Summary
En flyt cytometri-baserte mobilnettet bindende analysen er beskrevet som hovedsakelig brukes som en screening verktøyet for å identifisere forbindelser som hemmer binding av en fluorescently merket CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) til CXC chemokine reseptoren 4 (CXCR4).
Abstract
Farmakologiske målretting av G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) er av stor betydning for menneskets helse, som dysfunksjonelle GPCR-mediert signalering bidrar til utviklingen av mange sykdommer. Ligand/reseptor paret CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine reseptor 4 (CXCR4) har reist klinisk interesse, for eksempel som potensielle mål for behandling av kreft og inflammatoriske sykdommer. Små molekyler som terapeutiske antistoffer spesielt CXCR4 og hemme reseptorens funksjonen er derfor ansett å være verdifulle farmakologiske verktøy. Her er en flyt cytometri-baserte mobilnettet analysen der identifikasjon av forbindelser (f.eks små molekyler) som oppheve CXCL12 binding til CXCR4, beskrevet. I hovedsak er analysen avhengig av konkurransen om reseptoren binding mellom en fast mengde fluorescently merket CXCL12, naturlig chemokine Agonistiske for CXCR4 og umerkede forbindelser. Dermed unngås uønsket bruk av radioactively merket sonder i denne analysen. I tillegg brukes levende celler som kilde til reseptor (CXCR4) i stedet for celle membran forberedelser. Dette gir enkel tilpasning til analysen til en plate format, som øker. Denne analysen har vist seg å være en verdifull generisk legemiddel søk analysen identifisere CXCR4 målretting forbindelser. Protokollen kan trolig være tilpasset andre GPCRs, minst hvis fluorescently merket ligander finnes eller kan genereres. Forutgående kunnskap om de intracellulær signalveier hjulpet ved aktivering av disse GPCRs, er ikke nødvendig.
Introduction
Dermed regulerer mange fysiologiske og utviklingsmessige behandler1G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) er cellen overflaten proteiner som kan aktiveres av ekstracellulære ligander (f.eks peptider, protein hormoner, aminer). Når en Agonistiske tar sin GPCR binding lomme, indusert conformational endringen i reseptor protein fremmer binding av intracellulær reseptor-assosiert heterotrimeric G proteiner, bestående av Gα- BNP og Gβγ underenheter. Etterfølgende utveksling av GTP for BNP på Gα delenhet resultatet av de G protein underenheter (Gα-GTP og Gβγ) som, i sin tur vil ytterligere starte nedstrøms signalnettverk trasé2,3. Når Gα-GTP blir hydrolyzed, re foreningen av Gα- BNP og Gβγ underenheter vil konvertere G protein tilbake til sin hvile tilstand3,4. Forskjellige typer G proteiner eksisterer (Gs, Gi/oGq, G12/13) som kategoriseres basert på sekvens likhet med Gα delenhet5. Alle disse G proteinene indusere definerte intracellulær signalveier underlie biologiske svaret reseptor aktivisering. Etter reseptor aktivisering phosphorylate GPCR kinaser (GRKs) intracellulær halen av GPCRs, og dermed fremme samspill med β-arrestins. Denne prosessen fører til oppsigelse av G protein signalnettverk, reseptor desensitization og internalisering6. Β-arrestins er også en del av flere molekylær komplekser som utløser signalering kaskader uavhengig av G protein signalering7.
GPCRs er blant de mest validert molekylære mål for terapeutisk intervensjon, deregulated GPCR-mediert signalnettverk, for eksempel på grunn av gevinst-av-funksjon mutasjoner i reseptor genet eller reseptoren overuttrykte, bidrar til etiologien for mange menneskelige sykdommer8. Derfor representerer GPCRs en av de viktigste klassene av narkotika mål etterforsket av legemiddelindustrien8,9,10. Et godt eksempel på en klinisk relevant GPCR er CXC chemokine reseptoren 4 (CXCR4), som kan aktiveres av en eneste naturlige ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11. På grunn av sin etablerte rolle som en stor co reseptor for humant immunsviktvirus 1 (HIV-1) oppføringen og infeksjon i cluster for differensiering 4 (CD4) positive T-lymfocytter12, CXCR4 ble først undersøkt som en antiviral stoffet. CXCL12-CXCR4 interaksjon i beinmargen ytterligere regulerer oppbevaring og homing stilk og stamfar celler13. Også gitt sitt engasjement i mange aspekter ved kreft biologi (f.eks svulst celle overlevelse, metastasering, tumor-relaterte angiogenese)14 og flere andre menneskelige sykdommer (f.eks inflammatoriske sykdommer)15CXCR4 hevet interesse som en lovende mål for medisiner. AMD3100, et lite molekyl som er spesielt rettet mot CXCR4, ble opprinnelig oppdaget en anti-HIV stoffet kandidat16 og er fortsatt en av de mest potente CXCR4 antagonister beskrevet dato17. Utviklingen avviklet som en antiviral stoffet var imidlertid18. Foreløpig brukes dette molekylet som stilk cellen mobilisering agent under behandling av myelom og lymfom pasienter18. Flere andre kjemisk urelaterte små molekyler og biologiske som hemmer CXCR4 funksjonen med varierende styrke har vært beskrevet19.
Reseptor bindende metoder er verdifulle verktøy i farmakologi at identifikasjonen av forbindelser (f.eks små molekyler) som direkte samhandler med GPCR rundt. For å utføre bindende studier, er det ikke behov for forkunnskaper for intracellulær signalnettverk egenskaper eller funksjonaliteten til en gitt GPCR. Selv om dette kan anses å være en fordel, innebærer det at forbindelser for hvilke reseptor binding kan påvises må være ytterligere preget av evaluere deres potensielle agonistic eller antagonistiske aktivitet. Denne aktiviteten kan evalueres ved hjelp farmakologiske eller biologiske analyser knyttet til GPCR under studien. Avhengig av profilen sin aktivitet, reseptor-molekyler som bindende kan deretter potensielt utvikles for å bli romanen bly forbindelser for etterforskning i prekliniske og kliniske studier. Molekyler som spesifikt bindes til en reseptor med høy affinitet kan også tjene som stillaser å generere terapeutisk eller diagnostiske verktøy, for eksempel ved radiolabeling dem for noninvasive i vivo bildebehandling tumor celler20, eller som mulig biler for målrettet levering therapeutics21. Ved CXCR4, har i vivo bildebehandling av kreftceller allerede vist bruker musen modeller der merket CXCR4 målretting molekyler tillatt visualisering av menneskelig kreft xenografts20,22,23 .
I denne rapporten beskriver vi en detaljert protokoll for en konkurransen bindende analysen som gjør identifisering av små molekyler og biologiske som direkte konflikt med Agonistiske (CXCL12) binding til CXCR4. Det grunnleggende prinsippet om analysen er konkurransen mellom en fast mengde fluorescently merket ligand (CXCL12AF647, se tabellen for materiale og reagenser) og umerkede forbindelser for å binde de reseptor protein17, 24. bestemt fluorescerende signalet fra merket ligand bundet til enkeltceller uttrykke CXCR4 er deretter analysert av flowcytometri. Fluorescerende signalet reduseres når umerket små molekyler forstyrre samspillet mellom CXCL12AF647 og CXCR4. Analysen bruker ikke-manipulert levende celler som uttrykker endogenously CXCR4 (dvs. Jurkat celler). Derfor uten cellemembranen forberedelser er nødvendig, noe som gjør analysen praktisk, rask og kompatibel med økt gjennomstrømning. Siden en fluorescently merket ligand brukes, unngås radioaktivitet.
CXCL12 er den naturlige Agonistiske for CXCR4, er små molekyl forbindelser som forstyrrer CXCL12AF647 binding i analysen sannsynlig å samhandle med orthosteric reseptor binding området (dvs. området bindende okkupert av naturlige Agonistiske). Molekyler som vil samhandle med reseptor bindende områder topografisk forskjellig fra orthosteric binding området forblir usett, hvis de ikke påvirker binding av CXCL12. For eksempel, positive og negative allosteric modulatorer, en viktig og voksende kategori av GPCR målretting molekyler opptrer på allosteric binding nettsteder25, potensielt ikke plukket med denne analysen. I tillegg om forbindelsene identifisert med bindende analysen funksjonen som reseptor antagonister eller agonister kan ikke avledes. Undersøkelse av de identifiserte forbindelsene i flere farmakologisk eller funksjonelle reseptor-relaterte analyser vil dermed være nødvendig. Disse analyser kan omfatte (en kombinasjon av) mobilnettet fluorescens - eller luminescence-baserte essay for gjenkjenning av andre messengers (f.eks, Ca2 +, syklisk adenosin monofosfat (cAMP)), fenotypiske eller biologiske metoder og β-arrestin Rekruttering analyser, valget som avhenger av spesifikke signalnettverk egenskapene til GPCR under studien. Dermed fungerer konkurransedyktige bindende analysen beskrevet heri hovedsakelig som en første screening analysen som må suppleres med andre cellebasert analyser aktivere en detaljert karakterisering av forbindelser med reseptor bindende styrke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vedlikehold av cellekultur
Merk: Alle trinnene som er beskrevet under 1 og 2 er utført under sterile forhold i en laminær strømning kabinett.
- Vokse celler i MT75 kultur flasker på 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
Merk: I denne analysen, Jurkat celler (dvs. menneskelige leukemic T lymfocytt celler som uttrykker endogenously CXCR417) brukes. Uttrykk for CXCR4 til celleoverflaten bør vurderes gjennom cellen dyrking ved hjelp av flowcytometri. En beskrivelse av flyt cytometri prosedyre og reagenser til å bestemme reseptor uttrykk nivåer på celleoverflaten er, men ikke innenfor denne protokollen, men har vært beskrevet tidligere17. - La Jurkat cellene vokse i suspensjon før de når 80-85% confluency. Før passaging cellene til en roman kolbe, la reagenser til romtemperatur (RT).
- Legge til 20 mL frisk komplett oppblomstringen medium (RPMI-1640 medium, 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM glutamin) en roman MT75 kultur kolbe.
- Legge til 5 mL av Jurkat celle suspensjon fra opprinnelige MT75 kolbe (inneholder 25 mL av cellen suspensjon) i romanen MT75 kultur kolbe. Ruge på 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
2. utarbeidelse av CXCL12, analysebuffer og Jurkat celler for konkurransen bindende analysen.
- Forbered en lagerløsning av CXCL12AF647 (20 µg/mL, se tabell av materialer og reagenser) ved oppløsning lyofilisert reagensen (lagret på-80 ° C, i mørket) i ultrapure vann med 0,01% (volum/volum) polysorbat 20. Lagre engangsbruk dele fra lager løsningen ved-80 ° C, beskyttet mot lyset.
- Forberede analysebuffer ved å legge til 40 mL HEPES (1 M, 20 mM endelige konsentrasjon) til 200 mL Hanks balansert saltløsning (HBSS, 10 x, uten fenol rød og uten natriumbikarbonat, 1 x siste konsentrasjon). Legg til ultrapure vann for å få et endelig antall 2 L. legge 4 g (0,2% vekt/volum) bovin serum albumin (BSA), og oppløse BSA via magnetisk stirring. Til slutt, justere pH 7,4 (bruk NaOH for dette) og filtrere løsningen gjennom 0,2 µm porene (se tabell av materialer og reagenser) bruker en vakuum manifold.
Merk: Denne analysebuffer brukes i alle ytterligere trinn av protokollen. - Tell antallet og levedyktigheten til cellene. For dette, ta en prøve av cellen suspensjon og fortynne den i fosfat bufret saltvann (PBS).
Merk: Vi rutinemessig bruker en automatisert celle levedyktighet analyserer (se tabell av materialer og reagenser) i stand til å telle celle suspensjoner i ulike konsentrasjoner. For cellen opptelling, kan du fortynne 0,5 mL av cellen suspensjon i 1,5 mL PBS (andre fortynninger, f.eks 0,1 mL i 1,9 mL PBS, er også mulig). Bruk av denne metoden, som er basert på metoden trypan blå fargestoff eksklusjon, har vært beskrevet tidligere26. Flere andre enheter er kommersielt tilgjengelig for opptelling celle nummer og levedyktighet som skal fungere like bra. - Samle inn ønsket antall celler (dvs. ~ 24 x 106 celler å kjøre analysen med en komplett 96-brønns plate) i et sterilt 50 mL tube med sentrifugering (se materialer og reagenser for typen sentrifuge brukes) på 400 x g i 5 min på RT.
- Forsiktig helle av nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet. Legge fersk analysebuffer (f.eks 20 mL) og resuspend celler av pipettering forsiktig opp og ned.
- Sentrifuge cellene igjen på 400 x g i 5 min på RT.
- Hell av nedbryting igjen og resuspend celle pellet i frisk analysebuffer å få en tetthet på 5 x 106 celler/mL.
3. konkurransen bindende analysen
Merk: Selve konkurransen bindende analysen utføres på RT og kan utføres under ikke-sterilt forhold.
- Fortynne forbindelser under etterforskning i analysebuffer (se 2.2) å få ønsket konsentrasjonen. Enten forberede en fast konsentrasjon av sammensatt for første screening (f.eks 10 µM siste konsentrasjon) eller alternativt en seriell fortynning rekke konsentrasjoner mer detaljert karakterisering av forbindelser (f.eks en 1/3, 1/4 eller 1 / 5 fortynning serie som starter på 1 µM, siste konsentrasjon). Husk at den sammensatte løsningen vil til slutt bli 2 x fortynnet i analysen; derfor forberede en 2 x konsentrert løsning.
- Dispensere 100 µL av sammensatte løsning (2 x konsentrert) i en klar 96-brønns rundt bunnplaten (se tabell av materialer og reagenser) etter en forhåndsdefinert eksperimentelle lå ut (f.eks figur 1 c).
Merk: På dette stadiet, negative og positive eksempler er inkludert i analysen. I negativ kontroll prøvenlegges 100 µL av analysebuffer i stedet for sammensatte fordelt av 96-brønns plate. For positive kontroll prøvenlegges også analysebuffer i dette trinnet. Se også figur 1 c for et typisk eksperimentelle oppsett der en fortynning rekke flere forbindelser er testet. - Legge til 50 µL av cellen suspensjon (se 2.7; 0,25 x 106 celler) fra en reagens reservoar i 96-brønnen platen ved hjelp av en flerkanals pipette. Inkuber platen i 15 min på RT i mørket.
- Legge til 50 µL av fluorescently merket CXCL12 (dvs. 100 ng/mL av CXCL12AF647 i analysebuffer, 4 x konsentrert, 25 ng/mL siste konsentrasjon) fra et lignende reagens reservoar fordelt av 96-brønns plate. Inkuber i 30 min på RT i mørket.
Merk: For negativ kontroll vareprøver, knytte analysebuffer i stedet. Fluorescerende signalet i negativ kontroll prøvene vil derfor tilsvare autofluorescent bakgrunn signal (figur 1A). For positive kontroll prøver, legge 50 µL/godt av CXCL12AF647. Positiv kontroll prøvene vil gi maksimal fluorescens signalet oppdaget, siden ingen potensielle hemming av pre-inkubering med stoffer ble inkludert (figur 1A). - Sentrifuge 96-brønns platen på 400 x g i 5 min på rett fjerne nedbryting fra pelleted celler ved å bla over platen. Tørr plate på en vev.
- Legge til 200 µL av fersk analysebuffer fra en reagens reservoaret fordelt ved hjelp av en flerkanals pipette. Gå rett.
- Sentrifuge platen igjen i 5 min på 400 x g ved RT. Fjern nedbryting av bla over platen og tørk den igjen på vev.
- Forsiktig resuspend celle pellet i 200 µL av 1% paraformaldehyde oppløst i PBS. Dette trinnet vil fikse cellene.
- Fortsette protokollen umiddelbart med kvantifisering av fluorescensen av flowcytometri.
4. analyse av prøvene av flowcytometri
CXCL12AF647 farget fiksert celler er nå klar til å bli analysert ved hjelp av flowcytometri. Flere typer flyt cytometers kan brukes, men de må være utstyrt med riktig laser (dvs. en rød laser, eksitasjon område ~ 630 nm) for eksitasjon og egnet filtre for fluorophore gjenkjenning (utslipp filtre ~ 660 nm). De trenger å være i stand til å håndtere prøver i 96-brønnen plate format. Eksempler på egnet flyt cytometri enheter er gitt i tabell av materialer og reagenser.
- Start opp enheten og åpne den tilsvarende programvaren (se tabell av materialer og reagenser).
- Velg følgende mobilnettet parametere til visualiseres i dot blot format: videresende xy (FSC), siden scatter (SSC) og fluorophore (CXCL12AF647) oppdagelsen kanalen.
Merk: Med parameteren FSC celler er diskriminert basert på størrelse, siden oppdaget lys absorpsjon er proporsjonal med cellens diameter. Parameteren SSC, måle lysspredning i 90° vinkel, gir informasjon om detaljene i cellene. - Velge ett utvalg (f.eks en negativ kontroll prøve) å utføre gating av en definert homogen celle befolkningen basert på parameterne FSC og SSC.
- Velg automatisk injeksjon av ~ 100 µL fiksert celler fra eksempelfilen negativ kontroll i flyt-cytometer. Velg alternativet "blande" før injeksjon og bruk en eksempel flow rate på 1,5 µL/s.
- Kjøre dette eksemplet ved å velge "Hent Data." FSC og SSC parameterne for dette eksemplet vises på skjermen.
- Velg programvarens gating verktøyet. Basert på FSC og SSC dot blot visualisering, pre-definere en homogen og levedyktig celle befolkningen av gating. Du gjør dette ved opprette en polygon (med programvaren gating verktøyet) som inneholder homogenously distribuert enkelt cellene ("arrangementer") basert på disse to dimensjonene.
Merk: Gating prosedyren er å definere en homogen og levedyktig celle befolkningen som skal brukes for videre analyse. Gating er avhengig av forutsetningen at flertallet av levedyktige cellers vil danne en homogen celle populasjon basert på parameterne FSC og SSC. Dette grepet, kan mobilnettet rusk, døde celler og celle aggregater i stor grad bli ekskludert fra videre analyse. En illustrasjon av gating prosessen er gitt i figur 1B.
- Velg for å analysere 20.000 "begivenheter" (dvs. enkeltceller) per prøve.
Merk: Dette betyr at for hver prøve, 20.000 cellene som faller innenfor forhåndsdefinerte porten til slutt vil bli analysert. Datainnsamling for hver prøve fortsetter inntil dette antallet hendelser er analysert. - Start Kjør (Velg "post Data"). Flow cytometri enheten vil nå analysere alle prøver en etter en ved mener fluorescens intensiteten (MFI) for hver prøve. Denne MFI tilsvarer mener fluorescerende signalet tilsvarer 20.000 cellene som faller innenfor den forhåndsdefinerte gate.
5. analyse
Bruk MFI innhentet for hver prøve alle ytterligere beregninger. Analyse av flyt cytometri data kan utføres av flere kommersielt tilgjengelig programvarepakker (se tabell av materialer og reagenser).
- For å finne ut prosentandelen hemming av fluorescerende bindende signalet, som følge av sammensatte pre-inkubering, gjelder følgende formel:
Hvor:
MFIExp = MFI av den eksperimentelle (= sammensatte behandlet) eksempel
MFIPC = MFI i kontrollen positiv
MFINC = MFI i kontrollen negative - For å bestemme IC50 verdien av et sammensatt (dvs. konsentrasjonen av stoff som kan redusere fluorescerende bindende signalet ved 50%), gjelde følgende formel:
Hvor:
Loggconc.2 = loggen over en konsentrasjon av forbindelse som resulterer i mindre enn 50% hemming av forskjellen mellom MFI verdien av PC og NC
Loggconc.1 = loggen over en konsentrasjon av forbindelse som resulterer i mer enn 50% hemming av forskjellen mellom MFI verdien av PC og NC
Merk: Alternativt ved svært aktive forbindelser, en dose-respons kurve som dekker flere logger av omfanget kan genereres basert på MFI tilsvarer hver testet konsentrasjon av sammensatte. Ved å bruke ikke-lineær regresjon kurve montering ved hjelp av riktig programvare (se tabell av materialer og reagenser), IC50 verdier kan deretter utledes fra genererte kurvene. Et eksempel på denne analysen er vist i Figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle arbeidsflyten av bindende analysen er presentert i figur 1A. En illustrasjon av flyt cytometri data innhentet for forskjellige utvalg typer i en standard eksperiment (dvs. negativ kontroll, positiv kontroll og eksperimentelle utvalg) er avbildet i figur 1B, og en mulig plate layout for å utføre analysen i 96-brønnen plate format er gitt i figur 1 c. Inkubasjon av Jurkat celler, som endogenously uttrykker chemokine reseptoren CXCR4 (dvs. GPCR av interesse i denne analysen) med økende mengder fluorescently merket CXCL12 (dvs. CXCL12AF647) resultert i økt nivåer av fluorescens (figur 2), reflekterer økte nivåer av ligand binding til CXCR4. For å demonstrere reseptor-spesifisitet av CXCL12AF647 binding, ble en veletablert og reseptor-spesifikke CXCR4 antagonist (de små molekylet AMD3100) brukt. Jurkat celler ble først pre inkubert med en 1/5 fortynning serie AMD3100 mellom 0.064 ng/mL 1000 ng/mL, etterfulgt av en inkubasjon med en siste konsentrasjon av 25 ng/mL CXCL12AF647 (dvs. fast mengden merket chemokine rutinemessig brukes i analysen). Deretter ble Jurkat celler ytterligere behandlet som beskrevet i protokollen. Fluorescerende signalet (mener fluorescerende intensiteten, MFI) etter tillegg av fast CXCL12AF647 til pre inkubert Jurkat cellene, ble innhentet av flyt cytometri analyse for alle utvalg. Fluorescerende signalet kan nesten bli helt hemmet i tilfelle Jurkat celler var pre-behandlet med den høyeste konsentrasjonen av AMD3100 (1000 ng/mL). Under denne tilstanden, hemmet nivået av fluorescens var bare litt over bakgrunnsnivået tilsvarer nivået av autofluorescence for Jurkat celler. Avslutningsvis generert bruke 25 ng/mL (siste konsentrasjon) av CXCL12AF647 i bindende analysen et stort fluorescerende signal vindu (i forhold til kontrollen negative) med et minimalt gjenværende uspesifisert reseptor binding ( Figur 3A).
Denne bindende analysen er primært brukt til skjermen for forbindelser forstyrre ligand binding i paneler av umerkede forbindelser i en enkelt fast konsentrasjon eller å studere doseavhengig effekten av aktive forbindelser. I sistnevnte tilfelle er målet å få IC50 verdier (dvs. konsentrasjonen av stoff som hemmer bindende signalet med 50%), som reflekterer bindende styrken av forbindelser. Figur 3 viser hvordan flyten cytometri innhentet med denne bindende analysen kan brukes til å bestemme hemmende styrken (i IC50) av små molekyler forstyrre binding av CXCL12 til CXCR4. Basert på doseavhengig hemming av CXCL12AF647 binding av AMD3100, identifiserte IC50 verdien her ved å bruke ikke-lineær regresjonsanalyse. I dette eksemplet tilsvarer den beregnede IC50 verdien for AMD3100 18.12 ng/mL. Fordi i screening kampanjer, fleste av tilfeldig valgte forbindelser forventes ikke å hemme binding av CXCL12AF647 å CXCR4+ Jurkat celler, et eksempel på en inaktiv forbindelse var også inkludert i denne studien. Her, ble små molekyl-maraviroc, som viser potent anti-HIV-1 aktivitet ved å opptre som en bestemt antagonist for CC chemokine reseptoren 5 (CCR5)27, testet i bindende analysen. Ingen hemming av maksimal fluorescerende binding ble oppdaget etter pre rugende Jurkat celler med maravoric, selv ved den høyeste konsentrasjonen testet (100 ng/mL; Figur 3B). I samme forsøket ble en seriell fortynning rekke AMD11070, en annen små molekyl relatert til AMD3100, men med bedre farmakokinetiske egenskapene28. I motsetning til maraviroc hemmet en 1/5 fortynning serien fra AMD11070, fra 0.0064 til 100 ng/mL klart og dose-dependently CXCL12AF647 binding (figur 3B).
Figur 1: oversikt over arbeidsflyt og illustrasjon av data innhentet. (A). de viktigste trinnene av protokollen er schematized for negative og positive kontroll prøver og sammensatte behandlet prøver. Prøvene uten sammensatte pre-inkubering og uten tillegg av fluorescently merket chemokine (CXCL12AF647) er inkludert for å finne bakgrunnen (auto) fluorescens (negativ kontroll eksempler). Prøver uten sammensatte pre-inkubering, men med tillegg av en fast mengde CXCL12AF647 brukes til å bestemme maksimal bindende signalet i analysen (positiv kontroll eksempler). I sammensatte behandlet prøver, er celler pre inkubert med sammensatte før addisjon av en fast mengde CXCL12AF647. (B). mener fluorescerende bindende signalet bestemmes av flyt cytometri analyse av Jurkat celler. Fra alle hendelser (dvs. Jurkat celler) analyserte (venstre panel) brukes bare fluorescerende signalet fra en port subpopulasjon celler for videre analyse (midten panel). Pre-inkubering av celler med små molekyler (f.eks AMD3100) hemmer binding av ligand fluorescently merket reseptor, og dette vil redusere maksimal bindende signalet (høyre panel, i et histogram representasjon). (C). en mulig plate layout når konkurransedyktige bindende analysen i 96-brønnen plate format. I dette tilfellet seks ulike forbindelser (cpd 1 - 6) er testet i en 1/5 føljetong fortynning serie (i duplikat) fra 1000 nM ned 0,32 nM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Binding av CXCL12AF647 Jurkat celler. Jurkat celler ble inkubert med økende mengder av CXCL12AF647, i fravær av pre-inkubering med sammensatte. Mener fluorescens intensitet (MFI, uttrykt i vilkårlig lyset enheter) ± SD vises (n = 2). Montering kurve ble utført ved hjelp av lineær regresjon ved hjelp av en en-side totalt bindende modell etter ligningen
med BMaks . (maksimal bestemt bindende) = 18,345; Kd = 92.8 ng/mL; NS (skråningen av uspesifikke bindende) = 2.139; og bakgrunnen = 332.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hemming av binding av CXCL12AF647 av aktive og inaktive forbindelser. (A) doseavhengig hemming av CXCL12AF647 binding av pre rugende celler med økende konsentrasjoner av AMD3100, før tillegg av 25 ng/mL CXCL12AF647. Merk at maksimale hemmet mener fluorescens intensitet (MFI, uttrykt i vilkårlig lyset enheter) er fortsatt litt over bakgrunnen (auto) fluorescens oppnådd for Jurkat celler (mener ± SD (n = 3)). Montering kurve ble utført med en variabel skråning (fire parametere) i henhold til ikke-lineær regresjon
HillSlope er her 1.313 og den beregnede IC50 er 18.12 ng/mL. (B). doseavhengig effekten av AMD11070 og maraviroc på CXCL12AF647 binding til CXCR4+ Jurkat celler (MFI ± SD (n = 3)). Kurven som passer for AMD11070 svaret ble utført tilsvarende med en HillSlope av 1.458 og beregnede IC50 verdien 0.9052 ng/mL. For maraviroc svaret, ble ingen passende utført gitt mangelen på aktiviteten til dette sammensatte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med andre typer bindende analyser (dvs. metning bindende og kinetisk bindende eksperimenter), er konkurransen bindende analyser best egnet for screening formål. Faktisk, de tillater evaluering av store grupper av umerkede forbindelser, for eksempel små molekyler, scoret deres evne til å påvirke bindingen for et fast beløp på en merket reseptor ligand. Forbindelser som binder seg til andre reseptor nettsteder enn merket ligand kan forbli uoppdaget i analysen. Selv om konkurransen bindende eksperimentet beskrevet heri fokuserer på chemokine reseptoren CXCR4 spesielt, kan det trolig tjene som en blåkopi for design av konkurransen bindende analyser for andre GPCRs. For eksempel ble CXC chemokine reseptoren 7 (CXCR7) beskrevet som en alternativ reseptor for CXCL12, i stand til bindende CXCL12 med høy affinitet29,30. Derfor brukes den samme merket chemokine (CXCL12AF647) som for den beskrevet CXCR4 konkurransen bindende analysen kan brukes til å konfigurere CXCR7 binding eksperimenter. Fordi CXCR4 og CXCR7 CXCL12 som en vanlig ligand, ville det være viktig å arbeide med cellular modeller som eneste av både reseptorer uttrykkes på celleoverflaten, for å evaluere bestemte reseptor bindende. Våre tidligere arbeid har vist at Jurkat celler ikke Vis endogene uttrykket CXCR717. Dermed i analysen beskrevet her for CXCR4, er interferens med binding til CXCR7 utelukket.
Flere viktige funksjoner for konkurransen bindende analysen tillate den å bli brukt som en rask, første screening verktøyet for å identifisere små molekyler forstyrrer Agonistiske binding til CXCR4. En av analysens viktigste fordelene er bruken av hele levende celler uttrykke reseptoren av interesse. Dette unnlater behovet for arbeidskrevende cellemembranen preparater. Også, lavt nivå av bakgrunn (auto) fluorescens oppdaget med Jurkat celler er gunstig. Med store signal vinduet innhentet etter tillegg av definerte fluorescently merket probe, bidrar det til en gunstig signal bakgrunn forhold. Dette forenkler påvisning av potensielle bindende hemming av umerkede forbindelser. I tilfelle dette bindende analysen utføres med andre CXCR4 uttrykke celler, anbefaler vi å alltid vurdere disse parametrene (bakgrunn fluorescens, signal-vinduet) forhånd som de kan variere fra cellen linje til cellen linje. Det faktum at Jurkat celler endogenously uttrykke CXCR4 til nivå over lengre perioder, gjør det en praktisk mobilnettet modell. Det samme nivået reseptor uttrykk kan fås med stabilt transfekterte cellen kloner. I kontrast, anbefaler vi ikke bruk av transiently transfekterte celler fordi dette vil sannsynligvis føre til en mye bredere distribusjon av fluorescens intensitet, færre forståelsesfull celler i analysen og mindre konsistens mellom eksperimenter. Siden ikke finnes noen CXCR4 negative Jurkat celler, ble spesifisitet av reseptor binding til disse cellene demonstrert av pre-inkubering med veletablerte bestemt reseptor antagonister (AMD3100 og AMD11070). Disse antagonister er strukturelt forskjellig fra merket ligand. Dette er viktig fordi, når du bruker den umerkede varianten av ligand som konkurrent, både med og uten etiketter ligand kan også konkurrere for å binde ikke-spesifikk bindende områder potensielt tilstede på celleoverflaten.
Bortsett fra mobilnettet verten, flere andre aspekter av analysen beskrevet her må tas i betraktning før du begynner å bygge en lignende analysen for andre GPCRs. Fluorescently merket sonder som mål GPCRs har blitt utviklet som alternativer for radioaktivt sonder, er men kun et begrenset antall GPCRs og de er relativt dyre. Videre kan modifikasjon av naturlige reseptor ligander med fluorophores endre bindingsegenskapene sammenlignet med umerkede overordnede molekylet, spesielt ved liten ligander (f.eks aminer) eller små peptider31, 32. For eksempel ved små ligander, et linker er vanligvis nødvendig å skille pharmacophore fra fluorophore til reseptorens orthosteric binding området31. Stabiliteten i reseptor-fluorescerende sonden komplekse må også tas i betraktning. I vår erfaring, etter 90-120 minutter (dvs., tiden det tar å kjøre to påfølgende 96-brønns plater), mener fluorescerende intensiteten for positiv kontroll brønnene vanligvis reduseres med ~ 5% sammenlignet med gjennomsnittet av alle positive kontroll på den plate, med sporadiske outliers mellom 5 og 10%.
Iboende aktiviteten til merket ligand er også av betydning. Mens reseptor antagonister vise ingen iboende aktivitet reseptoren, merket agonister sannsynlig indusere reseptor aktivisering og i konsekvens, reseptor internalisering. Dette kompromitterer reversibel natur ligand-reseptor samhandling33. For å minimere mulig problemer med reseptor internalisering, inkubasjon med merket ligand (i tilfelle en merket Agonistiske) må være begrenset i tid og bør fortrinnsvis utføres ved romtemperatur eller lavere. Det faktum at prosedyren utføres ved romtemperatur gjør analysen også praktisk og mer kompatible med screening innsats i plate format. Til slutt, et tilstrekkelig antall celler per prøve (f.eks 250.000 per brønn av en 96-brønns plate) bør brukes i analysen til slutt beholde et tilstrekkelig antall celler (20 000 celler, "enkelt arrangementer," basert på gating av befolkningen hele cellen, se Figur 1) for flyt cytometri analyse. Bruke mindre celler ville gjøre det vanskeligere å stadig når dette antallet analysert celler, noe som kan kompromittere påliteligheten av lese ut. Med mindre celler per prøve (per vel) vil også øke på tidsintervallet nødvendig å analysere utvalget av flowcytometri, og dermed øker den totale tiden å analysere en hel 96-brønns plate. Dette kompromitterer økt gjennomstrømning. På grunn av ovennevnte anledningen, fremtidige miniatyrisering til analysen kan således omdreining seg ikke å være en triviell oppgave.
Til sammen har en konkurransen bindende analysen som hovedsakelig brukes i vår lab som screening verktøyet for å identifisere små molekyler som kan konkurrere med en fast mengde merket CXCL12 for binding til CXCR4 blitt beskrevet i detalj. Disse bindende studiene er interessante som de er en relativt rask og enkel metode for å identifisere forbindelser kan reseptor bindende. Selv om identifikasjonen av forbindelser med bindende kapasitet er allerede verdifulle i seg selv, gir denne typen analysen ikke informasjon om aktiviteten av de identifiserte forbindelsene. Det gjenstår derfor nødvendig å validere og karakterisere deres potensielle agonistic eller antagonistiske aktivitet i andre farmakologiske og funksjonelle reseptor analyser. Av interesse, i CXCR4 har det vært vist at reseptor antagonister som viser økt aktivitet i bindende analysen (dvs. som genererer lave IC50 verdier for bindende hemming) utfører relativt bedre i andre CXCR4-relaterte søk også17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Eric Fonteyn for utmerket kundestøtte. Dette arbeidet har vært støttet av KU Leuven (gi nei. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, gir ingen. G.485.08) og Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
References
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
- Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
- Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
- Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
- Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
- Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
- De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
- Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
- Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
- Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
- Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).
