Estrategias de muestreo y procesamiento de las muestras de tejido de Biobanco de porcinos modelos biomédicos

Summary

La aplicación práctica y el rendimiento de métodos para la generación de muestras de tejido representativo de modelos animales porcinos para un amplio espectro de análisis aguas abajo en el Banco de proyectos se demuestran, incluyendo volumetría, muestreo al azar sistemático, y procesamiento de muestras de tejido de tipo cualitativo y cuantitativo análisis morfológicos y moleculares de diagnóstico.

Abstract

En la investigación médica aplicada, modelos porcinos constantemente han vuelto más populares. Considerando el alto valor de cada animal, particularmente de cerdos genéticamente modificados modelos y a menudo limitado número de animales disponibles de estos modelos, establecimiento de colecciones (Biobanco) de muestras de tejido adecuadamente procesado adecuado para un amplio espectro de métodos de análisis posteriores, incluyendo análisis no especificados en el momento del muestreo, representan enfoques significativos para aprovechar al máximo el valor traslacional del modelo. Con respecto a las peculiaridades de la anatomía porcina, recientemente han establecido directrices amplias para generación estandarizado de representante, muestras de alta calidad de diferentes órganos porcinos y tejidos. Estas directrices son indispensables para la reproducibilidad de los resultados y su comparabilidad entre diferentes estudios e investigadores. La grabación de los datos básicos, como el órgano pesos y volúmenes, la determinación de los lugares de muestreo y de los números de las muestras de tejido que se generen, así como su orientación, tamaño, proceso y direcciones de ajuste, es factores relevantes determinar la generalización y la utilización de la muestra para análisis morfológicos moleculares, cualitativas y cuantitativas. Aquí, se presenta una demostración ilustrativa, práctica, paso a paso de las técnicas más importantes para la generación de representante, espécimen multiuso Biobanco de tejidos porcinos. Los métodos aquí descritos incluyen la determinación de volúmenes de órganos y tejidos y densidades, la aplicación de un procedimiento de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen de órganos parenquimales por punto de conteo, la determinación del grado de contracción de tejido relacionadas con la fijación histológica de las muestras y la generación de muestras aleatoriamente orientadas para análisis estereológicos cuantitativos, como isotrópica uniforme aleatorio (IUR) las secciones generadas por los métodos de "Orientador" y "Isector" y vertical uniforme aleatorias secciones (VUR).

Introduction

En la medicina traslacional, los cerdos son cada vez más común para el uso como modelos de animales grandes^1,2,3,4,5, debido a varias ventajas similitudes el porcino y anatomía humana y fisiología y la disponibilidad de métodos biológicos moleculares establecidos permitiendo generación de adaptados, modificados genéticamente modelos de cerdo para una amplia gama de condiciones de enfermedad^1,4.

Sin embargo, en comparación con modelos de roedores, se limita el número de animales de un modelo de cerdo respectivo que puede prestarse para experimentos en cualquier momento. Esto es debido al intervalo de generación porcina de aproximadamente un año y los esfuerzos financieros y tiempo necesarios para la generación de modelos porcinos y cría de animales. Por lo tanto, los individuos de un modelo porcino, así como las muestras que se pueden generar de estos cerdos, son muy valiosos, especialmente si genéticamente modelos porcinos o cuestiones experimentales a largo plazo (por ejemplo, las complicaciones tardías de enfermedades crónicas) se examinan en individuos de^2,6,7.

En el curso de cualquier estudio, realización de análisis adicionales que no había sido previsto en el diseño experimental inicial del estudio puede más tarde resultan para ser relevantes, por ejemplo, distintas preguntas que surgen de previamente descubiertos por dirección resultados inesperados. Si las muestras adecuadas para tales experimentos adicionales no están disponibles, desproporcionadamente elevado costo y gastos de tiempo podrían ser necesarios generar cerdos adicionales y muestras de tejido. Para estar preparado para tales eventualidades, generación de colecciones de Biobanco de conservado muestras de respaldo de diferentes órganos, tejidos o bio-líquidos, cuantitativa y cualitativamente adecuados para una amplia gama de análisis posteriores, se considera un importante enfoque^2,6,7. Derivando beneficios óptima de un modelo animal porcino, la disponibilidad de muestras adecuada Biobanco también ofrece la posibilidad única para efectuar un amplio espectro de métodos de análisis diferentes sobre los materiales idénticos a nivel de órganos múltiples en la misma cada animal, por ejemplo, por la distribución de las muestras a los científicos de diferentes grupos de trabajo organizados en una red de investigación^2,6,7. Además, la estrategia de muestreo '' progresista '' en biobancos también contribuye a una reducción del número de animales necesarios en un estudio. Las ventajas del modelo porcino biobancos han demostrado recientemente en un órgano múltiple, multiomics estudio, examen de órganos diafonía en un modelo porcino genéticamente modificado de la diabetes a largo plazo, utilizando muestras del Biobanco cerdo Munich MIDY ².

Hay algunos requisitos obligatorios Biobanco de muestras generalmente deben cumplir para establecer la fiabilidad y la interpretabilidad de los resultados de los análisis realizados posteriormente. Las muestras deben generarse reproducible, y deben ser adecuadamente representante, es decir, que reflejan las características morfológicas y moleculares interesadas del tejido/órgano las muestras fueron tomadas de⁷. Para ser conveniente para una amplia gama de tipos de análisis posteriores, las muestras deberán tomadas en cantidades suficientes y procesadas según las demandas (incluyendo las condiciones de tiempo y temperatura) de los diferentes métodos analíticos, incluyendo descriptivo Análisis histopatológicos, como cryohistology, parafina plástico histología, inmunohistoquímica, hibridación en situ , análisis microscópico ultraestructural de electrón y diagnóstico análisis de laboratorio clínico, así como moleculares Análisis de DNA, RNA, proteínas y metabolitos.

Para permitir la evaluación de una amplia gama de distintos parámetros morfológicos cuantitativos tales como números, volúmenes, longitudes o superficies de las estructuras tisulares distintos análisis estereológicos cuantitativa, planos de sección al azar de la las muestras histológicas de los respectivos órganos/tejidos necesitan ser preparado^7,8,9,10,11. En estudios morfológicos cuantitativos, la determinación precisa del volumen total del tejido, órgano o compartimiento del órgano, las muestras fueron tomadas de (es decir, el espacio de referencia) es de crucial importancia^{7,9 , 12} para calcular las cantidades absolutas de los parámetros de interés en el respectivo órgano, tejido u organismo. Finalmente, el efecto de la contracción relacionada con la inclusión del tejido durante la preparación de secciones histológicas tiene que ser determinada y tener en cuenta¹³. Por lo tanto, cuantitativos análisis estereológicos, especialmente de muestras archivadas (fijada bloques de tejido embebido, cortes histológicos, las muestras de tejido, etc.) de los estudios anteriores son a veces severamente limitada o incluso imposible¹², particularmente si la volumetría de los respectivos órganos/tejidos no se realizó, si no hay diseños de muestreo adecuado se aplicaron para garantizar muestras representativas, si los números y cantidades de muestras individuales disponibles no son suficientes, o si el procesamiento de la muestras es incompatible con la estimación de los parámetros morfológicos cuantitativos de interés. Debido a los múltiples posibles factores que influyen en la adecuación de los materiales de archivo-muestra para los análisis de distintos parámetros morfológicos cuantitativos inequívocamente no puede ser respondida, pero depende de la cuidadosa evaluación de cada caso individual.

Así, como la ubicación, tamaño, número, proceso, dirección de ajuste y orientación de muestras potencialmente afectarán los resultados de los análisis posteriores, estos factores son de gran importancia y deben ser considerados en el diseño experimental de cualquier estudio. En cuanto a estos aspectos y las particularidades de la anatomía porcina, directrices de muestreo completa, detallada, a gran escala recientemente se han establecido modelos animales adaptados al porcino, proporcionando una sólida referencia estandarizados, reproducibles y la eficiente generación de muestras redundantes, adecuadamente procesadas, alta calidad de más de 50 diferentes porcino órganos y tejidos^6,7.

Las descripciones metodológicas y el video tutorial se muestra en el presente artículo proporcionan detallada, ilustrativo, comprensible, instrucciones paso a paso para el funcionamiento práctico de una variedad de técnicas de volumetría, toma de muestras de tejidos porcinos y órganos y procesamiento de las muestras de tejido para métodos de diferente análisis aguas abajo. Las técnicas recomendadas incluyen métodos para determinación de densidades basadas en los principios de Arquímedes y Cavalieri⁹y volúmenes de órganos y tejidos, incluyendo la determinación de las dimensiones de la contracción tridimensional de tejidos relacionados con la incrustación en diferentes inclusión media¹⁴ durante el proceso de la examinación histológica, acerca de la aplicación del muestreo aleatorio sistemático ponderado de volumen posible, procesamiento de muestras de tejido muestreado para diferentes posterior Análisis^7,8,9,15y generación de apropiadamente orientan y procesaron muestras para posibles análisis estereológicos cuantitativa^{7,8, 9,10,11}. Junto a su aplicación en proyectos de Biobanco porcino, los métodos demostrados son generalmente apropiados para examinar propiedades cuantitativas histo-morfológico de órganos/tejidos todos los estudios. Además, diseños de muestreo al azar sistemático son particularmente beneficios para la generación de muestras representativas en experimentos utilizando métodos de análisis molecular para detectar alteraciones de la abundancia de, por ejemplo, ARN, proteínas o metabolitos en distintos órganos y tejidos.

Los párrafos siguientes proporcionan una breve introducción a estos métodos, mientras que su rendimiento práctico se describe en la sección de protocolo.

Determinación de volúmenes de órganos y tejidos
Determinación de volúmenes y pesos de órganos es importante en varios parámetros experimentales, como estos factores podrían indicar cambios, potencialmente relacionados a experimentalmente examinan factores de interés. El volumen total de un órgano, tejido también es necesaria para calcular parámetros cuantitativos absolutos (por ejemplo, el número total de células), de densidades de volumen stereologically Estimado numérico(es decir, el número de células por unidad de volumen del tejido)^7,12. Aparte de técnicas de uso de equipo técnico complejo, tales como tomography de la computadora, hay básicamente tres métodos prácticos utilizados para determinar el volumen absoluto de un órgano o tejido. El volumen de un órgano puede determinarse "volumétrica medida directa" según el principio de Arquímedes, es decir, medición del volumen de agua o solución salina desplazados por la estructura cuando completamente sumergida. Sin embargo, de órganos porcinos comparable grandes, estos enfoques son imprácticos y propensas a la imprecisión, ya que requieren matraces volumétricos/medición muy grande. Más convenientemente, se puede calcular el volumen de un órgano/tejido de su peso y densidad^7,12,16, que eficientemente puede ser determinado mediante el «método de inmersión»^{7,12 ,16} (paso protocolo 1.1.). Volúmenes de órganos y tejidos se pueden calcular también mediante volumetría enfoques basados en el "principio de Cavalieri" (1598-1647). En términos simples, se establece el principio de Cavalieri, que si dos objetos son seccionados en planos paralelos a un plano de tierra, y los perfiles de las secciones de cortan a través de los dos objetos en la correspondiente Distancias desde el plano de tierra tienen las mismas áreas, los dos objetos tienen el mismo volumen. Así, el volumen de los objetos forma arbitrariamente puede estimarse como el producto de sus áreas de Perfil de sección en planos paralelos, igualmente distante de la sección y la distancia entre los planos de sección. Esto es comprensible con la siguiente analogía: considere dos pilas que consiste en el mismo número de monedas idénticas se colocan lado a lado, una pila con la ordenada de monedas apilado uno encima del otro dando forma cilíndrica de la pila de monedas y el otro pila de monedas con el centro coloca monedas (Figura 3A). Aunque las formas de las dos pilas de moneda son diferentes, sus volúmenes son los mismos, desde las áreas de las monedas en los niveles correspondientes de ambas pilas (es decir, las áreas de los perfiles de secciones paralelas de cortan a través de dos pilas de moneda en distancias iguales desde el de tierra) son idénticos. Estimación de los volúmenes de órganos porcinos y tejidos utilizando el principio de Cavalieri^7,12,15 se describe en el paso 1.2.

Determinación del grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión histológica
En el análisis de varios parámetros morfológicos cuantitativos medidos en las secciones histológicas del tejido, el efecto de la contracción relacionada con la inclusión del tejido que ocurre durante el proceso de la histología del tejido debe ser determinado y tomado en cuenta. El grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión puede ser variable y depende tanto en el tejido, su procesamiento y el medio empotrar^{8,13,17,18,19}. Generalmente, se producen cambios relacionados con la inclusión del volumen de una muestra de tejido (es decir, principalmente la contracción) en las tres dimensiones del espacio y, por tanto, afecta a todos los parámetros dimensionales estimados por análisis cuantitativos estereológicos⁸ . Básicamente, se puede estimar el grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión, expresado como el factor de contracción de tejido lineal (f_S), como se muestra en el paso 1.3. y se utiliza para la corrección de parámetros morfológicos cuantitativos (sensible a la contracción)¹⁴.

Muestreo aleatorio sistemático ponderado por el volumen de órganos/tejidos
Para el establecimiento de una colección de Biobanco de muestras de órganos y tejidos porcinos, enfoques de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen como se describe en el paso 2 han demostrado para ser técnicas prácticas, ahorro de tiempo y eficientes para la generación de representante, tejido de usos múltiples muestras^7,8,9,15.

Generación de secciones isotrópico aleatorio uniforme y Vertical uniforme aleatoria secciones para cuantitativos análisis estereológicos
Las muestras de tejido de Biobanco deben ser conveniente para una amplia variedad de métodos diferentes análisis estereológicos cuantitativa para la estimación de un máximo de parámetros que no se pudo determinar sin una muestra adecuadamente preparada. Casi todos los parámetros estereológicos cuantitativos pueden determinarse, utilizando «isotrópico (independiente) uniforme aleatorio (IUR) las secciones»^8,9. En las secciones IUR, la orientación tridimensional del plano de sección de la muestra de tejido es al azar. Esto puede lograrse por asignación al azar de la posición de la muestra de tejido en relación con la posición del plano de sección, como se aplica en el método de "Isector"¹¹ (paso 3.1 del Protocolo), o por asignación al azar de la orientación del plano de sección relativa a la muestra de tejido, como en el método de "Orientadores"¹⁰ (paso 3.2 del Protocolo). En muestras de tejido, como piel o mucosa muestra mostrar un eje vertical presente de forma natural, o definido y bien identificable, preparación de "uniforme aleatorio (VUR) las secciones verticales" (paso de protocolo 3.3.) estrictamente seccionado en el plano de su eje vertical es ventajoso^8,20. Para un discurso completo de los fundamentos teóricos del muestreo de IUR/VUR y una discusión amplia de posibles análisis estereológicos cuantitativas aguas abajo, el lector interesado se refiere a los libros de texto de estereología cuantitativa en la vida Ciencias^8,9.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí utilizan muestras de tejidos derivadas animales muertos y cumplen con las regulaciones legales alemanas del bienestar animal.

1. volumetría

1. Técnica de inmersión para la determinación de densidades de tejido/órgano (figura 1 y figura 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Preparar materiales: hojas bisturí, toallas de papel, pinzas finas, escalas estándar de laboratorio, vidrio o vasos de plásticos, solución salina al 0.9% y titulares construido por la propia muestra (figura 2A).
   2. Suprimir un pedazo de tejido (tamaño máximo: 2 x 2 x 2 cm³) de los órganos y tejidos, específicamente desde el compartimiento del órgano de interés. Órganos pequeños, como la pituitaria o la glándula pineal, son medidos en su totalidad.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el tamaño de la muestra es notablemente más pequeño que el diámetro interior de la taza (paso 1.1.5 et seq.) y su nivel de llenado para permitir la inmersión completa de la muestra sin contacto con las paredes internas del vaso en el paso 1.1.7.
   3. Limpiar cuidadosamente la muestra con papel de cocina para eliminar el exceso de sangre/tejido líquido.
   4. Pesar la muestra en una balanza de precisión y registrar el peso de la muestra (m_S). Determinar el peso de las muestras de tejido pequeñas con mg (figura 1A).
   5. Lugar un vaso lleno de solución salina al 0.9% temperatura en la escala. No llene completamente el vaso, para permitir una inmersión de la muestra de tejido en el paso posterior sin desbordamiento.
      PRECAUCIÓN: Utilice un tamaño de vaso apropiado para el tamaño y peso de las muestras de tejido a medir y el rango de medición eficaces de la escala. Para muestras más grandes hasta 2 x 2 x 2 cm³, un tamaño de vaso de precipitados de 50 – 100 mL es apropiado en combinación con una escala de medición de aproximadamente de 100 mg a 500 g, mientras que para muestras pequeñas, utilice vasos de 5 – 10 mL en combinación con Balanzas de precisión con rangos de medición entre aproximadamente 0.1 mg y 20 g.
   6. Sumerja el sostenedor de la muestra (es decir, un lazo lo suficientemente rígido de alambre fino o algo similar, figura 2A) en la solución salina en una posición marcada (flechas en figura 2, figura 1By figura 2B). Luego, restaura (Tara) la pantalla de la báscula a cero.
   7. Colocar cuidadosamente la muestra de tejido para el sostenedor de la muestra y sumergir completamente la muestra con la solución salina hasta alcanzar la posición marcada en el portamuestras (flechas en figura 2, figura 1By figura 2B).
      PRECAUCIÓN: La muestra sumergida y el sostenedor de la muestra no deben tener contacto con las paredes internas o el fondo del vaso o la superficie de la solución salina.
   8. Mientras sostiene el portamuestras y la muestra sumergida en esa posición, registrar el peso visualizado en la báscula (m_L), refiriéndose al peso de solución salina desplazado por la muestra de tejido (figura 1 C, figura 2B, y Figura 2).
   9. Calcular el volumen de la muestra (V_S) de m_Ly la densidad de la solución salina a temperatura ambiente (20 ° C) (_{solución salina} ρ = 1,0048 g/cm³) como V_S = m_L/ _Salina de ρ [g/g/cm³] (Figura 1).
   10. Calcular la densidad de la muestra de tejido (ρ_muestra) el peso (es decir, masa) de la muestra (m_S) y su volumen (V_S): _muestra ρ = m_S /V_S[g/cm³] (figura 1).
   11. Para órganos medidos en su totalidad, repita la medición tres veces y calcular la densidad del órgano promedio de los valores de medición individuales. Grandes órganos/tejidos, realizar mediciones repetidas con muestras diferentes del mismo órgano/tejido/órgano compartimiento y calcular la densidad media de las mediciones individuales, por consiguiente.
   12. Calcular el volumen total del compartimiento del órgano/tejido/órgano de su peso y densidad (figura 1).
2. Aplicación del método de Cavalieri para la determinación de volúmenes de órgano porcino ⁷
   1. Preparar materiales: regla, pinza, cuchillo, tijeras, pinzas, lápiz resistente al agua, transparencias plásticas, scanner, Foto cámara y rejillas cruzadas impresas en plástico transparencias.
   2. Coloque el totalidad de órganos y tejidos en una superficie lisa (corte de base) y mida la longitud (l) del órgano a lo largo de su eje longitudinal (figura 3B, figura 5A).
   3. Cortar el órgano/tejido completo equidistantes paralelos ortogonal al eje longitudinal del órgano (figura 3, figura 5B). Elija una distancia d entre dos secciones (es decir, el espesor de sección intervalo seccionamiento, generalmente aproximadamente 1 cm) lo suficientemente pequeñas para obtener un número suficiente de placas de tejido/órgano. Posición al azar la primera sección dentro de una distancia entre 0 y el intervalo de seccionamiento desde el margen del órgano. Mientras corte, visualizar la posición y orientación de cada plano de sección, para obtener aproximadamente paralelo de órganos y tejidos las losas de espesor aproximadamente uniforme.
      Nota: El número de placas de tejido/órgano necesario depende de la forma y el tamaño de los órganos y tejidos examinados. Si órganos pequeños o muestras deben ser seccionados en losas delgadas de ≤5 mm, incrustar las muestras en agar antes de seccionamiento (ver paso 1.3.3.) y usar un dispositivo técnico para rebanar de la muestra embebido en agar. Intervalos de seccionamiento empíricamente recomendables para porcinos más órganos y tejidos, así como ejemplos de dispositivos de corte, se indican en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"⁷.
   4. Colocar todos los bloques de órganos y tejidos en la misma superficie hacia abajo en la base de corte (es decir, constantemente en el derecho o el plano de la sección izquierda de cada losa de órgano, figura 3D, figura 5) y contar las losas (n).
   5. Obtener perfiles de sección de las placas de tejido por uno de los siguientes métodos:
      1. Cuidadosamente coloque las placas de tejido en transparencias de plástico debidamente etiquetados, manteniendo la orientación de sus superficies superior e inferior de la sección. Trace los contornos de las placas de tejido en las transparencias de plástico usando un lápiz resistente al agua (figura 3E1-2).
      2. Tomar imágenes fotográficas de las placas de tejido, sosteniendo la cámara verticalmente sobre la superficie de la sección (figura 3F). Para la calibración, coloque una regla de tamaño al lado de las placas de tejido.
      3. Analizar las placas de tejido en un escáner plano manteniendo la orientación de las superficies de sección superior e inferior (figura 3). Para la calibración, coloque una regla de tamaño al lado de las placas de tejido.
   6. Medir las áreas de los perfiles de sección (calcada, fotografiada o escaneada) de todos los bloques de tejido por uno de los siguientes métodos:
      1. Recubrimiento o superposición de los perfiles de la losa de órgano trazado con un tamaño adecuado, rejilla calibrada de cruces equidistantes imprime una transparencia plástica y todos los cruces de golpear el área del perfil (figura 3E3-4; Compárese con Figura 5). Calcular el área de Perfil de sección de la losa de cada órgano al multiplicar al número de cruces que golpea el área del perfil por el área correspondiente a una cruz.
         Nota: Para recibir el volumen suficientemente precisa estimaciones, elegir una rejilla cruzada con una distancia suficientemente pequeña entre cruces adyacentes, que cruza un promedio de al menos 100 llegará a las superficies de sección de las losas de un órgano en cada caso examinado del estudio . Tamaños de rejilla cruzada empíricamente recomendable para porcino más órganos y tejidos se indican en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"⁷.
      2. Medir las áreas de las placas de tejido en las imágenes digitales de fotos/exploraciones usando apropiado disponible comercialmente o freeware morfometría suave - y aplicaciones de hardware (figura 3 H), como un sistema de análisis de imagen comercial de²¹, o ImageJ²².
         Atención: Nota que uno tejido losa (la primera o la última) se coloca en el escáner descansando sobre su superficie natural, respectivamente, se enfrenta a la cámara con su superficie natural. Por lo tanto, el escaneado de la imagen, la imagen de esta losa, no mostrará una superficie de sección. Por lo tanto, no hay Perfil de área de sección se mide en la imagen de escaneado de imágenes y fotos de esta losa de tejido (figura 3I). También nota excesiva proyección presente en imágenes escaneadas y fotografías de las losas de órganos y tejidos, es decir, sólo medir las áreas de los perfiles de sección real, pero no del tejido en la imagen de mentira detrás de la superficie de la sección de la losa (figura 12 G-H).
   7. Calcular el volumen del órgano estima como el producto de la suma de todos los ámbitos de Perfil de sección correspondientes de todos los bloques de tejido por caso (es decir, constantemente de la derecha o la izquierda, respectivamente, la superficie de la sección superior o inferior de cada órgano de la losa y el espesor medio de las losas (es decir, el cociente de la longitud medida del eje vertical del órgano (l) y el número de losas)¹⁵.
3. Determinación del grado de contracción de tejido tridimensional relacionado con la incorporación durante el procesamiento de las muestras de tejido para histología
   1. Preparar materiales: cuchillas microtomo, fórceps, agar, moldes de fundición de metales, scanner digital y regla de tamaño (p. ej., papel milimetrado).
   2. Cortar una superficie fresca, de sección plana de una muestra de tejido fijo.
      Nota: Si utilizando muestras de fácilmente deformables () tejidos (tejido adiposo, tejidos gelatinosos), incorporar la muestra de tejido fijo en agar antes de seccionamiento (Figura 4A).
   3. Para embeber la muestra en agar:
      1. Mezclar polvo de agar estándar como para medio de cultivo Microbiología con un volumen adecuado de agua (aproximadamente 0,5 – 1 g agar/10 mL de agua) en un vaso de vidrio. Revolver la mezcla y calentar en el microondas a 700 W hasta que hierva de 3 a 5 s. revolver la mezcla y hervir nuevamente por 3 – 5 s.
      2. Opcionalmente, para aumentar el contraste del agar para la muestra de tejido, tinte el agar líquido, por ejemplo, con tinta negra (Añadir tinta de 1 mL a 10 mL de agar líquido caliente y agitar vigorosamente).
      3. Verter el agar caliente en un molde de bastidor (por ejemplo, un molde de metal utilizado para parafina inclusión, figura 10A-D) y sumerja la muestra de tejido fijo en el agar caliente. Dejar que el agar enfriar hasta la solidificación, retire el molde y corte el bloque de agar con el tejido embebido usando un micrótomo u hoja de afeitar.
         PRECAUCIÓN: Durante la manipulación de agar líquido caliente, utilizar guantes y gafas protectoras. Las muestras de tejido del proceso fijadas en solución de formaldehído en un extractor campana y usan gafas protectoras y guantes de laboratorio.
   4. Coloque la muestra con su superficie de sección hacia abajo en un escáner plano, junto con una regla de tamaño y escanear la superficie de la sección (Figura 4AB).
   5. Determine el área de la superficie de la sección de la muestra de tejido fijo (A_f) en la exploración digital, utilizando una de las técnicas descritas en el paso 1.2.6 (Figura 4B).
   6. Embeber la muestra en medio de empotrar plástico, tales como epoxi (p. ej., Epon) o glycolmethacrylate/metacrilato de metilo (MMA/GMA)²³, (protocolos siguientes)^{25 24,23,} Figura 4). Asegurar que la superficie de la sección de la muestra fija en el paso anterior (1.3.4) se mantiene en la muestra de plástico incorporado.
      Nota: Para mantener la orientación de la superficie de la sección de la muestra durante el procesamiento de la muestra, siempre coloque la muestra con su superficie de sección previsto hacia abajo en el cassette de inclusión o lo molde de la fundición, o marcar la sección prevista superficie (o el lado opuesto de la muestra) con tinta.
   7. Corte una sección histológica del bloque plástico correspondiente a la superficie original de la sección de la muestra de tejido fijo (paso 1.3.2) usando un micrótomo (figura 4), la sección de montaje en un portaobjetos de vidrio (figura 4) y mancha de forma rutinaria) por ejemplo, hematoxilina y eosina tinción H & E)^24,25.
      Atención: Para recibir una sección histológica aproximadamente en el mismo plano que la superficie original de la sección de la muestra de tejido fijo, ajuste cuidadosamente la posición de los bloques en el Monte del micrótomo antes de seccionamiento.
   8. Coloque el portaobjetos con la sección manchada hacia abajo en un escáner plano con una regla de tamaño y escanear la sección (figura 4E).
   9. Determinar el área de la sección de la muestra de tejido de plástico encajado (A_e) en la exploración digital, utilizando una de las técnicas descritas en el paso 1.2.6 (figura 4F).
   10. Calcular la contracción media relacionados con la inclusión del tejido (para el tejido respectivo y medio inclusión) de las áreas de medición de perfiles de sección correspondientes de las muestras de tejido antes y después de la incrustación de plástico medio de inclusión. El factor de contracción lineal f_s se calcula como la raíz cuadrada del cociente de las áreas de los perfiles de sección de n muestras de tejido después de la incrustación de plástico incrustar medio (A_e) y las áreas de la perfiles de sección correspondientes de las mismas muestras de tejido antes de incrustar en plástico incrustar medio (A_f) (figura 4)¹⁴.

2. volumen ponderado muestreo sistemático al azar los puntos de conteo y procesamiento de tejido submuestras para diferentes tipos de análisis aguas abajo⁷

1. Preparar materiales: regla, pinza, cuchillo, tijeras, pinzas, lápiz resistente al agua, punto de Cruz cuadrículas impresas en transparencias de plástico y las tablas de número aleatorias.
   Nota: Se proporcionan plantillas de copia para cruzar las rejillas (5 a 60 mm) en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"⁷.
2. Coloque los órganos y tejidos en una superficie lisa (corte de base) y mida la longitud (l) del órgano a lo largo de su eje longitudinal (figura 5A, figura 6A).
3. Cortar el órgano/tejido completo equidistantes paralelos ortogonal a su eje longitudinal (figura 5B). Elija una distancia d entre dos secciones (es decir, el seccionamiento, sección intervalo grueso, generalmente aproximadamente 1 cm) lo suficientemente pequeñas para obtener un número suficiente de rebanadas de tejido/órgano. Posición al azar la primera sección dentro de una distancia entre 0 y el intervalo de seccionamiento desde el margen del órgano. Mientras corte, visualizar la posición y orientación de cada plano de sección para obtener Losas de aproximadamente paralelo de órganos y tejidos de espesor aproximadamente uniforme.
   Nota: El número de placas de tejido/órgano necesario depende del tamaño de los órganos y tejidos examinados y el número de localizaciones de tejido muestreado. Si órganos pequeños o muestras deben ser seccionados en losas delgadas de ≤5 mm, incrustar las muestras en agar antes de seccionamiento (ver paso 1.3.3.) y uso de dispositivos técnicos para el corte de la muestra embebido en agar. Intervalos de seccionamiento empíricamente recomendables para porcinos más órganos y tejidos, así como ejemplos de dispositivos de corte se indican en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"⁷.
4. Colocar todos los bloques de órganos y tejidos en la misma superficie hacia abajo en la base de corte (Figura 6B).
5. Superposición de las placas de tejido con una tamaño adecuado rejilla cruzada impresión en una transparencia plástica colocando el exterior izquierda superior transversal de la rejilla sobre un punto al azar en el tejido (figura 5-D, Figura 6B).
   Nota: Elegir una rejilla cruzada con una distancia suficientemente pequeña entre cruces adyacentes, por lo que en cada caso examinado del estudio, por lo menos dos veces tantos cruces llegará a la superficie de sección del compartimiento del tejido muestreado, como el número de muestras que debe tomar de eso compartimiento de tejido. Tamaños de rejilla cruzada empíricamente recomendable para porcino más órganos y tejidos se indican en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"⁷.
6. Marca y cuenta cruza golpeando el tejido (respectivamente, el tejido sub-compartimiento de ser muestreado). Aplicar siempre un modo uniforme de conteo y la numeración de las cruces que golpea el compartimiento del tejido muestreado en todos los bloques de tejido, por ejemplo, de numeración consecutiva de las respectivas cruces en cada línea por línea, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, o, por ejemplo, numerando las cruzas en una losa de tejido tras otro en dirección a la derecha, a partir de la Cruz más cercana a la posición de 12:00, como exemplarily demostrados en la figura 5E.
7. Divida el número de cruces que golpea el compartimiento de tejido/tejido para ser muestreadas (n) por el número de muestras que se generen para obtener el intervalo de muestreo sistemático (i).
8. Determinar la primera posición de muestreo seleccionando un número aleatorio x en el intervalo entre 1 y yo. Para ello, utilice una tabla de números al azar. Marca la primera posición de la toma de muestras (x) y cada siguiente x +, x + 2, x + 3i, etc., Cruz golpea el compartimiento de tejido/tejido muestreado en la transparencia del plástico utilizando un lápiz resistente al agua (figura 5F).
   Nota: Tablas de números aleatorias pueden ser convenientemente y rápidamente generadas utilizando un generador de números al azar en línea.
9. El tejido de lugares correspondientes a la marcada cruza ligeramente elevando la transparencia plástica y colocar un pequeño trozo de papel confeti limpio, en blanco en la superficie de la losa de tejido utilizando un par de pinzas (figura 5, figura 6E de la etiqueta ).
10. Impuestos especiales muestras de tejido de los lugares muestreados (figura 5 H, figura 6F, Figura 7A) y los diferentes tipos de análisis posteriores (figura 6, Figura 7A-B), tal como se especifica en subdividir aún más Tabla 1.
11. Después del muestreo, limpie las transparencias de plástico con agua tibia y jabón, seca y reutilizarlos.

3. generación de secciones al azar uniforme isotrópico (IUR) y Vertical uniforme aleatorio (VUR) secciones para cuantitativas análisis estereológicos

1. Técnica "Isector"
   1. Preparar materiales: cuchillas de afeitar o micrótomo, agar, moldes de la fundición esférica (p. ej., moldes de fundición de bombones, que pueden obtenerse de los proveedores de pastelería), foldback abrazaderas y pinzas.
   2. Colocar una pieza tamaño adecuado (1 x 1 x 1 cm³) fijas, sistemáticamente al azar muestreada de tejido en un molde de fundición esférica, sujetan por las abrazaderas foldback y llenar el molde con agar líquido caliente (figura 8A-E).
   3. Desmoldar la esfera agar (figura 8F) fundición después de la solidificación del agar.
   4. Rodar la esfera de agar con la muestra de tejido embebido en la mesa, detener y sección en una posición aleatoria.
      Nota: El plano de la sección resultante es una sección IUR (figura 8F-G).
   5. Proceder a integrar la muestra de tejido en la resina plástica como GMA/MMA, manteniendo la orientación de la sección IUR plano (ver 1.3.5).
2. Técnica de "Orientador"
   1. Preparar los materiales: cuchillas de afeitar o micrótomo, agar, pinzas, tablas de números aleatorias, estampados de círculos equiangular y coseno-weighted.
      Nota: Se proporcionan plantillas de copia de círculos en anteriores publicaciones^8,26.
   2. Coloque la muestra de tejido fijo (o de tejido fijo embebido en agar) en una impresión de un círculo equiangular con un borde paralelo a la 0 – 180 ° dirección (Fig. 9A, figura 10E).
   3. Determinar un ángulo al azar mediante la tabla de números aleatorios. Encontrar las marcas correspondientes a la escala del círculo equiangular, que la muestra se basa en. Uso de estas marcas, corte una sección a través de la muestra (o por el agar que rodea la muestra de tejido embebido), con el plano de sección estar orientado paralelo a la dirección del ángulo al azar indicada en la escala del círculo equiangular y vertical a la superficie de la muestra (figura 9B-C, figura 10F) en reposo.
   4. Coloque el bloque de tejido de la superficie de la sección generada en el paso anterior frente a la desventaja en un círculo de coseno-weighted con el borde de la superficie de descanso colocado paralelo a la dirección de 1-1 (figura 9, figura 10 H).
   5. Repita el paso 3.2.3 y corte una sección nueva a través de la muestra en un ángulo aleatorio determinado mediante la tabla de números aleatorios (figura 9E-F, figura 10I-J).
      Nota: El plano de la sección resultante es una sección IUR.
   6. Caso, determinar el área del perfil de sección IUR el fijo de muestra de tejido para la determinación de la contracción relacionada con la inclusión del tejido (figura 9-J) como se describe en el paso 1.3 y proceder a integrar la muestra de tejido de plástico resina como GMA/MMA.
3. Generación de secciones al azar uniforme Vertical (VUR)
   1. Preparar materiales: cuchillas de afeitar o micrótomo, agar, pinzas, tablas de números al azar y estampados de círculos equiangular.
      Nota: Se proporcionan plantillas de copia de círculos en anteriores publicaciones^8,26.
   2. Definir un eje vertical dentro de la muestra de tejido fijo que siempre es reconocible en las secciones de muestra durante los pasos subsecuentes.
      Nota: Normalmente, el eje vertical a la superficie natural de la muestra de tejido es elegido como el eje vertical.
   3. Si procede, incluir la muestra en agar (figura 11B).
      Nota: Inclusión de Agar antes de VUR - o IUR-seccionamiento de la muestra fija es generalmente recomendable para muestras pequeñas, finas, frágil o blandas. También usar agar-inclusión de las muestras para facilitar la colocación de la muestra seccionada de RVU durante la posterior fijación de la muestra en medio de la resina plástica.
   4. Coloque la muestra en una impresión de un círculo equiangular con el eje vertical está orientado ortogonalmente al plano de la mesa de papel/tabla (figura 11).
   5. Cortar la muestra en un ángulo aleatorio (determinado mediante una tabla de números aleatorios) con el plano de sección ortogonal a la mesa y paralelos al eje vertical para recibir un plano de sección VUR (figura 11).
   6. Caso, determinar el área del perfil de sección IUR el fijo de muestra de tejido para la determinación de la contracción de tejidos relacionados con la inclusión como se describe en el paso 1.3 (Comparar con figura 9-J) y proceder a integrar la muestra de tejido en resina plástica como GMA/MMA.

Representative Results

Técnica de inmersión para la determinación de la densidad del tejido/órgano

Figura 12A -B muestra la representación determinación de la densidad y el volumen de un riñón porcino utilizando la técnica de inmersión que se describe en el paso 1.1 (figura 1, figura 2). Resultados más representativos de las mediciones de densidad de órganos porcinos adicionales y tejidos se presentan en la tabla 2. Una lista más completa de densidades de referencia de diferentes tejidos porcinos y órganos se muestra en el "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"⁷. La validez de los valores de medición de densidad de tejido obtenido mediante el método de inmersión puede ser estimada por mediciones repetidas de la misma muestra y muestras independientes. Los tejidos más porcinos muestra valores de densidad ligeramente superiores al agua (ρ_agua ≈ 1.0), mientras que los tejidos en solución salina (tejido adiposo, tejido pulmonar) muestra densidades < 1.0.

Método de Cavalieri para la determinación de volúmenes de órgano

Figura 12 -F muestra la determinación representativa del volumen de riñón porcino (el mismo órgano como se muestra en la figura 12A-B). Las áreas de las superficies de sección de las losas del órgano se determinan por conteo de punto, utilizando una rejilla cruzada superpuesta impresa sobre una transparencia en plástico, así como por medición planimétrica de las áreas de sección de las losas de órgano en una imagen digitalizada de las losas (servicio de pago atención a la proyección excesiva del tejido situado detrás de las superficies de sección de las losas, figura 12 G-H). La exactitud de los datos obtenidos por el desempeño de la estrategia de Cavalieri (paso 1.2, figura 3) pueden estimarse en comparación al volumen respectivo de volumen de órganos y tejidos calculada a partir del peso y la densidad de los órganos y tejidos. Los volúmenes del riñón en figura 12 determinan por el método de inmersión y los métodos de Cavalieri difieren por menos del 1% de uno a. Como una medida de la precisión de las estimaciones de volumen de Cavalieri, se puede calcular su coeficiente de error (CE), como descrito anterior¹⁵.

Determinación de la contracción de tejido tridimensional relacionado con la incorporación durante el procesamiento de las muestras de tejido para histología

Resultados representativos del grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión de muestras de tejido porcino (tejido renal cortical) en resinas plásticas (GMA/MMA o epoxy) para examen histomorfológicas cuantitativa se muestran en la tabla 2 (previamente datos no publicados). Los factores de contracción lineal indicados en la tabla 2 se determinaron como se describe en el paso 1.3 (figura 4). Se refieren a una reducción de volumen tridimensional del 29% para incrustar GMA/MMA y el 22% de epoxy incrustación de porcino tejido renal cortical. Figura 13 muestra ejemplos representativos de muestras preparadas adecuadamente y escaso tejido adiposo embebido en agar, formalina-fijos para la medición de la superficie de sección de muestra antes de la incrustación de plástico.

Muestreo aleatorio sistemático volumen ponderado por punto de conteo y procesamiento de tejido submuestras para los diferentes tipos de análisis aguas abajo

La técnica de "seccionamiento y conteo de punto" para el muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen de órganos parenquimatosos (paso 2, figura 5, figura 6, figura 7) representa un método robusto, establecido para la generación de representante muestras de varios tipos posteriores de análisis^2,7. Resultados representativos de la generación de Biobanco sistemáticamente al azar muestreados, redundantes muestra de distintos órganos porcinos y tejidos, con procesamiento diferencial posterior de las muestras de tejido suprimido para varios diferentes aguas abajo métodos de análisis mediante la técnica de muestreo que se describe en el paso 2 (figura 5, figura 7y exemplarily demostrados en la figura 6) han sido publicadas². Para la generación de Biobanco de muestras de tejido del hígado en un biobanco porcino anterior estudio², por ejemplo, hígados de porcinos totalmente se seccionaron en aproximadamente 20 losas de 2-3 cm de espesor, superpuestas con un con un 3 cm Cruz de rejilla, como se describe en el paso 2 y 16 localizaciones de tejido de aproximadamente 2 x 2 x 2 cm³ sistemáticamente al azar fueron muestreadas y suprimidos en cada caso. De cada una de las muestras suprimidas cinco submuestras se generaron posteriormente para análisis moleculares (congelados a-80 ° C) de localidades muestreadas, una submuestra de cryohistology, una submuestra fue fijada en solución de Methacarn y en solución de formaldehído para posterior parafina histológica y empotrar- y la examinación de immunohistochemical. La generación de las 74 muestras diferentes por caja (hasta el congelamiento o la transferencia de las muestras en solución de fijación) se logró en aproximadamente 20 minutos, en promedio². Éxito y viabilidad del describe el muestreo y submuestreo enfoque puede estimarse por la evaluación de la calidad de las muestras generadas (es decir, la calidad de la proteína o RNA aislados, preservación de la histomorfológicos y características ultraestructurales de las muestras de tejido, su idoneidad para el análisis immunohistological, etc.)²

Generación de aleatorios uniforme isotrópico (IUR) secciones y secciones al azar uniforme Vertical (VUR) para análisis cuantitativos de estereológicos

Las técnicas demostraron para una generación orientada al avance de isotrópica uniforme aleatorio (IUR) las secciones y las secciones VUR de muestras de tejido porcino (Biobanco) (paso del protocolo 3, figura 8, figura 9, figura 10, figura 11), permitiendo para el examen de la mayoría de los parámetros estereológicos cuantitativa, puede lograrse rápidamente con algo de práctica y sin dificultades razonables o fuentes de error. Por lo tanto, la generación de IUR-muestras se muestra en la figura 9 (isector técnica) y la figura 10 (técnica de orientadores) es plenamente representativa de estos métodos.

Figura 1: ilustración esquemática de la técnica de"inmersión" para la determinación de densidades de tejido/órgano. (A) medición del peso de muestra (es decir, de masa, m_S). (B) escala tarada el peso de un vaso lleno de solución salina al 0.9% de 20 ° C y un sostenedor de la muestra sumergida en la solución salina en una posición definida, marcada. (C) inmersión completa de la muestra a la posición marcada de lo portamuestras sin contacto a las paredes internas o la parte inferior del vaso. El peso en el equilibrio es el peso del volumen desplazado por la muestra solución salina). La densidad de la muestra se calcula como se indica (aquí: ρ_muestra = m_S/V_S = m_S/ (m_L/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1,141 g/cm³_). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: "Técnica de inmersión" para la determinación de densidades de tejido/órgano. (A) titulares diferentes de la muestra de alambre fino. De izquierda a derecha: un lazo de hilo de alambre fino a través de una cánula de inyección fina, una cesta helicoidal de alambre para sostener las muestras pequeñas y frágiles y una eslinga simple de alambre fino. Las flechas en A-C indican las posiciones que los portamuestras son sumergidos en la solución salina. (B, C) Posicionamiento del sostenedor de la muestra durante la inmersión de la muestra en solución salina (Comparar con figura 1 C). (B) completos porcino hipófisis en un sostenedor de la muestra en forma de cesta. (C) muestra del miocardio porcino. Tenga en cuenta la inmersión completa de las muestras en solución salina sin contacto con las paredes o el fondo del vaso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: ilustración esquemática de la aplicación del método de Cavalieri para la determinación de volúmenes de órgano porcino. (A) moneda de pila de ejemplo para la comprensión del principio de Cavalieri. Para detalles véase la introducción. (B-H) Demostración esquemática de estimación del volumen de un fijo de perfusión del riñón. (B) medición de la longitud (l) del riñón a lo largo de su eje longitudinal. (C) corte del órgano completo en n igualmente grueso (d) paralelo rebanadas ortogonales al eje longitudinal del órgano. (D) losas de órganos colocan en la misma superficie hacia abajo. Tenga en cuenta que la primera losa de tejido (derecha) se encuentra en su superficie natural, es decir, no tiene una superficie de sección. (E-H) Diferentes enfoques para determinar las superficies de sección de las placas de tejido. (E) trazar el contorno de la losa de cada órgano con un rotulador resistente al agua en un recubrimiento de plástico de la transparencia de los perfiles de la losa de órgano contorneado con un tamaño adecuado, calibrado transversal cuadrícula impresa en una transparencia en plástico, conteo de cruces golpear la área del perfil. El área de Perfil de sección de losa de órgano se calcula a partir del número de cruces de golpear el área de Perfil de sección y el área correspondiente a una cruz. (F,G) Determinación de áreas de la sección del órgano losas en imágenes tomadas en posición vertical a la superficie de la sección (F), o en imágenes escaneadas de las placas de tejido (G), con reglas para la calibración. (H) determinación de las áreas de sección de las placas de tejido en las imágenes digitales de las fotos/exploraciones utilizando aplicaciones de software apropiadas morfometría. Área () cálculo del volumen estimado del órgano como el producto de los acumulados de las correspondientes superficies de sección de todas las losas de órgano, multiplicadas por el espesor promedio del órgano losas de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: ilustración esquemática de la determinación de la contracción de tejido tridimensional relacionado con la incorporación durante el procesamiento de las muestras de tejido para histología. (A) corte de una superficie fresca, plano de sección de una muestra de tejido fijo (estabilización de la forma de los tejidos (suaves) deformables como el adiposo o tejido pulmonar por inclusión en agar antes de seccionamiento). Exploración de la superficie de la sección de la muestra junto con una regla de tamaño. (B) determinación planimétrica de la zona de la superficie de la sección de la muestra de tejido fijo (A_f). Rutina (C) inclusión de la muestra de plástico medio de inclusión. (D) preparación de una sección histológica del bloque de plástico con la preservación del plano de sección de la muestra. Montaje de la sección sobre un portaobjetos de vidrio y la coloración rutinaria de la diapositiva. Exploración (E) de la diapositiva junto con una regla de tamaño. (F) determinación planimétrica del área de la sección de la muestra de plástico incrustado (A_e). (G) cálculo del grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión como el cociente de las áreas de medición de perfiles de sección correspondientes de las muestras de tejido antes y después de la incrustación de plástico incrustar medio¹⁴. Imágenes a la derecha muestran la superficie de sección de una muestra de formaldehído-fija de tejido grasa incrustada en agar ennegrecido de tinta antes de empotrar en resina plástica (arriba) y el correspondiente Perfil de sección (tinción de) de la muestra GMA/MMA-embedded (abajo). Barras de escala = 2 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: ilustración esquemática del muestreo al azar sistemático volumen ponderado. El ejemplo presentado muestra muestreo al azar sistemático de seis localizaciones de tejido dentro de la corteza renal de un riñón fijo de perfusión. (A) medición de la longitud (l) del riñón a lo largo de su eje longitudinal. (B) completa de seccionamiento del órgano entero en igual espesor (d) paralelo rodajas ortogonales al eje longitudinal del órgano. (C) losas de órganos y tejidos colocan en el mismo (es decir, la izquierda o la derecha) superficie hacia abajo. (D) superposición de las placas de tejido con una rejilla cruzada tamaño adecuado imprime en una transparencia en plástico. Exterior izquierda superior transversal de la rejilla se coloca sobre un punto al azar fuera de los tejidos (indicado por un punto azul, •). (E) conteo y numeración de todos los cruces golpeando la corteza renal. En el presente ejemplo, las cruces golpeando la corteza renal se numeran consecutivamente en losa de un riñón tras otro (de izquierda a la derecha), en cada procedimiento de la losa en dirección a la derecha, a partir de la Cruz más cercana a la posición de 12:00. Aquí, 36 cruces golpearon la corteza renal. Seis posiciones de muestreo deben ser muestreadas. Por lo tanto, se muestrea cada sexta posición donde una cruz golpea el tejido (36/6 = 6). (F) en el presente ejemplo, la posición de la cuarta cruzada (N ° 4) golpea la corteza renal es elegida al azar como la primera posición de muestreo. Cada siguiente sexto Cruz golpea la corteza renal es marcada en la transparencia de plástico usando un lápiz resistente al agua. En el ejemplo presente, estas son las posiciones 4, 10, 16, 22, 28 y 34. (G) selección de los lugares correspondientes de tejido por pequeños trozos de papel confetti limpio, en blanco colocado en la superficie del tejido. (H) la supresión de los especímenes del tejido de los lugares muestreados al azar sistemática y posterior tratamiento para mayores análisis. Esta figura se ha modificado de Albl et al (2016), las figuras S236 y S237, página 186 (suplementos)⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: muestreo aleatorio sistemático ponderado por el volumen de la corteza renal de un riñón porcino (véase figura 5) y las reglas para el recuento de puntos. Riñón de cerdo fresco (A). (B) riñón seccionado en igual paralelo rodajas gruesas ortogonales al eje longitudinal del órgano, overlaid con cruz cuadrícula impresa en una transparencia en plástico. El círculo rojo indica la posición del punto aleatorio utilizado para aleatorizar la posición de la parrilla cruzada. (C) ilustración de las reglas de conteo de punto: una cross/point se cuenta como golpea el compartimiento del tejido a ser muestreados (compartimiento de referencia), si el interno superior derecha esquina de la vertical y horizontal de la barra de la Cruz (flecha) cubre el tejido. (D) marca de cruces golpeando la corteza renal y el muestreo al azar sistemático de localizaciones de tejido (aquí, 119 cruces golpear la corteza renal y 17 lugares se muestrean sistemáticamente al azar utilizando un muestreo intervalo = 7). (E) muestreados al azar sistemáticamente lugares de corteza renal con la etiqueta de papel confeti. (F) suprimido las muestras. (G) mayor subdivisión de suprimido muestras para posterior tratamiento de las submuestras para tipos diferentes de análisis aguas abajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: subdivisión de las muestras de tejido suprimido de sistemáticamente lugares muestreados al azar del tejido y el procesamiento de submuestras para tipos diferentes de análisis aguas abajo. (A) Ilustración esquemática de la generación de submuestras de tejido de un lugar sistemáticamente al azar muestra de corteza renal (tejido propio) para diferentes análisis (p. ej., FF-PE: muestra formalina-fijos, parafina-encajado y MTC-PE: Muestra Methacarn-fijo, parafina-encajado para histología luz-microscópico; CRIO: Muestras para histología de sección congelada; -80 ° C: seco-hielo congelado las muestras de tejido para análisis molecular). (B) supresión de localidades muestreadas sistemáticamente al azar de la corteza renal de un riñón fijo de perfusión, mayor subdivisión de las muestras del tejido suprimido y el procesamiento de las submuestras para análisis morfológicos cualitativos y cuantitativos. Losas de riñón porcino a fijo de perfusión (1), Cruz (2), la red tabla de números aleatorios (3), equiangular y pesó coseno círculos (4) para la generación de secciones IUR (ver figura 9, figura 10), soluciones de fijación diferentes (5, 6, 7) y la muestra contenedor para muestras microscópicas de electrones (8). Esta figura ha sido modificada de Albl et al. (2016), figura S239, página 186 (suplementos)⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: preparación de tejido porcino formalina-fijo de la sección de "Isector". (A) muestra de corteza renal porcina fijo de perfusión. Molde esférico (B). (C) agar líquido. (D-E) Agar-inclusión de muestras en molde esférico. Agar (F) de la esfera con la muestra de tejido embebido. (G) Agar esfera con embedded tejido seccionado en una posición aleatoria (plano de sección IUR). Esta figura ha sido modificada de Albl et al. (2016), figura S6, página 14 (suplementos)⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: ilustración esquemática de la técnica de "Orientador" para la preparación de secciones IUR. (A) muestras de tejido fijo colocan en un círculo equiangular (ci1) con un borde paralelo a la 0 – 180 ° dirección (indicada por una línea roja). (B) secciones de la muestra en un ángulo aleatorio (línea verde). (B, C) Recién generado superficie de sección de la muestra de tejido (indicada en color verde). (D) muestra colocada sobre un círculo de coseno-pesado (ci2) con la superficie seccional generada en el paso anterior hacia el lado negativo y un borde de la superficie de apoyo paralelo a la dirección de 1-1 (indicada por una línea roja). (E) corte de la segunda sección a través de la muestra en un ángulo al azar. (F) resultando al azar isotrópico sección plano de la muestra (indicada en color azul). (G) determinación del área de la sección IUR el fijo de muestra de tejido para la estimación de la contracción de tejidos relacionados con la inclusión como se describe en el paso 1.3. (H) incorporación de la muestra de tejido en la resina plástica. () Es el seccionamiento del bloque plástico seccionado (paralelo al plano de IUR) en un micrótomo. (J) montaje de las IUR plástico-secciones sobre portaobjetos de vidrio. Esta figura ha sido modificada de Albl et al. (2016), figura S8, página 15 (suplementos)⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: técnica de "Orientador" para la preparación de secciones de muestras de tejido embebido en agar de IUR. (A, D) Opcionalmente, se puede agar-incrustar un espécimen sistemáticamente al azar muestra de tejido fijo (incrustación de agar es útil para muestras pequeñas de tejido, para que la primera o ambas secciones al azar pueden colocarse dentro del agar sin cortar el tejido). (E) colocación del bloque de agar en un círculo equiangular (ci1) con un borde paralelo a la dirección de 1-1 (indicada por una línea roja). (F, G) Seccionamiento del bloque en un ángulo aleatorio (aquí: 15-15, línea verde) determinó mediante una tabla de números aleatorios (rnt, verde flecha). Posteriores (H) colocación del bloque de agar sobre la superficie de la sección corta en F en un círculo de coseno-weighted (ci2) con el borde de la superficie de descanso colocado paralelo a la dirección de 1-1 (indicada por una línea roja). () Segunda sección corta a través de la muestra con un ángulo al azar (aquí: 20-20, indicada por una línea azul), determinado utilizando una tabla de números aleatorios (flecha de la rnt, azul). (J) resultante IUR sección plano de la muestra de tejido. Esta figura ha sido modificada de Albl et al. (2016), figura S9, página 16 (suplementos)⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: ilustración esquemática de la preparación de sección VUR. (A) muestra de tejido fijo definido (identificable) eje vertical (por ejemplo, vertical a la superficie natural). Muestra de tejido fijo (B) embebidas en agar. (C) colocación de muestra de tejido de the(agar-embedded) en una impresión de un círculo equiangular (ci1). V_A: eje Vertical. (D) seccionamiento de la muestra en un ángulo al azar (tabla de números aleatorios; aquí: 30-30 dirección, indicada por una línea azul) con el plano de sección estar orientado ortogonalmente a la tabla y paralelo al eje vertical de la muestra. Plano de sección VUR resultante de la muestra de tejido (indicado en color azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: volumetría de representante de un riñón porcino. (A-B) Técnica de inmersión. (A) determinar el peso del riñón (m_chico). (B) determinación del peso del volumen de solución salina desplazado por el riñón (m_displ.saline). El riñón es colgado de una cuerda y completamente sumergido en solución salina sin tocar el fondo o las paredes del vaso. El volumen calculado del riñón es 92,6 cm³. (C-D) Técnica de Cavalieri, planimetría por punto de conteo. (C) medición de la longitud (l) del riñón a lo largo de su eje longitudinal. (D) determinación de las zonas de Perfil de sección de riñón losas por punto de conteo después de superposición de una retícula de cruces equidistantes impresas sobre una transparencia en plástico. Aquí, el volumen estimado del riñón es 93,3 cm³. (E-F) Técnica de Cavalieri, planimetría de imágenes escaneadas de las áreas de Perfil de sección de las losas (F) del riñón. Aquí, el volumen estimado del riñón es 92,8 cm³. C-E, natural redonda de superficie de la primera o la última losa del riñón colocado en el escáner o superpuestas por la transparencia de red cruzado no es una superficie de sección y por lo tanto, no hay superficie de sección se mide en la losa de este tejido. (G-H) Demostración de overprojection en imágenes escaneadas de las losas de órganos y tejidos (G) y en las losas de órganos y tejidos con una transparencia de red cruzado (H). Overprojecting partes del tejido de las losas del órgano se indican mediante líneas punteadas de blancas y negras. Sólo las zonas de los perfiles de sección real (es decir, el tejido rodeado por la línea de puntos blanca parcialmente indicada) se determinan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13: ilustración representativa de adecuada (A) y óptima (B) preparación de muestras de tejido embebido en agar para la determinación de la contracción del tejido relacionado con fijación de muestras histológicas plástico medio de inclusión. (A) imagen escaneada de la superficie de sección de una muestra fija de tejido adiposo subcutáneo porcina antes de empotrar en resina plástica. La muestra va embebido en agar ennegrecido de tinta para la estabilización de la forma de la muestra y clara identificación de los contornos superficiales de sección. (B) contorno indistinto de la burbuja de aire atrapado y superficie de sección (flecha) en el agar. Barras de la escala = 5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis		Muestra	Procesamiento de
Tipo	Métodos de
Análisis moleculares	Transcripción de RNA, proteínas, metabolitos y perfiles de lípidos, metabolómica, análisis de ADN	Pequeños pedazos * de tejido fresco (nativo)	Congele en hielo seco o nitrógeno líquido. Tienda a-80 ° C.
Análisis morfológicos cualitativos	Histología [microscopía, incluyendo inmunohistoquímica (IHQ) e hibridación in situ]	Fresco (nativo), o en situ - fijadas * las muestras de tejido	Utilizar diferentes fijadores (p. ej., solución de formaldehído 4%) y medio de inclusión (parafina, GMA/MMA, de epoxy), según corresponda.
	Cryohistology (secciones congeladas, incl. IHC)	Muestras de tejido fresco (nativo)	Embeber la muestra en medio de bloqueo y congelación en isopentano enfriado en nitrógeno líquido.
	Análisis ultraestructural [microscopía, incluyendo transmisión (TEM) y microscopía electrónica]	Pequeños trozos de fresco (nativo), o en situ- fijadas * las muestras de tejido	Fijar la muestra en solución de glutaraldehído al 2.5-6.25% y embed en resina plástica epoxy.
Análisis morfológicos cuantitativos	Microscopía de luz	Fresco (nativo) - o en situ - fijo * las muestras de tejido	Preparar IUR-secciones (orientador-, isector secciones) o VUR-secciones de muestras de plástico tejido embebido.
	TEM	Pequeños trozos de fresco (nativo), o en situ - fijadas * tejido	Prepare secciones IUR (orientador-, isector secciones) de las muestras de tejido embebido en epoxy.

Tabla 1: tratamiento de submuestras de tejido de localizaciones sistemáticamente al azar muestras tipos diferente análisis aguas abajo. Dependiendo del diseño experimental de un estudio y de los órganos y tejidos bajo investigación, diversos números de submuestras deben ser suprimidos desde cada ubicación sistemáticamente al azar muestras de tejido y procesados para los diferentes tipos de análisis aguas abajo. Protocolos detallados para más porcino de órganos/tejidos y tipos de estudios se encuentran en el "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"⁷. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/metacrilato de metilo. IUR: Isotrópica uniforme al azar. VUR: Vertical uniforme al azar. * max. 2 x 2 x 2 mm³. por ejemplo, tejido de perfusión fijada o tejido pulmonar pulmones infundido con la solución de fijación.

Método	Resultados representativos
Técnica de inmersión para la determinación de densidades de tejido/órgano (paso 1.1, figura 1, figura 2)	Órganos y tejidos porcinos		Ρ (g/cm³)
	Hígado		1.071 ± 0.007
	Páncreas		1.062 ± 0.016
	Miocardio de ventrículo		1.036 ± 0,014
	Riñón		1.044 ± 0.006
	Tejido adiposo visceral abdominal *		0.921 ± 0.032
	Glándula tiroides		1.061 ± 0.007
	Cerebro		1.051 ± 0.007
	Glándula suprarrenal		1.063 ± 0.025
	Músculo esquelético **		1.074 ± 0.003
	Los datos son medios ± pesos de órganos y tejidos específicos SD. se determinaron n = 18 cerdos (14 cerdos femeninos y 4 masculinos; edad 60 días a 2 años; 30 – 250 kg de peso corporal). * Tejido adiposo del mesenterio yeyunal. ** Valores medios para el M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. brachii del tríceps y M. gluteobiceps.
Determinación de la contracción de tejido tridimensional relacionado con la incorporación durante el procesamiento de las muestras de tejido para histología (paso 1.3, figura 4)	Órganos y tejidos	Medio de inclusión	fS
	Corteza renal (cerdo)	GMA/MMA	0,89 ± 0.02
		Epoxy	0,92 ± 0.02
	Los datos son medio ± SD de mediciones de 24 muestras de 12 cerdos. fS: factor de corrección de la contracción lineal.

Tabla 2: Resultados representativos de las densidades de las porcino órganos y tejidos⁷y factores de corrección de la contracción lineal para contracción de tejidos relacionados con la inclusión del tejido renal cortical porcino en plástico diferentes medio de inclusión.

Discussion

Generación de colecciones de muestras Biobanco de modelos animales porcinos requiere técnicas robustas y protocolos para la determinación de volúmenes de órganos y tejidos, la generación reproducible de representante, las muestras de tejido redundante apto para una amplia gama de métodos de análisis diferentes y por la aleatorización de la orientación de las secciones de la muestra para los análisis cuantitativos de estereológicos. Los métodos descritos en el presente artículo se adaptan a los tamaños de porcinos órganos y tejidos y se han desarrollado para satisfacer eficazmente las demandas^2,7. Se basan en principios metodológicos bien reconocidos y previamente ha demostrado su viabilidad en diferentes estudios publicados^2,7,12,21. Los métodos recomendados son importantes para varios tipos de estudios que examinan las muestras de tejido/órgano, puesto que proporcionan una base para la generación de muestras representativas y para la adquisición de una variedad de parámetros que de lo contrario no podría ser determinado. Estos métodos pueden realizarse rápidamente con poco esfuerzo y son compatibles con prácticamente todas las clases de análisis aguas abajo. Por lo tanto, se considera adecuados no sólo para proyectos de Biobanco de modelo animal porcino, pero también son útiles en estudios que incluyeron análisis histomorfológicos cuantitativo de muestras de tejido de otras especies de grandes animales modelo (por ejemplo, ovejas), como así como en estudios de veterinaria. Habida cuenta de los aspectos técnicos de los diferentes métodos, algunos pasos críticos y las limitaciones tienen que ser considerados durante la implementación de los protocolos de las técnicas respectivas.

Técnica de inmersión para la determinación de la densidad del tejido/órgano

Durante la determinación de densidades mediante el método de sumersión (paso 1.1, figura 1, figura 2), cuidado se debe no toque las paredes internas o el fondo del vaso con la muestra de tejido o el sostenedor de la muestra mientras que el tejido del tejido muestra es sumergido en solución salina. De lo contrario, la báscula mostrará el peso de la muestra, más que el peso del volumen desplazado por la muestra solución salina. Para muestras de tejido de luz muy pequeña (unos pocos mg), es limitado, debido a la surface tension de la solución salina y el adverso alto cociente del volumen muestra el volumen de líquido de sumersión en el vaso, que es el método de inmersión para la determinación de la densidad del tejido que impiden la exactitud de la medición. Aquí, el peso de la muestra podría utilizarse para cálculos posteriores en lugar del volumen calculado de densidad. Determinación de densidades de tejido por inmersión no es también eficaz para el tejido pulmonar (interpretaciones) fresco, debido al inconsistente contenido de aire en el tejido y en algunos casos, donde los órganos son perfundidos/inculcado experimentalmente con fijadores.

Método de Cavalieri para la determinación de volúmenes de órgano

El método de Cavalieri volumetría de órganos porcinos y tejidos es más engorroso en comparación con la determinación del volumen del órgano desde el órgano peso y densidad. Sin embargo, es conveniente para los órganos que no pueden ponderarse adecuadamente debido a su proceso experimental (por ejemplo, órganos fijos de perfusión o pulmones infundidos con la solución de fijación). Aquí, el método de volumetría de Cavalieri idealmente puede combinarse con la técnica de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen descrita en el paso 2 (figura 5, figura 6, figura 12). Durante la estimación de volúmenes de órganos y tejidos de las áreas de perfiles de sección de rebanadas paralelas, equidistantes de los órganos y tejidos (enfoque de Cavalieri, paso 1.2, figura 3), mantenimiento de la orientación del tejido (plano de sección superior e inferior de las losas ), así como la determinación exacta de la zona de todos los perfiles de sección son de gran importancia. Particularmente, si se analizan imágenes digitales o escaneos de órgano losas planimétricamente, overprojections del tejido (fuera del plano del tejido seccionado) de la losa (figura 12G-H) del tejido cuidadosamente deberá proporcionar volumen confiable según las estimaciones.

Determinación de la contracción de tejido tridimensional relacionado con la incorporación durante el procesamiento de las muestras de tejido para histología

El grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión depende del medio de inclusión y el tipo de tejidos y puede variar entre muestras procesadas diferencialmente del mismo tejido.

Mientras que las secciones congeladas son consideradas para no mostrar casi ninguna contracción en el plano X-Y y encajadura plástica generalmente causa poca contracción del tejido, contracción de tejidos relacionados con la inclusión es particularmente extensa en las muestras de tejido parafina-encajado y se deterioran generalmente significativamente el análisis morfológicos cuantitativos de parámetros dimensionales en cortes histológicos de estas muestras. Además de la gran parte de la contracción global tridimensional, inclusión en parafina también causa una contracción no uniforme, diferencial, anisotrópico y variable de la muestra y de diferentes estructuras anatómicas, tipos de tejidos y tipos celulares dentro de el tejido muestra^8,13. Por otra parte, particularmente en más gruesos cortes histológicos de muestras de tejido parafina-encajado, el grado de contracción de tejido puede diferir también significativamente en X-Y y la dirección Z de la sección. Esto puede ser debido a una contracción diferencial de la zona de sección (en dirección X-Y) y la altura de la sección (es decir, el espesor de la sección vertical) durante el estiramiento de la sección en el baño de agua caliente tejido flotación después de la sección de corte del tejido bloque y durante los procedimientos posteriores de transformación, coloración y cubreobjetos de la sección montada sobre un cristal diapositiva (es decir, un colapso homogéneo del eje z las secciones)⁸. Además, en secciones gruesas, puede haber una compresión más fuerte comparable de las regiones sección plano cerca del tejido dentro de la sección mientras que la sección se reduce desde el bloque de tejido (que conduce a una deformación diferencial del eje z las secciones)¹⁹ . Estos efectos también luego pueden distorsionar las estimaciones del número de estructuras de tejido dentro de la sección por métodos distintos análisis estereológicos cuantitativo, como el disector óptico. Por lo tanto, predicción, monitoreo y corrección de la contracción de tejidos relacionados con la inclusión no es factible para las muestras de tejido parafina-encajado⁸.

En cambio, el grado de contracción de volumen de las muestras de tejido embebido en resinas plásticas, como la GMA/MMA o epoxy, es significativamente menor y más uniforme. Por lo tanto, inclusión en resina plástica con un supuesto homogénea, isotrópica y mundial la contracción del tejido es ventajosa para varios métodos de análisis de diferentes parámetros morfológicos cuantitativos^17,18. Durante la valoración de la contracción del tejido relacionado con incrustación en resina plástica, la forma del tejido fijo no debe ser distorsionada además durante el procedimiento de inclusión, para permitir la comparación de áreas de Perfil de sección correspondiente de la fija y encajado muestras. Esto puede ser difícil en las muestras de tejido blando o fácilmente compresible como el adiposo o tejido pulmonar, o en muestras de tejido con un alto contenido líquido. Aquí, es útil para estabilizar la forma de la muestra de tejido durante el plástico posterior procedimiento de inclusión inclusión de la muestra fija en agar antes de seccionar el tejido (paso de protocolo 1.3., figura 4). Para lograr datos confiables, deben realizarse mediciones repetidas de la contracción de tejidos relacionados con la inclusión, utilizando diferentes muestras del mismo tejido. El grado de contracción de tejidos relacionados con la integración se expresa como la contracción de tejido lineal factor f_s (paso de protocolo 1.3.9., figura 4). Ejemplos de ecuaciones usando f_s para la corrección de la contracción de diferentes longitud, superficie y parámetros de volumen de las estructuras tisulares diferentes se encuentran en varios estudios estereológicos cuantitativos^{14, 21,27}.

Muestreo aleatorio sistemático ponderado por volumen de puntos de conteo y procesamiento de submuestras de tejido para tipos diferentes de análisis aguas abajo

La técnica de muestreo ponderado por el volumen presentado de órganos porcinos determina lugares de muestreo al azar dentro del tejido una vez y posteriormente genera todas las muestras necesarias para los más diversos análisis por submuestreo de las muestras de tejido de estos lugares⁷. En regímenes de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen, cada ubicación de muestreo posible dentro del volumen total de los órganos y tejidos bajo examen tiene exactamente la misma oportunidad al azar para ser muestreados, y generalización es asegurada por la colección de un número suficiente de muestras. Por lo tanto, utilizando diseños de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen de generación de muestras de órganos parenquimales, previene con eficacia el análisis de resultados posiblemente sesgadas (potencialmente inesperado y desconocido) las distribuciones desiguales de distintos propiedades funcionales o morfológicas del tejido en diferentes lugares de un órgano, que se han demostrado, por ejemplo, para el volumen promedio y la densidad de volumen numérico de hepatocitos porcinos en diferentes regiones de la parenquimia del hígado²⁸ . La estrategia de "corte longitudinal del tejido y submuestreo" de órganos porcinos es fácilmente comprensible, cumple con los requisitos técnicos de los métodos de análisis aguas abajo y puede rápidamente realizada y adaptada a las exigencias de un estudio específico, evitando sesgos de muestreo sistemático, reducción de la variabilidad experimental y aumentar la precisión del experimento global, siendo más eficiente que el muestreo en el que cada lugar de muestreo solo se determina al azar de estrategias^{9 ,15}. El número de ejemplares que han de generarse, obviamente dependen de los parámetros examinados y su variabilidad dentro de muestras de diferentes lugares del muestra de órganos y tejidos. Para la generación de colecciones de muestras Biobanco diseñado para permitir la examinación de un máximo de diferentes parámetros (no especificado en el momento de muestreo) por una variedad de diferentes métodos analíticos, una estrategia de muestreo prospectivas generalmente horarios generación de un número relativamente alto de muestras redundantes por órganos y tejidos.

Generación de aleatorios uniforme isotrópico (IUR) secciones y secciones al azar uniforme Vertical (VUR) para análisis cuantitativos de estereológicos

Algunas de las técnicas utilizadas para la generación de IUR y VUR secciones para cuantitativa análisis estereológicos han complicado un poco las bases teóricas, y las explicaciones son por lo tanto a menudo (innecesariamente) evitó por muchos científicos, aunque su práctica la implementación es razonablemente fácil. VUR secciones son particularmente fácil de generar y son óptimo para las estimaciones de densidad superficie en combinación con sistemas de prueba de cicloide^8,9,20. A menudo se prefieren debido a la orientación familiar del plano de sección. Sin embargo, en contraste con las secciones IUR, secciones de RVU no son adecuadas para la estimación de parámetros de longitud^8,9.

Durante la preparación de secciones IUR y RVU, el paso crítico es, básicamente, para mantener la superficie de sección IUR o VUR de la muestra fija durante la incrustación en resina plástica y para asegurar que el eje vertical de las secciones VUR siempre puede ser identificado (paso 3, Figura 9, figura 10, figura 11).

En el futuro, la aplicación más amplia de los métodos descritos anteriormente podría contribuir sustancialmente para establecer consistentemente de alta calidad para la generación de muestras Biobanco comparable, multiusos de porcinos y otros modelos animales grandes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.