Summary
En flow flowcytometri-baserede cellulære bindende assay er beskrevet, som bruges primært som en screeningsværktøj til at identificere stoffer, der hæmmer bindingen af en fluorescently mærket CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) til CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).
Abstract
Farmakologiske målretning af G protein koblede receptorer (GPCRs) er af stor betydning for menneskers sundhed, som dysfunktionel GPCR-medieret signalering bidrager til udviklingen af mange sygdomme. Ligand-receptoren par CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) har rejst store klinisk interesse, for eksempel som et potentielt mål for behandling af kræft og inflammatoriske sygdomme. Små molekyler samt terapeutiske antistoffer, der specifikt målretter mod CXCR4 og hæmme den receptor funktion anses derfor for at være værdifulde farmakologiske værktøjer. Her, er en flow flowcytometri-baserede cellulære assay der giver mulighed for identificering af forbindelser (f.eks. små molekyler) der ophæver CXCL12 binding til CXCR4, beskrevet. Det væsentlige, analysen bygger på konkurrence for receptor binding mellem et fast beløb af fluorescently mærket CXCL12, naturlige chemokine agonist til CXCR4 og umærkede forbindelser. Dermed undgås uønskede brugen af radioaktivt mærket sonder i denne analyse. Derudover der levende celler bruges som kilde til receptoren (CXCR4) i stedet for cellemembranen præparater. Dette giver mulighed for nem tilpasning af analysen til et format, plade, hvilket øger dataoverførselshastigheden. Denne analyse har vist sig at være en værdifuld generisk lægemiddel discovery assay at identificere CXCR4-targeting forbindelser. Protokollen kan sandsynligvis tilpasses til andre GPCRs, i det mindste hvis fluorescently mærket ligander er tilgængelige eller kan genereres. Der kræves ikke forudgående kendskab til intracellulær signalering veje, der er fremkaldt ved aktivering af disse GPCRs.
Introduction
G protein koblede receptorer (GPCRs) er celle overflade proteiner, som kan aktiveres af ekstracellulære ligander (fx, peptider, protein hormoner, aminer), derved regulere mange fysiologiske og udviklingsmæssige processer1. Når en agonist indtager sin GPCR bindende lomme, den inducerede konformationelle ændring i receptor protein fremmer bindingen af intracellulære receptor-associerede heterotrimeric G proteiner, bestående af Gα- BNP og Gβγ underenheder. Den efterfølgende udveksling af GTP for BNP på Gα -underenhed resultater i dissociation af G protein underenheder (Gα-GTP og Gβγ), der vil til gengæld yderligere indlede nedstrøms signalering veje2,3. Når Gα-GTP bliver hydrolyseret, fornyet tilknytning af Gα- BNP og Gβγ subunits vil konvertere G protein tilbage til dets hvilende tilstand3,4. Forskellige typer af G proteiner findes (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), som er kategoriseret på sekvens lighed med Gα -underenhed5. Alle disse G proteiner fremkalde definerede intracellulær signalering veje, der ligger til grund for den biologiske respons til receptor aktivering. Efter receptor aktivering phosphorylate GPCR kinaser (GRKs) GPCRs, derved at fremme interaktion med β-arrestins intracellulære halen. Denne proces fører til opsigelse af G protein signalering, receptor desensibilisering og internalisering6. Β-arrestins er også en del af multi molekylære komplekser at udløse signalering kaskader uafhængigt af G protein signalering7.
GPCRs er blandt de mest validerede molekylære mål for terapeutisk intervention, som dereguleret GPCR-medieret signalering, for eksempel på grund af tab af funktion mutationer i receptoren genet eller receptor overekspression, bidrager til ætiologien af mange menneskelige sygdomme8. GPCRs repræsenterer derfor et af de vigtigste klasser af narkotika mål undersøgt af den farmaceutiske industri8,9,10. Et bemærkelsesværdigt eksempel på en klinisk relevante GPCR er CXC chemokine receptor 4 (CXCR4), som kan aktiveres af en eneste naturlige ligand, den CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11. På grund af sin etablerede rolle som en større Co receptor for human immundefekt virus 1 (HIV-1) posten og infektion i klynge af differentiering 4 (CD4) positiv T-lymfocytter12, CXCR4 blev først undersøgt som et antiviralt lægemiddel mål. CXCL12-CXCR4 interaktion i knoglemarven yderligere regulerer opbevaring og målsøgende stilk og stamfader celler13. Også givet sin deltagelse i mange aspekter af kræft biologi (fx tumor celle overlevelse, metastase, tumor-relaterede angiogenese)14 og flere andre sygdomme hos mennesker (f.eks. inflammatoriske sygdomme)15, CXCR4 rejst væsentlige interesse som en lovende mål for drug discovery. AMD3100, et lille molekyle, der er specifikt målrettet CXCR4, blev oprindeligt opdaget som en anti-HIV medicin kandidat16 og er stadig en af de mest potente CXCR4 antagonister beskrevet til dato17. Dens udvikling afbrudt som et antiviralt stof blev dog18. I øjeblikket er dette molekyle brugt som en stamcelle mobilisering agent under behandling af myelomatose og lymfom patienter18. Flere andre kemisk ikke relateret små molekyler og biologiske lægemidler, der hæmmer CXCR4 funktion med varierende styrke har været beskrevet19.
Receptor bindende metoder er værdifulde værktøjer i farmakologi, der giver mulighed for identificering af forbindelser (f.eks. små molekyler), der direkte interagerer med GPCR af interesse. For at udføre bindende undersøgelser, er der ikke behov for forudgående viden om intracellulær signalering egenskaber eller funktionalitet af en given GPCR. Selv om dette kan anses for at være en fordel, indebærer det, at forbindelser for hvilke receptor binding kan påvises skal karakteriseres yderligere ved at evaluere deres potentielle agonistisk eller antagonistisk aktivitet. Denne aktivitet kan evalueres ved hjælp af farmakologiske eller biologiske assays relateret til GPCR under undersøgelsen. Afhængig af deres aktivitet profil, receptor binding molekyler kan derefter potentielt udvikle sig til at blive roman blyforbindelser for undersøgelsen i prækliniske og kliniske undersøgelser. Molekyler, der specifikt binder sig til en receptor med høj affinitet kan også tjene som stilladser skabe terapeutiske eller diagnostiske redskaber, for eksempel ved at radiolabeling dem for noninvasiv i vivo billeddannelse af tumor celler20, eller som potentiale køretøjer til målrettet levering af therapeutics21. I tilfælde af CXCR4, er i vivo billeddannelse af tumorceller allerede påvist ved hjælp af musen modeller hvori mærket CXCR4-targeting molekyler tilladt visualisering af menneskelige cancer xenografts20,22,23 .
I denne rapport beskriver vi en detaljeret protokol for en konkurrence bindende assay, der muliggør identifikation af små molekyler og biologiske lægemidler, der direkte interfererer med agonist (CXCL12) bindende til CXCR4. Det grundlæggende princip i analysen er konkurrence mellem et fast beløb af fluorescently mærket ligand (CXCL12AF647, se tabel af materialer og reagenser) og umærket forbindelser for binding til receptoren protein17, 24. den specifikke fluorescerende signal fra mærket ligand bundet til enkelt celler udtrykker CXCR4 er derefter analyseret ved flowcytometri. Denne fluorescerende signal vil være reduceret, når umærkede små molekyler forstyrre samspillet mellem CXCL12AF647 og CXCR4. Analysen benytter ikke-manipuleret levende celler, som endogent express CXCR4 (dvs. Jurkat celler). Derfor ingen cellemembranen forberedelse er nødvendig, hvilket gør analysen bekvem, hurtig og kompatibel med øget overførselshastighed. Da en fluorescently mærket ligand anvendes, undgås radioaktivitet.
Fordi CXCL12 er den naturlige agonist til CXCR4, er lille molekyle forbindelser, der interfererer med CXCL12AF647 binding i analysen tilbøjelige til at interagere med orthosteric receptor bindingssted (dvs. bindingssted besat af naturligt agonist). Molekyler, der ønsker interagerer med receptor bindingssteder topografisk adskiller sig fra orthosteric bindingssted forblive uopdaget, hvis de ikke påvirker bindingen af CXCL12. For eksempel, vil positive og negative allosteriske modulatorer, en vigtig og nye kategori af GPCR målretning molekyler optræder på allosteriske bindende websteder25, potentielt ikke afhentes med dette assay. Derudover om stofferne identificeres med denne bindende assay funktion som receptor antagonister eller agonister kan ikke afledes. Undersøgelse af de identificerede stoffer i yderligere farmakologiske eller funktionelle receptor-relaterede assays vil således være påkrævet. Disse assays kan omfatte (en kombination af) cellulære fluorescens - eller luminescence-baserede assays til påvisning af anden messengers (fx, Ca2 +, cyklisk adenosin fra (cAMP)), fænotypiske eller biologiske assays og β-arrestin rekruttering assays, valg som afhænger af de specifikke signaling egenskaber af GPCR under undersøgelsen. Derfor, konkurrencedygtige bindende analysen beskrevet heri primært fungerer som en indledende screening assay, der skal suppleres med andre celle-baserede assays til at aktivere en dybdegående karakterisering af forbindelser med receptor binding potens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vedligeholdelse af cellekultur
Bemærk: Alle trin beskrevet under 1 og 2 udføres under sterile forhold i en laminar flow kabinet.
- Vokse celler i T75 kultur kolber på 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator.
Bemærk: I denne analyse, Jurkat celler (dvs. menneskelige leukemic T-lymfocyt celler, som endogent express CXCR417) er brugt. Udtryk for CXCR4 på cellens overflade bør evalueres i hele celle dyrkning ved flowcytometri. En beskrivelse af den flow flowcytometri og reagenser til at bestemme receptor udtryk niveauer på cellens overflade er, dog, ikke er omfattet af denne protokol, men har været beskrevet tidligere17. - Lad Jurkat celler vokse i suspension indtil de når 80-85% confluency. Før passaging celler til en roman kolbe, tillade alle reagenser til nå stuetemperatur (RT).
- Der tilsættes 20 mL af frisk komplet vækstmediet (RPMI-1640 medium, 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM glutamin) til en roman T75 kultur kolbe.
- Tilsættes 5 mL af Jurkat cellesuspension fra den oprindelige T75 kolbe (indeholdende 25 mL cellesuspension) til romanen T75 kultur kolbe. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator.
2. forberedelse af CXCL12, analysebuffer og Jurkat celler for konkurrencen bindende Assay.
- Forberede en stamopløsning af CXCL12AF647 (20 µg/mL, se tabel af materialer og reagenser) ved at opløse den frysetørrede reagens (opbevares ved-80 ° C i mørke) i ultrarent vand suppleret med 0,01% (volumen/bind) af Polysorbat 20. Gemme engangsbrug delprøver af denne stamopløsning ved-80 ° C, beskyttet mod lys.
- Forbered analysebuffer ved at tilføje 40 mL HEPES (1 M, 20 mM endelige koncentration) til 200 mL Hank afbalanceret saltopløsning (HBSS, 10 x, uden phenol rød og natriumbikarbonat, 1 x slutkoncentration). Tilføj ultrarent vand til at opnå en endelige mængden af 2 L. tilføje 4 g (0,2% vægt/volumen) bovint serumalbumin (BSA), og opløse BSA via magnetiske omrøring. Endelig, ph indstilles til 7.4 (bruge NaOH til dette) og filtreres gennem 0,2 µm porer (Se tabel af materialer og reagenser) ved hjælp af et vakuum manifold.
Bemærk: Denne analysebuffer vil blive brugt i alle yderligere foranstaltninger i protokollen. - Tælle antallet og levedygtigheden af cellerne. For dette, tage en prøve af cellesuspension og fortynde det i fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
Bemærk: Bruger vi rutinemæssigt en automatiseret celle levedygtighed analyzer (Se tabel af materialer og reagenser) i stand til at tælle celle suspensioner i varierende koncentrationer. Til celle optælling, fortyndes 0,5 mL cellesuspension i 1,5 mL PBS (andre fortyndinger, fx 0,1 mL i 1,9 mL PBS, er også mulige). Brug af denne metode, som er baseret på metoden trypan blå farvestof udstødelse, er blevet beskrevet tidligere26. Flere andre enheder er kommercielt tilgængelige for tælle cell antal og levedygtighed, der skal arbejde lige så godt. - Indsamle de ønskede antal celler (dvs., ~ 24 x 106 celler til at køre analysen med en komplet 96-brønd plade) i en steril 50 mL tube ved centrifugering (Se tabel af materialer og reagenser for typen af centrifuge bruges) ved 400 x g i 5 min. ved RT.
- Hæld forsigtigt supernatanten uden at forstyrre den celle pellet. Tilføj frisk analysebuffer (f.eks. 20 mL) og resuspend cellerne af pipettering forsigtigt op og ned.
- Centrifugeres celler igen på 400 x g i 5 min på RT.
- Hæld supernatanten igen og resuspenderes celle i frisk analysebuffer til at opnå en massefylde på 5 x 106 celler/mL.
3. konkurrencen bindende Assay
Bemærk: Selve konkurrencen bindende analysen udføres på RT og kan udføres under ikke-sterile forhold.
- Fortynd forbindelser under efterforskning i analysebuffer (Se 2.2) for at opnå den ønskede koncentration. Enten forberede en fast koncentration af stof til indledende screening (f.eks. 10 µM endelige koncentration) eller alternativt en seriel fortyndingsrække koncentrationer for mere detaljerede karakterisering af forbindelser (f.eks. en 1/3, 1/4 eller 1 / 5 fortyndingsrække starter ved 1 µM, endelige koncentration). Husk at sammensatte løsningen bliver i sidste ende 2 x fortyndet i analysen; Derfor forberede en 2 x koncentreret opløsning.
- Afpipetteres 100 µL af sammensatte løsning (2 x koncentreret) i en klar 96-brønd runde bundplade (Se tabel af materialer og reagenser) Ifølge en foruddefineret eksperimentelle lå ud (f.eks. figur 1 c).
Bemærk: På dette stadium, er negative og positive kontrolprøver inkluderet i analysen. I negativ kontrolprøve, er 100 µL af analysebuffer tilføjet i stedet for sammensatte brønde i 96-brønd-pladen. For den positive kontrolprøveføjes analysebuffer også under dette trin. Se også figur 1 c for en typisk eksperimentel layout som en fortyndingsrække af flere stoffer er testet. - Tilsæt 50 µL af cellesuspension (Se 2.7; 0,25 x 106 celler) fra et reagens reservoir i 96-brønd pladen ved hjælp af en multikanalpipette. Inkuber plade i 15 min. på RT i mørke.
- Tilsæt 50 µL af fluorescently mærket CXCL12 (dvs. 100 ng/mL af CXCL12AF647 i analysebuffer, 4 x koncentreret, 25 ng/mL endelige koncentration) fra en lignende reagens reservoir brønde i 96-brønd-pladen. Inkuber i 30 min. ved RT i mørke.
Bemærk: De negative kontrolprøver, tilføje analysebuffer i stedet. Derfor, den fluorescerende signal opdaget i negative kontrolprøverne vil svare til autofluorescent baggrund signal (figur 1A). De positive kontrolprøver, tilsæt 50 µL/brønd af CXCL12AF647. Positive kontrolprøverne vil give maksimal fluorescens signal registreres, da ingen potentielle hæmning af præ-inkubation med forbindelser var inkluderet (figur 1A). - Der centrifugeres 96-brønd pladen på 400 x g i 5 min på RT. Fjern supernatanten fra pelleted celler ved at vende over pladen. Tør pladen på en væv.
- Tilføje 200 µL af frisk analysebuffer fra et reagens reservoir brønde ved hjælp af en multikanalpipette. Straks fortsætte.
- Der centrifugeres plade igen i 5 min på 400 x g på RT. Fjern supernatanten ved at vende over pladen og igen tørre det på væv.
- Forsigtigt resuspenderes celle i 200 µL af 1% PARAFORMALDEHYD opløses i PBS. Dette trin reparerer cellerne.
- Fortsætte protokollen straks med en kvantificering af fluorescens ved flowcytometri.
4. analyse af prøver ved flowcytometri
CXCL12AF647 farvede og fikseret celler er nu klar til at blive analyseret ved hjælp af flowcytometri. Flere typer af flow cytometers kan bruges, men de skal være udstyret med den korrekte laser (dvs. en rød laser, excitation vifte ~ 630 nm) for excitation og egnede filtre til registrering af fluorophore (emission filtre ~ 660 nm). De skal være i stand til håndtering af prøver i et format, 96-brønd plade. Eksempler på egnede flow flowcytometri enheder er vist i tabel af materialer og reagenser.
- Start enheden og åbne den tilsvarende software (Se tabel af materialer og reagenser).
- Vælg følgende cellulære parametre til visualiseres i et prik skamplet format: videresende scatter (FSC), side scatter (SSC) og fluorophore (CXCL12AF647) opdagelse kanal.
Bemærk: Med parameteren FSC celler er diskrimination baseret på deres størrelse, da de detekterede lys absorption er proportional med den celle diameter. Parameteren SSC, måling af lysspredning på en vinkel på 90°, giver oplysninger om granulering af celler. - Vælg én prøve (f.eks. en negativ kontrolprøve) til at udføre i en defineret homogen celle population baseret på parametrene FSC og SSC-gating.
- Vælg automatisk injektion af ~ 100 µL af fikseret celler fra denne negativ kontrolprøve i flow Flowcytometret. Vælg indstillingen "blanding" før injektion og bruge en prøvegassens strømningshastighed af 1,5 µL/s.
- Køre dette eksempel ved at vælge "Erhverve Data." FSC og SSC parametrene for denne prøve vises nu på skærmen.
- Vælg den gating softwareværktøj. Baseret på FSC og SSC dot skamplet visualisering, foruddefinere en homogen og levedygtige celle population af gating. At gøre det, skal du oprette en polygon (ved hjælp af softwarens gating værktøj), der omfatter de homogen måde distribueret enkelt celler ("begivenheder") baseret på disse to dimensioner.
Bemærk: Gating proceduren har til formål at definere en homogen og levedygtige celle befolkning, der vil blive anvendt til yderligere analyse. Gating bygger på den antagelse, at størstedelen af levedygtige celler vil udgøre en homogen celle population baseret på parametrene FSC og SSC. Ved at udføre dette trin, kan celleaffald, døde celler og celle aggregater i vid udstrækning udelukkes fra yderligere analyse. En illustration af den gating proces gives i figur 1B.
- Vælg for at analysere 20.000 "begivenheder" (dvs., enkelt celler) pr. prøve.
Bemærk: Dette betyder, at for hver prøve, 20.000 celler, der falder ind under den foruddefinerede gate vil til sidst blive analyseret. Dataopsamling for hver prøve vil fortsætte indtil denne række begivenheder er analyseret. - Start Kør (Vælg "postdata"). Flow flowcytometri enhed vil nu analysere alle prøver én efter én ved at optage den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) for hver prøve. Denne MFI svarer til den gennemsnitlige fluorescerende signal svarende til 20.000 cellerne, der falder ind under den foruddefinerede gate.
5. dataanalyse
Bruge MFI opnået for hver prøve for at udføre alle yderligere beregninger. Analyse af flow flowcytometri data kan udføres af flere kommercielt tilgængelige softwarepakker (Se tabel af materialer og reagenser).
- For at bestemme procentdelen hæmning af fluorescerende bindende signal, som følge af sammensatte præ-inkubation, gælder følgende formel:
Hvor:
MFIExp = MFI for den eksperimentelle (= sammensatte-behandlet) prøve
MFIPC = MFI i den positive kontrol
MFINC = MFI for den negative kontrol - For at bestemme IC50 værdien af et stof (dvs., at koncentrationen af stof, der kan reducere fluorescerende bindende signal med 50%), gælde følgende formel:
Hvor:
Logconc.2 = log af en koncentration af stof, der resulterer i mindre end 50% hæmning af forskellen mellem MFI værdien af PC og NC
Logconc.1 = log af en koncentration af stof, der resulterer i mere end 50% hæmning af forskellen mellem MFI værdien af PC og NC
Bemærk: Alternativt, i tilfælde af meget aktive forbindelser, en dosis-respons kurve der dækker flere logfiler i størrelsesorden kan genereres baseret på MFI svarende til hver testet koncentration af stof. Ved at anvende ikke-lineær regression kurve montering ved hjælp af passende software (Se tabel af materialer og reagenser), IC50 værdier kan derefter udledes af de genererede kurver. Et eksempel på denne analyse tilgang er vist i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle arbejdsgang af bindende assay er præsenteret i figur 1A. En illustration af typen flow flowcytometri data indhentet af forskellige sample former i en standard eksperiment (dvs. negativ kontrol, positiv kontrol og eksperimentelle prøve) er afbildet i figur 1B, og en eventuel plade layout til at udføre analysen i en 96-brønd plade format er angivet i figur 1 c. Inkubation af Jurkat celler, som endogent express chemokine receptor CXCR4 (dvs. GPCR af interesse i denne analyse), med stigende mængder af fluorescently mærket CXCL12 (dvs. CXCL12AF647) resulterede i øget niveauer af fluorescens (figur 2), som afspejler øget niveauer af ligand binding til CXCR4. For at vise CXCL12AF647 bindende receptor-specificitet, blev en veletableret og receptor-specifikke CXCR4 antagonist (den lille molekyle AMD3100) brugt. Jurkat celler blev først pre inkuberes med en 1/5 fortyndingsrække af AMD3100, som spænder fra 0.064 ng/mL til 1,000 ng/mL, efterfulgt af en inkubering med en endelig koncentration på 25 ng/mL CXCL12AF647 (dvs. det faste beløb af mærket chemokine rutinemæssigt anvendes i analysen). Jurkat celler blev derefter videreforarbejdes som beskrevet i protokollen. Den fluorescerende signal (den gennemsnitlige fluorescerende intensitet, MFI) efter tilsætning af et fast beløb af CXCL12AF647 på forhånd indlagte Jurkat cellerne, blev opnået ved flow flowcytometri analyse for alle prøver. Denne fluorescerende signal kunne næsten være helt hæmmede i tilfælde af Jurkat celler blev forbehandlet med den højeste koncentration af AMD3100 (1.000 ng/mL). På denne betingelse, hæmmet af fluorescens var kun lidt over baggrundsniveau svarende til niveauet for autofluorescence for Jurkat celler. Afslutningsvis, genereret anvende 25 ng/mL (endelig koncentration) af CXCL12AF647 i bindende assay en stor fluorescerende signal vindue (i forhold til den negative kontrol) med en minimal restmængde af uspecifik receptor binding ( Figur 3A).
Denne bindende assay er primært blevet anvendt til at screene for forbindelser forstyrre ligand bindende i paneler af umærket forbindelser på et enkelt fast koncentration eller at studere dosisafhængig effekt af aktive stoffer. I sidstnævnte tilfælde er målet at få IC50 værdier (dvs., at koncentrationen af stof, der hæmmer bindende signal ved 50%), som afspejler den bindende styrken af forbindelser. Figur 3 illustrerer hvordan flow flowcytometri data opnået med denne bindende assay kan bruges til at bestemme den hæmmende potens (målt i IC50) af små molekyler forstyrre bindingen af CXCL12 til CXCR4. Baseret på dosisafhængig hæmning af CXCL12AF647 binding af AMD3100, blev IC50 værdi fastsat her ved at anvende ikke-lineær regressionsanalyse. I dette eksempel er svarer den beregnede IC50 værdi for AMD3100 til 18.12 ng/mL. Fordi i screening kampagner, fleste af tilfældigt udvalgte forbindelser forventes ikke at hæmme bindingen af CXCL12AF647 til CXCR4+ Jurkat celler, et eksempel på en inaktiv sammensatte blev også medtaget i denne undersøgelse. Her, blev lille molekyle maraviroc, som udstiller potent anti-HIV-1 aktivitet ved at fungere som en specifik antagonist for CC chemokine receptor 5 (CCR5)27, testet i bindende assay. Ingen hæmning af maksimal fluorescerende bindende signal blev opdaget efter pre inkubere Jurkat celler med maravoric, selv med den højeste koncentration testet (100 ng/mL; Figur 3B). I det samme eksperiment blev en seriel fortynding serie af AMD11070, en anden lille molekyle relateret til AMD3100, men med forbedret farmakokinetiske egenskaber28, inkluderet. I modsætning til maraviroc hæmmede en 1/5 fortynding serie fra AMD11070 lige fra 0.0064 til 100 ng/mL klart og dosis-afhængigt CXCL12AF647 bindende (figur 3B).
Figur 1: oversigt over arbejdsgangen og illustration af typen af data indhentet. (A). de vigtigste trin i protokollen er skematiserede for de negative og positive kontrolprøver, og stof-behandlede prøver. Prøver uden sammensatte præ-inkubation og uden tilsætning af fluorescently mærket chemokine (CXCL12AF647) er inkluderet for at bestemme baggrunden (auto) Fluorescens (negative kontrolprøver). Prøver uden sammensatte præ-inkubation, men med tilføjelse af et fast beløb på CXCL12AF647 bruges til at bestemme den maksimal bindende signal i analysen (positive kontrolprøver). I stof-behandlede prøver inkuberes celler pre med sammensatte før tilsætning af et fast beløb på CXCL12AF647. (B). gennemsnitlig fluorescerende bindende signal bestemmes af flow flowcytometri analyse af Jurkat celler. Fra alle events (dvs. Jurkat celler) analyseres (venstre panel) bruges kun den fluorescerende signal fra en gated delpopulation af celler til videre analyse (midterste panel). Præ-inkubation af celler med små molekyler (fx AMD3100) hæmmer bindingen af fluorescently mærket receptor-ligand og dette vil reducere maksimal bindende signal (højre panel, vist i et histogram repræsentation). (C). en muligt plade layout, når du udfører konkurrencedygtige bindende analysen i en 96-brønd plade format. I dette tilfælde, seks forskellige forbindelser (cpd 1 - 6) er testet i en 1/5 seriel fortynding serie (i duplikat) spænder fra 1.000 nM ned til 0,32 nM. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Binding af CXCL12AF647 til celler, Jurkat. Jurkat celler blev inkuberet med stigende mængder af CXCL12AF647, i mangel af præ-inkubation med sammensatte. Den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI, udtrykte i vilkårlige lys enheder) ± SD er vist (n = 2). Kurven montering blev udført ved hjælp af ikke-lineær regression ved hjælp af en one-site samlede bindende model efter ligningen
med Bmax (maksimal specifikke bindende) = 18,345; Kd = 92.8 ng/mL; NS (hældningen af uspecifik bindende) = 2.139; og baggrund = 332.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hæmning af bindingen af CXCL12AF647 aktive og inaktive forbindelser. (A) dosisafhængig hæmning af CXCL12AF647 binding af pre inkubere celler med stigende koncentrationer af AMD3100, før tilsætning af 25 ng/mL CXCL12AF647. Bemærk at maksimale hæmmede gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI, udtrykt i vilkårlige lys enheder) er stadig lidt over baggrunden (auto) Fluorescens opnået for Jurkat celler (betyde ± SD (n = 3)). Kurven montering blev udført ved hjælp af ikke-lineær regression med en variabel hældning (fire parametre) i henhold til
HillSlope er her 1.313 og den beregnede IC50 er 18.12 ng/mL. (B). dosisafhængig effekt af AMD11070 og maraviroc på CXCL12AF647 binding til CXCR4+ Jurkat celler (MFI ± SD (n = 3)). Kurve til AMD11070 svar blev udført på samme måde med en HillSlope af 1.458 og en beregnet IC50 værdi af 0.9052 ng/mL. For maraviroc svaret, var ingen montering udføres i mangel af aktiviteten af dette stof. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med andre typer af bindende assays (dvs., mætning bindende og kinetic bindende eksperimenter), er konkurrencen bindende assays bedst egnet til screening. Faktisk, de tillader evaluering af store partier af umærket forbindelser, for eksempel små molekyler, ved at score deres evne til at blande sig med bindingen af et fast beløb af en mærket receptor-ligand. Forbindelser, der binder sig til andre receptor websteder end mærket ligand kan forblive uopdaget i analysen. Selv om konkurrencen bindende eksperiment beskrevet heri fokuserer på chemokine receptor CXCR4 især, kan det sandsynligvis tjene som et oplæg til design af konkurrencen bindende assays til andre GPCRs. For eksempel, blev CXC chemokine receptor 7 (CXCR7) beskrevet som en alternativ receptor for CXCL12, i stand til at bindende CXCL12 med høj affinitet29,30. Derfor, den samme mærket chemokine (CXCL12AF647) som bruges til de beskrevne CXCR4 konkurrencen bindende assay kan bruges til at oprette CXCR7 bindende eksperimenter. Fordi CXCR4 og CXCR7 del CXCL12 som et fælles ligand, ville det være vigtigt at arbejde med cellulære modeller som er udtrykt i kun én af begge receptorer på celleoverfladen, for at evaluere bestemte receptor binding. Vores tidligere arbejde har vist, at Jurkat celler ikke vise endogene udtryk af CXCR717. Således i analysen beskrives her for CXCR4, er interferens med binding til CXCR7 udelukket.
Flere nøglen egenskaber i konkurrencen bindende assay tillader det at blive brugt som en hurtig, oprindelige, screening værktøj til at identificere små molekyler forstyrrer agonist binding til CXCR4. En af de assay hovedfordele er brugen af hele, levende celler udtrykker receptor af interesse. Dette udelader behovet for arbejdskrævende cellemembranen præparater. Det lave niveau af baggrunden (auto) Fluorescens opdaget med Jurkat celler er også gavnligt. Sammen med den store signal vindue fremstillet ved tilsætning af det definerede antal fluorescently mærket sonde, bidrager det til en gunstig signal til baggrunden ratio. Dette muliggør en opdagelse af potentielle bindende hæmning af umærket forbindelser. I tilfælde af denne bindende assay er udført med andre CXCR4 udtrykker celler, anbefaler vi altid vurdere disse parametre (baggrund fluorescens, signal vindue) upfront som de kan afvige fra cellelinie til cellelinie. Det faktum, at Jurkat celler endogent express CXCR4 på et ensartet over lange perioder, gør det en praktisk cellulære model. Den samme konsekvent niveau af receptor udtryk kan opnås med stabilt transfekteret celle kloner. Derimod anbefaler vi ikke brug af forbigående transfekteret celler, fordi dette vil sandsynligvis resultere i en meget bredere fordeling af fluorescens intensiteter, færre modtagelig celler i analysen og mindre sammenhæng mellem eksperimenter. Da ingen CXCR4 negative Jurkat celler findes, blev specificitet af receptor binding til disse celler demonstreret af præ-inkubation med veletablerede specifikke receptor antagonister (AMD3100 og AMD11070). Disse antagonister adskiller sig strukturelt fra den mærket ligand. Dette er vigtigt, fordi når du bruger den umærkede variant af liganden som konkurrent, både mærkede og umærkede ligand kan også konkurrere for binding til uspecifikke bindingssteder potentielt til stede på cellens overflade.
Ud over den cellulære vært, flere andre aspekter af analysen beskrives her skal tages i betragtning før du begynder at bygge et lignende assay for andre GPCRs. Fluorescently mærket sonder, der er målrettet mod GPCRs er blevet udviklet som alternativer til radioaktivt sonder, men i øjeblikket kun tilgængelig for et begrænset antal GPCRs og de er relativt dyre. Desuden, ændring af naturlige receptor ligander med fluorophores kan ændre bindende egenskaber sammenlignet med umærkede overordnede molekyle, især i tilfælde af meget små ligander (fx aminer) eller små peptider31, 32. For eksempel i tilfælde af små ligander, en linker er generelt kræves til at adskille pharmacophore fra fluorophore til at give adgang til den receptor orthosteric bindende site31. Også skal stabiliteten af receptor-fluorescerende sonden komplekse tages i betragtning. Vores erfaring, efter 90-120 minutter (dvs. tid til at køre to på hinanden følgende 96-brønd plader), den gennemsnitlige fluorescerende intensitet for positive kontrolhullerne typisk er reduceret med ~ 5% i forhold til gennemsnittet af alle positive kontrolhullerne på den plade, med lejlighedsvise outliers mellem 5 og 10%.
Den iboende aktivitet af mærket ligand er også af betydning. Mens receptor antagonister viser ingen iboende aktivitet på receptoren, mærket agonister sandsynligvis fremkalde receptor aktivering og i konsekvens, receptor internalisering. Dette bringer den reversible karakter af ligand-receptor interaktion33. For at minimere mulige problemer med receptor internalisering, inkubation med mærket ligand (i tilfælde af en mærket agonist) skal være tidsbegrænset og skal fortrinsvis udføres ved stuetemperatur eller lavere. Det faktum, at proceduren, der udføres ved stuetemperatur gør analysen også praktisk og mere kompatible med screening indsats i plade format. Endelig, et tilstrækkeligt antal celler pr. sample (fx 250.000 pr. brønd af en 96-brønd plade) bør anvendes i analysen i sidste ende bevare et tilstrækkeligt antal celler (20.000 celler, "single begivenheder," baseret på gating med befolkningens hele cellen, jf. Figur 1) for flow flowcytometri analyse. Ved hjælp af mindre celler ville gøre det vanskeligere at konsekvent nå dette antal analyserede celler, som kan kompromittere pålideligheden af Læs ud. Ved hjælp af mindre celler pr. sample (pr. brønd) også vil øge det tidsinterval, der er nødvendige for at analysere prøven ved flowcytometri, og dermed øger den samlede tid til at analysere en hele 96-brønd plade. Dette bringer øget overførselshastighed. På grund af ovennævnte grunde, fremtidige miniaturisering af analysen kan således vise sig ikke at være en triviel opgave.
Tilsammen er en konkurrence bindende assay, der anvendes primært i vores lab som en screeningsværktøj til at identificere små molekyler, der kan konkurrere med et fast beløb af mærket CXCL12 til binding til CXCR4 blevet beskrevet i detaljer. Disse bindende undersøgelser er af interesse, som de er en forholdsvis hurtig og enkel metode til at identificere forbindelser i stand til at receptor binding. Selv om identificering af forbindelser med bindende kapacitet allerede er værdifuldt i sig selv, indeholder denne type af analysen ikke oplysninger om aktiviteten af de identificerede stoffer. Derfor er det stadig nødvendigt at validere og karakterisere deres potentielle agonistisk eller antagonistisk aktivitet i andre farmakologiske og funktionelle receptor assays. Af interesse for CXCR4 har det vist sig at receptor antagonister, som viser øget aktivitet i den bindende assay (dvs., at generere lav IC50 værdier for bindende hæmning) udføre relativt bedre i andre funktionelle CXCR4-relaterede undersøgelser samt17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Eric Fonteyn for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde er blevet støttet af KU Leuven (give nr. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, give nr. G.485.08) og Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
References
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
- Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
- Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
- Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
- Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
- Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
- De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
- Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
- Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
- Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
- Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).
