रमुख लाभ में से एक पूरे का उपयोग करते हैं, रहने वाले ब्याज की रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं । यह श्रम गहन कोशिका झिल्ली की तैयारी के लिए की जरूरत है छोड़ता है । साथ ही, Jurkat कोशिकाओं के साथ बैकग्राउंड (auto) प्रतिदीप्ति का निम्न स्तर का पता लगाना फायदेमंद होता है । एक साथ बड़े संकेत फ्लोरोसेंट लेबल जांच की निर्धारित राशि के अलावा पर प्राप्त खिड़की के साथ, यह पृष्ठभूमि अनुपात करने के लिए एक अनुकूल संकेत करने के लिए योगदान देता है । यह unलेबल्ड यौगिकों द्वारा संभावित बाध्यकारी निषेध का पता लगाने की सुविधा । मामले में इस बाध्यकारी परख अंय CXCR4 व्यक्त कोशिकाओं के साथ किया जाता है, हम हमेशा इन मापदंडों (पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, संकेत विंडो) अग्रिम के रूप में वे सेल लाइन से सेल लाइन से अलग हो सकता है का मूल्यांकन करने की सलाह देते हैं । तथ्य यह है कि Jurkat कोशिकाओं को लंबे समय पर एक सुसंगत स्तर पर CXCR4 एक्सप्रेस endogenously, यह एक सुविधाजनक सेलुलर मॉडल बनाता है । रिसेप्टर अभिव्यक्ति के एक ही अनुरूप स्तर छुरा transfected सेल क्लोन के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इसके विपरीत, हम क्षणिक transfected कोशिकाओं के उपयोग की सिफारिश नहीं है क्योंकि यह संभावना प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक बहुत व्यापक वितरण में परिणाम होगा, परख में कम उत्तरदायी कोशिकाओं और प्रयोगों के बीच कम निरंतरता. के बाद से कोई CXCR4 नकारात्मक Jurkat कोशिकाओं मौजूद हैं, इन कोशिकाओं के रिसेप्टर बाध्यकारी की विशिष्टता के साथ पूर्व-मशीन द्वारा प्रदर्शन किया गया था अच्छी तरह से स्थापित विशिष्ट रिसेप्टर विरोधी (AMD3100 और AMD11070). इन विरोधी लेबल ligand से संरचनात्मक रूप से अलग हैं । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि, प्रतिस्पर्धी के रूप में ligand के अनलेबल्ड वैरिएंट का उपयोग करते समय, दोनों लेबल किए गए और अनलेबल्ड ligand भी कक्ष की सतह पर संभावित रूप से मौजूद गैर-विशिष्ट बाइंडिंग साइटों के लिए बाइंडिंग के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं ।

सेलुलर मेजबान के अलावा, कई परख के अंय पहलुओं यहां वर्णित करने के लिए अंय GPCRs के लिए एक समान परख का निर्माण शुरू करने से पहले खाते में ले लिया जाना चाहिए । फ्लोरोसेंट लेबल जांच कि लक्ष्य GPCRs रेडियोधर्मी के लिए विकल्प के रूप में विकसित किया गया है जांच, लेकिन वर्तमान में केवल GPCRs की एक सीमित संख्या के लिए उपलब्ध है और वे अपेक्षाकृत महंगे हैं । इसके अलावा, fluorophores के साथ प्राकृतिक रिसेप्टर लाइगैंडों के संशोधन के रूप में unलेबल्ड जनक अणु की तुलना में बाध्यकारी गुणों को बदल सकता है, विशेष रूप से बहुत छोटे लाइगैंडों के मामले में (जैसे, अमीन) या छोटे पेप्टाइड्स31, 32. उदाहरण के लिए, छोटे लाइगैंडों के मामले में, एक linker आम तौर पर है रिसेप्टर orthosteric बाध्यकारी साइट के लिए उपयोग की अनुमति देने के लिए fluorophore से pharmacophore अलग करने के लिए आवश्यक है31. इसके अलावा, रिसेप्टर की स्थिरता-फ्लोरोसेंट जांच परिसर को ध्यान में रखा जाना चाहिए । हमारे अनुभव में, 90 के बाद-120 मिनट (यानी, समय के लिए दो लगातार 96-अच्छी तरह से प्लेटें चलाने की जरूरत), सकारात्मक नियंत्रण कुओं आमतौर पर के लिए मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता ~ 5% द्वारा सभी सकारात्मक पर नियंत्रण कुओं के औसत की तुलना में कम है प्लेट, 5 और 10% के बीच सामयिक outliers के साथ ।

इसके अलावा, लेबल ligand की आंतरिक गतिविधि महत्व का है । जबकि रिसेप्टर विरोधी रिसेप्टर पर कोई आंतरिक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, एगोनिस्ट की संभावना रिसेप्टर सक्रियण प्रेरित और, परिणाम में, रिसेप्टर internalization. यह ligand-रिसेप्टर इंटरेक्शन33के प्रतिवर्ती प्रकृति समझौता । रिसेप्टर internalization के साथ संभव मुद्दों को कम करने के लिए, लेबल ligand के साथ गर्मी (एक लेबल एगोनिस्ट के मामले में) समय में सीमित होने की जरूरत है और तरजीही कमरे के तापमान या कम पर किया जाना चाहिए. तथ्य यह है कि प्रक्रिया कमरे के तापमान पर किया जाता है परख भी सुविधाजनक और प्लेट प्रारूप में स्क्रीनिंग के प्रयासों के साथ संगत बनाता है । अंत में, नमूने प्रति कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या (जैसे, एक 96 अच्छी प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 250,000) परख में इस्तेमाल किया जाना चाहिए अंततः कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या (20,000 कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए, "एकल घटनाओं," पूरे सेल जनसंख्या के गेटिंग के आधार पर; देखें चित्र 1) त्यात प्रवाह cytometry विश्लेषण. कम कोशिकाओं का उपयोग कर इसे और अधिक लगातार कठिन विश्लेषित कोशिकाओं है, जो की विश्वसनीयता समझौता हो सकता है की इस संख्या तक पहुंचने के लिए होगा बाहर पढ़ें । नमूना प्रति कम कोशिकाओं का उपयोग करना (प्रति अच्छी तरह से) भी समय के लिए प्रवाह cytometry द्वारा नमूना विश्लेषण की जरूरत अंतराल में वृद्धि होगी, और इस तरह कुल समय बढ़ जाती है एक पूरे 96 अच्छी तरह से थाली का विश्लेषण । यह समझौता बढ़ प्रवाह । कारण abovementioned कारण, परख के भविष्य miniaturization इस प्रकार बाहर बारी के लिए एक तुच्छ काम नहीं हो सकता है ।

एक साथ ले लिया, एक प्रतियोगिता बाध्यकारी परख कि मुख्य रूप से एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है छोटे अणुओं है कि CXCR4 के लिए बाध्यकारी के लिए CXCL12 लेबल की एक निश्चित राशि के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते है की पहचान विस्तार में वर्णित किया गया है । इन बाध्यकारी अध्ययनों के ब्याज के रूप में वे एक अपेक्षाकृत तेज और सरल तरीका रिसेप्टर बाइंडिंग में सक्षम यौगिकों की पहचान कर रहे हैं । हालांकि बंधन क्षमता के साथ यौगिकों की पहचान पहले से ही अपने आप में मूल्यवान है, परख के इस प्रकार की पहचान यौगिकों की गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है । इसलिए, यह आगे मांय और अंय औषधीय और कार्यात्मक रिसेप्टर परख में अपने संभावित agonistic या विरोधी गतिविधि को चिह्नित करने के लिए आवश्यक रहता है । ब्याज की, CXCR4 के मामले में यह है कि रिसेप्टर विरोधी दिखा दिया गया है कि बाध्यकारी परख (यानी, कम आईसी उत्पन्न50 मूल्यों के लिए बाध्यकारी निषेध में गतिविधि में वृद्धि दिखाने के अन्य कार्यात्मक में अपेक्षाकृत बेहतर प्रदर्शन CXCR4 से संबंधित परख के रूप में अच्छी तरह से17।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एरिक Fonteyn शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस काम को कू Leuven ने सपोर्ट किया है (ग्रांट नं. PF/10/018), शौकीनों voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, अनुदान सं. छ. 485.08) और सप्रेम Dormeur Vaduz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSCanto II Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSDIVA Software
BD FACSArray Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSArray System Software
Graphpad Prism Graphpad software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3
FlowJo FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.
Vi-CELL Beckman Coulter Not applicable cell viability analyzer
Sigma 3-18 KS Sigma Not applicable centrifuge
AMD3100 Sigma A5602-5mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc Pfizer antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647) ALMAC CAF-11-B-01 fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Jurkat cells ATCC
Reagent reservoir PP Sigma BR703411
Rapid flow filter: 0.2 µm aPES Thermo Scientific 566-0020
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear Thermo Scientific 611U96
Falcon tubes, 50ml Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024

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References

  1. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  2. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
  3. Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
  4. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  5. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  6. Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
  7. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  8. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  9. Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
  10. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  11. Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  12. Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
  13. Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
  14. Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
  15. Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  16. Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
  18. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  19. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  20. Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
  21. Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
  22. Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
  23. De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
  24. Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  25. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  26. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
  27. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  28. Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
  29. Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  30. Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  31. Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
  32. Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
  33. Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 133 ग्राम प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर CXC chemokine रिसेप्टर 4 फ्लोरोसेंट chemokine ligand 12 प्रवाह cytometry सेल आधारित परख रिसेप्टर बाइंडिंग ड्रग डिस्कवरी छोटे अणुओं Jurkat कोशिकाओं लेबल
एक प्रवाह Cytometry-परख की पहचान करने के लिए यौगिक यौगिकों कि बाधा फ्लोरोसेंट की बाध्यकारी-लेबल CXC Chemokine Ligand 12 करने के लिए CXC Chemokine रिसेप्टर 4
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Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys,… More

Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4. J. Vis. Exp. (133), e57271, doi:10.3791/57271 (2018).

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