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Genetics

स्तनधारी कोशिकाओं में क्रोमेटिन पहुंच मापने के लिए विनियामक तत्वों की Formaldehyde-असिस्टेड आइसोलेशन

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/57272
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

Summary

परमाणु वास्तुकला की प्लास्टिक की गैर कोडिंग RNAs, डीएनए मिथाइल, nucleosome के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हिस्टोन संरचना और संशोधन सहित गतिशील epigenetic तंत्र द्वारा नियंत्रित है । यहां हम एक Formaldehyde विनियामक तत्वों (साफ) प्रोटोकॉल जो एक reproducible, सस्ती, और सरल तरीके से क्रोमेटिन पहुंच के निर्धारण की अनुमति देता है की सहायता अलगाव का वर्णन ।

Abstract

उपयुक्त extracellular cues के जवाब में जीन अभिव्यक्ति, कि है, ऊतक और वंश-विशिष्ट जीन प्रतिलेखन, गंभीर क्रोमेटिन संगठन के उच्च परिभाषित राज्यों पर निर्भर करता है । नाभिक के गतिशील वास्तुकला कई तंत्र द्वारा नियंत्रित और transcriptional उत्पादन कार्यक्रम आकार है । इसलिए, एक विश्वसनीय फैशन है कि अधिमानतः एंटीबॉडी, जो प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता का एक संभावित स्रोत हो सकता है से स्वतंत्र है में लोकस विशिष्ट क्रोमेटिन पहुंच निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । क्रोमेटिन पहुंच विभिंन तरीकों से मापा जा सकता है, विनियामक तत्वों के Formaldehyde-असिस्टेड अलगाव (निष्पक्ष) परख, कि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम संख्या में सामांय क्रोमेटिन पहुंच के निर्धारण की अनुमति सहित । यहां हम एक निष्पक्ष प्रोटोकॉल है कि एक कम प्रोटीन अधिभोग के साथ सरल, विश्वसनीय, और जीनोमिक क्षेत्रों की तेजी से पहचान की अनुमति देता है का वर्णन । इस विधि में, डीएनए एक crosslinking एजेंट के रूप में formaldehyde का उपयोग कर क्रोमेटिन प्रोटीन के लिए बाध्य covalently और छोटे टुकड़े करने के लिए कतरनी है । मुक्त डीएनए बाद में phenol का उपयोग कर समृद्ध है: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण । नि: शुल्क डीएनए के अनुपात मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) या डीएनए sequencing कुल डीएनए का प्रतिनिधित्व करने वाले एक नियंत्रण नमूने की तुलना में (डीएनए seq) द्वारा निर्धारित किया जाता है । एक पराजित क्रोमेटिन संरचना के साथ क्षेत्रों मुक्त डीएनए नमूने में समृद्ध कर रहे हैं, इस प्रकार कम क्रोमेटिन संकुचन के साथ जीनोमिक क्षेत्रों की पहचान की अनुमति ।

Introduction

eukaryotic कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए कसकर nucleosomes में पैक किया जाता है, जो हटा दिया या आदेश में डीएनए के साथ अन्य प्रोटीन की बातचीत की अनुमति के लिए remodeled करने की जरूरत है. एक जीन के transcriptional सक्रियण आमतौर पर अपनी nucleosomal संरचना का एक और अधिक खुला विन्यास की ओर जाता है, विशेष रूप से + 1 nucleosome1में, आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा प्रतिलेखन की सुविधा के लिए. इसके अलावा, प्रवर्तकों और बढ़ाने के रूप में विनियामक क्षेत्र क्रोमेटिन संशोधक या प्रतिलेखन कारकों के साथ बातचीत की अनुमति देने के लिए अपने क्रोमेटिन पहुंच में गतिशील परिवर्तन से गुजरना2। इन nucleosome-मुक्त क्षेत्रों की पहचान करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं । इनमें DNase I3 या micrococcal nuclease4जैसे nucleases के प्रति संवेदनशीलता शामिल है, जो nucleosomes के आसपास कसकर लिपटी न होने पर ही डीएनए का उपयोग कर सकती है । ओपन क्रोमेटिन या मुफ्त डीएनए की पहचान के लिए अंय तरीकों में शामिल है transposase-retrotransposable तत्वों की मध्यस्थता एकीकरण (transposase के लिए परख-सुलभ क्रोमेटिन, ATAC)5, या क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) का उपयोग histones के खिलाफ एंटीबॉडी । निष्पक्ष विधि एक एंजाइम की क्षमता पर आधारित नहीं है डीएनए या एक विशेष प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी के बंधन तक पहुंचने के लिए, लेकिन इसके बजाय एक phenol द्वारा nucleosome मुक्त क्षेत्रों की शुद्धि पर निर्भर करता है: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण6,7। इस विधि में, डीएनए crosslinking एजेंट formaldehyde द्वारा क्रोमेटिन प्रोटीन के लिए बाध्य covalently है और बाद में sonication द्वारा छोटे टुकड़े करने के लिए कतरनी है । कसकर पैक्ड क्रोमेटिन क्षेत्रों में प्रचुर मात्रा में डीएनए होगा/प्रोटीन crosslinks, जबकि कोई या कुछ nucleosomes के साथ डीएनए क्षेत्रों कम या कोई crosslinked डीएनए/ एक phenol: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण जलीय चरण में गैर crosslinked मुक्त डीएनए की शुद्धि की अनुमति देता है, जबकि डीएनए crosslinked प्रोटीन कार्बनिक phenol चरण या जलीय-कार्बनिक चरण में एक साथ प्रोटीन के साथ कब्जा कर लिया है । कुल डीएनए नमूने के एक संदर्भ की तुलना में इस मुफ्त डीएनए के ठहराव क्रोमेटिन मुक्त क्षेत्रों की पहचान की अनुमति देता है । निष्पक्ष विधि व्यक्तिगत जीनोमिक क्षेत्रों के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यहां वर्णित है, लेकिन भी जीनोम चौड़ा क्रोमेटिन पहुंच की पहचान के लिए उपयुक्त है जब गहरे अनुक्रमण के लिए युग्मित के रूप में विभिंन मॉडलों में वर्णित है8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. मेलों द्वारा प्राप्त परिणाम-seq और अंय तरीकों जैसे ATAC-seq मोटे तौर पर14अतिव्यापी हैं । निष्पक्ष विधि एक बहुत मजबूत, सस्ते, और nucleosome मुक्त क्षेत्रों की पहचान करने के लिए विधि करने के लिए आसान है । अन्य तरीकों के विपरीत, यह nucleases के लिए आवश्यक के रूप में पाचन के उचित स्तर का निर्धारण करने के लिए पायलट प्रयोगों की आवश्यकता नहीं है (DNase-seq, MNase-seq) या transposases (ATAC-seq) और एक हाल की समीक्षा में विस्तार से चर्चा की15. केवल पैरामीटर समायोजित किया जा करने के लिए sonication शर्तों और कुछ मामलों में निर्धारण समय है । यह कागज एक सीधा प्रोटोकॉल है कि योजनाबद्ध रूप से चित्रा 1 में प्रदर्शित किया जाता है का वर्णन करता है और यह है कि किसी भी विशेष एक sonicator के अलावा अन्य उपकरणों की आवश्यकता नहीं है । प्रोटोकॉल एक यथोचित कम समय में प्रदर्शन किया जा सकता है और एक आसान और विश्वसनीय विधि के लिए विभिंन प्रकार के सेल के एक नंबर में क्रोमेटिन पहुंच परीक्षण फेफड़ों कोशिकाओं11 से प्राथमिक कोशिकाओं माउस जिगर से प्राप्त करने के लिए16।

Protocol

1. दिन 1: सेल संस्कृति

  1. संस्कृति प्रकोष्ठों को वांछित राशि का विश्लेषण किया जाए. सेल कल्चर की स्थिति और मीडिया जांच के अंतर्गत कक्ष प्रकारों पर निर्भर करता है ।
    नोट: सिद्धांत रूप में, किसी भी eukaryotic सेल निष्पक्ष द्वारा क्रोमेटिन पहुंच के एक विश्लेषण के लिए उत्तरदाई है । इस प्रयोग के लिए, 4 x 106 HEK-293T कोशिकाओं को 10% के साथ पूरक DMEM माध्यम में एक एकल 10 सेमी डिश में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं (v/v) FBS और 1% (w/v) पेनिसिलिन/streptomycin, और 5% CO2 और 37 ° c 24 h के लिए जब तक कोशिकाओं तक पहुंचने 70-80% संगम (~ 8 x 10 पर मशीन डिश प्रति 6 कोशिकाओं) ।

2. Day 2: Formaldehyde Crosslinking और सेल हार्वेस्टिंग

चेतावनी: Formaldehyde अत्यधिक विषाक्त है और हमेशा एक धुएं डाकू के तहत किया जाना चाहिए । सुरक्षात्मक कपड़े (दस्ताने और लैब कोट) पहनते हैं । कचरे को उचित रूप से त्यागें ।

  1. एक धुएं डाकू में सेल संस्कृति माध्यम को सीधे formaldehyde जोड़ें 1% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए (v/v) (270 µ एल के 37% (वी/वी) formaldehyde से 10 मिलीलीटर सेल संस्कृति माध्यम) । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन (20-25 डिग्री सेल्सियस) और कई प्लेटें मैंयुअल रूप से हर 2 मिनट ।
    नोट: crosslinking समय कक्ष प्रकार के अनुसार समायोजित किया जा सकता है । सेल लाइनों के बहुमत के लिए, crosslinking के 10 मिनट पर्याप्त है । ऊतकों के लिए, अब गर्मी सभी कोशिकाओं के निर्धारण की अनुमति देने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  2. ०.१२५ मीटर के अंतिम एकाग्रता के लिए glycine जोड़ें formaldehyde बुझाने के लिए (एक 2.5 एम glycine शेयर के 500 µ एल जोड़ने संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर) । कमरे के तापमान और कई हर 2 मिनट में 5 मिनट के लिए मशीन ।
  3. धो बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ 3x कोशिकाओं (8 g/NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l ना2HPO4 · 2H2हे, ०.२४ g/L KH2PO4, एचसीएल या NaOH के साथ पीएच को 7.4 समायोजित करें । मीडियम महाप्राण और पंजाबियों की 10 मिलीलीटर जोड़कर सीधे सेल कल्चर डिश या कुप्पी में धो लें । दोहराएं इस कदम को दो बार इस तरह HEK-293T के रूप में लचर अनुयाई कोशिकाओं के मामले में बहुत सावधान किया जा रहा है । पंजाबियों को सावधानी से डिश के पक्ष में जोड़ें ताकि कोशिकाओं की टुकड़ी से बचने के लिए ।
  4. तीसरे धोने के बाद, बर्फ शीत पंजाबियों की 1 मिलीलीटर में सेल को पुनर्निलंबित और बर्फ पर एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब को हस्तांतरण । आवश्यक होने पर कक्षों को अलग करने के लिए कक्ष खुरचनी का उपयोग करें.
    नोट: एक सीमित सामग्री के साथ शुरू करते हैं, प्रक्रिया के दौरान नमूना नुकसान से बचने के लिए कम डीएनए बाइंडिंग ट्यूबों का उपयोग करें ।
  5. 5 मिनट के लिए 300 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस में एक शांत तालिका के केंद्रापसारक के लिए केंद्रापसारक । supernatant को सावधानीपूर्वक aspirating से त्यागें ।

3. सेल Lysis और क्रोमेटिन विखंडन

  1. 1 मिलीलीटर faire lysis बफर में सेल गोली reसस्पेंड (1% (डब्ल्यू/10 मिमी EDTA, 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.1, 10 µ जी/एमएल leupeptin, 10 µ जी/एमएल aprotinin, 2 मिमी PMSF), और कई बार ऊपर और नीचे ध्यान से pipetting कोशिकाओं reसस्पैंड । बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन । इस कदम पर-80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की जरूरत है अगर दुकान ।
  2. Sonicate crosslinked डीएनए यह 200-300 बीपी के एक औसत आकार को कतरनी करने के लिए । sonicator की विशिष्ट सेटिंग्स नमूनों के प्रत्येक स्रोत और प्रयुक्त sonication डिवाइस के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । किसी भी मामले में सुनिश्चित करें कि डीएनए कुशलतापूर्वक कतरनी है । डीएनए कतरनी के लिए एक अनुकूलन कदम चरण ५.१४ के तहत वर्णित है । नमूने के हीटिंग से बचने के लिए sonication के दौरान बर्फ पर नमूनों को ठंडा करें ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट और 13,000 x g के लिए नमूना केंद्रापसारक ।
  4. supernatant एक नई प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । नमूनों को 100 µ l aliquots में विभक्त करें । -80 ° c, यदि आवश्यक हो तो नमूनों की दुकान ।
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर बाधित किया जा सकता है ।

4. De-नियंत्रण डीएनए के crosslinking

  1. crosslink रिवर्स करने के लिए और कुल डीएनए के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए कदम 3.4 से एक 100 µ एल aliquot ले लो । RNase के 10 µ एल जोड़ें-एक (10 मिलीग्राम/एमएल) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए मशीन ।
  2. Proteinase K (20 mg/एमएल) के 10 µ l को जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए मशीन और फिर 65 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए एक प्रोग्राम थर्मामीटरों-ब्लॉक का उपयोग करने के लिए प्रोटीन सट और crosslinks रिवर्स करने के लिए । अंत में, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने पकड़ जब तक प्रोटोकॉल फिर से शुरू है और फिर चरण 5 के लिए आगे बढ़ना है ।
    नोट: अंय मेलों प्रोटोकॉल कोशिकाओं से क्रोमेटिन नमूनों का उपयोग करें, जो संदर्भ के रूप में crosslinked नहीं किया गया है, इस प्रकार de-crosslinking11के लिए आवश्यकता को समाप्त करने । तथ्य यह है कि इन नमूनों crosslinked नहीं कर रहे है sonication दक्षता में या डीएनए स्थिरता में अंतर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इसलिए कुल डीएनए संदर्भ नमूने है कि परीक्षण के नमूनों के रूप में एक ही प्रक्रिया आया है का उपयोग अधिक सटीक है ।

5. Day 3: Phenol: डीएनए का क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण

  1. नॉन-डे-crosslinked aliquot को स्टेप 3.4 से लें । RNase के 10 µ एल जोड़ें-एक (10 मिलीग्राम/एमएल) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए मशीन ।
  2. नॉन-de-crosslinked aliquot प्रपत्र चरण 5.1 और de-crosslinked नमूना चरण 4.2 से ले और समानांतर में आगे बढ़ें । 300 µ l के अंतिम वॉल्यूम तक पहुंचने के लिए H2O जोड़ें ।
  3. phenol के 300 µ एल जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (25:24:1) एक धुएं डाकू और भंवर में जोरदार ।
    चेतावनी: Phenol संक्षारक और विषाक्त है और हमेशा एक धुएं डाकू के तहत इस्तेमाल किया जाना चाहिए । सुरक्षात्मक कपड़े पहनें (दस्ताने और लैब कोट), सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया ट्यूब कसकर बंद कर रहे हैं, और अपशिष्ट निपटान उचित ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 x g में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  5. ध्यान से एक नई प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए ऊपरी जलीय चरण के 280 µ एल स्थानांतरण । जो भी प्रोटीन होता है उस चरण से कोई भी मलबा लेने के लिए सुनिश्चित करें । शेष निचले चरण कार्बनिक विलायक अपशिष्ट के रूप में त्यागें ।
  6. दोहराएं चरणों 5.3 करने के लिए 5.5 और ध्यान से एक नई प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए ऊपरी जलीय चरण के 270 µ एल स्थानांतरण ।
  7. एक धुएं डाकू और भंवर में क्लोरोफॉर्म के 270 µ एल जोड़ें जोरदार ।
    नोट: यह चरण नमूना से किसी भी शेष phenol को समाप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 x g में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  9. ध्यान से एक नई प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए ऊपरी जलीय चरण के 250 µ एल हस्तांतरण, एक चरण से किसी भी मलबे ले जाने के लिए नहीं ध्यान रखना. शेष नमूना कार्बनिक विलायक अपशिष्ट के रूप में छोड़ें ।
  10. 5 M NaCl के 25 µ l को जोड़ें और isopropanol के 250 µ l डीएनए वाहक के रूप में ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम/एमएल) के 5 µ एल जोड़ें । ट्यूबों और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन पलटना द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 x g में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक के लिए डीएनए वेग ।
  11. 70% (v/v) इथेनॉल के 400 µ एल के साथ डीएनए गोली धो लें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 x g में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  12. महाप्राण supernatant ध्यान से और गोली शुष्क कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए करते हैं । 100 µ l ते बफर (10 एमएम Tris नं० 8, 1 एमएम EDTA) में पुनर्स्थगित ।
  13. गैर-de-crosslinked नि: शुल्क डीएनए नमूना 4 एच के लिए 65 डिग्री सेल्सियस में अंतर-डीएनए crosslinks को दूर करने के लिए । -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।
  14. एक spectrophotometer का उपयोग कर डीएनए की मात्रा को बढ़ाता है और एक 2% (डब्ल्यू/वी) agarose जेल पर टुकड़ा आकार की जांच करने के लिए एक aliquot चलाते हैं । agarose जेल ट्रो द्वारा डीएनए आकार विश्लेषण के परिणामों पर निर्भर करते हुए, कतरनी समय और तीव्रता को समायोजित करने के लिए, $३०० बीपी का एक औसत आकार प्राप्त करने के लिए ।

6. मात्रात्मक रीयल टाइम द्वारा नि: शुल्क बनाम कुल डीएनए का निर्धारण पीसीआर (qRT-पीसीआर)

  1. nucleosome-नि: शुल्क डीएनए के अनुपात (निंनलिखित में मुफ्त डीएनए के रूप में भेजा) बनाम कुल डीएनए qRT-पीसीआर17,18द्वारा निर्धारित की जाती है । नमूने भी मात्रात्मक microarray संकरण या जीनोम चौड़ा दृढ़ संकल्प के लिए गहरी अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
  2. डिजाइन क्षेत्रों के लिए qPCR प्राइमरों का परीक्षण किया जा करने के लिए और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए ।
    नोट: उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण ACTB, GAPDH, TPI1, या TUBA1A (एंकोडिंग β-Actin, GAPDH, TPI या α-Tubulin) के रूप में सक्रिय रूप से लिखित गृह व्यवस्था जीन के प्रवर्तक में स्थित प्राइमर हैं । उचित नकारात्मक नियंत्रण heterochromatin क्षेत्रों या जीन रेगिस्तान में पाए जाते हैं । अंय उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण जांच के तहत गतिशील विनियमित लोकस से सटे जीनोमिक क्षेत्रों में डिजाइन किया जा सकता है स्थानीय प्रति संख्या मतभेदों को नियंत्रित करने के लिए (तालिका 1) ।
  3. 10 एनजी/µ एल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए नमूनों को कमजोर ते बफर के साथ, और अंतिम गणना के लिए खाते में कमजोर पड़ने कारक ले (चरण 6.5 देखें) ।
  4. 96-वेल प्लेट में triplicates में qPCR रिएक्शन सेट करें, के साथ निंनलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण के प्रति अच्छी तरह से: टेंपलेट डीएनए: 20 एनजी (2 µ एल), फॉरवर्ड प्राइमर 200 एनएम (एक 5 µ एम स्टॉक के 0.4 µ एल), रिवर्स प्राइमर 200 एनएम (एक 5 µ मीटर स्टॉक के 0.4 µ एल) , एक वाणिज्यिक के लिए एक 2x स्टॉक से हरी डाई (5 µ एल युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग करने के लिए तैयार), और एच2O करने के लिए 10 µ एल
  5. पूर्ण ठहराव मोड का उपयोग कर, एक वास्तविक समय qPCR डिवाइस में भागो, और विभिन्न प्राइमरी जोड़े के साथ नमूनों की सीटी निर्धारित करते हैं । निम्न सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक प्राइमरी के लिए कुल डीएनए के लिए नि: शुल्क डीएनए की वसूली के अनुपात की गणना, खाते में 6.3 कदम से कमजोर पड़ने कारकों ले:
    Equation 1
    प्रतिनिधि परिणाम और एक उदाहरण परिकलन तालिका 2में दिए गए हैं ।
  6. नमूनों के बीच अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, सकारात्मक नियंत्रण वसूली अनुपात को सामान्य:
    Equation 2

Representative Results

हमने मेलों विधि का इस्तेमाल किया है HEK293T कोशिकाओं में MHC वर्ग द्वितीय जीन के क्रोमेटिन पहुंच में मतभेदों को मापने के रूप में प्रकाशित19। MHC कक्षा द्वितीय एंकोडिंग जीन में व्यक्त कर रहे है प्रतिजन (APCs) कोशिकाओं को पेश, या तो constitutively या cytokine संकेतन के जवाब में20। MHCII जीन की अभिव्यक्ति एक उत्प्रेरक जटिल है जो विशिष्ट डीएनए तत्वों को बांध से प्रेरित है, XY बक्से, प्रवर्तक और इन जीनों21,22के बढ़ाने में स्थित है । यह क्रोमेटिन के स्तर पर परिलक्षित होता है, के रूप में MHC वर्ग द्वितीय जीन एचएलए-DPB1 और एचएलए-DMA में चयनित क्षेत्रों के हमारे निष्पक्ष विश्लेषण से पता चला । इन प्रयोगों से पता चला कि क्रोमेटिन XY बक्से को शामिल क्षेत्रों में खुला है, जबकि यह जीन निकायों में अधिक कॉंपैक्ट है (चित्रा 2) ।

एक उदाहरण के रूप में, गणना के लिए, इस विशेष प्रयोग में, हम कुल डीएनए नमूना 10 बार (कमजोर पड़ने फैक्टर 10) पतला, और मुफ्त डीएनए नमूना पतला नहीं था (कमजोर पड़ने फैक्टर 1) qRT-पीसीआर के लिए । परीक्षण और अंतिम वसूली अनुपात और रिश्तेदार वसूली अनुपात प्राप्त करने के लिए गणना विभिन्न क्षेत्रों के लिए प्राप्त सीटीएस तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं. इन सापेक्ष वसूली अनुपात सकारात्मक नियंत्रण के रूप में ACTB प्रमोटर का उपयोग कर प्राप्त किया गया । ध्यान दें कि ये परिकलन आरेख 2में दिखाए गए परिणामों को जनरेट करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिकृतियों में से एक के लिए हैं ।

एक अलग संदर्भ में, क्रोमेटिन पहुंच inducible जीन अभिव्यक्ति के लिए एक मॉडल में परीक्षण किया गया । इस मामले में, समर्थक भड़काऊ उत्तेजना ट्यूमर परिगलन कारक (TNF) के जवाब में क्रोमेटिन संकुचन के तेजी से परिवर्तन मापा गया । हेला कोशिकाओं अनुपचारित छोड़ दिया गया था या 1 के लिए TNF के साथ उत्तेजित ज, के बाद प्रवर्तक TNF-उत्तरदायी cytokine interleukin 8 (IL8) एंकोडिंग जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित क्षेत्र में क्रोमेटिन संकुचन मापने के लिए । ये परिणाम TNF-उत्तेजित कोशिकाओं (चित्र 3) के IL8 प्रवर्तक पर एक जोरदार वृद्धि हुई क्रोमेटिन पहुंच दिखाया । IL-8 प्रमोटर पर पहुंच TNF उत्तेजना के बाद भी है कि ACTB इस विनियामक क्षेत्र में एक नाटकीय क्रोमेटिन remodeling दिखा प्रमोटर में पाया से अधिक है । वसूली अनुपात इस मामले में प्राप्त के रूप में सकारात्मक नियंत्रण (ACTB प्रमोटर) रिश्तेदार वसूली अनुपात एक से अधिक है के रूप में इस्तेमाल क्षेत्र में प्राप्त की तुलना में अधिक है ।

Figure 1
चित्र 1: उचित कार्यप्रवाह. कोशिकाएँ formaldehyde (ए) जोड़कर कोशिका संस्कृति की कुप्पी या पकवान में सीधे crosslinked हैं. formaldehyde के शमन के बाद, कोशिकाओं को तीन बार बर्फ ठंडा पंजाबियों (ख) के साथ धोया जाता है, और एक प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित कर रहे है जहां वे निष्पक्ष lysis बफर और sonicated में reactioned डीएनए (सी) के लिए स्थगित कर रहे हैं । निकाले क्रोमेटिन के एक aliquot de-crosslinked 65 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग से है, कुल डीएनए संदर्भ (डी) पाने के लिए, और बाद में मुक्त डीएनए phenol का उपयोग कर निकाला जाता है: क्लोरोफॉर्म दोनों से crosslinked और de-crosslinked aliquots (ई) । अंत में, डीएनए quantified है, और मुक्त बनाम कुल डीएनए के अनुपात (च) की गणना की जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: HEK293T कक्षों में MHC वर्ग द्वितीय जीन क्लस्टर में क्रोमेटिन पहुंच का निर्धारण. मेलों द्वारा HEK293T कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया. मुक्त बनाम कुल डीएनए के बीच का अनुपात (यानी, रिश्तेदार वसूली अनुपात) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में ACTB जीन के प्रवर्तक के लिए निर्धारित किया गया था, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में Chr .12 पर एक heterochromatin क्षेत्र, और विनियामक क्षेत्रों और MHC के जीन निकायों द्वितीय श्रेणी के जीन एचएलए-DMA और एचएलए-DPB1. ऊपरी भाग लोकस के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और प्राइमरों की स्थिति से पता चलता है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन से दो जैविक प्रतिकृति triplicates में मापी का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा एक प्रकाशित रिपोर्ट19से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: TNF उपचार के जवाब में IL8 प्रमोटर में डीएनए पहुंच के परिवर्तन । हेला कोशिकाओं TNF के साथ उत्तेजित (20 एनजी/एमएल) 1 एच के लिए और परियों द्वारा विश्लेषण किया गया । मुक्त बनाम कुल डीएनए के बीच अनुपात ACTB के प्रवर्तक के लिए निर्धारित किया गया था (सकारात्मक नियंत्रण), Chr .12 पर एक heterochromatin क्षेत्र (नकारात्मक नियंत्रण), और IL8 प्रमोटर. त्रुटि पट्टियों के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व (SEM) से तीन जैविक प्रतिकृति डुप्लिकेट में मापा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: sonication शर्तों का अनुकूलन । 293T कोशिकाओं से निकाली क्रोमेटिन उपयुक्त ट्यूबों (सामग्री की तालिका) के साथ एक केंद्रित sonicator का उपयोग sonified था । क्रोमेटिन निंनलिखित सेटिंग्स के साथ 30 एस के दोहराव के साथ संकेत दिया समय के लिए sonicated था: पीक पावर 150, ड्यूटी फैक्टर 15, 500 फट प्रति चक्र, 30 एस के बाद: पीक पावर 2.5, ड्यूटी फैक्टर 15, 500 फट प्रति चक्र । परिणामस्वरूप क्रोमेटिन de-crosslinked था, phenol द्वारा शुद्ध: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और एक 2% agarose जेल में भरी हुई । एक ethidium-ब्रोमाइड दाग जेल दिखाया गया है, और आणविक भार मार्करों के पदों बीपी में संकेत दिया जाता है । इस प्रयोग में, इष्टतम क्रोमेटिन आकार (200-300 bp) sonication के 20 मिनट के बाद प्राप्त किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्राइमरी अनुक्रम
ACTB-प्रवर्तक-च AAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-प्रवर्तक-आर TTCCTCAATCTCGCTCTCGC
Chr. 12 नकारात्मक नियंत्रण-F ATGGTTGCCACTGGGGATCT
Chr. 12 नकारात्मक नियंत्रण-R TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
एचएलए-DMA-XY-बॉक्स-F CATCAGTCACTGGGGAGACG
एचएलए-DMA-XY-Box-R GCTTCCCAGCCCAGTTACAT
एचएलए-DMA-5'-F GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
एचएलए-DMA-5'-R AGCTGCTATGTGTGGTTGGT
एचएलए-DMA-3'-F TGGGGACCTAGTTAGGGAGC
एचएलए-DMA-3'-R AGATCCATGGGAGGAGGCTT
एचएलए-DPB1-XY-बॉक्स-F GTCCAATCCCAGGGTCACAG
एचएलए-DPB1-XY-बॉक्स-R TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
एचएलए-DPB1-5 '-च GCGTGTTCATGTCTGCATCC
एचएलए-DPB1-5 '-R TGATCCTCAGAGCCTGGACA
एचएलए-DPB1-3 '-च CCAGCCTAGGGTGAATGTTT
एचएलए-DPB1-3 '-R GCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 प्रवर्तक-च GTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 प्रमोटर-आर CTTATGGAGTGCTCCGGTGG

तालिका 1: qPCR के लिए प्राइमर ।

Table 2
तालिका 2: उचित सापेक्ष पुनर्प्राप्ति अनुपातों का उदाहरण परिकलन. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

मेलों एक मजबूत और सस्ती nucleosome-मुक्त क्षेत्रों की पहचान की अनुमति विधि है । यह सिद्धांत पर आधारित है कि nucleosomes के आसपास डीएनए लिपटे आसानी से histones को crosslinked जा सकता है । एक phenol: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण को प्रोटीन से बंधे डीएनए से गैर-crosslinked और प्रोटीन रहित डीएनए अंशों को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो निचले phenol चरण में और कुछ हद तक (चित्र 1) में पाया जाता है । इसलिए, nucleosome मुक्त क्षेत्रों जलीय चरण में मुफ्त डीएनए के अंश में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । प्रकाशनों के एक नंबर मेला विधि23,24,25,26है, जो यहां वर्णित प्रक्रिया पूरक करने के लिए परामर्श किया जा सकता है की विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।

अंय क्रोमेटिन संरचना निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के समान, निष्पक्ष विधि भी गंभीर डीएनए के इष्टतम कतरनी पर निर्भर करता है । यदि टुकड़े बहुत लंबे हैं, तो किसी भी nucleosome-मुक्त क्षेत्र आसन्न क्रोमेटिन-बंधे डीएनए द्वारा नकाबपोश हो जाएगा । यदि टुकड़े बहुत छोटे हैं, qPCR या गहरी अनुक्रमण द्वारा पता लगाना बहुत मुश्किल हो जाता है । इस कारण से, sonication के डीएनए के एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि नियंत्रित किया जाना चाहिए और अनुकूलित करने के लिए चारों ओर टुकड़े प्राप्त करने के लिए 200-300 बीपी लंबाई, जो 1-2 nucleosomes(चित्रा 4) का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

एक अंय पैरामीटर है कि अंतिम परिणाम को प्रभावित कर सकते है नमूना के crosslinking है । हालांकि निर्धारण की प्रक्रिया यहां वर्णित सबसे सेल लाइनों के लिए मांय है, शोधकर्ता ध्यान से अध्ययन के तहत विशेष रूप से नमूने के लिए इस कदम का मूल्यांकन करना चाहिए, खासकर जब ऊतकों, जहां अब निर्धारण समय की अनुमति के लिए आवश्यक हो सकता है का उपयोग कर formaldehyde सभी ऊतक नमूने में कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए ।

ऐसी DNase मैं या micrococcal nuclease अतिसंवेदनशीलता, चिप, या ATAC के रूप में अंय तरीकों के विपरीत, मुंहासे एक एंजाइमी गतिविधि या विशिष्ट एंटीबॉडी पर भरोसा नहीं है, और इसलिए यह अनुमापन या प्रतिक्रिया शर्तों के अनुकूलन की जरूरत नहीं है । यह क्रोमेटिन क्षेत्र में थोड़ा अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं के लिए क्रोमेटिन पहुंच को मापने के लिए एक आदर्श पद्धति को साफ करता है । इसके अलावा, पायलट प्रयोगों केवल आदेश में डीएनए कतरनी कदम और crosslinking समय, जब आवश्यक अनुकूलित करने के लिए आवश्यक हैं ।

विधि शुरू में खमीर6में विकसित किया गया था, लेकिन यह भी स्तनधारी कोशिकाओं को बढ़ाया गया है । निष्पक्ष विधि के साथ शुद्ध डीएनए गहरी अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रोमेटिन स्थिति के जीनोम चौड़ा लक्षण वर्णन की अनुमति । यह पहले से ही कई अध्ययनों में उपयोगी साबित हो गया है8,9,10,11,12,13,19,27, 28.

निष्पक्ष-seq प्रयोगों से परिणाम DNase I-seq14जैसे अंय पद्धतियों द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ एक बड़ा ओवरलैप दिखाते हैं, हालांकि कुछ अंतर पैदा होते हैं । इस उदाहरण के लिए के रूप में methodological मतभेद के कारण है आराम या remodeled nucleosomes अभी भी DNase द्वारा दरार बाधा सकता है मैं, जबकि इन डीएनए क्षेत्रों कम डीएनए का उत्पादन करने के लिए प्रवण होगा/प्रोटीन crosslinks और इस प्रकार nucleosome के रूप में निर्धारित किया जाएगा मुक्त संपल्यानंतर९का उपयोग करते हुए क्षेत्र. इसके अलावा, गैर हिस्टोन प्रोटीन की उपस्थिति ऐसी आरएनए polymerases या epigenetic के निशान के लिए पाठक प्रोटीन के रूप में डीएनए/प्रोटीन crosslinks में परिणाम सकता है और इस तरह परियों प्रयोगों में प्रोटीन पैक क्षेत्रों के रूप में व्याख्या की जाएगी । इन सीमाओं हर विधि क्रोमेटिन राज्य के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया, इस प्रकार के लिए विभिंन तरीकों का एक संयोजन का उपयोग करने के लिए एक व्यापक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की आवश्यकता स्थापना के लिए अंतर्निहित हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों टिलमैन Borggrefe (Giessen के विश्वविद्यालय) कृपया sonication डिवाइस साझा करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । M.L.S. से काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, उत्कृष्टता क्लस्टर कार्डियो-पल्मोनरी सिस्टम (ECCPS, EXC 147/2), ड्यूश Krebshilfe (१११४४७) और IMPRS-HLR कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित है मैक्स-प्लैंक सोसायटी की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Carl Roth A156.1
Glycogen, 20 mg/ml Thermo Fisher R0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox Thermo Fisher AB1162B
Proteinase K, 20 mg/ml Thermo Fisher EO0491
RNase A, 10 mg/ml Thermo Fisher EN0531
Leupeptin Sigma L8511
Aprotinin Sigma A1603
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma 78830
milliTUBE 1 ml AFA Fiber Covaris 520130
Holder milliTUBE 1ml Covaris 500371
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosistems 4376600

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References

  1. Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994 (2015).
  15. Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28 (2016).
  17. Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455 (2014).
  18. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50 (2013).
  19. Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547 (2017).
  20. Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
  26. Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660 (2017).
  28. Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

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जेनेटिक्स अंक 134 क्रोमेटिन पहुंच निष्पक्षता विनियामक तत्व nucleosomes phenol: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रोटीन-डीएनए crosslink
स्तनधारी कोशिकाओं में क्रोमेटिन पहुंच मापने के लिए विनियामक तत्वों की Formaldehyde-असिस्टेड आइसोलेशन
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Rodríguez-Gil, A., Riedlinger, T., Ritter, O., Saul, V. V., Schmitz, M. L. Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57272, doi:10.3791/57272 (2018).

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