استراتيجيات أخذ العينات وتجهيزها لعينات الأنسجة المصرف البيولوجي من النماذج الطبية الخنزير

Summary

هي أثبت التطبيق العملي والأداء لطرق لتوليد عينات الأنسجة التمثيلية من نماذج حيوانية الخنزير لمجموعة واسعة من التحليلات المصب في مشاريع المصرف البيولوجي، بما في ذلك فولوميتري، عينة عشوائية منتظمة، وتجهيز فرق لعينات الأنسجة لأنواع التحليلات الجزيئية والسمات النوعية والكمية.

Abstract

في البحوث الطبية متعدية الجنسيات، أصبحت نماذج الخنزير اطراد أكثر شعبية. النظر في القيمة العالية للحيوانات الفردية، ولا سيما من الخنازير المعدلة وراثيا نماذج، وعدد الحيوانات المتوفرة لهذه النماذج محدودة غالباً، إنشاء مجموعات المصرف (البيولوجي) لعينات الأنسجة المجهزة على نحو كاف يناسب طائفة واسعة من أساليب التحاليل اللاحقة، بما في ذلك التحليلات غير محدد في النقطة الزمنية لأخذ العينات، تمثل النهج ذات مغزى الاستفادة الكاملة من قيمة متعدية للنموذج. فيما يتعلق بالخصائص المميزة للتشريح الخنزير، أنشئت مؤخرا مبادئ توجيهية شاملة لجيل موحدة للممثل، ونماذج عالية الجودة من الخنزير وأنسجة مختلفة. هذه المبادئ التوجيهية شرطان أساسيان لإمكانية تكرار نتائج النتائج وقابليتها للمقارنة بين مختلف الدراسات والمحققين. تسجيل البيانات الأساسية، مثل الأوزان الجهاز ووحدات التخزين، وتحديد مواقع أخذ العينات، وإعداد عينات الأنسجة إلى يتم إنشاؤها، فضلا عن التوجه، وحجمها وتجهيز واتجاهات التشذيب، هي من العوامل ذات الصلة تحديد جينيراليزابيليتي وقابليتها للاستخدام من العينة للتحليلات المورفولوجية الجزيئية والنوعي والكمي. هنا، مظاهرة توضيحية، عمليا، خطوة بخطوة التقنيات الأكثر أهمية لجيل ممثل، عينة المصرف البيولوجي متعددة الأغراض من أنسجة الخنزير ويرد. الأساليب الموصوفة هنا تشمل تحديد حجم الجهاز/الأنسجة والكثافة، تطبيق إجراء المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة لأجهزة متني بتحديد مدى تقلص الأنسجة عد نقطة، تتصل بتضمين النسيجي من العينات، وتوليد العينات عشوائياً موجها لتحليلات ستيريولوجيكال الكمية، مثل الخواص موحدة عشوائي (أيار) المقاطع الناجمة عن أساليب "أورينتاتور" و "إيسيكتور"، والزي العمودي عشوائي (فور) المقاطع.

Introduction

الطب متعدية الجنسيات، والخنازير شائعة بشكل متزايد لاستخدامها كنماذج^1،2،3،،من⁴⁵، نظراً لأوجه الشبه مفيدة عدة بين الخنزير من الحيوانات الكبيرة و تشريح جسم الإنسان وعلم وظائف الأعضاء، وتوافر الوسائل البيولوجية الجزيئية المنشأة السماح لجيل من مصممة خصيصا، والكائنات المعدلة وراثيا خنزير نماذج لمجموعة واسعة من الأمراض الشروط^1،4.

بالمقارنة مع نماذج القوارض، العدد من حيوانات طراز خنزير كل منها التي يمكن توفيرها لإجراء تجارب عليها في أي وقت غير محدود. هذا سبب الفاصل الزمني جيل الخنزير حوالي سنة واحدة، والجهود المالية والوقت الكثيفة اللازمة لتوليد نماذج الخنزير وتربية الحيوانات. ولذلك، الحيوانات الفردية من طراز خنزيري، فضلا عن العينات التي يمكن أن تتولد من هذه الخنازير، قيمة للغاية، لا سيما إذا كان وراثيا نماذج النقانق و/أو القضايا التجريبية على المدى الطويل (مثلاً، مضاعفات متأخرة ويتم فحص الأمراض المزمنة) في الأفراد الذين تتراوح أعمارهم بين^2،،من⁶⁷.

أثناء الدراسة، وأي أداء التحليلات الإضافية التي كانت مقرره في تصميم الدراسة التجريبية الأولية لا يمكن لاحقاً تتحول إلى أن تكون ذات الصلة، مثلاً، بعنوان اكتشف متميزة المسائل الناشئة من قبل نتائج غير متوقعة. إذا لم تتوفر عينات مناسبة لمثل هذه التجارب الإضافية، قد يكون غير متناسب ارتفاع التكاليف والنفقات كثيفة الوقت اللازمة لتوليد إضافية الخنازير وعينات الأنسجة. أن نكون مستعدين لمثل هذه الاحتمالات، وجيل مجموعات المصرف البيولوجي المصانة احتياطية عينات من مختلف الأجهزة أو الأنسجة البيولوجية-السوائل، مناسب كما وكيفا لمجموعة واسعة من التحليلات اللاحقة، يعتبر هاما نهج^2،،من⁶⁷. الاستفادة المثلى من نموذج حيوان الخنزير، توافر عينات كافية المصرف البيولوجي كما يوفر إمكانية فريدة لتنفيذ طائفة واسعة من أساليب التحليل المختلفة على المواد عينة مماثلة على مستوى جهاز متعدد في نفسه ونظمت الحيوانات الفردية، مثلاً، بتوزيع العينات للعلماء من مختلف الأفرقة العاملة في أبحاث شبكة^2،،من⁶⁷. بالإضافة إلى ذلك، الاستراتيجية '' تطلعي '' أخذ العينات في بيوبانكينج يساهم أيضا في خفض عدد الحيوانات اللازمة في دراسة. مزايا نموذج الخنزير بيوبانكينج ثبت مؤخرا في جهاز متعدد، دراسة مولتيوميكس، فحص الجهاز عبر الحديث في نموذج الخنزير معدلة وراثيا للسكري الطويلة الأمد، باستخدام عينات من "المصرف البيولوجي خنزير" ميونيخ ميدي ².

وهناك بعض المتطلبات الإلزامية التي يجب أن تمتثل عينات المصرف البيولوجي عموما إثبات الموثوقية والقابلية للتفسير لنتائج التحليلات التي يؤديها في وقت لاحق. يجب أن يكون إنشاء العينات تكاثر، ويجب أن تكون ممثلة، أيعلى نحو كاف مما يعكس الميزات المورفولوجية والجزيئية المهتمة الأنسجة/جهاز أخذ العينات من⁷. يجب أن تكون مناسبة لمجموعة واسعة من أنواع التحليل المصب، تؤخذ بكميات كافية العينات وتجهيزها وفقا للمطالب (بما في ذلك ظروف الوقت ودرجة الحرارة) أساليب تحليلية مختلفة، بما في ذلك وصفية تحاليل نسيجية، مثل كريوهيستولوجي والبارافين والأنسجة البلاستيك، immunohistochemistry، التهجين في الموقع ، والتحليل المجهري الإلكترون ultrastructural والتحليلات التشخيصية المختبرات السريرية، كذلك صيغته الجزيئية تحاليل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات ونواتج الأيض.

للسماح بتقييم مجموعة واسعة من المعلمات المورفولوجية كمية مميزة مثل الأرقام أو وحدات التخزين أو أطوال أو المساحات السطحية لهياكل الأنسجة متميزة بالتحليلات الكمية ستيريولوجيكال، قسم تجارب معشاة طائرات عينات نسيجية لكل الأجهزة/الأنسجة تحتاج إلى إعداد^7،،من^89،،من¹⁰¹¹. في الدراسات المورفولوجية الكمية، والتحديد الدقيق للحجم الكلي للأنسجة، والجهاز، أو حجرة الجهاز، أخذ العينات من (أي، المساحة المرجعية) من الأهمية بمكان^{7،9 , 12} لحساب الكميات المطلقة من المعلمات المهتمة داخل الجهاز كل منهما أو الأنسجة، أو الكائن الحي. في نهاية المطاف، قد أثر انكماش الأنسجة المتصلة بتضمين أثناء إعداد مقاطع نسيجية تكون مصممة وتؤخذ في الاعتبار¹³. ولذلك، تحليلات ستيريولوجيكال الكمية، لا سيما من العينات المحفوظة (الثابتة عينات الأنسجة، كتل الأنسجة المضمنة، أقسام النسيجي، إلخ) من الدراسات السابقة في بعض الأحيان محدودة للغاية أو حتى مستحيلاً¹²، خاصة إذا لم يتم فولوميتري لكل الأجهزة/الأنسجة، إذا تم تطبيق لا تصميم العينات كافية لتبرير عينات تمثيلية، إذا كانت الأرقام والمبالغ من العينات الفردية المتاحة غير كافية، أو التجهيز عينات غير متوافق مع تقدير لمعلمة (معلمات) المورفولوجية كمية من الفائدة. بسبب العوامل المؤثرة المحتملة المتعددة، مدى ملاءمة مواد الأرشيف-عينة لإجراء تحليلات متميزة من المعلمات المورفولوجية الكمية يتعذر الرد على نحو لا لبس فيه، ولكن يعتمد على تقييم دقيق لكل حالة على حدة.

وهكذا، حسب الموقع، الحجم، عدد، وتجهيز واتجاه التشذيب، والتوجه لعينات يحتمل أن تؤثر على نتائج التحاليل اللاحقة، هذه العوامل ذات أهمية كبيرة ويجب النظر في تصميم أي دراسة تجريبية. وفيما يتعلق بهذه الجوانب والسمات الخاصة للتشريح الخنزير، إرشادات أخذ العينات شاملة ومفصلة وواسعة النطاق قد أنشئ مؤخرا نماذج حيوانية تتكيف مع الخنزير، توفير إشارة قوية موحدة، واستنساخه ، وكفاءة توليد عينات زائدة عن الحاجة، ومعالجتها على نحو كاف وذات جودة عالية من أكثر من 50 مختلفة الخنزير والأنسجة^6،7.

الوصف المنهجي، وفيديو تعليمي المبين في هذه المادة توفر تفصيلية وتوضيحية ومفهومة، خطوة بخطوة تعليمات للأداء العملي لمجموعة متنوعة من التقنيات فولوميتري، أخذ عينات من أنسجة الخنزير و الأجهزة، ومعالجة عينات الأنسجة لأساليب مختلفة من تحليل المتلقين للمعلومات. التقنيات الموصى بها التي تشمل أساليب لتحديد حجم الجهاز/الأنسجة وكثافات استناداً إلى مبادئ أرخميدس وكافالييري⁹، بما في ذلك تحديد الأبعاد لانكماش أنسجة ثلاثية الأبعاد ذات الصلة تضمين في وسائل الإعلام المختلفة التضمين¹⁴ أثناء تجهيزها للفحص النسيجي، تطبيق عمليا حجم المرجحة المنتظمة عينة عشوائية نهج، تجهيز العينات عينات الأنسجة لمختلف اللاحقة تحليلات^7،8،،من⁹¹⁵، وتوليد مناسب الموجهة وتجهيز العينات المحتملة التحليلات الكمية ستيريولوجيكال^{7،8، 9،،}من¹⁰¹¹. بجوار تطبيقها في مشاريع المصرف البيولوجي الخنزير، الأساليب الواضحة ملائمة عموما لجميع الدراسات دراسة الخصائص المورفولوجية histo الكمية الأجهزة/الأنسجة. علاوة على ذلك، يتم تصميم العينات العشوائية المنتظمة مفيدة بصفة خاصة لجيل عينات ممثلة في تجارب باستخدام أساليب التحليل الجزيئي للكشف عن التعديلات وفرة من، مثلاً، والكشف، والبروتينات، أو نواتج الأيض في مختلف الأعضاء والأنسجة.

تقدم الفقرات التالية عرضاً موجزاً لهذه الأساليب، أثناء أدائهم العملي هو الموصوفة في المقطع بروتوكول.

تحديد حجم الجهاز/الأنسجة
تحديد الأوزان الجهاز ووحدات التخزين مهم في العديد من إعدادات التجريبية، كما قد تشير هذه العوامل إلى دراسة التغييرات، يحتمل أن تتصل تجريبيا العوامل ذات الأهمية. الحجم الإجمالي الجهاز/الأنسجة مطلوب أيضا عادة حساب المعايير الكمية المطلقة، (مثلاً، عدد الخلايا الإجمالي)، من كثافة الحجم العددي ستيريولوجيكالي المقدر (أي، والعدد من الخلايا كل وحدة التخزين من الأنسجة)^7،12. وبصرف النظر عن تقنيات استخدام معدات تقنية معقدة، مثل التصوير المقطعي بالكمبيوتر، وهناك أساسا ثلاثة الأساليب العملية التي تستخدم عادة لتحديد الحجم المطلق لجهاز أو الأنسجة. يمكن تحديد حجم الجهاز بواسطة "القياس الحجمي المباشر" وفقا لمبدأ أرخميدس، أي، قياس حجم الماء أو المحلول الملحي شردهم هيكل عندما غمرت تماما. أجهزة الخنزير كبيرة نسبيا، هذه النهج غير عملي وعرضه لعدم الدقة، نظراً لأنها تتطلب قوارير كبيرة جداً الحجمي/قياس. أكثر سهولة، يمكن حساب حجم الجهاز/الأنسجة من الوزن والكثافة^7،،من¹²¹⁶، الذي يمكن تحديد كفاءة استخدام "أسلوب غمر"^{7،12 ،16} (البروتوكول خطوة 1.1.). يمكن أيضا تقدير حجم الجهاز/الأنسجة باستخدام النهج فولوميتري استناداً إلى "مبدأ كافالييري" (1598-1647). بعبارات بسيطة، مبدأ كافالييري ينص على أن إذا هي مقطوع كائنين في طائرات موازية لطائرة على أرض، ولمحات المقاطع قطع طريق الكائنين في المقابل المسافات من الطائرة على الأرض نفس المناطق، الكائنين تحتوي وحدة التخزين نفسها. وهكذا يمكن تقدير حجم الكائنات على شكل تعسفي كنتاج لمناطقهم الشخصية قسم في الطائرات قسم مواز، بعيد المنال على قدم المساواة، والمسافة بين الطائرات القسم. وهذا أمر يمكن فهمه بالقياس التالية: النظر في الكدسات اثنين تتألف من نفس العدد من القطع متطابقة وتوضع جنبا إلى جنب، مكدس واحد مع منظم عملات مكدسة فوق بعضها البعض في الغلة شكل أسطواني مكدس عمله، والآخر كومة من القطع النقدية مع قبالة مركز وضع القطع النقدية (الشكل 3A). على الرغم من اختلاف الأشكال الموجودة في كلا كدسات عمله، على وحدات التخزين هي نفسها، منذ مجالات القطع على المستويات المقابلة لكلا كدسات (أيمجالات لمحات مقاطع المتوازية تخترق كلا كدسات العملة في مسافات متساوية من الأرض) متطابقة. ويرد تقدير الكم من الأعضاء والأنسجة باستخدام كافالييري المبدأ^7،،من¹²¹⁵ الخنزير في الخطوة 1.2.

تحديد مدى تقلص الأنسجة المتصلة بتضمين النسيجي
في تحليلات للعديد من المعلمات المورفولوجية الكمية المقاسة في أقسام الأنسجة النسيجي، قد أثر انكماش الأنسجة المتصلة بالتضمين التي تحدث خلال الأنسجة المعالجة للأنسجة تكون مصممة وأخذها في الاعتبار. مدى تقلص الأنسجة المتصلة بالتضمين قد يكون المتغير، ويعتمد على كل من الأنسجة، والمعالجة، والتضمين متوسطة^8،،من^1317،،من¹⁸¹⁹. عموما، تحدث التغييرات المتعلقة بتضمين حجم عينة الأنسجة (أي، معظمهم من انكماش) في جميع الأبعاد الثلاثة للفضاء، ومن ثم يؤثر على كافة المعلمات الأبعاد وتقدر الكمية تحليلات ستيريولوجيكال⁸ . أساسا، ويمكن تقدير مدى تقلص الأنسجة المتصلة بالتضمين، معبراً عنها بمعامل انكماش الأنسجة الخطي (f_S)، كما هو موضح في الخطوة 1، 3. ويستخدم لتصحيح معلمات المورفولوجية الكمية (انكماش حساسة)¹⁴.

المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة من الأجهزة/الأنسجة
لإنشاء مجموعة المصرف البيولوجي من عينات الجهاز/أنسجة الخنزير، أثبتت النهج المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة مثل كما هو موضح في الخطوة 2 أن التقنيات العملية، وتوفير الوقت، وتتسم بالكفاءة لجيل ممثل، عينات الأنسجة المتعددة الأغراض^7،،من^89،15.

جيل من المقاطع "عشوائي موحد الخواص" والمقاطع "الرأسية موحدة عشوائي" للتحليلات الكمية ستيريولوجيكال
عينات الأنسجة المصرف البيولوجي بحاجة إلى أن تكون مناسبة لمجموعة واسعة من أساليب التحليل ستيريولوجيكال الكمية المختلفة لتقدير أقصى قدر معلمات التي لا يمكن تحديده دون عينة إعداد الكافي. يمكن تحديد معلمات ستيريولوجيكال الكمية كلها تقريبا، استخدام "الخواص (مستقلة) موحدة عشوائي (أيار) أقسام"^8،9. في المقاطع أيار، هو العشوائية ثلاثي الأبعاد اتجاه الطائرة مقطع عينة الأنسجة. ويمكن تحقيق ذلك بالتوزيع العشوائي للموقف الذي عينة الأنسجة بالنسبة إلى موقف الطائرة القسم, كما هو مطبق في أسلوب "إيسيكتور"¹¹ (الخطوة 3، 1 من البروتوكول)، أو بواسطة التعشيه التوجه للطائرة الباب نسبة إلى عينة الأنسجة، كما هو الحال في أسلوب "أورينتاتور"¹⁰ (الخطوة 3، 2 من البروتوكول). في عينات الأنسجة، مثل الجلد أو الغشاء المخاطي العينة عرض محور عمودي بطبيعة الحال الراهنة، أو المعرفة والتعرف عليها بشكل صحيح، إعداد "موحدة عشوائي (فور) المقاطع العمودية" (البروتوكول خطوة 3.3.) مقطوع تماما داخل الطائرة من بهم المحور الرأسي هو مفيد^8،20. لخطاب كامل الأسس النظرية لأخذ العينات في أيار/فور ومناقشة شاملة المحتملة تحليلات ستيريولوجيكال الكمية المصب، ويحال القارئ المهتمة بالكتب المدرسية للكمية ستيريولوجي في الحياة العلوم^8،9.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا استخدام عينات الأنسجة المستمدة من الحيوانات الميتة، والامتثال الكامل للنظام القانوني الألماني للرفق بالحيوان.

1-فولوميتري

1. غمر تقنية لتحديد كثافة الأنسجة/الجهاز (1 الرقم و الرقم 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. إعداد المواد: مشرط ريش والمناشف الورقية والملقط غرامة، جداول المختبرات القياسية، الزجاج أو قنينة بلاستيكية، ملحي 0.9% وأصحاب العينة المشيدة ذاتيا (الشكل 2A).
   2. المكوس قطعة من الأنسجة (الحد الأقصى لحجم: 2 × 2 × 2 سم³) من الجهاز/الأنسجة، على وجه التحديد من حجرة الجهاز للفائدة. الأجهزة الصغيرة، مثل الغدة النخامية أو الغدة الصنوبرية، يتم قياسها بكاملها.
      تنبيه: تأكد من أن حجم العينة لا سيما أصغر من القطر الداخلي للكأس (الخطوة 1.1.5 وما يليها)، ومستوى التعبئة للسماح باكتمال غمر العينة دون الاتصال بالجدران الداخلية للكأس في خطوة 1.1.7.
   3. مسحه العينة مع منشفة ورقية لإزالة السوائل الزائدة من الدم/الأنسجة بدقة.
   4. وزن العينة على مقياس دقة وتسجيل وزن العينة (m_S). تحديد وزن عينات الأنسجة الصغيرة بملغ أقرب (الشكل 1A).
   5. ضع كوب مملوءة بدرجة حرارة الغرفة ملحي 0.9% على المقياس. لا شغل تماما الكأس، للسماح لغمر عينة الأنسجة في الخطوة اللاحقة دون تجاوزه.
      تحذير: استخدام حجم الكأس مناسب للحجم ووزن sample(s) الأنسجة التي يمكن قياسها ونطاق القياس الفعال للجدول. للحصول على عينات أكبر تصل إلى 2 × 2 × 2 سم³، حجم كوب من 50 – 100 مل المناسب في تركيبة مع مقياس قياس من ما يقرب من 100 ملغ إلى 500 غرام، بينما لعينات صغيرة، استخدم قنينة حجم 5 – 10 مل في تركيبة مع جداول الدقة مع قياس يتراوح بين حوالي 0.1 ملغ و 20 غرام.
   6. غمر صاحب العينة (أي، حلقة جامدة بما فيه الكفاية من سلك رفيع أو شيئا من هذا القبيل، الشكل 2 ألف) في المياه المالحة إلى موضع ملحوظ (الأسهم في الشكل 1B, 2B الشكل، و الشكل 2). ثم إعادة تعيين (الفارغ) عرض الجدول إلى صفر.
   7. إرفاق عينة الأنسجة بدقة لصاحب العينة وغمر العينة في المياه المالحة تماما حتى يتم التوصل إلى موقف ملحوظ على صاحب العينة (الأسهم في الشكل 1B, 2B الشكل، و الشكل 2).
      تنبيه: العينة المغمورة وصاحب العينة يجب إلا يكون الاتصال مع الجدران الداخلية أو أسفل الكأس أو على سطح المياه المالحة.
   8. حين عقد صاحب العينة والعينة المغمورة في هذا الموقف، تسجيل الوزن المعروض في الجدول (م_ل)، إشارة إلى وزن المحلول الملحي شردهم عينة الأنسجة (الشكل 1 ج، الشكل 2، و الشكل 2).
   9. حساب حجم العينة (V_S) من م_ل، وكثافة المحلول الملحي في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) (ρ_{المالحة} = 1.0048 g/cm³) الخامس_S = m_L/ Ρ_{المالحة} [ز/g/cm³] (الشكل 1).
   10. حساب كثافة عينات الأنسجة (ρ_عينة) من الوزن (أيكتلة) العينة (m_S) وحجمه (V_S): ρ_عينة = م_S /V_S[g/cm³] (الشكل 1).
   11. لأجهزة قياس بكاملها، كرر القياس ثلاث مرات وحساب الجهاز متوسط الكثافة من قيم قياس واحد. الأجهزة الكبيرة/الأنسجة، إجراء القياسات المتكررة مع عينات مختلفة من حجرة الجهاز/الأنسجة/الجهاز نفسه، وحساب متوسط كثافة من القياسات واحد، تبعاً لذلك.
   12. حساب الحجم الإجمالي لحجرة الجهاز/الأنسجة/الجهاز من الوزن والكثافة (الشكل 1).
2. تطبيق كافالييري-طريقة لتحديد حجم الجهاز الخنزير ⁷
   1. إعداد المواد: صور حاكم، قدمه ذات الورنيّة، سكين، مقص، ملقط، القلم للماء، والبلاستيك الشفاف، الماسح الضوئي، الكاميرا، وعبر شبكات مطبوعة على الورق الشفاف البلاستيك.
   2. ضع كامل الجهاز/الأنسجة على سطح عادي (قطع قاعدة) وقياس الطول (l) للجهاز على طول محورها الطولي (الشكل 3B، الشكل 5A).
   3. قطع الجهاز كاملة/الأنسجة إلى مسافة واحدة موازية شرائح متعامد على المحور الطولي الجهاز (الشكل 3، الرقم 5 (ب)). اختر مسافة d بين فرعين (أي، سمك الفاصل الزمني/قسم تقطيع، عادة حوالي 1 سم) صغيرة بما فيه الكفاية الحصول على عدد كاف من ألواح الأنسجة/الجهاز. عشوائياً موقف القسم الأول على مسافة بين 0 والفاصل الزمني لتقطيع من الهامش للجهاز. بينما تشريح، القاضي بصريا بالموقف والتوجه لكل طائرة القسم، للحصول على حوالي الجهاز المتوازي/الأنسجة في ألواح من سمك موحد تقريبا.
      ملاحظة: العدد اللازم من ألواح الأنسجة/جهاز يعتمد على الشكل والحجم لفحص الجهاز/الأنسجة. إذا كانت الأجهزة الصغيرة أو العينات يجب أن تكون مقطوع في ألواح رقيقة من دي فايف مم، تضمين العينات في أجار قبل تمزيقها (راجع الخطوة 1.3.3.) واستخدام جهاز تقني لتقطيع العينة جزءا لا يتجزأ من أجار. فترات تقطيع المستحب تجريبيا للخنزير الأكثر والأنسجة، وكذلك أمثلة لأجهزة تشريح، مبينة في "المواد التكميلية" من الأنسجة أخذ العينات أدلة للخنزير الطب الحيوي "نماذج" "⁷.
   4. ضع جميع الجهاز/أنسجة ألواح على نفس السطح أسفل على قاعدة شاملة (أي، دأبت على الحق أو الطائرة الجزء الأيسر من كل لوح الجهاز، 3D الشكل، الشكل 5) والعد الألواح (n).
   5. الحصول على ملفات قسم من ألواح الأنسجة بواحدة من الطرق التالية:
      1. بعناية وضع ألواح الأنسجة على الورق الشفاف البلاستيك المسمى على نحو ملائم، مع المحافظة على التوجه لتلك السطوح القسم العلوي والسفلي. تتبع الخطوط العريضة لألواح الأنسجة على الورق الشفاف البلاستيك باستخدام قلم لماء (3E الشكل1-2).
      2. أخذ صور فوتوغرافية لألواح الأنسجة، عقد الكاميرا عمودياً فوق السطوح القسم (3F الشكل). لمعايرة، ضع مسطرة حجم إلى جانب ألواح الأنسجة.
      3. مسح ألواح الأنسجة على ماسح ضوئي مسطح مع المحافظة على التوجه لتلك السطوح القسم العلوي والسفلي (الشكل 3). لمعايرة، ضع مسطرة حجم إلى جانب ألواح الأنسجة.
   6. قياس مجالات القسم (تم تتبعها أو تصويرها أو الممسوحة ضوئياً) لمحات من جميع أنسجة ألواح بواحدة من الطرق التالية:
      1. تراكب أو ركب الملامح لوح الجهاز تتبع مع حجم مناسب، طباعة معايرة الشبكة من الصلبان متباعدة بالتساوي على شفافية البلاستيك وعدد جميع الصلبان ضرب منطقة الشخصية (الرقم 3 أي3-4؛ قارن إلى الشكل 5). حساب مساحة المقطع الشخصية لكل لوح الجهاز بضرب العدد الصلبان ضرب منطقة الشخصية بالمنطقة المقابلة للصليب واحد.
         ملاحظة: للحصول على حجم دقيقة بما فيه الكفاية تقديرات، اختر شبكة مشتركة مع مسافة صغيرة بما فيه الكفاية بين الصلبان المجاورة، حيث أن يعبر في متوسط على الأقل 100 سوف تصل السطوح قسم من الألواح جهاز واحد في كل دراسة حالة للدراسة . الأحجام المستحب تجريبيا عبر الشبكة لأعضاء وأنسجة الخنزير الأكثر مبينة في "المواد التكميلية" من الأنسجة أخذ العينات أدلة للخنزير الطب الحيوي "نماذج" "⁷.
      2. قياس المجالات من ألواح الأنسجة في الصور الرقمية من الصور/المسح الضوئي باستخدام المناسبة المتاحة تجارياً أو مجانية مورفوميتري الناعمة-وتطبيقات الأجهزة (الشكل 3 ح)، مثل نظام تجاري صورة تحليل²¹، أو إيماجيج²².
         تنبيه: ملاحظة أن أحد الأنسجة بلاطة (الأول أو آخر) ينصب على الماسح الضوئي يستريح على سطحه الطبيعية، على التوالي، ويواجه الكاميرا مع سطحه الطبيعية. ولذلك، الممسوحة ضوئياً صورة صورة صور هذه البلاطة، لن تظهر على سطح قسم. ولذلك، يتم قياس أي ملف تعريف المجال قسم في الصورة الصورة/الصورة الممسوحة ضوئياً من هذه البلاطة الأنسجة (الرقم 3I). أيضا ملاحظة الإسقاط الزائد الموجودة في الصور الممسوحة ضوئياً، والصور الفوتوغرافية من ألواح الجهاز/الأنسجة، أي، فقط قياس مجالات ملامح المقطع الفعلي، ولكن ليس من الأنسجة في صورة الكذب وراء سطح البلاطة القسم (الشكل 12 جه).
   7. حساب حجم الجهاز يقدر كنتاج لمجموع كل قسم مجالات المقابلة الشخصية جميع ألواح الأنسجة للحالة الواحدة (أياستمرار لليمين أو اليسار، على التوالي، على سطح الجزء العلوي أو السفلي من كل جهاز لوح ومتوسط سمك ألواح (أي، حاصل قسمة قياس طول المحور الرأسي الجهاز (l) وعدد ألواح)¹⁵.
3. تحديد مدى انكماش أنسجة ثلاثية الأبعاد ذات الصلة بتضمين أثناء تجهيز عينات الأنسجة لعلم الأنسجة
   1. إعداد المواد: مبضع ريش والملقط واجار، قوالب صب المعادن، والماسح الضوئي الرقمي وحاكم الحجم (مثلاً، ورق الرسم البياني).
   2. قطع سطح قسم طائرة جديدة، من عينة أنسجة ثابتة.
      ملاحظة: إذا كان بسهولة باستخدام عينات من تضمين الأنسجة (الناعمة) تشوه (الأنسجة الدهنية والأنسجة هلامية)، عينة الأنسجة الثابتة في أجار قبل تقطيع (الشكل 4 أ).
   3. لتضمين عينة في أجار:
      1. مزيج مسحوق أجار القياسية المستخدمة للأحياء المجهرية الثقافة المتوسطة مع حجم مناسب للمياه (حوالي 0.5 – 1 ز أجار/10 مل من الماء) في كوب زجاج. يقلب الخليط والحرارة في فرن ميكروويف في 700 ث حتى الغليان 3 – 5 س. يقلب الخليط وجلب ليغلي مرة أخرى ل s 3 – 5.
      2. بشكل اختياري، لزيادة على النقيض أجار إلى عينة الأنسجة، صبغ أجار السائل، مثلاً، بالحبر الأسود (إضافة الحبر 1 مل 10 مل أجار السائل الساخن ويقلب بشدة).
      3. صب أجار الساخنة في قالب صب (مثلاً، العفن معدنية المستخدمة البارافين التضمين، الرقم 10 ألف-دال)، وغمر عينة الأنسجة الثابتة في أجار الحارة. واسمحوا أجار بارد حتى التجميد، وإزالة العفن، وخفض كتلة أجار مع الأنسجة المضمنة باستخدام مبضع أو شفرة حلاقة.
         تنبيه: أثناء التعامل مع أجار السائل الساخن، ارتداء نظارات واقية وقفازات. عينات الأنسجة عملية ثابتة في الحل فورمالدهايد تحت عادم هود وارتداء نظارات واقية وقفازات المختبر.
   4. ضع العينة مع سطحه المقطع أسفل على ماسح ضوئي مسطح، جنبا إلى جنب مع حاكم حجم ومسح سطح القسم (الشكل 4 أ، ب).
   5. تحديد المنطقة سطح مقطع عينة الأنسجة الثابتة (_f) في المسح الرقمي، باستخدام واحدة من التقنيات الموضحة في الخطوة 1.2.6 (الشكل 4 باء).
   6. تضمين العينة في المتوسط التضمين البلاستيكية، مثل الإيبوكسي (مثلاً، ابن) أو جليكولميثاكريلاتي/ميثيلميثاكريلاتي (GMA/مجلس العمل المتحد)²³، البروتوكولات القياسية التالية^23،،من²⁴²⁵ ( الشكل 4). ضمان المحافظة على سطح مقطع عينة الثابتة الممسوحة ضوئياً في الخطوة السابقة (1.3.4) في العينة جزءا لا يتجزأ من البلاستيك.
      ملاحظة: للحفاظ على التوجه لقسم سطح العينة أثناء معالجة العينة، استمرار وضع العينة مع سطحه القسم المقصود تواجه هبوطاً في الكاسيت التضمين أو قالب الصب، أو وضع علامة المقطع المقصود السطح (أو الجانب الآخر من العينة) مع الحبر.
   7. قص مقطع النسيجي من كتلة البلاستيك المقابلة لسطح العينة الأنسجة الثابتة (الخطوة 1.3.2) الفرع الأصلي استخدام تحميل المقطع على شريحة زجاجية (الشكل 4) مبضع (الشكل 4)، ووصمة بشكل روتيني ( مثلاً، وتوضع وويوزين وصمة عار، ح & ه)^24،25.
      تنبيه: لتلقي مقطع النسيجي تقريبا في نفس الطائرة كسطح المقطع الأصلي من عينة الأنسجة الثابتة، بعناية على ضبط موقف كتلة البلاستيك في جبل مبضع قبل تمزيقها.
   8. مع المقطع الملون التي تواجه هبوطاً على ماسح ضوئي مسطح جنبا إلى جنب مع حاكم حجم مكان الشريحة وتفحص المقطع (4E الشكل).
   9. تحديد مجال المقطع عينة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البلاستيك(_ﻫ)في المسح الرقمي، باستخدام واحدة من التقنيات الموضحة في الخطوة 1.2.6 (4F الشكل).
   10. حساب انكماش الأنسجة المتصلة بتضمين متوسط (لكل الأنسجة والمتوسطة التضمين) من مجالات قياس الملامح القسم المقابلة لعينات الأنسجة قبل وبعد تضمين في تضمين المتوسطة من البلاستيك. ويحسب معامل الانكماش الخطي و_s كالجذر التربيعي لحاصل قسمة مجالات لمحات قسم من عينات الأنسجة ن بعد تضمينها في البلاستيك التضمين المتوسطة (أ) (_ه) وفي المناطق الملامح القسم المقابلة لعينات الأنسجة نفسها قبل تضمينها في البلاستيك التضمين المتوسطة (_f) (الشكل 4)¹⁴.

2-حجم المرجحة عينة عشوائية منتظمة بنقطة الفرز وتجهيز عنها الأنسجة لأنواع التحليل المصب⁷

1. إعداد المواد: المسطرة، الفرجار، سكين، مقص، ملقط، القلم للماء، نقطة/عبر شبكات مطبوعة على الورق الشفاف البلاستيك، وجداول الأرقام العشوائية.
   ملاحظة: نسخ قوالب لعبر الشبكات (5-60 مم) يتم توفيرها في "المواد التكميلية" من الأنسجة أخذ العينات أدلة للخنزير الطب الحيوي "نماذج" "⁷.
2. ضع الجهاز/الأنسجة على سطح عادي (قطع قاعدة) وقياس الطول (l) للجهاز على طول محورها الطولي (الشكل 5A، الشكل 6A).
3. قطع الجهاز/الأنسجة كاملة إلى مسافة واحدة موازية شرائح متعامد على محورها الطولي (الشكل 5 (ب)). اختر مسافة d بين فرعين (أيتقطيع المقطع الفاصل الزمني/سمك، عادة حوالي 1 سم) صغيرة بما يكفي للحصول على عدد كاف من شرائح الأنسجة/الجهاز. عشوائياً موقف القسم الأول على مسافة بين 0 والفاصل الزمني لتقطيع من الهامش للجهاز. بينما تشريح، القاضي بصريا بالموقف والتوجه لكل طائرة الفرع للحصول على ألواح متوازية تقريبا الجهاز/الأنسجة من سمك موحد تقريبا.
   ملاحظة: العدد اللازم من ألواح الأنسجة/الجهاز يعتمد على حجم الأنسجة/الجهاز فحص وعدد مواقع عينات الأنسجة. إذا كانت الأجهزة الصغيرة أو العينات يجب أن تكون مقطوع في ألواح رقيقة من دي فايف مم، تضمين العينات في أجار قبل تمزيقها (راجع الخطوة 1.3.3.) واستخدام الأجهزة التقنية لتقطيع العينة جزءا لا يتجزأ من أجار. وترد في "المواد التكميلية" من الأنسجة أخذ العينات أدلة للخنزير الطب الحيوي "نماذج" "⁷فترات تقطيع المستحب تجريبيا للخنزير الأكثر والأنسجة، وكذلك أمثلة لتشريح الأجهزة.
4. ضع جميع الجهاز/أنسجة ألواح على نفس السطح أسفل على قاعدة قطع (الشكل 6B).
5. تراكب ألواح الأنسجة مع شبكة عبر حجم مناسب مطبوعة على شفافية بلاستيك عن طريق وضع الأبعد ترك العلوي عبر الشبكة عبر نقطة عشوائية من الأنسجة (الشكل 5-د، الشكل 6B).
   ملاحظة: اختر شبكة مشتركة مع مسافة صغيرة بما فيه الكفاية بين الصلبان المجاورة، حيث أنه في كل حالة دراسة لهذه الدراسة، سوف تصل الصلبان على الأقل ضعف عدد surface(s) قسم من حجرة الأنسجة أخذ عينات، كعدد العينات التي يجب أن يؤخذ من هذه المقصورة الأنسجة. الأحجام المستحب تجريبيا عبر الشبكة لأعضاء وأنسجة الخنزير الأكثر مبينة في "المواد التكميلية" من الأنسجة أخذ العينات أدلة للخنزير الطب الحيوي "نماذج" "⁷.
6. مارك وعدد جميع الصلبان ضرب الأنسجة (على التوالي، المقصورة الأنسجة الفرعية أخذ عينات). استمرار تطبيق طريقة موحدة للعد والترقيم من الصلبان ضرب حجرة الأنسجة أخذ عينات في جميع الأنسجة ألواح، مثلاً، بترقيم متعاقبة من الصلبان كل منها في كل سطر بسطر، من اليسار إلى اليمين ومن من الأعلى إلى الأسفل، أو، مثلاً، بترقيم الصلبان في بلاطة نسيج واحد تلو الآخر في اتجاه عقارب الساعة، بدءاً من الصليب الأقرب إلى موقف 12:00 م، كما أظهرت القبض في الشكل 5E.
7. قسمة العدد الصلبان ضرب حجرة الأنسجة/الأنسجة لتكون عينات (n) عدد العينات إلى يتم إنشاؤها للحصول على الفاصل الزمني العينة المنتظمة (i).
8. تحديد موضع المعاينة الأولى باختيار عدد عشوائي x في الفاصل الزمني بين 1، و. لهذا، استخدم جدول رقم عشوائي. وضع علامة على موضع أخذ العينات الأول (x) وكل القادم x + i، x + 2أنا x + 3ط، إلخ، عبر ضرب حجرة الأنسجة/الأنسجة أخذ عينات على شفافية البلاستيك استخدام قلم لماء (5F الشكل).
   ملاحظة: الجداول رقم عشوائي يمكن سهولة وسرعة إنشاء باستخدام أرقام عشوائية على إنترنت.
9. العلامة الأنسجة تقاطع المواقع المقابلة للملحوظة بزيادة شفافية البلاستيك قليلاً ووضع قطعة صغيرة من ورق حلويات فارغة ونظيفة على سطح البلاطة الأنسجة باستخدام زوج من ملاقط (الشكل 5، 6E الشكل ).
10. المكوس عينة أنسجة من مواقع عينات (ح رقم 5، 6F الشكل، الشكل 7 أ)، وكذلك تقسيم لأنواع مختلفة من التحاليل اللاحقة (الشكل 6، الشكل 7 أ-ب)، كما هو محدد في الجدول 1.
11. وبعد أخذ العينات، تنظيف الورق الشفاف البلاستيك بالماء الدافئ والصابون، وجافة، وإعادة استخدامها.

3-توليد عشوائي موحد الخواص (أيار) المقاطع والمقاطع الرأسية موحدة عشوائي (فور) للتحليلات الكمية ستيريولوجيكال

1. تقنية "إيسيكتور"
   1. إعداد المواد: شفرات الحلاقة أو مبضع واجار، وقوالب الصب كروية (مثلاً، صب قوالب لحلوى، التي يمكن الحصول عليها من الموردين حلواني)، والمشابك foldback والملقط.
   2. ضع قطعة حجم الكافي (1 × 1 × 1 سم³) الثابتة، بشكل منهجي عشوائياً عينات أنسجة في قالب صب كروية وعقد معا المشابك foldback، وملء القالب مع أجار السائل الحار (الشكل 8 أ-ه).
   3. إزالة المجال أجار (الشكل 8F) من قالب الصب بعد التجميد لاجار.
   4. لفة في المجال أجار مع العينة جزءا لا يتجزأ من النسيج عبر الجدول، وقف، والفرع هو في موقف عشوائي.
      ملاحظة: الطائرة قسم الناتج قسما أيار (الرقم 8F-ز).
   5. المضي قدما بتضمين عينات الأنسجة في راتنج البلاستيك مثل التقييم البحري العالمي/مجلس العمل المتحد، الحفاظ على اتجاه المقطع أيار طائرة (انظر 1.3.5).
2. تقنية "أورينتاتور"
   1. إعداد المواد: شفرات الحلاقة أو مبضع، أجار، الملقط، جدول/جداول الأرقام العشوائية، ويطبع الدوائر اكويانجولار، وجيب التمام المرجحة.
      ملاحظة: تتوفر نسخ القوالب من الدوائر في المنشورات السابقة^8،26.
   2. ضع العينة من الأنسجة الثابتة (أو الأنسجة الثابتة جزءا لا يتجزأ من أجار) في طباعة دائرة اكويانجولار مع حافة واحدة موازية إلى 0-180 ° الاتجاه (الشكل 9 ألف، الرقم 10E).
   3. تحديد زاوية عشوائية باستخدام جدول الأرقام العشوائية. البحث عن علامات المطابقة في نطاق دائرة اكويانجولار، الذي يستند العينة. استخدام هذه العلامات، قطع مقطع من خلال العينة (أو عن طريق أجار المحيطة بالعينة جزءا لا يتجزأ من النسيج)، مع الطائرة الفرع موجهة موازية لاتجاه الزاوية العشوائية المشار إليها في نطاق دائرة اكويانجولار، والرأسية إلى يستريح سطح العينة (9B الشكل-C، الرقم 10F).
   4. وضع كتلة الأنسجة مع سطح المادة التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة التي تواجه الجانب السلبي في دائرة المرجحة جيب التمام مع حافة سطح يستريح توضع موازية لاتجاه 1-1 (الشكل 9، الرقم 10 ح).
   5. كرر الخطوة 3.2.3 وقص مقطع جديد من خلال العينة بزاوية عشوائية مصممة باستخدام الجدول رقم عشوائي (9E الشكل-واو، الرقم 10I-ي).
      ملاحظة: الطائرة القسم الناتجة قسم أيار.
   6. إذا كان ذلك مناسباً، تحدد مجال الشخصية قسم أيار عينة الأنسجة الثابتة للبت في انكماش الأنسجة المتصلة بالتضمين (الشكل 9-ي) كما هو موضح في الخطوة 1، 3، والمضي قدما لتضمين عينات الأنسجة في البلاستيك الراتنج مثل التقييم البحري العالمي/مجلس العمل المتحد.
3. جيل مقاطع الرأسية موحدة عشوائي (فور)
   1. إعداد المواد: شفرات الحلاقة أو مبضع، أجار، الملقط، جدول/جداول الأرقام العشوائية، ويطبع من الدوائر اكويانجولار.
      ملاحظة: تتوفر نسخ القوالب من الدوائر في المنشورات السابقة^8،26.
   2. تحديد محور عمودي ضمن العينة الأنسجة الثابتة التي دائماً معترف بها في العينة/الأقسام أثناء الخطوات اللاحقة.
      ملاحظة: عادة ما يتم اختيارها المحور العمودي على سطح العينة الأنسجة الطبيعية كالمحور العمودي.
   3. إذا كان ذلك مناسباً، تضمين العينة في أجار (الشكل 11 باء).
      ملاحظة: تضمين أجار قبل فور-أو أيار-تقطيع العينة الثابتة المفضل عموما لعينات صغيرة ورقيقة وهشة، أو لينة. أيضا استخدام التضمين أجار من عينات لتسهيل وضع العينة فور مقطعة أثناء تضمين اللاحقة للعينة في المتوسط راتنج البلاستيك.
   4. ضع العينة في طباعة دائرة اكويانجولار، مع المحور الرأسي أورثوجونالي موجهة إلى طائرة الجدول الجدول/الورقة (الشكل 11).
   5. قص العينة بزاوية عشوائية (تحديد باستخدام جدول أرقام عشوائية) مع الطائرة مقطع متعامد إلى الجدول وموازية للمحور الرأسي الحصول على طائرة قسم فور (الشكل 11).
   6. إذا كان ذلك مناسباً، تحدد مجال الشخصية قسم أيار عينة الأنسجة الثابتة للبت في انكماش الأنسجة المتصلة بالتضمين كما هو موضح في الخطوة 1، 3 (مقارنة الرقم 9-ي)، والمضي قدما لتضمين عينات الأنسجة في راتنج البلاستيك مثل التقييم البحري العالمي/مجلس العمل المتحد.

Representative Results

تقنية غمر لتحديد كثافة الأنسجة/الجهاز

رقم 12A ب- يظهر تصميم الممثل كثافة وحجم الكلي الخنزير باستخدام تقنية غمر هو موضح في الخطوة 1، 1 (الشكل 1و الشكل 2). وترد نتائج أكثر تمثيلاً لقياسات كثافة إضافية الخنزير والأنسجة في الجدول 2. يظهر قائمة أكثر شمولاً من مرجع كثافات متنوعة الخنزير الأنسجة والأعضاء في الأنسجة أخذ العينات أدلة للخنزير الطب الحيوي "نماذج" "⁷. ويمكن تقدير صحة قيم القياس كثافة الأنسجة التي تم الحصول عليها باستخدام الأسلوب غمر بالقياسات المتكررة لنفس العينة والعينات المستقلة. أنسجة الخنزير الأكثر عرض قيم الكثافة أعلى قليلاً من الماء (≈ρ_المياه 1.0)، بينما تعرض الأنسجة للسباحة في المياه المالحة (الأنسجة الدهنية وأنسجة الرئة) الكثافة < 1.0.

كافالييري الأسلوب لتحديد حجم الجهاز

الرقم 12 --و يدل على تصميم الممثل من الحجم الكلي الخنزير (الجهاز نفسه كما هو مبين في الشكل 12 ألف-ب). وحددت مجالات القسم أسطح ألواح الجهاز عد نقطة، استخدام شبكة عبر فرضه المطبوعة على شفافية بلاستيك، فضلا عن قياس مجالات القسم ألواح الجهاز في صورة الممسوحة ضوئياً من الألواح (دفع المتعلقة الانتباه إلى إسقاط الزائد من الأنسجة الواقعة خلف ألواح الباب السطوح، الشكل 12 ز-ح). حساب دقة حجم الجهاز/الأنسجة يمكن تقدير البيانات التي حصلت عليها أداء النهج كافالييري (الخطوة 1، 2، 3 الشكل) بالمقارنة بحجم كل منها من الوزن وكثافة من الجهاز/الأنسجة. وحدات التخزين الكلي درست في الشكل 12 يحدده الأسلوب غمر وتختلف أساليب كافالييري بأقل من 1% من بعضها البعض. كمقياس لدقة تقديرات حجم كافالييري، يمكن حساب معامل الخطأ (CE)، ك سابقة وصف¹⁵.

تصميم انكماش أنسجة ثلاثية الأبعاد ذات الصلة بتضمين أثناء تجهيز عينات الأنسجة لعلم الأنسجة

نتائج تمثيلية لمدى تقلص الأنسجة المتصلة بالتضمين لعينات الأنسجة الخنزير (الأنسجة القشرية الكلوية) في الراتنجات البلاستيكية (GMA/مجلس العمل المتحد أو الإيبوكسي) لفحص كمية هيستومورفولوجيكال مبينة في الجدول 2 (سابقا بيانات غير منشورة). تم تحديد عوامل الانكماش الخطي المشار إليه في الجدول 2 كما هو موضح في الخطوة 1، 3 (الشكل 4). أنها تشير إلى انخفاض حجم ثلاثي الأبعاد من 29 في المائة لتضمين التقييم البحري العالمي/مجلس العمل المتحد، و 22% لتضمين الإيبوكسي الخنزير النسيج الكلوي القشرية. يظهر الرقم 13 أمثلة العينات مستعدين على نحو كاف وغير كاف من الأنسجة الدهنية جزءا لا يتجزأ من أجار، الفورمالين--الثابتة لقياس منطقة سطح مقطع عينة قبل التضمين البلاستيكية.

المرجحة حجم "عينة عشوائية منتظمة" بنقطة الفرز وتجهيز الأنسجة عنها "مختلف أنواع تحليل المتلقين للمعلومات"

تقنية "تقطيع والعد نقطة" المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة متني الأجهزة (الخطوة 2، الرقم 5، رقم 6، رقم 7) يمثل وسيلة ثابتة وقوية لجيل ممثل عينات لأنواع متعددة من اللاحقة من تحليلات^2،7. النتائج ممثلة لجيل عينة المصرف البيولوجي عينات بشكل منهجي عشوائياً، وشدة زائدة من النقانق مختلف الأعضاء والأنسجة، مع اللاحقة التفاضلية تجهيز عينات الأنسجة قصت متعددة مختلفة من مجرى النهر وقد سبق أساليب التحليل باستخدام تقنية أخذ العينات الموضحة في الخطوة 2 (الرقم 5و الرقم 7، و نحو الواضحة في الشكل 6) المنشورة². لجيل من المصرف البيولوجي عينات من أنسجة الكبد في سابق دراسة المصرف البيولوجي الخنزير²، على سبيل المثال، كبد الخنزير كان تماما مقطوع إلى ما يقرب من 20 ألواح سمك 2-3 سم، فرضه مع مع سم 3 عبر الشبكة، كما هو موضح في الخطوة بشكل منهجي عشوائياً مواقع الأنسجة 2 و 16 من ما يقرب من 2 × 2 × 2 سم³ عينات واقتطعت في كل حالة على حدة. من كل من العينات قصت، عنها خمس تم إنشاؤها لاحقاً للتحليلات الجزيئية (المجمدة في-80 درجة مئوية) لمواقع أخذ عينات، وعينه فرعية واحدة كريوهيستولوجي، عينة فرعية واحدة ثابتة في حل ميثاكارن، وواحد في حل فورمالدهايد البارافين اللاحقة التضمين وغذائها-والفحص المناعي. وقد تحقق توليد عينات مختلفة 74 كل حالة (حتى تجميد أو نقل العينات إلى حل التثبيت) داخل حوالي 20 دقيقة في المتوسط². ويمكن تقدير الطابع العملي/نجاح وصف بأخذ العينات والاختزال النهج بتقييم جودة العينات التي تم إنشاؤها (أي، نوعية من الجيش الملكي النيبالي-أو البروتين يعزل، الحفاظ هيستومورفولوجيكال و ultrastructural خصائص عينات الأنسجة، وملاءمتها لتحليل إيمونوهيستولوجيكال، و ما إلى ذلك)²

الجيل عشوائي موحد الخواص (أيار) المقاطع والمقاطع الرأسية موحدة عشوائي (فور) للتحليلات الكمية ستيريولوجيكال

أثبتت التقنيات لجيل توجها نحو الأمام الخواص موحدة عشوائي (أيار) الأقسام والفروع فور من عينات الأنسجة النقانق (المصرف البيولوجي) (بروتوكول الخطوة 3، رقم 8، رقم 9، رقم 10، الشكل 11)، مما يسمح بدراسة لمعظم المعلمات ستيريولوجيكال الكمية، ويمكن تحقيق ذلك بسرعة مع بعض الممارسة، ودون صعوبات معقولة أو مصادر الخطأ. ولذلك، جيل أيار-العينات هو مبين في الشكل 9 (إيسيكتور تقنية) و الرقم 10 (أورينتاتور تقنية) التمثيل الكامل لأساليب هذه.

رقم 1: التوضيح التخطيطي "تقنية غمر" لتحديد كثافة الأنسجة/الجهاز. (أ) قياس وزن العينة (أيكتلة، m_S). (ب) مقياس تريد وزن كوب مليئة ملحي 0.9% 20 درجة مئوية وحامل عينة مغمورة في المياه المالحة إلى وظيفة محددة، الملحوظ. (ج) غمر كاملة من العينة إلى موقف ملحوظ لصاحب العينة دون أي اتصال للجدران الداخلية أو الجزء السفلي من الكأس. الوزن المعروض في التوازن هو وزن حجم المحلول الملحي شردهم العينة). يتم حساب كثافة العينة كما هو مبين (هنا: ρ_عينة = m_S/V_S = m_S/(m_L/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 g/cm³_)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: "غمر تقنية" لتحديد كثافة الأنسجة/الجهاز. (أ) نموذج مختلف أصحاب شيدت من سلك رفيع. من اليسار إلى اليمين: حلقة خيط سلك رفيع من خلال قنية حقن رقيقة، سلة حلزونية من الأسلاك لإجراء عينات صغيرة وهشة، وحبال بسيطة من سلك رفيع. تشير الأسهم في أ-ج إلى المواقف التي المكلفين بعينه مغمورة في المحلول الملحي. (ب، ج) لتحديد المواقع لصاحب العينة أثناء غمر العينة في المحلول الملحي (مقارنة ب الرقم 1 ج). (ب) استكمال الخنزير الغدة النخامية وضعها في حامل عينة على شكل سلة. (ج) عينة من عضلة القلب الخنزير. ملاحظة غمر كاملة من العينات في المياه المالحة دون الاتصال على الجدران أو الجزء السفلي من الكأس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: التوضيح التخطيطي تطبيق الأسلوب كافالييري لتحديد حجم الجهاز الخنزيري. العملة (أ) كومة مثال لفهم مبدأ كافالييري. انظر مقدمة لمزيد من التفاصيل. (ب-ح) مظاهرة التخطيطي لتقدير حجم الكلي ثابت التروية. (ب) قياس طول الكلي على طول محورها الطولي (l). (ج) قطع الجهاز كاملة في ن نفس القدر سميكة (د) موازية لشرائح متعامد على المحور الطولي الجهاز. (د) وضع ألواح الجهاز على نفس السطح إلى الأسفل. علما بأن أول لوح الأنسجة (يمين) يوضع على سطحه الطبيعية، أي، ليس لديه سطح قسم. (ﻫ-ح) نهج مختلفة لتحديد قسم المساحات السطحية لألواح الأنسجة. (ﻫ) تتبع الخطوط العريضة لكل لوح الجهاز مع قلم لماء في تغشيه شفافية بلاستيك من الملامح لوح الجهاز المبين بحجم مناسب، معايرة عبر الشبكة مطبوعة على شفافية بلاستيك، عد من تقاطع ضرب المساحة الشخصية. منطقة الشخصية قسم لوح الجهاز يحسب من عدد الصلبان ضرب منطقة الشخصية القسم والمنطقة المقابلة للصليب واحد. (و،ز) تحديد المجالات قسم الجهاز ألواح في الصور الفوتوغرافية التي أخذت في الاتجاه الرأسي للأسطح القسم (F)، أو الصور الممسوحة ضوئياً من ألواح الأنسجة (ز)، مع الحكام للمعايرة. (ح) تحديد مجالات القسم ألواح الأنسجة في الصور الرقمية من الصور/المسح الضوئي باستخدام تطبيقات البرمجيات مورفوميتري المناسبة. المنطقة (أنا) حساب الحجم المقدر للجهاز كنتاج التراكمي الأسطح القسم المقابل لكل ألواح الجهاز مضروبة في متوسط سمك الجهاز ألواح¹⁵. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: توضيح التخطيطي لتصميم انكماش أنسجة ثلاثية الأبعاد ذات الصلة بتضمين أثناء تجهيز عينات الأنسجة لعلم الأنسجة. (أ) قطع من سطح القسم الطازجة، والطائرة من عينة أنسجة ثابتة (لتحقيق الاستقرار لشكل الأنسجة (الناعمة) تشوه بسهولة مثل الأنسجة الدهنية أو الرئة بتضمينها في أجار قبل تمزيقها). مسح سطح العينة جنبا إلى جنب مع حاكم حجم القسم. (ب) تحديد المتعلقة من مساحة سطح مقطع عينة الأنسجة الثابتة (_f). روتين (ج) تضمين العينة في تضمين المتوسطة من البلاستيك. (د) إعداد قسم النسيجي كتلة البلاستيك مع الحفاظ على الطائرة قسم عينة. تركيب الجزء المتعلق بالشريحة الزجاجية وتلطيخ الروتينية للشريحة. (ﻫ) المسح الضوئي الشريحة جنبا إلى جنب مع حجم مسطرة. (و) تحديد المتعلقة فيما يتعلق بالجزء العينة جزءا لا يتجزأ من البلاستيك (أ) (_ه). (ز) حساب مدى تقلص الأنسجة المتصلة بتضمين كحاصل قسمة قياس مجالات المقابلة الباب لمحات من عينات الأنسجة قبل وبعد تضمين في تضمين متوسطة¹⁴من البلاستيك. الصور على الجانب الأيمن تظهر على السطح قسم ثابت فورمالدهايد عينة من الأنسجة الدهنية جزءا لا يتجزأ من أجار اسودت الحبر قبل تضمينها في راتنج البلاستيك (أعلى) والمقابلة الشخصية قسم (أنه يلطخ) التقييم البحري العالمي/مجلس العمل المتحد--جزءا لا يتجزأ من العينة (أسفل). تغيير حجم أشرطة = 2 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: توضيح تخطيطي المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة. يوضح المثال قدم عينة عشوائية منتظمة من ستة مواقع الأنسجة داخل قشرة الكلي الكلي ثابت التروية. (أ) قياس طول الكلي على طول محورها الطولي (l). (ب) إكمال تقطيع الجهاز كامل إلى نفس القدر سميكة (د) موازية شرائح متعامد على المحور الطولي الجهاز. (ج) وضع ألواح الجهاز/الأنسجة على نفسه (أي، أما اليمين أو إلى اليسار) السطح إلى الأسفل. (د) تراكب من ألواح الأنسجة مع شبكة عبر حجم مناسب المطبوعة على شفافية بلاستيك. ويوضع الأبعد اليسار العلوي عبر الشبكة عبر نقطة عشوائية خارج الأنسجة (المشار إليها بواسطة نقطة زرقاء، •). (ﻫ) عد وترقيم جميع الصلبان ضرب قشرة الكلي. في هذا المثال، يتم ترقيم الصلبان ضرب القشرة الكلوية التتالي في بلاطة الكلي واحد بعد آخر (من اليسار إلى اليمين)، في كل دعوى لوح في اتجاه عقارب الساعة، بدءاً من الصليب الأقرب إلى موقف 12:00 م. وهنا، ضرب الصلبان 36 القشرة الكلوية. ستة مواقع لأخذ العينات أخذ عينات. ولذلك، هو أخذ عينات كل الموضع السادس حيث عبر عدد مرات تصفح الموقع الأنسجة (36/6 = 6). (و) في هذا المثال، عبر موقف الرابع (رقم 4) ضرب القشرة الكلوية يتم اختيارها عشوائياً كموقف أخذ العينات الأولى. السادسة عبر كل يلي ضرب قشرة الكلي هو علامة على شفافية البلاستيك باستخدام قلم لماء. في هذا المثال، هذه هي مواقف 4 و 10، 16، 22، 28 و 34. (ز) وسم المواقع الأنسجة المقابلة بالقطع الصغيرة من الورق حلويات فارغة ونظيفة وضعها على سطح النسيج. (ح) الختان من عينات الأنسجة من مواقع عينات عشوائياً بشكل منهجي والمعالجة اللاحقة لمزيد من التحليلات. لقد تم تعديل هذا الرقم من البل et al. (2016)، الأرقام S236 و S237، الصفحة 186 (ملاحق)⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة من القشرة الكلوية الكلي الخنزير (انظر الشكل 5)، وقواعد لعد نقطة. (أ) خنزير الطازجة الكلي. (ب) الكلي مقطوع إلى نفس القدر سميكة شرائح متوازية متعامدة على محور الجهاز طولية، مضافين مع عبر الشبكة مطبوعة على شفافية بلاستيك. دائرة حمراء يشير إلى موضع نقطة عشوائية تستخدم لموقف عبر الشبكة بطريقة عشوائية. (ج) رسم توضيحي لعد نقطة القواعد: cross/point تحسب كضرب حجرة الأنسجة لتكون عينات (مرجع المقصورة)، إذا الداخلية اليمنى العليا الزاوية من العمودي والأفقي بار للصليب (السهم) يغطي الأنسجة. (د) وضع علامات على الصلبان ضرب القشرة الكلوية وعينه عشوائية منتظمة لمواقع الأنسجة (هنا، ضرب الصلبان 119 القشرة الكلوية وهي عينات 17 موقعا عشوائياً بشكل منتظم أخذ عينات الفاصل زمني أنا باستخدام = 7). (ه) عينات عشوائياً بشكل منتظم مواقع القشرة الكلوية الموسومة بورقة حلويات. (و) اقتطعت العينات. (ز) مواصلة تقسيم العينات قصت للمعالجة اللاحقة عنها لأنواع مختلفة من تحليل المتلقين للمعلومات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 7: تقسيم عينات الأنسجة اقتطعت من بانتظام مواقع عشوائياً عينات الأنسجة وتجهيز عنها لأنواع مختلفة من تحليل المتلقين للمعلومات- (أ) التوضيح التخطيطي لتوليد أنسجة عنها من موقع عينات بشكل منهجي عشوائياً من القشرة الكلوية (الأنسجة الأصلية) لتحليلات مختلفة (مثلاً، FF-PE: نموذج ثابت الفورمالين، وجزءاً لا يتجزأ من البارافين، ولجنة النقل البحري-PE: نموذج ميثاكارن--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين للأنسجة المجهرية الضوء؛ البرد: نموذج لعلم الأنسجة في القسم المتجمد؛ -80 ° c: الثلج الجاف تجميد عينات الأنسجة للتحليل الجزيئي). (ب) الختان من مواقع أخذ عينات بانتظام عشوائياً من قشرة الكلي ثابت التروية الكلوية، وكذلك تقسيم عينات الأنسجة قصت، وتجهيز عنها للتحليلات المورفولوجية النوعية والكمية. ألواح من نضح ثابتة الكلي الخنزير (1)، (2)، عبر الشبكة العشوائية الجدول رقم (3)، اكويانجولار ووزن جيب التمام دوائر (4) لجيل أبواب أيار (انظر الشكل 9، الرقم 10)، تثبيت مختلف الحلول (5، 6، 7)، وعينه حاوية لعينات مجهرية الإلكترون (8). وقد تم تعديل هذا الرقم من البل et al. (2016)، الرقم S239، الصفحة 186 (ملاحق)⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 8: "إيسيكتور" الفرع إعداد من أنسجة الخنزير الفورمالين--ثابت- (أ) عينة من القشرة الكلوية الخنزير نضح ثابتة. (ب) قوالب الصب كروية. (ج) أجار السائل. (د-ه) أجار-تضمين عينات في قوالب الصب كروية. المجال أجار (F) مع عينة جزءا لا يتجزأ من النسيج. (ز) أجار المجال مع الأنسجة المضمنة مقطوع في موضع عشوائي (أيار باب الطائرة). وقد تم تعديل هذا الرقم من البل et al. (2016)، الرقم S6، الصفحة 14 (ملاحق)⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 9: التوضيح التخطيطي تقنية "أورينتاتور" لإعداد مقاطع ايور. Sample(s) (A) من الأنسجة الثابتة المفروضة دائرة اكويانجولار (ci1) مع حافة موازية إلى 0-180 ° الاتجاه (يشار إليها بخط أحمر). (ب) سيكتيونينج للعينة بزاوية عشوائية (الخط الأخضر). (ب، ج) التي تم إنشاؤها حديثا سطح مقطع عينة الأنسجة (مشار إليها باللون الأخضر). (د) عينة وضعها على دائرة وزن جيب التمام (ci2) مع سطح الأقسام التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة التي تواجه الجانب السلبي وحافة واحدة من السطح يستريح موازية لاتجاه 1-1 (يشار إليها بخط أحمر). (ه) قطع المقطع الثاني من خلال العينة بزاوية عشوائية. الفرع الناتجة (و) عشوائياً الخواص طائرة العينة (المشار إليها باللون الأزرق). (ز) تحديد منطقة قسم عينة الأنسجة الثابتة لتقدير انكماش الأنسجة المتصلة بالتضمين كما هو موضح في الخطوة 1، 3 أيار. (ح) تضمين من عينة الأنسجة في راتنج البلاستيك. (أنا) سيكتيونينج كتلة البلاستيك مقسمة (الموازية للطائرة أيار) على مبضع. (ي) تصاعد البلاستيك-أبواب أيار على الشرائح الزجاجية. وقد تم تعديل هذا الرقم من البل et al. (2016)، الرقم S8، الصفحة 15 (ملاحق)⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 10: تقنية "أورينتاتور" لإعداد مقاطع أيار لعينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من أجار. (أ-د) اختيارياً، واحد قد أجار-تضمين عينة عشوائياً بشكل منتظم عينات الأنسجة الثابتة (تضمين أجار مفيد لعينات الأنسجة الصغيرة، حيث أن الأولى أو كلا القسمين عشوائي يمكن وضعه ضمن أجار دون قطع الأنسجة). (ﻫ) تحديد المواقع كتلة أجار في دائرة اكويانجولار (ci1) مع حافة موازية لاتجاه 1-1 (يشار إليها بخط أحمر). (و، ز) تقطيع كتلة بزاوية عشوائية (هنا: 15-15، الخط الأخضر) تحدد باستخدام جدول رقم عشوائي (السهم رنت، الخضراء). اللاحقة (ح) تحديد المواقع كتلة أجار على سطح قسم قص في و على دائرة المرجحة جيب التمام (ci2) مع حافة سطح يستريح توضع موازية لاتجاه 1-1 (يشار إليها بخط أحمر). القسم الثاني (أنا) قطع طريق العينة بزاوية عشوائية (هنا: 20-20، المبين بخط أزرق)، تحدد باستخدام جدول أرقام عشوائية (السهم رنت، الأزرق). (ي) "الناتجة عن أيار" الفرع طائرة عينة الأنسجة. وقد تم تعديل هذا الرقم من البل et al. (2016)، الرقم S9، الصفحة 16 (ملاحق)⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 11: التوضيح التخطيطي لإعداد القسم فور- (أ) عينة الأنسجة الثابتة مع محور عمودي (شخصية) محددة (مثلاً، عمودي على سطحه الطبيعية). (ب) عينة الأنسجة الثابتة المضمنة في أجار. (ج) تحديد المواقع من عينة الأنسجة the(agar-embedded) في طباعة دائرة اكويانجولار (ci1). V_A: المحور الرأسي. سيكتيونينج (د) من العينة بزاوية عشوائية (الجدول رقم عشوائي؛ وهنا: الاتجاه 30-30، يشير إليه خط أزرق) مع الطائرة قسم أورثوجونالي موجهة إلى الجدول وموازية للمحور الرأسي للعينة. الطائرة القسم فور الناتجة من عينات الأنسجة (المشار إليها باللون الأزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 12: فولوميتري ممثل لإحدى كليتيه الخنزير- (أ-ب) تقنية غمر. (أ) تحديد الوزن الكلي (م_طفل). (ب) تحديد وزن حجم المحلول الملحي شردهم الكلي (م_displ.saline). معلقة على سلسلة الكلي والكامل غارقة في المياه المالحة دون لمس الجزء السفلي أو جدران الكأس. هو حجم الكلي المحسوبة 92.6 cm³. (ج-د) تقنية كافالييري، بلانيميتري عن طريق العد نقطة. (ج) قياس طول الكلي على طول محورها الطولي (l). (د) تحديد مجالات الشخصية قسم الكلي ألواح نقطة العد بعد طباعة تراكب الشبكة من الصلبان متباعدة بالتساوي على شفافية بلاستيك. هنا، هو الحجم التقديري الكلي 93.3 cm³. (ه-و) تقنية كافالييري، بلانيميتري صور الممسوحة ضوئياً من المجالات الشخصية قسم من ألواح الكلي (F). هنا، هو الحجم التقديري الكلي 92.8 cm³. ج-ه، جولة الطبيعي سطح الأول أو لوح الماضي الكلي على الماسح الضوئي أو مضافين بشفافية عبر الشبكة ليس سطح قسم ولذلك يتم قياس مساحة لا قسم في هذه البلاطة الأنسجة. (ز-ح) مظاهرة أوفيربروجيكشن في الصور الممسوحة ضوئياً من ألواح الجهاز/الأنسجة (ز) وفي الجهاز/أنسجة ألواح مضافين مع شفافية عبر شبكة (ح). وترد أوفيربروجيكتينج أجزاء من أنسجة ألواح الجهاز بخطوط بيضاء وسوداء منقطة. تحدد المناطق فقط من ملفات المقطع الفعلي (أي، الأنسجة محاطة بخط منقط أبيض المشار إليه جزئيا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 13: الممثل التوضيح الكافي (A) ودون المستوى الأمثل (ب) إعداد عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من أجار للبت في انكماش الأنسجة المتصلة بتضمين عينات في البلاستيك النسيجي تضمين وسائل الإعلام- (أ) الصورة الممسوحة ضوئياً من سطح مقطع عينة الثابتة في الأنسجة الدهنية تحت الجلد الخنزير قبل تضمينها في راتنج البلاستيك. مضمن في أجار اسودت الحبر لتحقيق الاستقرار في شكل العينة العينة وتحديد واضح لملامح سطح القسم. (ب) مخطط غيرواضح فقاعة الهواء السطحي وفخ الباب (السهم) داخل أجار. تغيير حجم أشرطة = 5 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تحليل		عينة	تجهيز
نوع	أسلوب (أساليب)
التحليلات الجزيئية	نسخة الحمض النووي الريبي والبروتين، المستقلب والتنميط، والدهن تحليل جميع، وتحليل الحمض النووي	القطع الصغيرة * الأنسجة (أصلي) جديد	تجميد في الثلج الجاف، أو في نيتروجين سائل. مخزن في-80 درجة مئوية.
التحليلات المورفولوجية النوعية	علم الأنسجة [مجهرية الخفيفة، بما في ذلك إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) والتهجين في الموقع]	الطازجة (أصلية) – أو في الموقع -ثابت * عينات الأنسجة	استخدام المصفف مختلفة (مثلاً، 4% فورمالدهايد الحل) وتضمين الوسائط (البارافين، التقييم/مجلس العمل المتحد، الإيبوكسي)، حسب الاقتضاء.
	كريوهيستولوجي (الأجزاء المجمدة، بما في ذلك المدينة)	عينات الأنسجة (أصلي) جديد	تضمين العينة في المتوسط حظر وتجميد في إيسوبينتاني تبريد النيتروجين السائل.
	تحليل ultrastructural [الميكروسكوب الإلكتروني، بما في ذلك انتقال-(TEM) والمجهر الإلكتروني المسح]	قطع صغيرة من جديد (أصلية) – أو في الموقع-ثابت * عينات الأنسجة	إصلاح العينة في محلول glutaraldehyde 2.5-6.25% وتضمين في راتنج البلاستيك الإيبوكسي.
التحليلات المورفولوجية الكمية	الخفيفة الميكروسكوب	الطازجة (أصلية)-أو في الموقع -ثابت * عينات الأنسجة	إعداد أبواب أيار (أورينتاتور-، إيسيكتور-الأقسام) و/أو فور-مقاطع من عينات الأنسجة المضمنة البلاستيك.
	تيم	قطع صغيرة من جديد (أصلية) – أو من في الموقع -ثابت * الأنسجة	إعداد المقاطع أيار (أورينتاتور-، إيسيكتور-مقاطع) لعينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الإيبوكسي.

الجدول 1: تجهيز عنها الأنسجة التي اقتطعت من مواقع أخذ عينات بانتظام عشوائياً لأنواع مختلف التحليلات المصب. اعتماداً على التصميم التجريبي لدراسة والجهاز/الأنسجة قيد التحقيق، ينبغي إعداد مختلفة عنها اقتطعت من كل موقع من المواقع بانتظام عشوائياً عينات الأنسجة والمجهزة لأنواع مختلفة من تحليل المتلقين للمعلومات. يتم توفير بروتوكولات مفصلة للأجهزة الأكثر الخنزير/الأنسجة ودراسة أنواع في الأنسجة أخذ العينات أدلة للخنزير الطب الحيوي "نماذج" "⁷. التقييم/مجلس العمل المتحد: جليكولميثاكريلاتي/ميثيلميثاكريلاتي. أيار: زي موحد الخواص عشوائي. فور: الرأسية موحدة عشوائي. * كحد أقصى. 2 × 2 × 2 مم³. مثلالأنسجة نضح ثابتة أو أنسجة الرئة الرئتين تغرس مع تثبيت الحل.

الأسلوب	نتائج تمثيلية
تقنية غمر لتحديد كثافة الأنسجة/الجهاز (الخطوة 1-1، الشكل 1، الشكل 2)	الجهاز/أنسجة الخنزير		Ρ (g/cm³)
	الكبد		1.071 ± 0.007
	البنكرياس		1.062 ± 0.016
	عضلة القلب في البطين		1.036 ± 0.014
	الكلي		1.044 ± 0.006
	البطن الحشوي الأنسجة الدهنية *		0.921 ± 0.032
	الغدة الدرقية		1.061 ± 0.007
	الدماغ		1.051 ± 0.007
	الغدة الكظرية		1.063 ± 0.025
	الهيكل العظمى العضلات * *		1.074 ± 0.003
	البيانات هي وسائل ± الأوزان الجهاز/الأنسجة الخاصة بالتنمية المستدامة. وقد تحددت في n = 18 الخنازير (الخنازير الذكور والإناث 4 14؛ وسن 60 يوما إلى سنتين؛ الجسم الوزن 30 – 250 كجم). * الأنسجة الدهنية من مساريق jejunal. * * يعني قيم dorsi لونجيسيموس م. م. الظنبوبي كرانياليس، م. ثلاثية الرؤوس العضدية وم. جلوتيوبيسيبس.
تصميم انكماش أنسجة ثلاثية الأبعاد ذات الصلة بتضمين أثناء تجهيز عينات الأنسجة لعلم الأنسجة (الخطوة 1، 3، 4 الرقم)	الجهاز/الأنسجة	تضمين المتوسطة	وS
	قشرة الكلي (خنزير)	التقييم/مجلس العمل المتحد	0.89 ± 0.02
		الإيبوكسي	0.92 ± 0.02
	البيانات هي وسائل ± SD من قياسات للعينات 24 12 الخنازير. وS: عامل التصحيح الانكماش الخطي.

الجدول 2: نتائج الممثل للكثافة المحددة وأنسجة الخنزير⁷، وعوامل تصحيح الانكماش الخطي لانكماش الأنسجة المتصلة بتضمين النسيج الكلي القشرية الخنزير في البلاستيك مختلفة تضمين وسائل الإعلام.

Discussion

جيل من المصرف البيولوجي عينة مجموعات من النماذج الحيوانية النقانق يتطلب تقنيات قوية والبروتوكولات لتحديد حجم الجهاز/الأنسجة، جيل استنساخه من الممثل، عينات الأنسجة الزائدة مناسبة لمجموعة واسعة نطاق من أساليب تحليل مختلفة، التعشيه التوجه لأقسام عينة للتحاليل الكمية ستيريولوجيكال. الأساليب الموصوفة في هذه المادة هي تتكيف مع أحجام الخنزير والأنسجة، وقد وضعت بشكل فعال تلبية هذه المطالب^2،7. أنها تقوم على أساس المبادئ المنهجية المعترف بها جيدا، وأثبتت سابقا الطابع العملي في مختلف الدراسات المنشورة^2،،من^712،21. الأساليب الموصى بها هامة لأنواع مختلفة من الدراسات فحص عينات الأنسجة/الجهاز، حيث أنها توفر أساسا لجيل عينات التمثيلية، والحصول على مجموعة متنوعة من المعلمات التي خلاف ذلك لا يمكن تحديده. هذه الطرق يمكن تنفيذها بسرعة مع القليل من الجهد، وهي متوافقة مع تقريبا كل أنواع التحليلات المتلقين للمعلومات. ولذلك، تعتبر مناسبة ليس فقط لمشاريع المصرف البيولوجي نموذج الحيوان الخنزير، ولكنها هي أيضا مفيدة في الدراسات التي تشمل التحليلات الكمية هيستومورفولوجيكال من عينات الأنسجة من الأنواع النموذجية الحيوانات الكبيرة الأخرى (مثلاً، الأغنام)، كما كما هو الحال في دراسات الطب البيطري. مراعاة الجوانب التقنية أساليب مختلفة، عدد قليل من الخطوات الحاسمة والقيود المفروضة يجب أن تؤخذ أثناء تنفيذ بروتوكولات التقنيات الخاصة بكل منها.

تقنية غمر لتحديد كثافة الأنسجة/الجهاز

أثناء تحديد الأنسجة كثافات استخدام أسلوب غمر (الخطوة 1-1، الشكل 1، الشكل 2)، الرعاية الواجب اتخاذها لا لتلمس الجدران الداخلية أو الجزء السفلي من الكأس مع عينات الأنسجة أو صاحب العينة بينما الأنسجة عينة مغمورة في المحلول الملحي. وبخلاف ذلك، سيتم عرض المقياس وزن العينة بدلاً من ثقل حجم المحلول الملحي المشردين بسبب العينة. لعينات الأنسجة الصغيرة/خفيفة جداً (بضعة ملغ)، أسلوب غمر لتحديد كثافة الأنسجة محدودة، بسبب surface tension للمياه المالحة وحاصل سلبا على ارتفاع حجم العينة على حجم السائل غمر في الكأس، التي تعوق دقة القياس. هنا، قد يتم استخدام وزن العينة لمزيد من العمليات الحسابية بدلاً من وحدة التخزين تحسب كثافة. أيضا تحديد كثافة الأنسجة بغمر ليست فعالة لانسجة الرئة (غير المثبتة) جديدة، بسبب محتوى الهواء في الأنسجة، وفي بعض الحالات، حيث تكون الأجهزة تجريبيا perfused/تغرس مع المصفف غير متناسقة.

كافالييري الأسلوب لتحديد حجم الجهاز

طريقة فولوميتري كافالييري أعضاء وأنسجة الخنزير أكثر تعقيداً بالمقارنة مع تحديد حجم الجهاز من وزن الجهاز والكثافة. ومع ذلك، أنها مناسبة للأجهزة التي لا يكون وزنه مناسب بسبب تجهيزها تجريبية (مثلأجهزة التروية ثابتة أو الرئتين تغرس مع تثبيت الحل). هنا، يمكن من الناحية المثالية الجمع بين الأسلوب فولوميتري كافالييري مع تقنية المرجحة حجم عينة عشوائية المنهجية الموضحة في الخطوة 2 (الشكل 5، 6 الشكل، الشكل 12). أثناء تقدير حجم الجهاز/الأنسجة من المناطق في التشكيلات الجانبية لقسم من شرائح متوازية، ومسافة واحدة من الجهاز/الأنسجة (نهج كافالييري، الخطوة 1، 2، 3 الشكل)، ألواح الحفاظ على التوجه للأنسجة (طائرة القسم العلوي والسفلي )، فضلا عن تحديد دقيق لمنطقة كافة التشكيلات الجانبية لقسم تتسم بأهمية كبيرة. خاصة، إذا كان يتم تحليل الصور الرقمية أو مسح لألواح الجهاز بلانيميتريكالي، أوفيربروجيكشنز أنسجة (خارج الطائرة مقطعة الأنسجة) من لوح الأنسجة (الشكل 12ز-ح) يجب النظر بعناية يكون لتوفير وحدة تخزين يمكن الاعتماد عليها وتشير تقديرات.

تصميم انكماش أنسجة ثلاثية الأبعاد ذات الصلة بتضمين أثناء تجهيز عينات الأنسجة لعلم الأنسجة

مدى انكماش الأنسجة المتصلة بتضمين يعتمد على المتوسط التضمين والنوع من الأنسجة، وقد تختلف أيضا بين خلطات معالجة عينات الأنسجة نفسها.

بينما تعتبر الأجزاء المجمدة لعرض تقريبا لا انكماش في الطائرة X-Y، والتضمين البلاستيكية عموما يسبب تقلص قليلاً من الأنسجة، انكماش الأنسجة المتصلة بالتضمين واسعة النطاق لا سيما في عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين ، وسوف تنال عادة إلى حد كبير الكمية التحليلات المورفولوجية لمعلمات الأبعاد في مقاطع نسيجية لهذه العينات. بالإضافة إلى قدر كبير من انكماش ثلاثي الأبعاد الشاملة، تضمين البارافين يتسبب أيضا انكماش غير موحدة والتفاضلية، ومتباين، ومتغير من العينة ومختلف الهياكل التشريحية وأنواع الأنسجة وأنواع الخلايا داخل ^8،الأنسجة عينة¹³. وعلاوة على ذلك، لا سيما في غذائها أبواب عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين سمكا، أيضا إلى حد كبير قد تختلف مدى تقلص الأنسجة في X-Y و Z-اتجاه المقطع. هذا يمكن أن يكون سبب انكماش فرق منطقة مقطع (في اتجاه-س-ص) وارتفاع الباب (أي، سمك المقطع الرأسي) خلال تمتد من القسم في حوض ماء تعويم الأنسجة الدافئة بعد قطع المقطع من الأنسجة كتلة، وأثناء إجراءات تجهيز وتلطيخ وكوفيرسليبينج اللاحقة للقسم التي شنت على شريحة (أي، انهيار متجانسة من محور ع المقاطع) زجاج⁸. بالإضافة إلى ذلك، في أبواب سميكة، قد يكون هناك ضغط أقوى نسبيا من مناطق باب الطائرة قرب الأنسجة داخل القسم في حين يتم قطع المقطع من كتلة الأنسجة (مما يؤدي إلى تشوه تفاضلية لمحور ع المقاطع)¹⁹ . ثم أيضا هذه الآثار قد يشوه تقديرات عدد من الهياكل الأنسجة داخل القسم بأساليب التحليل الكمي متميزة ستيريولوجيكال، مثل ديسيكتور الضوئية. ولذلك، التنبؤ ورصد وتصحيح من انكماش الأنسجة المتصلة بالتضمين ليس مجديا ل عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين⁸.

وفي المقابل، مدى تقلص حجم عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الراتنجات البلاستيكية، مثل التقييم البحري العالمي/مجلس العمل المتحد أو الإيبوكسي، بدرجة كبيرة أقل، والأهم من ذلك، موحدة أكثر. ولذلك، تضمين في راتنج البلاستيك مع المفترضة متجانسة، انكماش الأنسجة الخواص، والعالمي مفيد لعدة أساليب التحليل المختلفة معلمات المورفولوجية الكمية^17،18. أثناء تقدير انكماش الأنسجة المتصلة بتضمينها في راتنج البلاستيك، شكل الأنسجة الثابتة ينبغي أن لا بالإضافة إلى ذلك تكون مشوهة أثناء إجراء الدمج، للسماح للمقارنة بين قسم المقابلة الشخصية المناطق الثابتة وجزءاً لا يتجزأ عينات. وهذا يمكن أن يكون صعباً في عينات الأنسجة الناعمة أو قابل للضغط بسهولة مثل الأنسجة الدهنية أو الرئة أو في عينات الأنسجة ذات محتوى المرتفع من السوائل. هنا، تضمين العينة ثابتة في أجار قبل تقطيع الأنسجة مفيد لتحقيق الاستقرار في شكل عينات الأنسجة خلال البلاستيك اللاحقة تضمين الإجراء (البروتوكول خطوة 1.3.، الشكل 4). لتحقيق بيانات موثوق بها، ينبغي أن يقوم القياسات المتكررة لانكماش الأنسجة المتصلة بالتضمين، استخدام عينات مختلفة من النسيج نفسه. يعبر عن مدى تقلص الأنسجة المتصلة بالتضمين ك عامل انكماش الأنسجة الخطية و_s (البروتوكول خطوة 1.3.9.، الشكل 4). وترد أمثلة لمعادلات استخدام و_s لتصحيح انكماش مختلفة الطول والمساحة السطحية ومعلمات حجم هياكل الأنسجة المختلفة في عدة دراسات كمية ستيريولوجيكال^{14، 21،27}.

المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة بنقطة الفرز وتجهيز الأنسجة عنها لأنواع مختلفة من تحليل المتلقين للمعلومات

تقنية أخذ العينات المقدمة حجم المرجحة لأجهزة الخنزير تحدد مواقع أخذ العينات العشوائية داخل الأنسجة مرة واحدة، وبعد ذلك يولد جميع العينات اللازمة لمزيد من التحليلات المختلفة بالاختزال لعينات الأنسجة التي اقتطعت من هذه المواقع⁷. في نظم المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة، كل موقع أخذ العينات الممكنة ضمن إجمالي حجم الجهاز/الأنسجة تحت الفحص بالضبط نفس الفرصة عشوائي أخذ عينات، وتكفل جمع جينيراليزابيليتي الحصول على عدد كاف من العينات. باستخدام تصاميم المرجحة حجم عينة عشوائية منتظمة لجيل عينات من الأجهزة متني، ولذلك يمنع عمليا نتائج التحليل ربما متحيزة بتوزيعات غير متكافئة (يحتمل أن تكون غير متوقعة وغير المعترف بها) من متميزة خصائص أنسجة وظيفية أو المورفولوجية في مواقع مختلفة من جهاز ما، التي أثبتت، مثلاً، لأن متوسط حجم وكثافة الحجم العددي لخلايا الكبد الخنزير في مناطق مختلفة من حمة الكبد²⁸ . الاستراتيجية الموصى بها "سلابينج الأنسجة والاختزال" للأجهزة الخنزير أمر يمكن فهمه بسهولة، ويتوافق مع المتطلبات التقنية لأساليب تحليل المتلقين للمعلومات، ويمكن بسرعة نفذت وتكييفه مع متطلبات دراسة محددة، وبذلك يمكن تجنب التحيز المنهجي أخذ العينات، الحد من تقلب التجريبية، وزيادة دقة التجربة عموما، رغم أنها أكثر كفاءة من أخذ عينات من الاستراتيجيات التي يتم تحديد كل موقع واحد أخذ العينات عشوائياً^{9 ،15}. ومن الواضح أن عدد العينات التي يجب أن يتم إنشاؤها، تعتمد على فحص المعلمة وقابليته داخل عينات من مواقع مختلفة من عينات الجهاز/الأنسجة. لجيل مجموعات عينة المصرف البيولوجي مصممة لتسمح بفحص لأقصى قدر معلمات مختلفة (غير محددة في وقت أخذ العينات) من مجموعة متنوعة من أساليب تحليلية مختلفة، استراتيجية تطلعية أخذ عينات عادة جداول توليد أرقام عالية نسبيا من العينات زائدة في الجهاز/الأنسجة.

الجيل عشوائي موحد الخواص (أيار) المقاطع والمقاطع الرأسية موحدة عشوائي (فور) للتحليلات الكمية ستيريولوجيكال

بعض التقنيات المستخدمة لتوليد أبواب أيار وفور لكمية ستيريولوجيكال التحليلات المعقدة نوعا ما الأسس النظرية، والتفسيرات لذلك غالباً (دون داع) تحاشي كثير من العلماء، على الرغم من أن هذه العملية تنفيذ أمر سهل معقولة. الفروع فور سهلة خاصة لتوليد، والأمثل بالنسبة لتقديرات كثافة المساحة في تركيبة مع اختبار ملساء نظم^8،،من⁹²⁰. وهم غالباً ما المفضل بسبب اتجاه الطائرة المقطع مألوفة. ومع ذلك، خلافا لأبواب أيار، الفروع فور ليست مناسبة لتقدير طول معلمات^8،9.

أثناء إعداد المقاطع أيار وفور، الخطوة الحاسمة، أساسا، للحفاظ على سطح القسم أيار أو فور العينة ثابتة خلال التضمين في راتنج البلاستيك ولضمان أنه يمكن دائماً تحديد المحور الرأسي للفروع فور (الخطوة 3، الرقم 9، ، من الشكل 10 الرقم 11).

في المستقبل، التوسع في تطبيق الأساليب المذكورة أعلاه قد تسهم إسهاما كبيرا في وضع معايير جودة عالية دائماً لتوليد عينات المصرف البيولوجي قابلة للمقارنة، ومتعددة الأغراض من الخنزير وغيرها من النماذج الحيوانية الكبيرة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.