Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ساعد فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية لتدبير الكروماتين الوصول في خلايا الثدييات

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/57272
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

Summary

ويسيطر اللدونة للهندسة النووية آليات جينية الديناميكية بما في ذلك الترميز غير الكشف الحمض النووي مثلايشن وإعادة تموضع nucleosome، فضلا عن تكوين هيستون والتعديل. هنا يمكننا وصف بروتوكول عزل فورمالديهيدياسيستيد من عناصر تنظيمية (العملية) الذي يتيح تحديد الوصول الكروماتين في طريقة استنساخه وغير مكلفة وبسيطة.

Abstract

التعبير الجيني المناسب استجابة لإشارات خارج الخلية، هو النسخ الجينات الخاصة بالانسجة والنسب، تعتمد اعتماداً حاسما على دول محددة بدرجة عالية من منظمة الكروماتين. بنية النواة دينامية يتم التحكم بواسطة آليات متعددة والأشكال برامج الإنتاج النسخي. ولذلك، من المهم تحديد الوصول الكروماتين موقعا على حدة بطريقة موثوقة التي يفضل أن تكون مستقلة من الأجسام المضادة، التي يمكن أن تكون مصدر التباس يحتمل أن تقلب التجريبية. ويمكن قياس إمكانية الوصول الكروماتين بأساليب مختلفة، بما في ذلك فحص العزل فورمالديهيدياسيستيد من العناصر التنظيمية (العملية)، التي تسمح تحديد إمكانية الوصول العام الكروماتين في عدد قليل نسبيا من الخلايا. هنا يصف لنا فير بروتوكول يسمح لتحديد مناطق الجينوم مع شغل بروتين منخفض بسيطة وموثوق بها وسريعة. في هذا الأسلوب، منضمة إلى البروتينات الكروماتين استخدام فورمالدهايد كعامل crosslinking تساهمي الحمض النووي والمنفصمة إلى قطع صغيرة. بعد ذلك إثراء الحمض النووي مجاناً باستخدام الفينول: كلوروفورم الاستخراج. نسبة الحمض الحر يتحدد بكمية البلمرة المتسلسل (qPCR) أو تسلسل الحمض النووي (DNA-seq) مقارنة بعينه السيطرة تمثل مجموع الحمض النووي. يتم إثراء المناطق بهيكل أكثر مرونة من الكروماتين في عينة الحمض النووي مجاناً، مما يسمح بتحديد مناطق الجينوم مع انخفاض الضغط الكروماتين.

Introduction

هي معبأة بأحكام الحمض النووي للخلايا حقيقية النواة في نوكليوسوميس، الذي يحتاج إلى إزالة أو تشكيلها من أجل السماح بالتفاعل بين البروتينات الأخرى مع الحمض النووي. النسخي تنشيط الجين عادة ما يؤدي إلى تكوين أكثر انفتاحاً لهيكل نوكليوسومال، لا سيما في نوكليوسومي + 11، تيسيرا للنسخ بالحمض النووي الريبي بوليميراز. أيضا، المناطق التنظيمية مثل المروجين والقدرة على تغيرات دينامية في إمكانية الوصول الكروماتين للسماح بالتفاعل مع المعدلات الكروماتين أو عوامل النسخ2. وضعت عدة نهج لتحديد هذه المناطق خالية من نوكليوسومي. وتشمل هذه الحساسية إلى نوكليسيس مثل الدناز أنا3 أو نوكلاس ميكروكوككال4، الذي يمكن الوصول إليه فقط الحمض النووي عند غير محكم التفاف حول نوكليوسوميس. وتشمل أساليب أخرى للتعرف على الكروماتين مفتوحة أو الحمض الحر إدماج عناصر ريتروترانسبوسابل (مقايسة للوصول ترانسبوساسي "الكروماتين"، أتاك) ترانسبوساسي بوساطة5، أو باستخدام إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) الكروماتين أجسام مضادة ضد هيستونيس. أسلوب عدم التدخل لا يستند إلى قدرة إنزيم للوصول إلى الحمض النووي أو الربط من جسم مضاد لبروتين معين، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على تطهير المناطق الحرة نوكليوسومي من6،استخراج كلوروفورم فينول:7. في هذا الأسلوب، الحمض النووي تساهمي ملزمة للبروتينات الكروماتين فورمالدهايد عامل crosslinking والمنفصمة بعد ذلك إلى قطع صغيرة قبل sonication. وسيكون مناطق الكروماتين محكم معبأة وفرة الحمض النووي/البروتين كروسلينكس، بينما المناطق الحمض النووي مع نوكليوسوميس لا يوجد أو قليل سوف يكون قليلاً أو لا كروسلينكيد الحمض النووي/البروتين المجمعات. يسمح استخراج فينول: كلوروفورم تنقية كروسلينكيد-الحمض النووي مجاناً في المرحلة المائية، بينما كروسلينكيد الحمض النووي للبروتينات يتم التقاطها في المرحلة الفينول العضوية أو في الطور البيني مائي العضوية إلى جانب البروتينات. التحديد الكمي لهذا الحمض الحر مقارنة بإشارة من مجموع عينة الحمض النووي يسمح تحديد المناطق الحرة الكروماتين. الأسلوب فير يمكن استخدامها لتوصيف مناطق الجينوم الفردية كما هو موضح هنا، بل هو أيضا مناسبة للتعرف على إمكانية الوصول على نطاق الجينوم الكروماتين عندما يقترن بتسلسل العميق كما هو موضح في نماذج مختلفة8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-النتائج التي حصل عليها فير-seq وأساليب أخرى مثل seq أتاك هي متداخلة إلى حد كبير14. أسلوب عدم التدخل قوية جداً ورخيصة وسهلة لتنفيذ أسلوب لتحديد مناطق خالية من نوكليوسومي. خلافا لأساليب أخرى، أنها لا تتطلب تجارب رائدة لتحديد المستوى المناسب الهضم كما هو مطلوب ل nucleases (الدناز seq، seq منسى) أو ترانسبوساسيس (أتاك-seq) ونوقشت بالتفصيل في استعراض الأخيرة15. المعلمات فقط تعديلها هي سونيكيشن الشروط وفي بعض الحالات وقت التثبيت. وتصف هذه الورقة بروتوكولا مباشرة تخطيطياً المعروض في الشكل 1 ، والذي لا يتطلب أي معدات خاصة خلاف سونيكاتور. البروتوكول يمكن القيام بها في فترة زمنية قصيرة نسبيا ويجعل فير طريقة سهلة ويمكن الاعتماد عليها اختبار إمكانية الوصول الكروماتين في عدد من أنواع الخلايا المختلفة بدءاً من خلايا الرئة11 الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من كبد الفأر16.

Protocol

1-اليوم الأول: خلية ثقافة

  1. الثقافة في الخلايا ليتم تحليلها للمبلغ المطلوب. خلية ثقافة شروط ووسائل الإعلام تعتمد على أنواع الخلايا قيد التحقيق.
    ملاحظة: من حيث المبدأ، أي خلية حقيقية النواة قابلة لتحليل إمكانية الكروماتين بعدم التدخل. لهذه التجربة، وهي المصنفة 4 × 106 HEK 293T الخلايا في صحن واحد 10 سم في المتوسط دميم وتستكمل مع 10% (v/v) FBS و 1% (w/v) البنسلين/ستربتوميسين، والمحتضنة في 5% CO2 و 37 درجة مئوية عن 24 ساعة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70-80% (~ 8 × 10 6 خلايا للطبق الواحد).

2-يوم 2: Crosslinking فورمالدهايد وحصاد الخلية

تنبيه: فورمالدهايد عالي السمية ويجب أن تستخدم دائماً تحت غطاء دخان. ارتداء ملابس واقية (قفازات ومعطف مختبر). تجاهل النفايات على نحو ملائم.

  1. إضافة فورمالدهايد مباشرة إلى مستنبت الخلية في غطاء دخان للوصول إلى نهائي تركيز 1% (v/v) (270 ميليلتر من فورمالدهايد 37% (v/v) إلى 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة). احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) وعدد كبير اللوحات يدوياً كل 2 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن ضبط الوقت crosslinking طبقاً لنوع الخلية. لمعظم خطوط الخلية، 10 دقيقة من كروسلينكينج كافية. للأنسجة، إينكوبيشنز أطول قد تكون مطلوبة للسماح بتثبيت كافة الخلايا.
  2. إضافة جليكاين إلى تركيز نهائي من 0.125 M إخماد الفورمالدهايد (إضافة 500 ميليلتر من مخزون جليكاين 2.5 م إلى 10 مل من الثقافة المتوسطة). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وعدد كبير كل 2 دقيقة.
  3. تغسل الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني الباردة الجليد (8 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 0.2 جرام/لتر بوكل، 1.44 جرام/لتر Na2هبو4 · 2 ح2س، 0.24 غرام/لتر خ2ص4، ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 مع HCl أو هيدروكسيد الصوديوم). نضح المتوسطة وتغسل مباشرة في خلية ثقافة طبق أو قارورة بإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة مرتين ويجري حذراً جداً في حالة الخلايا ملتصقة فضفاضة مثل HEK-293T. إضافة برنامج تلفزيوني بعناية إلى جانب الطبق تفاديا لمفرزة من الخلايا.
  4. بعد الغسيل الثالث، ريسوسبيند الخلية الموجودة في 1 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب 1.5 مل رد فعل على الجليد. استخدام مكشطة خلية لفصل الخلايا عند الضرورة.
    ملاحظة: عند بدء تشغيل مع مادة محدودة، استخدام منخفضا الحمض النووي--ربط الأنابيب لتجنب فقدان عينة أثناء الإجراء.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 غرام x عند 4 درجة مئوية في منضدية تبريد أجهزة الطرد مركزي. تجاهل المادة طافية بعناية يسفط عليه.

3-الخلية تحلل وتفتت الكروماتين

  1. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل فير تحلل من المخزن المؤقت (1% (w/v)، 10 مم يدتا، 50 مم HCl تريس الأس الهيدروجيني 8.1، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، 10 ميكروغرام/مل أبروتينين، 2 مم بمسف)، وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج بعناية صعودا وهبوطاً عدة مرات. احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. تخزين العينات في-80 درجة مئوية في هذه الخطوة إذا لزم الأمر.
  2. Sonicate كروسلينكيد الحمض النووي القص أن حجم متوسط من 200-300 بي بي. يجب أن تحدد إعدادات محددة سونيكاتور لكل مصدر العينات والأجهزة المستخدمة sonication. وعلى أي حال ضمان أن الحمض النووي هو كفاءة المنفصمة. ويرد وصف خطوة الأمثل لقص الحمض النووي ضمن الخطوة 5.14. تبريد العينات على الجليد أثناء سونيكيشن لتجنب التسخين للعينة.
  3. الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة و 13,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
  4. نقل المادة طافية إلى أنبوب رد فعل جديد. تقسيم العينات في 100 ميليلتر مختبرين. تخزين العينات في-80 درجة مئوية، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يمكن أن توقف البروتوكول في هذه المرحلة.

4-دي-كروسلينكينج لمراقبة الحمض النووي

  1. تتخذ من 100 ميليلتر الكوة من الخطوة 3.4 لعكس في التشعب وستستخدم كمرجع للحمض النووي في المجموع. إضافة 10 ميليلتر رناسي-أ (10 مغ/مل) واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
  2. إضافة 10 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل). استخدام كتلة حرارية القابلة لبرمجة لاحتضان ح 4 في 37 درجة مئوية وثم ح 6 عند 65 درجة مئوية تنشق البروتينات وعكس في كروسلينكس. وأخيراً، أمسك العينات في 4 درجات مئوية حتى يتم استئناف البروتوكول وثم انتقل إلى الخطوة 5.
    ملاحظة: استخدام بروتوكولات أخرى فير الكروماتين عينات من الخلايا التي لم يكن كروسلينكيد مرجعاً، مما يلغي الحاجة إلى دي-كروسلينكينج11. حقيقة أن هذه العينات ليست كروسلينكيد يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في كفاءة سونيكيشن أو في استقرار الحمض النووي، وبالتالي استخدام مجموع عينات مرجعية الحمض النووي التي خضعت لنفس الإجراء كعينات الاختبار أكثر دقة.

5-يوم 3: الفينول: كلوروفورم تنقية الحمض النووي

  1. تأخذ كروسلينكيد دي غير الكوة من الخطوة 3، 4. إضافة 10 ميليلتر رناسي-أ (10 مغ/مل) واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
  2. تتخذ خطوة نموذج الكوة كروسلينكيد دي غير 5.1 والعينة دي-كروسلينكيد من الخطوة 4، 2 والمضي قدما في نفس الوقت. إضافة ح2س للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 300 ميليلتر.
  3. إضافة 300 ميليلتر من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل (25:24:1) في غطاء الدخان ودوامه بقوة.
    تنبيه: الفينول السامة والمسببة للتآكل، ويجب أن تستخدم دائماً تحت غطاء دخان. ارتداء ملابس واقية (قفازات ومعطف مختبر)، تأكد من أنابيب رد فعل تكون مغلقة بأحكام، والتخلص من النفايات على النحو المناسب.
  4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز في 4 درجات مئوية.
  5. نقل ميليلتر 280 المرحلة المائية العليا بعناية إلى أنبوب رد فعل جديد. تأكد من عدم القيام بأي حطام من الطور البيني التي تحتوي أيضا على البروتينات. تجاهل مرحلة انخفاض المتبقية كنفايات المذيبات العضوية.
  6. كرر الخطوات من 5، 3 إلى 5.5 ونقل ميليلتر 270 المرحلة المائية العليا بعناية إلى أنبوب رد فعل جديد.
  7. إضافة 270 ميليلتر من كلوروفورم في غطاء الدخان ودوامه بقوة.
    ملاحظة: يتم استخدام هذه الخطوة إلى القضاء على أي الفينول المتبقي من العينة.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز في 4 درجات مئوية.
  9. بعناية نقل 250 ميليلتر المرحلة المائية العليا إلى أنبوب رد فعل جديد، مع الحرص على عدم تحمل أي حطام الطور البيني. تجاهل العينة المتبقية كنفايات المذيبات العضوية.
  10. إضافة 25 ميليلتر من 5 م كلوريد الصوديوم و 250 ميليلتر من الايزوبروبانول. إضافة 5 ميليلتر من الجليكوجين (20 ملغ/مل) كالحمض النووي الناقل. خلط جيدا بعكس الأنابيب واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز عند 4 درجة مئوية يعجل بالحمض النووي.
  11. أغسل بيليه الحمض النووي مع 400 ميليلتر من الإيثانول 70% (v/v). أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز في 4 درجات مئوية.
  12. نضح المادة طافية بعناية واسمحوا بيليه الجاف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند في 100 ميليلتر TE العازلة (10 ملم تريس pH 8، 1 مم يدتا).
  13. احتضان عينة الحمض النووي كروسلينكيد دي غير مجانية ح 4 في 65 درجة مئوية لإزالة الحمض النووي بين كروسلينكس. تخزين العينات في-20 درجة مئوية.
  14. تحديد مقدار الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي وتشغيل قاسمة التحقق من حجم جزء على 2% (w/v) [اغروس] هلام. ضبط الوقت وكثافات الإمالة، واعتماداً على نتائج تحليل الحمض النووي الحجم من [اغروس] هلام التفريد، للحصول على حجم متوسط من 200-300 بي بي.

6-تحديد "مجموع مجاناً مقابل الحمض النووي" بالكمي PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR)

  1. نسبة الحمض النووي nucleosome خالية (في ما يلي المشار إليها كالحمض النووي مجاناً) مقابل مجموع الحمض النووي يتحدد بكر قرة17،18. يمكن أيضا تحليل عينات بالتهجين ميكرواري أو عميق تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة فيما يتعلق بالكمية.
  2. تصميم كبسولة تفجير qPCR للمناطق لفحصها وعناصر إيجابية وأخرى سلبية.
    ملاحظة: هي عناصر إيجابية مناسبة الإشعال الواقعة في المروج للتدبير المنزلي يدون بنشاط الجينات مثل أكتب أو GAPDH أو TPI1 أو TUBA1A (ترميز β-أكتين، جابده، TPI أو α-Tubulin). وتوجد ضوابط ملائمة للسلبية في المناطق هيتيروتشروماتين أو الصحارى الجينات. يمكن تصميم عناصر تحكم أخرى سلبية مناسبة في الجينوم المناطق المتاخمة لمحور التنظيم بشكل حيوي قيد التحقيق لعنصر التحكم للنسخة المحلية عدد الاختلافات (الجدول 1).
  3. تخفف من عينات الحمض النووي لتركيز نهائي 10 نانوغرام/ميليلتر مع المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، ومراعاة عامل تخفيف للحسابات النهائية (راجع الخطوة رقم 6، 5).
  4. قم بإعداد رد فعل قبكر في تريبليكاتيس في صفيحة 96-جيدا، مع مزيج الرد التالي كل بئر: قالب الحمض النووي: 20 نغ (2 ميليلتر)، إلى الأمام التمهيدي 200 نانومتر (0.4 ميليلتر من مخزون 5 ميكرومتر)، وعكس التمهيدي 200 نانومتر (0.4 ميليلتر من مخزون 5 ميكرومتر) ، استعداد تجارية لاستخدام مزيج التفاعل التي تحتوي على الصبغة الخضراء (5 ميليلتر من أسهم 2 x)، وح2س إلى 10 ميليلتر.
  5. تشغيل في جهاز qPCR في وقت الحقيقي، باستخدام طريقة القياس الكمي المطلق، وتحديد الأشعة المقطعية للعينات مع أزواج التمهيدي مختلفة. حساب نسبة استرداد الحمض الحر إلى مجموع الحمض النووي لكل التمهيدي باستخدام الصيغة التالية، مع مراعاة عوامل التخفيف من الخطوة 6.3:
    Equation 1
    وترد نتائج تمثيلية وحساب مثال في الجدول 2.
  6. وللتعويض عن الفروق بين العينات، تطبيع نسبة استعادة السيطرة الإيجابية:
    Equation 2

Representative Results

أننا استخدمنا الأسلوب فير لقياس الاختلافات في إمكانية الحصول على الكروماتين MHC class الثاني الجينات في الخلايا HEK293T ك نشر19. يتم التعبير عن MHC class الثاني ترميز الجينات في مستضد تقديم الخلايا (Apc)، أما مؤثرا أو استجابة سيتوكين مما يشير إلى20. مهسيي الجينات تحركها منشط معقدة التي تربط بين عناصر محددة من الحمض النووي، وصف مربعات XY، الموجود في المروج والقدرة على هذه الجينات،من21إلى22. وينعكس هذا على مستوى الكروماتين، كما يتبين من التحليل فير لمناطق مختارة في MHC class الثاني الجينات هلا DPB1 وهلا DMA. وأظهرت هذه التجارب أن الكروماتين فتح في المناطق التي تشمل صناديق XY، بينما أكثر أحكاما في الهيئات الجينات (الشكل 2).

على سبيل مثال، للحسابات، وفي هذه التجربة، خاصة وإننا المخفف المجموع عينة الحمض النووي 10 مرات (عامل تخفيف 10)، وكان لا تضعف عينة الحمض النووي مجاناً (عامل إضعاف 1) لل قرة--[بكر]. مجلس التجارة في الخدمات التي تم الحصول عليها لمختلف مناطق اختبار ويتم سرد العمليات الحسابية الحصول على نسب الاسترداد النهائي ونسب الانتعاش النسبي في الجدول 2- تم الحصول على هذه النسب الانتعاش النسبي باستخدام المروج أكتب كعنصر إيجابي. علما بأن هذه الحسابات واحدة من replicates المستخدمة لتوليد النتائج هو مبين في الشكل 2.

في سياق مختلف، تم اختبار الكروماتين إمكانية الوصول في نموذج للتعبير الجيني إيندوسيبلي. وفي هذه الحالة، تم قياس التغيرات السريعة من الضغط الكروماتين في الاستجابة لعامل حافز برو-التهابات نخر الورم (تنف). وقد تركت خلايا هيلا غير المعالجة أو حفز مع تنف ح 1، تليها فير لقياس الضغط الكروماتين في منطقة المروج التعبير المسيطر من الجينات ترميز انترلوكين سيتوكين تنف استجابة 8 (IL8). وأظهرت هذه النتائج الكروماتين بشدة زيادة إمكانية الوصول إلى في مروج IL8 تنف حفز الخلايا (الشكل 3). إمكانية الوصول إلى في المروج إيل-8 بعد التحفيز تنف أعلى حتى من التي وجدت في مروج أكتب عرض الكروماتين درامية يعيد البناء في هذه المنطقة التنظيمية. كما أن نسبة الاسترداد التي تم الحصول عليها في هذه الحالة أعلى من التي حصلت في المنطقة تستخدم كعنصر إيجابي (أكتب المروج) نسبة الانتعاش النسبي أعلى من أحد.

Figure 1
رقم 1: "عدم التدخل" سير العمل. الخلايا كروسلينكيد مباشرة في خلية ثقافة قارورة أو طبق بإضافة فورمالدهايد (A). بعد تبريد الفورمالدهايد، خلايا يتم غسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة الجليد (ب)، ونقل إلى أنبوب رد فعل حيث حراكه في المخزن المؤقت لتحلل فير وسونيكاتيد لقص الحمض النووي (ج). قاسمة واحد من الكروماتين المستخرجة كروسلينكيد دي بتدفئة في 65 درجة مئوية، للحصول على مجموع الإشارة الحمض الخلوي الصبغي (د)، وبعد ذلك يتم استخراج الحمض النووي مجاناً باستخدام الفينول: كلوروفورم كلا من كروسلينكيد ومختبرين دي-كروسلينكيد (ه). وأخيراً، هو كمياً الحمض النووي، وتحسب نسبة مجاناً مقابل إجمالي الحمض النووي (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحديد الوصول الكروماتين في الجينات ثانيا الطبقة MHC الكتلة في الخلايا HEK293T- وجرى تحليل خلايا HEK293T بعدم التدخل. النسبة بين مجاناً مقابل مجموع الحمض النووي (أي.، نسبة الانتعاش النسبي) مصممة للمروج للجينات أكتب كعنصر إيجابي، منطقة هيتيروتشروماتين على 12 أخبار كالمراقبة السلبية، والمناطق التنظيمية وهيئات الجينات MHC الفئة الثاني الجينات DMA هلا وهلا DPB1. يظهر الجزء العلوي تمثيل تخطيطي لمحور ومواقف الإشعال. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية من اثنان replicates البيولوجية يقاس في تريبليكاتيس. تم تعديل الرقم من تقرير منشور19. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التغييرات من وصول الحمض النووي في مروج IL8 استجابة للعلاج تنف. وقد حفز خلايا هيلا مع تنف (20 نانوغرام/مل) ل 1 ح وتم تحليلها بعدم التدخل. النسبة بين مجاناً مقابل مجموع الحمض النووي مصممة لمروج أكتب (مراقبة إيجابية) ومنطقة هيتيروتشروماتين في أخبار 12 (المراقبة السلبية) والمروج IL8. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية للوسط (SEM) من ثلاثة replicates البيولوجية يقاس في التكرارات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الاستغلال الأمثل للظروف sonication. وكان سونيفيد الكروماتين المستخرجة من خلايا 293T باستخدام سونيكاتور مركزة مع أنابيب مناسبة (جدول المواد). كان سونيكاتيد لونين للوقت المشار إليه مع تكرار 30 s مع الإعدادات التالية: ذروة السلطة 150، واجب عامل 15، دورات كل انفجار 500، تليها 30 s: ذروية 2.5، واجب عامل 15، دورات كل انفجار 500. وكان الكروماتين الناتجة دي-كروسلينكيد، تنقية باستخراج الفينول: كلوروفورم وتحميلها في 2% [اغروس] هلام. ويرد اثيديوم بروميد الملون هلام، ويتم الإشارة إلى مواقف علامات الوزن الجزيئي في بي بي. في هذه التجربة، تم الحصول على الحجم الأمثل الكروماتين (200-300 bp) بعد 20 دقيقة من sonication. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التمهيدي التسلسل
أكتب-المروج-F آآجكاكتتكجاكج
أكتب-المروج-R تككتكاتكتكجكتكتكجك
12 أخبار سلبية تحكم-F أتجتجككاكتجججاتكت
12 أخبار سلبية تحكم-R تجككااجككتاجججاجا
هلا DMA-س ص-مربع-إف كاتكاجتكاكتجججاجاكج
هلا-DMA-س ص-مربع-R جكتكككاجكككاجتاكات
هلا DMA-5 '-إف جاجاجاكاتكتككجكتكا
هلا-DMA-5 '-R أجكتجكتاتجتجتجتغت
هلا DMA-3 '-إف تجججاككتاجتاججاجك
هلا-DMA-3 '-R أجاتككاتججاجاجكت
هلا-DPB1-س-مربع-F جتككاتكككاججتكاكاج
هلا-DPB1-س-مربع-R تجاااجاجكتجكاجتكاجا
هلا-DPB1-5 '-F جكجتجتكاتجتكتجكاتكك
هلا-DPB1-5 '-R تجاتككتكاجاجككتجاكا
هلا-DPB1-3 '-F ككاجككتاججتجاتجتت
هلا-DPB1-3 '-R جككتججتاجااتككجتكا
IL8 المروج-F جتجاتجاكتكاجتتجكككت
IL8 المروج-R كتاتجاجتجكتككجتج

الجدول 1: كبسولة تفجير ل qPCR.

Table 2
الجدول 2: مثال على العمليات الحسابية من "نسب الانتعاش النسبي فير"- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

فير وسيلة قوية وغير مكلفة يسمح بتحديد مناطق خالية من نوكليوسومي. ويستند على مبدأ أن الحمض النووي الملتفة حول nucleosomes يمكن بسهولة كروسلينكيد إلى هيستونيس. استخراج كلوروفورم فينول: يستخدم لفصل غير كروسلينكيد وخالية من البروتين شظايا من الحمض النووي من البروتين-ربط الحمض النووي، الذي تم العثور عليه في مرحلة الفينول أقل، وإلى حد ما في الطور البيني (الشكل 1). ولذلك، مناطق خالية من نوكليوسومي مفرطاً في جزء صغير من الحمض النووي مجاناً في مرحلة مائي. وصف عدد من المنشورات بروتوكولات مفصلة فير الأسلوب23،24،25،26، التي يمكن الرجوع إليها لاستكمال الإجراء الموضح هنا.

مماثلة لسائر الأساليب المستخدمة لتحديد هيكل الكروماتين، يعتمد الأسلوب فير أيضا حاسمة على القص المثلى من الحمض النووي. إذا كانت الأجزاء طويل جداً، سيتم حجب أي منطقة خالية من نوكليوسومي بالحمض النووي المرتبطة الكروماتين المجاورة. إذا كانت الشظايا صغيرة جداً، يصبح من الصعب جداً الكشف بواسطة qPCR أو تسلسل عميق. ولهذا السبب، سونيكيشن من الحمض النووي هو معلمة حاسمة يجب أن تسيطر والأمثل من أجل الحصول على أجزاء حول طول 200-300 شركة بريتيش بتروليوم، التي تمثل 1-2 نوكليوسوميس (الشكل 4).

معلمة أخرى يمكن أن تؤثر على النتيجة النهائية هو كروسلينكينج عينة. على الرغم من أن الإجراء التثبيت الموضحة هنا صالحة لمعظم خطوط الخلايا، الباحث يجب أن تقيم بعناية هذه الخطوة للحصول على نموذج خاص قيد الدراسة، خاصة عند استخدام الأنسجة، حيث قد يكون من الضروري السماح لأوقات أطول في التثبيت فورمالدهايد للوصول إلى الخلايا في كل عينة الأنسجة.

على عكس الأساليب الأخرى، مثل الدناز أنا أو فرط نوكلاس ميكروكوككال أو شرائح، أو أتاك، فير لا تعتمد على نشاط الأنزيمي أو أجسام مضادة محددة، ولذلك فإنه لا حاجة المعايرة أو تحسين شروط رد فعل. وهذا يجعل فير طريقة مثالية لقياس إمكانية الوصول الكروماتين لمختبرات مع خبرة قليلة في مجال الكروماتين. وباﻹضافة إلى ذلك، تجارب رائدة مطلوبة فقط من أجل تحسين الخطوة قص الحمض النووي، وفي الوقت كروسلينكينج، عند الضرورة.

الطريقة التي وضعت في البداية في الخميرة6، بل أنها امتدت أيضا إلى خلايا الثدييات. يمكن استخدام الحمض النووي تنقيته باستخدام أسلوب عدم التدخل لتسلسل العميق، السماح لتوصيف حالة الكروماتين على نطاق الجينوم. وهذا الفعل قد أثبتت أنها مفيدة في عدد من الدراسات8،9،10،11،،من1213،،من1927، 28.

إظهار النتائج من التجارب فير-seq تداخل كبير مع النتائج التي تم الحصول عليها بطرق أخرى مثل الدناز-seq14، على الرغم من أن تنشأ بعض الاختلافات. هذا هو سبب الاختلافات المنهجية على سبيل المثال يمكن أن لا تزال تعيق nucleosomes استرخاء أو تشكيلها الانقسام ومن الدناز الأول، بينما هذه المناطق الحمض النووي سوف تكون أقل عرضه لإنتاج كروسلينكس الحمض النووي/البروتين وهكذا سوف يتحدد حسب خالية من نوكليوسومي المناطق باستخدام فير9. أيضا، وجود بروتينات غير هيستون مثل رنا بولمرس أو القارئ البروتينات لعلامات جينية يمكن أن يسفر عن كروسلينكس الحمض النووي/البروتين وهكذا سوف تفسر على أنها مناطق معبأة البروتين في التجارب فير. وهذه القيود الملازمة لكل أسلوب يستخدم لتحديد الدولة الكروماتين، مما يزيد الحاجة إلى استخدام مزيج من أساليب مختلفة للحصول على نظرة شاملة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر تيلمان بورجريفي (جامعة جيسين) يرجى تقاسم الجهاز sonication. دعم العمل من M.L.S. من المنح المقدمة من الأوقيانوغرافية ألماني (شم 1417/8-3)، SFB/TRR81، SFB1021، SFB1213، والتميز الكتلة نظام القلب والرئتين (اككبس، EXC 147/2)، Deutsche كريبشيلفي (111447) والبرنامج إيمبرس-HLR جمعية ماكس بلانك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Carl Roth A156.1
Glycogen, 20 mg/ml Thermo Fisher R0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox Thermo Fisher AB1162B
Proteinase K, 20 mg/ml Thermo Fisher EO0491
RNase A, 10 mg/ml Thermo Fisher EN0531
Leupeptin Sigma L8511
Aprotinin Sigma A1603
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma 78830
milliTUBE 1 ml AFA Fiber Covaris 520130
Holder milliTUBE 1ml Covaris 500371
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosistems 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994 (2015).
  15. Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28 (2016).
  17. Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455 (2014).
  18. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50 (2013).
  19. Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547 (2017).
  20. Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
  26. Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660 (2017).
  28. Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

Tags

علم الوراثة، العدد 134، الكروماتين إمكانية الوصول، فير، العناصر التنظيمية، نوكليوسوميس، واستخراج الفينول: كلوروفورم، التشعب البروتين-الحمض النووي
ساعد فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية لتدبير الكروماتين الوصول في خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodríguez-Gil, A., Riedlinger,… More

Rodríguez-Gil, A., Riedlinger, T., Ritter, O., Saul, V. V., Schmitz, M. L. Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57272, doi:10.3791/57272 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter