Strategier för provtagning och behandling av Biobank vävnadsprover från svin biomedicinska modeller

Summary

Den praktiska tillämpningen och prestanda för metoder för generering av representativa vävnadsprover på svin djurmodeller för ett brett spektrum av nedströms analyser i biobank projekt demonstreras, inklusive volumetry, systematisk slumpmässig provtagning, och differentierad behandling av vävnadsprover för kvalitativa och kvantitativa morfologiska och molekylära analyser typer.

Abstract

I translationell medicinsk forskning, har svin modeller stadigt blivit mer populära. Med tanke på det höga värdet på enskilda djur, särskilt av genmodifierad gris modeller och ofta begränsas av antalet tillgängliga djur av dessa modeller, inrättandet av (biobank) samlingar av tillräckligt bearbetade vävnadsprover passar en brett spektrum av efterföljande analyser metoder, inklusive analyser inte anges vid tidpunkten för provtagning, utgör meningsfulla strategier för att dra full nytta av överbryggande värdet av modellen. Om Europeiska skoindustrins särdrag av svin anatomi, har omfattande riktlinjer nyligen fastställts för standardiserade generation av företrädare, högkvalitativa prover från olika svin organ och vävnader. Dessa riktlinjer är väsentliga förutsättningar för reproducerbarheten för resultaten och deras jämförbarhet mellan olika studier och utredare. Registrering av grundläggande uppgifter, såsom organvikter och volymer, vid fastställandet av mätplatser som numrerar av vävnadsprover ska genereras, samt deras orientering, storlek, bearbetning och trimning riktningar, är relevanta faktorer fastställande av generaliserbarhet och användbarhet av förlagan för molekylär, kvalitativa och kvantitativa morfologiska analyser. Här, en belysande, praktiska, stegvisa demonstration av de viktigaste teknikerna för generering av representant, multi-purpose biobank provbit från svin vävnader presenteras. Metoderna som beskrivs här inkludera bestämning av organ/vävnad volymer och densiteter, tillämpningen av ett volymvägda systematisk slumpmässig provtagningsförfarande för parenkymal organ genom punkt-räkna, bestämning av omfattningen av vävnad krympning relaterade till histologiska inbäddning av prover, och generering av slumpmässigt orienterade prover för kvantitativa beteendetester analyser, till exempel isotropa enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt genereras av metoderna ”Orientator” och ”Isector”, och vertikala uniform slumpmässig (VUR) sektioner.

Introduction

I translationell medicin, grisar är vanligare för användning som stort djur modeller^1,2,3,4,5, flera fördelaktiga likheter mellan de svin och människans anatomi och fysiologi, och tillgängligheten av etablerade molekylär biologiska metoder som möjliggör generering av skräddarsydda, genetiskt modifierade gris modeller för ett brett utbud av sjukdom villkor^1,4.

Jämfört med gnagare modeller, är antalet djur av en respektive gris modell som kan tillhandahållas för experiment när som helst dock begränsad. Detta beror på svin generation intervallet för ungefär ett år och de finansiella och tidskrävande insatser som krävs för generering av svin modeller och djurhållning. Enskilda djur av en svin modell, liksom de prover som kan genereras från dessa grisar, är därför mycket värdefullt, särskilt om genetiskt modifierade svin modeller och/eller långsiktiga experimentella problem (t.ex., det sena komplikationer av kroniska sjukdomar) undersöks i äldre individer^2,6,7.

Under loppet av någon studie, prestanda av ytterligare analyser som inte hade planerats i den ursprungliga experimentella designen av studien skulle senare visa sig vara relevanta, t.ex., till adress skilda frågor som uppkommer tidigare upptäckt oväntade fynd. Om det inte finns lämpliga prover för sådana ytterligare experiment kan oproportionerligt höga kostnader och tidskrävande utgifter vara nödvändigt att generera ytterligare grisar och vävnadsprover. För att vara förberedd för sådana eventualiteter, anses generation av biobank samlingar av bevarade säkerhetskopiera prover av olika organ, vävnader eller bio-vätskor, kvantitativt och kvalitativt lämplig för ett brett spektrum av efterföljande analyser, en viktig strategi^2,6,7. Som följer optimala fördelar ett porcint djurmodell, tillgången på lämpliga biobanksprov erbjuder också den unika möjligheten att utföra ett brett spektrum av olika analysmetoder på identiskt provmaterial på mång--organ nivå i den mycket samma enskilda djur, t.ex., av distribution av prover till forskare av olika arbetsgrupper som organiseras i en forskning nätverk^2,6,7. Dessutom bidrar den '' framåtblickande '' provtagningsstrategi inom biobanker också till en minskning av antalet djur som behövs i en studie. Fördelarna med svin modell biobanker har nyligen visats i en flera organ, multiomics studie, att undersöka organ cross talk i en genetiskt modifierade svin modell av långvarig diabetes mellitus, med prover från München MIDY Gris biobanken ².

Det finns vissa obligatoriska krav biobanksprov måste i allmänhet följa för att fastställa tillförlitlighet och tolkningsbarhet av resultaten av de senare utförda analyserna. Proverna måste genereras reproducibly, och de måste vara representant, dvstillräckligt återspeglar de berörda morfologiska och molekylära funktionerna av vävnad/organ proven togs från⁷. För att vara lämplig för ett brett utbud av nedströms analystyper, måste proverna tas i tillräckliga mängder och behandlas enligt de olika analysmetoder, inklusive beskrivande krav (inklusive tid och temperatur förhållanden) histopatologiska analyser, såsom cryohistology, paraffin och plast histologi, immunohistokemi, i situ hybridisering, ultrastrukturella elektron mikroskopisk analyser och kliniska diagnostiska laboratorieanalyser, samt som molekylär analyser av DNA, RNA, proteiner och metaboliter.

För att möjliggöra bedömning av en rad distinkta kvantitativa morfologiska parametrar såsom tal, volymer, längder eller ytor av distinkta vävnad strukturer av kvantitativa beteendetester analyser är randomiserade avsnitt flygplan av den histologiska prover av respektive organ/vävnader behöver förberedas^7,8,9,10,11. I kvantitativa morfologiska studier, exakt bestämning av den totala volymen av vävnad, organ eller organ fack, proven togs från (dvs.utrymmet som referens) är ytterst viktig^{7,9 , 12} för att beräkna de absoluta kvantiteterna av de berörda parametrarna inom respektive organ, vävnad eller organism. Effekten av inbäddning-relaterade vävnad krympning under upprättandet av histologiska avsnitt har småningom, bestämmas och tas in i konto¹³. Kvantitativa beteendetester analyser, särskilt av arkiverade prover (fast vävnadsprover, inbäddade vävnad block, histologiska sektioner, etc.) från tidigare studier är därför ibland starkt begränsad eller omöjligt¹², särskilt om volumetry i respektive organ/vävnader inte utfördes, om ingen adekvat provtagning mönster tillämpades för att motivera representativa prover, om de siffror och mängder av tillgängliga enskilda prover är otillräckliga eller om behandlingen av den prover är oförenligt med uppskattning av den kvantitativa morfologiska parametrar av intresse. På grund av de många möjliga påverkande faktorerna, lämpligheten av Arkiv-provmaterial för analyser av olika kvantitativa morfologiska parametrar kan inte entydigt besvaras, men beror på en noggrann bedömning av varje enskilt fall.

Således, eftersom plats, storlek, antal, bearbetning, trimning riktning och orientering av prover potentiellt påverkar resultaten av de efterföljande analyserna, dessa faktorer är av stor betydelse och måste beaktas i experimentell design av någon studie. När det gäller dessa aspekter och särdragen hos svin anatomi, omfattande, detaljerad, storskalig provtagning riktlinjer anpassas till svin djurmodeller har nyligen fastställts, som ger en robust hänvisning till standardiserade och reproducerbar , och effektiv generering av redundant, tillräckligt bearbetade, högkvalitativa prover från mer än 50 olika svin organ och vävnader^6,7.

De metodiska beskrivningarna och den video tutorial som visas i denna artikel ger detaljerad, belysande, begriplig, steg-för-steg-instruktioner för praktiska utförandet av en mängd olika tekniker för volumetry, provtagning av svin vävnader och organ, och bearbetning av vävnadsprover för olika nedströms analysmetoder. De utvalda teknikerna inkluderar metoder för bestämning av organ/vävnad volymer och densiteter baserat på principerna om Archimedes och Cavalieri⁹, inklusive fastställande av dimensionerar av tredimensionella krympning av vävnad relaterade till den inbäddning i olika bädda media¹⁴ under bearbetning för Histologisk undersökning, tillämpningen av genomförbara volymvägda systematisk slumpmässig provtagning metoder, behandling av samplade vävnadsprover för olika efterföljande analyser^7,8,9,15, och generation av korrekt orienterade och bearbetade prover för potentiella kvantitativa beteendetester analyser^{7,8, 9,10,11}. Bredvid deras tillämpning i svin biobank projekt är påvisade metoderna i allmänhet lämpligt för alla studier kvantitativa histo-morfologiska egenskaper av organ/vävnader. Dessutom är systematisk slumpmässig provtagning mönster särskilt fördelaktigt för generering av representativa prover i experiment med molekylära analysmetoder för att upptäcka överflöd förändringar av, t.ex., RNAs, proteiner eller metaboliter i olika organ och vävnader.

Nästa punkter ger en kort introduktion till dessa metoder, medan deras praktiska resultat beskrivs i avsnittet protokoll.

Bestämning av organ/vävnad volymer
Bestämning av organvikter och volymer är viktigt i flera experimentella inställningar, eftersom dessa faktorer kan indikera förändringar, potentiellt relaterade till experimentellt undersökte faktorer av intresse. Den totala volymen av en organ/vävnad krävs också ofta att beräkna absoluta kvantitativa parametrar (t.ex., den totala mobilnummer), från stereologically beräknade numeriska volym tätheter (dvs, det antalet celler per volymenhet av vävnad)^7,12. Förutom teknik använder komplexa tekniska utrustning, såsom datortomografi, det finns i princip tre praktiska metoder som vanligen används för att bestämma den absoluta volymen av ett organ eller vävnad. Volymen av en orgel kan bestämmas genom ”direkt volumetrisk mätning” enligt principen om Archimedes, dvs, volymmätning av vatten eller koksaltlösning som fördrivits av strukturen när helt nedsänkt. För comparably stora svin organ är dessa metoder dock opraktisk och benägna att vagheten, eftersom de kräver mycket stor volymetrisk/mäta kolvar. Mer bekvämt, volymen av en organ/vävnad kan beräknas från dess vikt och densitet^7,12,16, som effektivt kan bestämmas med hjälp av den ”nedsänkning metod”^{7,12 ,16} (protokoll steg 1.1.). Organ/vävnad volymer kan också uppskattas med volumetry metoder som bygger på ”principen om Cavalieri” (1598 – 1647). I enkla termer, Cavalieri principen anges, att om två objekt är sektioneras på plan som är parallellt med ett jordplan och profiler av avsnitten skär genom de två objekten på motsvarande avstånd från jordplanet har samma områden, två objekt har samma volym. Volymen av godtyckligt formade objekt kan således beräknas som produkten av deras avsnitt profilområden i parallella, lika avlägsen avsnitt flygplan och avståndet mellan de avsnitt plan. Detta är begripligt med följande liknelse: överväga två högar bestående av samma antal identiskt mynt placeras sida vid sida, en stack med den mynt ordnad staplade ovanpå varandra ger en cylindrisk form av mynt stacken och andra stack av mynt med off-center placerad mynt (figur 3A). Även om båda mynt stackar former är olika, deras volymer är samma, sedan områdena av mynten på motsvarande nivåer i båda stackar (dvs.områdena av profiler av parallella sektioner skär genom båda mynt stackar på lika avstånd från den marken) är identiska. Uppskattning av volymerna av svin organ och vävnader med hjälp av Cavalieri princip^7,12,15 beskrivs i steg 1.2.

Fastställande av omfattningen av vävnad krympning relaterade till histologiska inbäddning
I analyser av flera kvantitativa morfologiska parametrar mäts i histologiska vävnadssnitt, har effekten av inbäddning-relaterade vävnad krympning som inträffar under vävnad behandling för histologi skall fastställas och beaktas. Omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning kan vara variabel, och beror både på vävnaden, dess bearbetning och inbäddning medium^{8,13,17,18,19}. Allmänhet, inbäddning-relaterade förändringar av volymen av ett vävnadsprov (dvsmestadels krympning) förekommer i alla tre dimensioner av rymden, och därmed påverkar alla dimensionell parametrar beräknad av kvantitativa beteendetester analyser⁸ . I princip kan omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning, uttryckt som en Linjär krympning vävnadsfaktor (f_S), uppskattas som visas i steg 1.3. och används för korrigering av (krympning-känslig) kvantitativa morfologiska parametrar¹⁴.

Volymvägda systematisk slumpmässig provtagning av organ/vävnader
För etableringen av en biobank samling av svin orgel/vävnadsprover, har volymviktade systematisk slumpmässig provtagning metoder såsom beskrivs i steg 2 visat sig vara praktiska, tidsbesparande och effektiva tekniker för generering av ombud, Multi-Purpose vävnad prover^7,8,9,15.

Generation av isotropiskt enhetliga Random avsnitt och vertikala enhetliga Random avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser
Biobank vävnadsprover måste vara lämplig för ett brett utbud av olika kvantitativa beteendetester analysmetoder för uppskattning av högst parametrar som inte kunde fastställas utan en lämplig förlaga. Nästan alla kvantitativa beteendetester parametrar kan bestämmas med hjälp av ”isotropiskt (oberoende) enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt”^8,9. I IUR avsnitt, är avsnittsplanet av vävnadsprov tredimensionella orientering randomiserade. Detta kan uppnås genom randomisering av placera av vävnadsprov i förhållande till placeringen av avsnittsplanet, som tillämpas i ”Isector” metod¹¹ (protokoll steg 3.1) eller genom randomisering av orienteringen av avsnittsplanet förhållande till den vävnadsprov, liksom de ”Orientator” metod¹⁰ (protokoll steg 3,2). I vävnadsprover, som hud- eller slemhinna specimen visar en naturligt, eller definierade och korrekt identifierbar vertikal axel, upprättandet av ”vertikala enhetliga slumpmässiga (VUR) avsnitt” (protokoll steg 3.3.) strikt sektioneras inom planet för deras lodräta axeln är fördelaktiga^8,20. För en komplett diskurs de teoretiska grunderna i IUR/VUR provtagning och en omfattande diskussion om potentiella nedströms kvantitativa beteendetester analyser hänvisas intresserade till läroböcker av kvantitativa stereology i livet vetenskaper^8,9.

Protocol

Alla metoder som beskrivs använder här vävnadsprover från döda djur och följa helt den tyska lagliga reglementet av djurskydd.

1. Volumetry

1. Nedsänkning teknik för bestämning av vävnad/Organ tätheter (figur 1 och figur 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Förbereda material: skalpell blad, pappershanddukar, fin pincett, standard laboratorium skalor, glas eller plast bägare, 0,9% koksaltlösning och egentillverkade preparathållare (figur 2A).
   2. Punktskatt en bit vävnad (maximal storlek: 2 x 2 x 2 cm³) från organ/vävnad, speciellt från orgel facket av intresse. Litet organ, till exempel hypofysen eller tallkottkörteln, är uppmätta i sin helhet.
      FÖRSIKTIGHET: Kontrollera att storleken på provet är särskilt mindre än den inre diametern bägaren (steg 1.1.5 FF.), och dess fyllning att tillåta fullständig nedsänkning av provet utan att kontakta de inre väggarna i bägaren i steg 1.1.7.
   3. Noggrant svabba provet med en pappershandduk för att avlägsna överflödigt blod/vävnadsvätska.
   4. Väg provet i precision skala och vikten av provet (m_S). Fastställa vikten av små vävnadsprover mg noggrannhet (figur 1A).
   5. Placera en bägare fylld med rumstemperatur 0,9% koksaltlösning på skalan. Fyll inte helt bägaren, som möjliggör en nedsänkning av vävnad provet i det efterföljande steget utan att flöda över.
      Varning: Använd lämplig storlek och vikt av vävnad Provexemplaren skall mätas och effektiv mätområdet av skalan bägare storlek. För större prover upp till 2 x 2 x 2 cm³, en bägare med storleken 50 – 100 mL är rimlig i kombination med en skala som mäter från cirka 100 mg till 500 g, medan för små prover, använda bägare av 5 – 10 mL volym i kombination med precision skalor med mätområden mellan cirka 0,1 mg och 20 g.
   6. Dränka provhållaren (dvs, en tillräckligt styva slinga av tunn tråd eller något liknande, figur 2A) i saltlösning till en markant position (pilar i figur 1B, figur 2Boch figur 2 c). Sedan återställa (tare) visning av skalan till noll.
   7. Fäst noga vävnadsprov provhållaren och helt dränka provet i saltlösning tills den markerade punkten på provhållaren nås (pilar i figur 1B, figur 2Boch figur 2 c).
      FÖRSIKTIGHET: Nedsänkt provet och provhållaren får inte ha kontakt med de inre väggarna eller botten av bägaren eller yta av saltlösning.
   8. Medan du håller provhållaren och nedsänkt provet i den positionen, registrera vikt visas på skalan (m_L), hänvisar till vikten av saltlösning på flykt av vävnadsprov (figur 1 C, figur 2B, och Figur 2 c).
   9. Beräkna volymen av provet (V_S) från m_Loch tätheten av saltlösning vid rumstemperatur (20 ° C) (ρ_saltlösning = 1.0048 g/cm³) som V_S = m_L/ Ρ_saltlösning [g/g/cm³] (Figur 1).
   10. Beräkna densiteten av vävnadsprov (ρ_prov) från vikten (dvsmassa) av provet (m_S) och dess volym (V_S): ρ_prov = m_S /V_S[g/cm³] (figur 1).
   11. För organ som mäts i sin helhet, upprepa mätningen tre gånger och beräkna det genomsnittliga orgel densitet från enstaka mätvärden. För stora organ/vävnader, utför upprepade mätningar med olika prover från samma organ/vävnad/organ facket, och beräkna den genomsnittliga tätheten från enstaka mätningar, med detta.
   12. Beräkna den totala volymen av organ/vävnad/organ kupén från dess vikt och densitet (figur 1).
2. Cavalieri - metoden för bestämning av svin orgel volymer ⁷
   1. Förbereda material: linjal, bromsok, kniv, sax, pincett, vattenfast penna, plast Oh, skanner, foto kamera och cross galler tryckt på plast OH-film.
   2. Placera hela organ/vävnad på en slät yta (skärande bas) och mäta längden (l) av orgeln längs dess längdaxel (figur 3B, figur 5A).
   3. Skär den kompletta organ/vävnaden i ekvidistanta parallella skivor ortogonala med längsgående orgel-axeln (figur 3 c, figur 5B). Välja en avståndet d mellan två sektioner (dvs, snittning intervall/snittjocklek, oftast ca 1 cm) som är tillräckligt liten för att motta ett tillräckligt antal vävnad/organ plattor. Slumpmässigt placera det första avsnittet inom ett avstånd mellan 0 och snittning intervallet från marginalen av orgeln. Samtidigt skivning, visuellt bedöma position och orientering av varje avsnittsplan, att få ungefär parallella organ/vävnad plattor av ungefär enhetlig tjocklek.
      Obs: Det nödvändiga antalet vävnad/organ plattor beror på formen och storleken på de undersökta organ/vävnaden. Om lilla organ eller prover måste vara sektioneras i tunna plattor av ≤5 mm, bädda in proverna i agar före snittning (se punkt 1.3.3.) och använder en teknisk anordning för skivning av agar-embedded provet. Empiriskt recommendable snittningen intervall för mest svin organ och vävnader, samt exempel för skivning enheter, anges i det kompletterande materialet ”vävnad provtagning guider för svin biomedicinska modeller”⁷.
   4. Placera alla organ/vävnad plattor på samma yta nedåt på skärande basen (dvskonsekvent på antingen höger eller vänster avsnittsplan varje orgel slab, figur 3D, figur 5 c) och räkna plattor (n).
   5. Hämta avsnitt profiler av vävnad plattor genom en av följande metoder:
      1. Noggrant placera vävnad plattor på lämpligt märkta plast Oh, samtidigt som inriktningen på deras övre och nedre snittytorna. Spåra konturerna av vävnad plattor på OH-plast med en vattenfast penna (figur 3E1-2).
      2. Ta fotografiska bilder av vävnad plattor, hålla kameran vertikalt över en snittytorna (figur 3F). För kalibrering, placera en storlek linjal bredvid vävnad plattor.
      3. Skanna vävnad plattor på en flatbäddsskanner bibehållen orientering på deras övre och nedre snittytorna (figur 3 g). För kalibrering, placera en storlek linjal bredvid vävnad plattor.
   6. Mäta områdena av (spårade, fotograferade eller skannade) avsnitt profiler av alla vävnad plattor av en av följande metoder:
      1. Overlay eller Superponera spårade orgel platta profiler med en lämplig storlek, kalibrerad rutnät av jämnt fördelade korsar tryckt på en plast öppenhet och räkna alla korsar att slå området profil (figur 3E3-4; jämför med Figur 5 d). Beräkna området avsnittet profil av varje orgel platta genom att multiplicera antalet korsningar att slå området profil av den areal som motsvarar en cross.
         Obs: För att få tillräckligt exakt volym uppskattningar, välja ett kors rutnät med ett tillräckligt litet avstånd mellan intilliggande korsningar, så att ett genomsnitt på minst 100 korsar kommer hit avsnitt ytbehandlar av plattor av ett organ i samtliga undersökta fall av studien . Empiriskt recommendable cross rutnät storlekar för mest svin organ och vävnader anges i det kompletterande materialet ”vävnad provtagning guider för svin biomedicinska modeller”⁷.
      2. Mäta områden av vävnad plattor i digitala bilder av foton/skanningar med lämpligt kommersiellt tillgängliga eller freeware morfometri mjuk- och hårdvara applikationer (figur 3 H), såsom en kommersiell bild analys system²¹, eller ImageJ²².
         FÖRSIKTIGHET: Obs att en vävnad betongplattor (antingen först eller sista) placeras på skannern vilar på sin naturliga yta, respektive, vetter mot kameran med sin naturliga yta. Därför den skannade bilden, bilden av denna platta i, kommer inte att visa en avsnitt yta. Därför mäts ingen sektionsprofil område i skannade bild/foto bilden av denna vävnad platta (figur 3I). Också notera alltför projektion närvarande i skannade bilder och fotografier av organ/vävnad plattor, dvs, bara mäta områdena av faktiska avsnitt profiler, men inte i vävnaden i bilden ligga bakom platta avsnitt ytan (figur 12 G-H).
   7. Beräkna volymen Beräknad orgel som produkten av summan av alla motsvarande avsnitt profilområden av alla vävnad plattor per fall (dvskonsekvent av antingen höger eller vänster, respektive, övre eller nedre avsnittet ytan av varje organ slab och den genomsnittliga tjockleken av plattor (dvs, kvoten av uppmätta längden på den vertikala orgel axeln (l) och antalet plattor)¹⁵.
3. Fastställande av omfattningen av tredimensionella inbäddning-relaterade vävnad krympning under bearbetningen av vävnadsprover för histologi
   1. Förbereda material: mikrotomen blad, pincett, agar, metall gjutning formar, digital scanner och storlek linjal (t.ex., rutat papper).
   2. Skär en färsk, planet avsnitt yta från ett fast vävnadsprov.
      Obs: Om du använder prover av enkelt deformerbara () mjukdelar (fettvävnad, geléartad vävnader), bädda in den fasta vävnadsprov i agar före snittning (figur 4A).
   3. Bädda in provet i agar:
      1. Blanda standard agar pulver som används för mikrobiologi odlingsmedium med en lämplig volym av vatten (cirka 0,5 – 1 g agar/10 mL vatten) i en glasbägare. Rör blandningen och värm i mikrovågsugn på 700 W till kokpunkten för 3 – 5 s. rör blandningen och koka upp igen för 3 – 5 s.
      2. Alternativt, för att öka kontrasten av agar till vävnadsprov, färga den flytande agar, t.ex., med svart bläck (tillsätt 1 mL bläck till 10 mL varm flytande agar och rör kraftigt).
      3. Häll den heta agar i en gjutning form (t.ex., en metall mögel används för paraffin inbäddning, figur 10A-D) och dränka den fasta vävnadsprov i den varma agar. Låt ägarn svalna tills stelning, ta bort mögel och skära blocket agar med inbäddade vävnaden med en mikrotomen eller rakblad.
         FÖRSIKTIGHET: Vid hantering av varma flytande agar, bära skyddsglasögon och handskar. Processen vävnadsprover fast i formaldehydlösning under ett avgassystem huva och Använd skyddsglasögon och skyddshandskar laboratorium.
   4. Lägg provet med dess avsnitt ytan nedåt på en flatbäddsskanner, tillsammans med en storlek linjal och skanna avsnitt ytan (figur 4AB).
   5. Bestäm arean för avsnitt ytan på den fasta vävnadsprov (en_f) i digital scan, använda en av de tekniker som beskrivs i steg 1.2.6 (figur 4B).
   6. Bädda in provet i plast inbäddning medium, till exempel epoxi (t.ex., Epon) eller glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/MMA)²³, följande standardprotokoll^23,24,25 ) Figur 4 c). Säkerställa att avsnitt ytan av fasta provet skannas i föregående steg (1.3.4) upprätthålls i plast-embedded provet.
      Obs: För att bibehålla orienteringen av provet avsnittet yta under bearbetningen av provet, konsekvent placera provet med dess avsedda avsnitt ytan vänd nedåt i inbäddning kassett eller gjutning mögel eller markera avsnittet avsedda ytan (eller motsatt sida av provet) med bläck.
   7. Skär en histologisk avsnitt från den plast block som motsvarar den ursprungliga avsnitt ytan av den fasta vävnadsprov (steg 1.3.2) använda en mikrotom (figur 4 d), montera avsnittet på en glasskiva (figur 4 d) och färga det rutinmässigt) t.ex., Hematoxylin och eosin fläcken, H & E)^24,25.
      FÖRSIKTIGHET: För att få en histologisk avsnitt ungefär i samma plan som den ursprungliga avsnitt ytan av den fasta vävnadsprov, noggrant justera positionen för plast blocket i monteringen av mikrotomen innan snittning.
   8. Placera bilden med den färgade delen nedåt på en flatbäddsskanner tillsammans med en storlek linjal och skanna avsnittet (figur 4E).
   9. Bestäm arean för avsnittet i den plast-embedded vävnadsprov (A_e) i digital scan, använda en av de tekniker som beskrivs i steg 1.2.6 (figur 4F).
   10. Beräkna den genomsnittliga inbäddning-relaterade vävnad krympningen (för respektive vävnad och inbäddning medium) från uppmätta områden i motsvarande avsnitt profiler av vävnadsprover före och efter inbäddning i plast inbäddning medium. Linjär krympning faktor f_s beräknas som kvadratroten av kvoten av områdena i avsnittet profiler av n vävnadsprover efter inbäddning i plast inbäddning medium (en_e) och områden i den motsvarande avsnitt profiler av samma vävnadsproverna innan inbäddning i plast inbäddning medium (en_f), (figur 4 g)¹⁴.

2. volymvägda systematisk slumpmässig provtagning av punkten räknar och bearbetning av vävnad delprover för olika nedströms analys-typer⁷

1. Förbereda material: linjal, bromsok, kniv, sax, pincett, vattenfast penna, punkt/cross nät tryckt på plast Oh och slumpmässiga siffertabeller.
   Obs: Kopiera mallar för cross nät (5-60 mm) finns i ”vävnad provtagning guider för svin biomedicinska modeller”⁷kompletterande Material.
2. Placera de organ/vävnaden på en slät yta (skärande bas) och mäta längden (l) av orgeln längs dess längdaxel (figur 5A, figur 6A).
3. Skär den kompletta organ/vävnaden i ekvidistanta parallella skivor ortogonala mot dess längdaxel (figur 5B). Välja en avståndet d mellan två sektioner (dvssnittningen intervall/snittjocklek, oftast ca 1 cm) som är tillräckligt små för att få ett tillräckligt antal vävnad/organ segment. Slumpmässigt placera det första avsnittet inom ett avstånd mellan 0 och snittning intervallet från marginalen av orgeln. Samtidigt skivning, visuellt bedöma position och orientering av varje avsnittsplan att få ungefär parallella organ/vävnad plattor av ungefär enhetlig tjocklek.
   Obs: Det nödvändiga antalet vävnad/organ plattor beror på storleken på de undersökta organ/vävnaden och antalet samplade vävnad platser. Om lilla organ eller prover måste vara sektioneras i tunna plattor av ≤5 mm, bädda in proverna i agar före snittning (se punkt 1.3.3.) och använda tekniska enheter för skivning av agar-embedded provet. Empiriskt recommendable snittningen intervall för mest svin organ och vävnader, samt exempel för skivning enheter anges i det kompletterande materialet ”vävnad provtagning guider för svin biomedicinska modeller”⁷.
4. Placera alla organ/vävnad plattor på samma yta nedåt på skärande basen (figur 6B).
5. Överlagring av vävnad plattor med en lämplig storlek cross grid tryckt på en plast öppenhet genom att placera den yttersta vänster övre cross i rutnätet över en slumpmässig punkt ur vävnaden (bild 5 c-D, figur 6B).
   Obs: Välj ett kors rutnät med ett tillräckligt litet avstånd mellan intilliggande korsningar, så att i varje undersökta fall av studien, minst dubbelt så många kors kommer att drabba de avsnitt 1.3.4.2.för från vävnad facket som skall provtas, som antalet prover som måste tas från denna vävnad fack. Empiriskt recommendable cross rutnät storlekar för mest svin organ och vävnader anges i det kompletterande materialet ”vävnad provtagning guider för svin biomedicinska modeller”⁷.
6. Mark och räkna alla korsar drabbar vävnaden (respektive vävnad sub facket som skall provtas). Konsekvent tillämpa ett enhetligt verkningssätt räknar och numreringen av de kors som drabbar den vävnad facket som skall provtas i alla vävnad plattor, t.ex., av löpande numrering av de respektiva kors i varje rad för rad, från vänster till höger och från topp till botten, eller, t.ex., av numreringen korsen i en vävnad platta efter en annan i medurs riktning, börjar med korset närmast till klockan tolv position, vilket exemplarily visas i figur 5E.
7. Dividera antalet korsar slår vävnad/vävnad facket för att vara samplade (n) av antalet prov som ska genereras för att få systematisk sampling intervallet (i).
8. Bestämma första provtagning placering genom att välja ett slumpmässigt tal x i intervallet mellan 1 och jag. Till detta Använd slumptal bord. Markera den första provtagning-positionen (x) och varje nästa x + i, x + 2jag, x + 3i, etc., korsa drabbar den vävnad/vävnad facket som skall provtas om plast insyn använda en vattenfast penna (figur 5F).
   Obs: Random siffertabeller kan bekvämt och snabbt genereras med en online slumpgenerator.
9. Tagga vävnaden platser som motsvarar den markerade korsar genom att något öka plast insynen och placera en liten papperslapp ren, Tom konfetti på ytan av vävnad plattan med hjälp av ett par pincett (figur 5 g, figur 6E ).
10. Punktskatt exemplar av vävnad från samplade platser (figur 5 H, figur 6F, figur 7A) och dela upp dem för olika typer av efterföljande analyser (figur 6 g, figur 7A-B) som anges i ytterligare Tabell 1.
11. Efter provtagningen, ren plast Oh med varmt vatten och tvål, torr, och återanvända dem.

3. generation av isotropiskt enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt och vertikala enhetliga slumpmässiga (VUR) avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser

1. ”Isector” teknik
   1. Förbereda material: rakhyvel eller mikrotomen blad, agar, sfäriska gjutning formar (t.ex., gjutning formar för praliner, som kan erhållas från konditorn leverantörer), foldback klämmor och pincett.
   2. Placera en adekvat storlek bit (1 x 1 x 1 cm³) fast, systematiskt slumpmässigt provtas vävnad i en sfärisk gjutning mögel, hålla ihop av foldback klämmor och Fyll formen med varm flytande agar (figur 8A-E).
   3. Ta bort området agar (figur 8F) från gjutning mögel efter solidificationen av agar.
   4. Rulla den agar sfären med den inbäddade vävnadsprov över bordet, stoppa, och avsnitt det på en slumpmässig position.
      Obs: Det resulterande avsnittsplanet är ett IUR avsnitt (figur 8F-G).
   5. Gå vidare till bädda in vävnadsprov i plast harts till exempel GMA/MMA, bibehålla orienteringen av avsnittet IUR plan (se 1.3.5).
2. ”Orientator” teknik
   1. Förbereda material: rakhyvel eller mikrotomen blad, agar, pincett, slumpmässiga nummer tabeller, utskrifter av likvinkliga och cosinus-viktade cirklar.
      Obs: Kopiera mallar av cirklar finns i tidigare publikationer^8,26.
   2. Placera provet fast vävnad (eller agar-embedded fast vävnad) på en utskrift av en likvinkliga cirkel med en kant parallellt med de 0 – 180 ° riktning (figur 9A, figur 10E).
   3. Fastställa en slumpmässig vinkel med hjälp av slumpmässiga nummer tabellen. Hitta motsvarande märken på omfattningen av likvinkliga cirkeln, som provet vilar på. Använder dessa märken, skära ett avsnitt genom provet (eller genom den agar som omger den inbäddade vävnadsprov), med avsnittsplanet att vara orienterade parallell till riktningen av slumpmässiga vinkeln anges på skalan av likvinkliga cirkeln, och vertikalt till den Vila ytan av provet (figur 9B-C, figur 10F).
   4. Placera blocket vävnad med avsnitt ytan genereras i föregående steg inför nackdelen på cosinus-viktade cirkel med kanten av vilande ytan placeras parallellt med 1-1 riktning (figur 9 d, figur 10 H).
   5. Upprepa steg 3.2.3 och skär en ny sektion genom provet i slumpmässiga vinkel bestäms med hjälp av slumpmässiga nummer tabellen (figur 9E-F, räkna 10I-J).
      Obs: Det resulterande avsnittsplanet är ett IUR avsnitt.
   6. I förekommande fall, Bestäm arean för IUR avsnitt profilen för den fasta vävnadsprov för bestämning av inbäddning-relaterade vävnad krympning (figur 9G-J) som beskrivs i steg 1.3, och fortsätt att bädda in vävnadsprov i plast harts som GMA/MMA.
3. Generation av vertikala enhetliga slumpmässiga (VUR) sektioner
   1. Förbereda material: rakhyvel eller mikrotomen blad, agar, pincett, slumpmässiga nummer tabeller och utskrifter av likvinkliga cirklar.
      Obs: Kopiera mallar av cirklar finns i tidigare publikationer^8,26.
   2. Definiera en lodrät axel inom den fasta vävnadsprov som alltid igenkännligt i prov/avsnitt under de efterföljande stegen.
      Obs: Vanligtvis axeln vertikalt till naturliga ytan av vävnadsprov har valts som den lodräta axeln.
   3. I förekommande fall, bädda in provet i agar (Fig. 11B).
      Obs: Agar-inbäddning före VUR - eller IUR-snittning av fast provet rekommenderas generellt för små, tunna, sköra eller mjuk prover. Också använda agar-inbäddning av prover för att underlätta placeringen av VUR sektionerad provet under den efterföljande inbäddning av provet i plast harts medium.
   4. Placera provet på en utskrift av en likvinkliga cirkel, med den vertikala axeln vinkelrätt att vara orienterade mot planet i tabellen tabell/papper (figur 11C).
   5. Skär provet i slumpmässiga vinkel (bestäms med hjälp av en slumpmässig nummertabellen) med avsnittsplanet ortogonalt till tabellen och parallellt med den vertikala axeln att ta emot en VUR avsnittsplan (figur 11D).
   6. I förekommande fall, Bestäm arean för IUR avsnitt profilen för den fasta vävnadsprov för bestämning av inbäddning-relaterade vävnad krympning som beskrivs i steg 1.3 (jämför med figur 9G-J) och fortsätt till bädda in vävnadsprov i plast harts till exempel GMA/MMA.

Representative Results

Nedsänkning teknik för bestämning av vävnad/organ densitet

Figur 12A -B visar representativa bestämning av densiteten och volymen av en svin njure med nedsänkning tekniken som beskrivs i steg 1,1 (figur 1, figur 2). Mer representativa resultat densitet mätningar av ytterligare svin organ och vävnader presenteras i tabell 2. En mer omfattande lista över referens tätheter av olika svin vävnader och organ visas i ”vävnad provtagning guider för svin biomedicinska modeller”⁷. Giltigheten av vävnad densitet mätvärden erhålls med nedsänkning metoden uppskattas genom upprepade mätningar av samma prov och av oberoende exemplar. Mest svin vävnader Visa värden för densitet något högre än vatten (ρ_vatten ≈ 1.0), medan vävnader simning i saltlösning (fettvävnad, lungvävnad) Visa tätheter < 1.0.

Cavalieri metod för bestämning av orgel volymer

Figur 12 c -F visar representativa bestämning av volymen av svin njure (samma organ som visas i figur 12A-B). Områdena av avsnitt ytor orgel plattor bestämdes av punkt-räkna, använder överlagrade cross nät tryckt på en plast öppenhet samt planimetriskt mätning av avsnitt områden orgel plattor i en skannad bild av plattor (betala uppmärksamhet på alltför projektion av vävnad som ligger bakom plattor avsnitt ytorna, figur 12 G-H). Riktigheten av organ/vävnad volym data som erhållits genom utförandet av metoden Cavalieri (steg 1.2, figur 3) kan uppskattas genom jämförelse till respektive volym beräknas från vikt och densitet av organ/vävnad. Volymerna av njuren undersökas i figur 12 bestäms av nedsänkning metoden och metoder som Cavalieri skiljde sig med mindre än 1% från varandra. Som ett mått på noggrannheten i Cavalieri volym uppskattningarna, kan dess koefficient av fel (CE) beräknas som beskrivs tidigare¹⁵.

Bestämning av tredimensionella inbäddning-relaterade vävnad krympning under bearbetningen av vävnadsprover för histologi

Representativa resultat av omfattningen av vävnad krympning relaterade till inbäddning av svin vävnadsprover (kortikal nedsatt vävnad) i plast hartser (GMA/MMA eller epoxi) för kvantitativ histomorphological granskning visas i tabell 2 (tidigare opublicerade data). Linjär krympning faktorer anges i tabell 2 bestämdes enligt steg 1.3 (figur 4). De hänvisar till en tredimensionell volym minskning med 29% för inbäddning av GMA/MMA, och 22% för epoxi inbäddning av svin kortikala nedsatt vävnad. Figur 13 visar representativa exempel på adekvat och otillräckligt förberedda prover av agar-embedded, formalin-fasta fettvävnad för mätning av provet avsnittet yta före plast-inbäddning.

Volymvägda systematisk slumpmässig provtagning av punkt Counting och bearbetning av vävnad delprover för olika efterföljande analys

Den ”snittning och punkt-counting” tekniken för volymvägda systematisk slumpmässig provtagning av parenkymal organ (steg 2, figur 5, figur 6, figur 7) representerar en etablerad, robust metod för generering av representant prover för flera efterföljande typer av analyser^2,7. Representativa resultat av generation av systematiskt slumpmässigt samplade, mycket redundant biobank exemplar av olika svin organ och vävnader, med efterföljande differentiell behandling av exciderad vävnadsproverna för flera olika nedströms analysmetoder med provtagning tekniken som beskrivs i steg 2 (figur 5, figur 7och exemplarily visas i figur 6) har tidigare varit publicerade². För generationen av biobanksprov av levervävnad i en tidigare svin biobank studie², exempelvis svin lever var helt sektioneras in cirka 20 plattor av 2-3 cm tjocklek, ovanpå med en med en 3 cm cross rutnät, som beskrivs i steg 2 och 16 vävnad platser av ca 2 x 2 x 2 cm³ var systematiskt slumpmässigt provtas och censurerade i varje fall. Från varje exciderad prov, fem delprover genererades därefter för molekylära analyser (fryst vid-80 ° C) av samplade platser, ett delprov för cryohistology, ett delprov fastställdes i Methacarn lösning, och en i formaldehydlösning för efterföljande paraffin inbäddning och histologiska- och immunhistokemisk undersökning. Generering av de 74 olika proverna per fall (tills frysning eller överföring av proverna till fixering lösning) uppnåddes inom cirka 20 min, på genomsnitt². Genomförbarhet/framgång beskrivs provtagning och delsampling tillvägagångssätt kan uppskattas genom bedömning av kvaliteten på de genererade proverna (dvs, kvalitet av RNA- eller protein isolat, bevarandet av histomorphological och ultrastrukturella egenskaper av vävnadsprover, deras lämplighet för immunohistological analyser, etc.)²

Generation av isotropiskt enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt och vertikala enhetliga slumpmässiga (VUR) avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser

Teknikerna som visats för en framåt-orienterade generation av isotropiskt enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt och VUR avsnitt från svin (biobank) vävnadsprover (protokoll steg 3, figur 8, bild 9, figur 10, figur 11), vilket möjliggör undersökning av de flesta kvantitativa beteendetester parametrar, kan snabbt åstadkommas med lite övning och utan rimliga svårigheter eller felkällor. Generering av IUR-prover visas i figur 9 (isector technique) och figur 10 (orientator teknik) är därför helt representativa för dessa metoder.

Figur 1: Schematisk illustration av ”nedsänkning tekniken” för bestämning av vävnad/organ tätheter. (A) mätning av provets vikt (dvsmassan, m_S). (B) skala tarerats vikten av en bägare fylld med 0,9% koksaltlösning på 20 ° C och en provhållare nedsänkt i saltlösning till en definierad, märkt position. (C) fullständig nedsänkning av provet till den markerade punkten av provhållaren utan kontakt med innerväggar eller botten av bägaren. Vikten visas på balance är vikten av volymen av saltlösning som fördrivits av provet). Tätheten av provet beräknas enligt (här: ρ_prov = m_S/V_S = m_S/ (m_L/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 g/cm³_). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: ”nedsänkning technique” för bestämning av vävnad/organ tätheter. (A) olika prov innehavare tillverkad av tunn tråd. Från vänster till höger: en slinga av tunn wire tråd genom en tunn injektion kanyl, spiralformade korg tråd att hålla små och ömtåliga exemplar och en enkel sele av tunn tråd. Pilarna i A-C anger positioner som innehavarna av provet är nedsänkt i saltlösning. (B, C) Positionering av provhållaren under nedsänkning av provet i saltlösning (jämför figur 1 C). (B) komplett svin hypofysen placeras i en korg-formade provhållaren. (C) prov av svin hjärtmuskeln. Observera att fullständig nedsänkning av proverna i saltlösning utan att kontakta väggarna eller botten av bägaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Schematisk illustration av tillämpningen av Cavalieri metoden för bestämning av svin orgel volymer. (A) mynt stack exempel för förståelsen av principen Cavalieri. Se Introduktion för detaljer. (B-H) Schematiska demonstration av volym uppskattning av en perfusion-fasta njure. (B) mätning av längd (l) i njuren längs sin längsgående axel. (C) skära av komplett orgeln i n lika tjock (d) parallella skivor ortogonal mot den längsgående orgel axeln. (D) orgel plattor placeras på samma ytan nedåt. Observera att den första (högra) vävnad plattan placeras på sin naturliga yta, dvs, har inte ett avsnitt yta. (E-H) Olika metoder att bestämma avsnittet surface områden av vävnad plattor. (E) spåra konturerna av varje orgel platta med en vattenfast penna på ett plast öppenhet överlägg av disponerad orgel platta profiler med en lämplig storlek, kalibrerad cross rutnät tryckt på en plast öppenhet, räkna av korsar att slå den profil-området. Området orgel platta avsnittet profil beräknas utifrån antalet korsningar att slå området avsnitt profil och den areal som motsvarar en cross. (F,G) Bestämning av avsnitt områden av orgeln plattor i fotobilder tagna i lodrät orientering till avsnitt ytor (F) eller skannade bilder av vävnad plattor (G), med linjaler för kalibrering. (H) bestämning av vävnad plattor i digitala bilder av foton/skanningar med hjälp av lämpliga morfometri program avsnittet områden. (jag) beräkning av den uppskatta mängden orgeln som produkten av den kumulativa område av alla organ plattor multiplicerat med orgeln genomsnittlig tjocklek motsvarande avsnitt ytor plattor¹⁵. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Schematisk illustration av bestämning av tredimensionella inbäddning-relaterade vävnad krympning under bearbetningen av vävnadsprover för histologi. (A) att skära en fräsch, planet avsnitt yta från ett fast vävnadsprov (stabilisering av lätt deformerbara (mjuk) vävnader såsom adipose eller lunga vävnad genom att bädda in i agar före snittning form). Skanning av avsnitt ytan av provet tillsammans med en storlek linjal. (B) planimetriskt fastställandet av arealen av den fasta vävnadsprov (en_f) avsnitt yta. (C) rutin inbäddning av provet i plast inbäddning medium. (D) förberedelse av en histologisk plast blocket med bevarandet av avsnittsplanet av provet. Montering av avsnittet på en glasskiva och rutinmässiga färgning av bilden. (E) skanning av bilden med en storlek linjal. (F) planimetriskt bestämning av området av avsnittet i plast-embedded provet (A_e). (G) beräkning av omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning som kvoten av de uppmätta områdena av motsvarande avsnitt profiler av vävnadsprover före och efter inbäddning i plast inbäddning medium¹⁴. Bilderna till höger visar avsnitt ytan av ett formaldehyd-fasta prov av fettvävnad inbäddade i bläck-sotad agar innan inbäddning i plast harts (överst) och den motsvarande avsnitt profilen (han-färgning) av GMA/MMA-embedded provet (nederst). Skala barer = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 5: Schematisk illustration av volymvägda systematisk slumpmässig provtagning. Presenterade exemplet visar systematisk slumpmässig provtagning sex vävnad platser inom nedsatt cortex av en perfusion-fasta njure. (A) mätning av längd (l) i njuren längs sin längsgående axel. (B) komplett snittning av hela orgeln i lika tjock (d) parallella skivor ortogonal mot den längsgående orgel axeln. (C) Organ/vävnad plattor placeras på samma (dvs.antingen höger eller vänster) ytan nedåt. (D) överlagring av vävnad plattor med en lämplig storlek cross grid tryckt på en plast öppenhet. Den yttersta vänster övre cross i rutnätet är placerad över en slumpmässig punkt utanför vävnaden (indikeras av en blå prick, •). (E) räkna och numrering av alla korsar slår nedsatt cortex. I det aktuella exemplet är korsen slår nedsatt cortex Smådelarna numrerade i en njure platta efter en annan (från vänster till höger), i varje platta fortsätter medurs, börjar med korset närmast positionen klockan tolv. Här, hit 36 korsar nedsatt cortex. Det är sex provtagning ståndpunkter som skall provtas. Därför, varje sjätte position där ett kors träffar vävnaden samplas (36/6 = 6). (F) i det aktuella exemplet, positionen för fjärde cross (N ° 4) slå nedsatt cortex är slumpmässigt valt som första provtagning position. Varje följande cross sjätte slår nedsatt cortex markeras om plast insyn med en vattenfast penna. I det aktuella exemplet är positionerna 4, 10, 16, 22, 28 och 34. (G) märkning av motsvarande vävnad platser av små bitar av ren, Tom konfetti papper placeras på ytan av vävnaden. (H) Excision av vävnadsprover från slumpmässigt systematiskt urvalet platser och efterföljande bearbetning för ytterligare analyser. Denna siffra har ändrats från Albl et al. (2016), siffrorna S236 och S237, sidan 186 (kosttillskott)⁷. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: volymvägda systematisk slumpmässig provtagning av nedsatt cortex av en svin njure (se figur 5) och regler för punkt-counting. (A) färskt gris njure. (B) njure sektioneras i lika tjocka parallella skivor ortogonal mot den längsgående orgel axeln, överdras med cross rutnät tryckt på en plast öppenhet. Den röda cirkeln anger positionen för den slumpmässiga punkt används för att slumpmässigt placera av rutnätet cross. (C) Illustration av punkt-räkna regler: en cross/point räknas som slår vävnad facket ska provtas (referens fack), om den högra övre inre hörnet av vertikal och horisontell bar korset (pil) omfattar vävnaden. (D) märkning av korsar att slå i nedsatt cortex och systematisk slumpmässig provtagning av vävnad platser (här, 119 korsar hit nedsatt cortex och 17 platser provtas systematiskt slumpmässigt använder en provtagning intervall jag = 7). (E) provtas slumpmässigt systematiskt platser av nedsatt cortex märkta av konfetti papper. (F) censurerade prover. (G) ytterligare underindelning av exciderad prover för efterföljande bearbetning av delproverna för olika nedströms Analystyper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: indelning av vävnadsprover censurerade från systematiskt slumpmässigt samplade vävnad platser och bearbetning av delproverna för olika nedströms Analystyper. (A) Schematisk illustration av generation av vävnad delproverna från en systematiskt slumpmässigt samplade plats av nedsatt cortex (native vävnad) för olika analyser (t.ex., FF-PE: Formalin-fast, paraffin-inbäddat urval och MTC-PE: Methacarn-fast, paraffin-inbäddat urval för ljus-mikroskopiska histologi; CRYO: Prov för frusna delen histologi; -80 ° C: torr-is fryst vävnadsprover för molekylär analys). (B) Excision av systematiskt slumpmässigt utvalda platser av nedsatt cortex av en perfusion-fasta njure, ytterligare underindelning av exciderad vävnadsproverna och bearbetning av delproverna för kvalitativa och kvantitativa morfologiska analyser. Plattor av perfusion-fasta svin njure (1), cross-grid (2), slumpmässiga nummertabellen (3), likvinkliga och cosinus-vägde cirklar (4) för generering av IUR sektioner (se figur 9, Bild 10), olika fixering lösningar (5, 6, 7) och prov behållare för elektron mikroskopisk prover (8). Denna siffra har ändrats från Albl et al. (2016), figur S239, sidan 186 (kosttillskott)⁷. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: ”Isector” avsnitt förberedelse från formalin-fasta svin vävnad. (A) prov av perfusion-fasta svin nedsatt cortex. (B) sfäriska gjutning formar. (C) flytande agar. (D-E) Agar-inbäddning av prover i sfäriska gjutning formar. (F) Agar sfär med inbäddade vävnadsprov. (G) Agar sfär med inbäddade vävnad sektioneras på en slumpmässig position (IUR avsnittsplan). Denna siffra har ändrats från Albl et al. (2016), figur S6, sidan 14 (kosttillskott)⁷. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9: Schematisk illustration av ”Orientator” teknik för beredning av IUR sektioner. (A) provexemplaren av fasta vävnad placeras på en likvinkliga cirkel (ci1) med en kant parallellt med de 0 – 180 ° riktning (indikeras av en röd linje). (B) Sectioning av provet i en slumpmässig vinkel (gröna linjen). (B, C) Nyligen genererade avsnitt ytan av de vävnadsprov (anges i grön färg). (D) provet placeras på en cosinus-vägde cirkel (ci2) med sectional ytan genereras i föregående steg inför nackdelen och ena kanten av vilande ytbehandlar parallell till 1-1 riktning (indikeras av en röd linje). (E) skär av den andra delen genom provet vid en slumpmässig vinkel. (F) resulterande slumpmässigt isotropiskt avsnitt plan av provet (anges med blå färg). (G) fastställandet av arealen av den fasta vävnadsprov för uppskattning av inbäddning-relaterade vävnad krympning som beskrivs i steg 1.3 IUR. (H) inbäddning av vävnad provet i plast harts. (jag) Sectioning av plast blocket är sektionerad (parallellt med IUR) på en mikrotom. (J) montering av IUR plast-delar på glasskivor. Denna siffra har ändrats från Albl et al. (2016), figur S8, sidan 15 (kosttillskott)⁷. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10: ”Orientator” teknik för beredning av IUR sektioner av agar-embedded vävnadsprover. (A-D) Alternativt en kan agar-bädda in ett systematiskt slumpmässigt samplade exemplar av fasta vävnad (agar-inbäddning är användbart för små vävnadsprover, så att först eller båda slumpmässiga sektioner kan placeras inom ägarn utan att skära vävnaden). (E) positionering agar block på en likvinkliga cirkel (ci1) med en kant som är parallella till 1-1 riktningen (indikeras av en röd linje). (F, G) Snittning av block i en slumpmässig vinkel (här: 15-15, gröna linjen) fastställs med hjälp av en slumpmässig nummertabellen (rnt, grön pil). (H) efterföljande positionering agar block på avsnitt ytan skära i F på en cosinus-viktade cirkel (ci2) med kanten av vilande ytan placeras parallellt med 1-1 riktning (indikeras av en röd linje). (jag) andra delen skära igenom provet i en slumpmässig vinkel (här: 20-20, indikeras av en blå linje), bestäms med hjälp av en slumpmässig nummertabellen (rnt, blå pil). (J) resulterande IUR avsnitt plan av vävnadsprov. Denna siffra har ändrats från Albl et al. (2016), figur S9, sidan 16 (kosttillskott)⁷. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11: Schematisk illustration av VUR avsnittet förberedelse. (A) fast vävnadsprov med en definierad (identifierbara) vertikala axel (t.ex., vertikalt till sin naturliga yta). (B) fast vävnadsprov inbäddad i agar. (C) positionering av the(agar-embedded) vävnadsprov på en utskrift av en likvinkliga cirkel (ci1). V_A: lodräta axeln. (D) Sectioning av provet i en slumpmässig vinkel (random nummertabellen; här: 30-30 riktning, en blå linje) med avsnittsplanet att vara ortogonalt orienterade till bordet och parallellt med vertikala axeln av provet. Resulterande VUR avsnittsplan provets vävnad (anges med blå färg). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 12: representant volumetry av en svin njure. (A-B) Nedsänkning teknik. (A) fastställande av njure vikt (m_kid). (B) fastställande av vikten av mängden saltlösning som fördrivits av njure (m_displ.saline). Njuren är hängde på en sträng och helt nedsänkt i saltlösning utan att röra botten eller väggarna i bägaren. Den beräknade volymen av njure är 92,6 cm³. (C-D) Cavalieri teknik, PLANIMETRI genom punkt-räkning. (C) mätning av längd (l) i njuren längs sin längsgående axel. (D) fastställande av avsnittet profilområden njuren plattor av punkten räknar efter överlagring av ett rutnät av jämnt fördelade korsar tryckt på en plast öppenhet. Här är den beräknade volymen av njure 93,3 cm³. (E-F) Cavalieri teknik, PLANIMETRI av skannade bilder av avsnittet profilområden av njure plattor (F). Här är den beräknade volymen av njure 92,8 cm³. I C-E, naturligt rundade yta av först eller sista plattan i njuren placeras på skannern eller överlagras av arga rutnät insynen är inte en avsnitt yta och därför inga avsnitt yta mäts i denna vävnad platta. (G-H) Demonstration av overprojection i skannade bilder av organ/vävnad plattor (G) och i organ/vävnad plattor överdrog med en cross rutnät öppenhet (H). Overprojecting delar av vävnaden i orgel plattor indikeras av prickade linjer som vita och svarta. Endast områdena av faktiska avsnitt profiler (dvs, den vävnad omgiven av den delvis indikerade vita streckade linjen) bestäms. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 13: representativa illustration av adekvat (A) och suboptimala (B) beredning av agar-embedded vävnadsprover för bestämning av vävnad krympning relaterade till inbäddning av prover i histologiska plast inbäddning media. (A) scannad bild av avsnitt ytan av ett fast prov av svin subkutan fettvävnad före inbäddning i plast harts. Provet är inbäddad i bläck-sotad agar för stabilisering av formen på provet och tydlig identifiering av avsnitt ytans konturer. (B) otydligt skissera av avsnittet surface och anhållna luftbubblan (pilen) inom ägarn. Skala barer = 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Analys		Prov	Bearbetning
Typ	Metod(er)
Molekylära analyser	RNA avskrift, protein, metabolit och lipid profilering, metabolomik analys, DNA-analys	Små bitar * färska (inbyggt) vävnad	Frysa på torris eller i flytande kväve. Förvaras vid-80 ° C.
Kvalitativa morfologiska analyser	Histologi [ljusmikroskop, inkl immunhistokemi (IHC) & in situ hybridisering]	Färsk (modersmål) — eller i situ - fast * vävnadsprover	Använda olika fixativ (t.ex., 4% formaldehydlösning) och bädda in media (paraffin, GMA/MMA, epoxi), i förekommande fall.
	Cryohistology (frusna snitt, inkl IHC)	Färsk (inbyggt) vävnadsprover	Bädda in provet i blockerande medium och frysa i flytande kväve-cooled isopentan.
	Ultrastrukturella analys [elektronmikroskopi, inkl överföring-(TEM) och scanning electron microscopy]	Små bitar av färsk (modersmål) — eller i situ- fast * vävnadsprover	Fixa prov i 2,5 – 6,25% glutaraldehyd lösning och bädda in i plast epoxiharts.
Kvantitativa morfologiska analyser	Ljusmikroskopi	Färsk (modersmål)- eller i situ - fast * vävnadsprover	Förbereda IUR-sektioner (orientator-, isector-sektioner) eller VUR-sektioner av plast inbäddade vävnadsprover.
	TEM	Små bitar av färsk (modersmål) — eller i situ - fast * vävnad	Förbereda IUR (orientator-, isector-sektioner) delar av epoxi-embedded vävnadsprover.

Tabell 1: bearbetning av vävnad delprover censurerade från systematiskt slumpmässigt utvalda platser för olika nedströms analyser typer. Beroende på experimentell design av en studie och organ/vävnad under utredning, bör olika antal delprover censurerade från varje systematiskt slumpmässigt samplade vävnad plats och bearbetas för olika typer av nedströms analyser. Detaljerade protokoll för mest svin organ/vävnader och studie typer finns i ”vävnad provtagning guider för svin biomedicinska modeller”⁷. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate. IUR: Isotropiskt uniform slumpmässiga. VUR: Vertikala uniform slumpmässiga. * max. 2 x 2 x 2 mm³. t experfusion fast vävnad eller pulmonell vävnad i lungorna ingjutit med fixering lösning.

Metoden	Representativa resultat
Nedsänkning teknik för bestämning av vävnad/organ tätheter (steg 1.1, figur 1, figur 2)	Svin organ/vävnad		Ρ (g/cm³)
	Lever		1.071 ± 0.007
	Bukspottkörteln		1.062 ± 0,016
	Ventrikeln hjärtmuskeln		1.036 ± 0,014
	Njure		1.044 ± 0,006
	Buken visceral fettvävnad *		0.921 ± 0,032
	Sköldkörteln		1,061 ± 0.007
	Hjärnan		1.051 ± 0.007
	Binjuren		1,063 ± 0,025
	Skeletal muscle **		1.074 ± 0,003
	Data är medel ± SD. organ/vävnad vikterna bestämdes i n = 18 grisar (14 kvinnliga och 4 galtar; ålder 60 dagar till 2 år; kroppsvikt 30 – 250 kg). * Fettvävnad från jejunal krös. ** Medelvärden för de M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. tricepsbrachii och M. gluteobiceps.
Bestämning av tredimensionella inbäddning-relaterade vävnad krympning under bearbetningen av vävnadsprover för histologi (steg 1.3, figur 4)	Organ/vävnad	Bädda in medium	fS
	Nedsatt cortex (gris)	GMA/MMA	0.89 ± 0,02
		Epoxi	0.92 ± 0,02
	Uppgifterna är medel ± SD mätningar av 24 prov 12 grisar. fS: Linjär krympning korrigeringsfaktor.

Tabell 2: Representativa resultat av tätheter av valda svin organ och vävnader⁷och Linjär krympning korrektionsfaktorer för inbäddning-relaterade vävnad krympning av svin kortikala njure vävnad i olika plast bädda in media.

Discussion

Generering av biobank provkollektioner från svin djurmodeller kräver robusta tekniker och protokoll för bestämning av organ/vävnad volymer, reproducerbara generering av representant, redundanta vävnadsprover som är lämplig för ett brett spektrum av olika analysmetoder, och för randomisering av orienteringen av provet avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser. De metoder som beskrivs i denna artikel är anpassade efter storleken på svin organ och vävnader, och har utvecklats för att effektivt möta dessa krav^2,7. De är baserade på väl erkända metodologiska principer och har tidigare visat sin genomförbarhet i olika publicerade studier^2,7,12,21. De utvalda metoderna är viktiga för olika typer av studier som undersöker vävnad-och/eller organprov, eftersom de ger en grund för generering av representativa prover och för förvärv av en mängd parametrar som annars inte kunde fastställas. Dessa metoder kan snabbt utföras med liten ansträngning och är kompatibla med praktiskt taget alla typer av nedströms analyser. Därför de anses lämpliga inte bara för svin djurmodell biobank projekt, men är också användbar i studier med kvantitativ histomorphological analyser av vävnadsprover andra stora djurmodell arter (t.ex., får), som samt i veterinärmedicinska studier. Hänsyn till de tekniska aspekterna av de olika metoderna, måste några kritiska moment och begränsningar anses under genomförandet av protokollen av respektive teknik.

Nedsänkning teknik för bestämning av vävnad/organ densitet

Under fastställandet av vävnad densiteter med nedsänkning metoden (steg 1.1, figur 1, figur 2), vård måste inte man röra innerväggar eller botten av bägaren med vävnadsprov eller provhållaren medan vävnaden är prov nedsänkt i saltlösning. Annars visas skalan i stället vikten av provet för vikten av mängden saltlösning som fördrivits av provet. För mycket liten/lätt vävnadsprover (några mg) är nedsänkning metoden för bestämning av vävnad densitet begränsad, på grund av surface tension saltlösning och negativt hög kvoten av provvolymen till nedsänkning vätskevolym i bägaren, som är hindrar noggrannheten i mätningen. Här, kan vikten av provet användas för ytterligare beräkningar istället för densitet-beräknas volymen. Bestämning av vävnad densiteter genom nedsänkning är också inte effektivt för färska (ofixerade) lungvävnad, på grund av luft i vävnaden, och i vissa fall, där organ är experimentellt perfusion/ingjutit med fixativ inkonsekvent.

Cavalieri metod för bestämning av orgel volymer

Metoden i Cavalieri volumetry av svin organ och vävnader är mer besvärligt jämfört med bestämning av volymen orgel från orgel vikt och densitet. Det passar dock av organ som inte korrekt vägas på grund av deras experimentella bearbetning (t.ex., perfusion-fast organ eller lungorna ingjutit med fixering lösning). Här, kan metoden Cavalieri volumetry idealiskt kombineras med den volymviktade systematisk slumpmässig provtagningsteknik som beskrivs i steg 2 (figur 5, figur 6, figur 12). Vid uppskattning av organ/vävnad volymer från områden i avsnittet profiler av parallella, ekvidistanta skivor av organ/vävnad (Cavalieri strategi, steg 1.2, figur 3) plattor underhåll av orienteringen av vävnaden (övre och nedre avsnittsplan ), samt noggrann bestämning av området i alla avsnitt profiler är av stor betydelse. Särskilt om digitala bilder eller skanningar av orgel plattor analyseras planimetrically, måste overprojections av vävnaden (utanför sektionerad vävnad planet) i vävnad plattan (figur 12G-H) noga anses ge tillförlitliga volym uppskattningar.

Bestämning av tredimensionella inbäddning-relaterade vävnad krympning under bearbetningen av vävnadsprover för histologi

Omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning beror på inbäddning mediet och typ av vävnader, och kan också variera mellan differentially bearbetade prover av samma vävnad.

Bör frusna snitt anses Visa praktiskt taget ingen krympning i X-Y-planet, och plast inbäddning allmänhet orsakar liten krympning av vävnad, är inbäddning-relaterade vävnad krympning särskilt omfattande i paraffin-inbäddat vävnadsprover , och kommer vanligtvis avsevärt försämra kvantitativa morfologiska analyser av dimensionell parametrar i histologiska sektioner av dessa prover. Förutom den stora graden av övergripande tredimensionella krympning orsakar paraffin-inbäddning också en icke-uniform, differential, Anisotrop och variabel krympning av provet och olika anatomiska strukturer, vävnadstyper och celltyper inom den vävnad prov^8,13. Dessutom särskilt i tjockare histologiska sektioner av paraffin-inbäddat vävnadsprover, omfattningen av vävnad krympning kan också avsevärt skilja sig i X-Y och Z-riktningen av avsnittet. Detta kan bero på en differentiell krympning av området avsnitt (i X-Y-riktning) och avsnitt höjden (dvs, den vertikala snittjockleken) under stretching av avsnittet i det varma vävnad flotation vattenbadet efter avsnittet skärs från vävnaden blockera och under efterföljande bearbetning, färgning och täckglasapplicering förfarandena i avsnittet monterad på en glas slide (dvs, en homogen kollaps av avsnitten z-axeln)⁸. Dessutom i tjocka sektioner, det kan finnas en comparably starkare kompression av Regionkommittén avsnitt-plan-nära vävnad inom sektionen medan avsnittet skärs från blocket vävnad (som leder till en differentiell deformering av avsnitten z-axeln)¹⁹ . Dessa effekter kan då också snedvrida uppskattningarna av antalet vävnad strukturer inom sektionen av olika kvantitativa beteendetester analysmetoder, såsom den optiska disector. Därför, prediktion, övervakning och korrigering av inbäddning-relaterade vävnad krympning är inte genomförbart för paraffin-inbäddat vävnad prover⁸.

Omfattningen av volym krympning av vävnadsprover inbäddade i plast hartser, såsom GMA/MMA eller epoxi, är däremot betydligt lägre och, ännu viktigare, mer enhetligt. Därför inbäddning i plast harts med en förmodad homogen, isotrop och globala krympning av vävnad är fördelaktigt för flera analysmetoder av olika kvantitativa morfologiska parametrar^17,18. Vid uppskattning av vävnad krympning relaterade till inbäddning i plast harts, bör formen av fasta vävnad inte dessutom snedvrids under förfarandet inbäddning, för att möjliggöra jämförelse av motsvarande avsnitt profilområden av de fasta och inbäddade prover. Detta kan vara svårt i mjuka eller enkelt komprimerbar vävnadsprover såsom adipose eller lunga vävnad eller i vävnadsprover med ett högt flytande innehåll. Här, inbäddning av fast provet i agar före snittning av vävnad är bra att stabilisera formen på vävnadsprov under efterföljande plast inbäddning förfarande (protokoll steg 1.3., figur 4). För att uppnå tillförlitliga uppgifter, bör upprepade mätningar av inbäddning-relaterade vävnad krympning utföras med olika prover av samma vävnad. Omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning uttrycks som den linjära vävnad krympning faktor f_s (protokoll steg 1.3.9., figur 4 g). Exempel för ekvationer med f_s för krympning korrigering av olika längd, yta och volym parametrar för olika vävnad strukturer finns i flera kvantitativa beteendetester studier^{14, 21,27}.

Volymvägda systematisk slumpmässig provtagning av punkten räknar och bearbetning av vävnad delprover för olika nedströms analystyper

Den presenterade volymvägda provtagningsteknik för svin organ bestämmer slumpmässigt urval platser inom vävnaden en gång och därefter genererar alla nödvändiga prov för ytterligare olika analyser av delsampling av vävnadsproverna censurerade från dessa platser⁷. I volymvägda systematisk slumpmässig provtagning regimer, varje möjligt provtagning plats inom den totala volymen av organ/vävnad under prövning har exakt samma slumpmässiga chans som skall provtas och generaliserbarhet säkerställs genom insamling av en tillräckligt antal exemplar. Använda volymvägda systematisk slumpmässig provtagning mönster för generering av prover från parenkymal organ, därför förhindrar effektivt analysresultat eventuellt påverkade av (potentiellt oväntade och okända) ojämlika fördelningen av distinkta funktionella eller morfologiska vävnad egenskaper inom olika platser i ett organ, vilket har påvisats, t.ex., för medelvärdet och numeriska volym tätheten av svin hepatocyter i olika regioner i levern parenkymet²⁸ . Presenterade ”vävnad-slabbing och delsampling” strategin för svin organ kan är lätt begripligt, uppfyller de tekniska kraven i de efterföljande analyser metoderna, och snabbt utföras och anpassat till kraven på en särskild studie, därmed undvika systematisk sampling fördomar, minska experimentella variabilitet, och öka precisionen av övergripande experimentet, samtidigt vara effektivare än provtagning strategier där varje enskild provtagning läge bestäms slumpmässigt^{9 ,15}. Hur många prover som skall tas fram, beror naturligtvis på den undersökta parametern och dess variabilitet inom prover från olika platser av samplade organ/vävnad. För generationen av biobank provsamlingar som utformats för att undersökning av högst olika parametrar (inte anges vid tidpunkten för provtagning) av en mängd olika analysmetoder, scheman sådan en framåtblickande provtagningsstrategi vanligtvis generering av relativt höga antal redundanta prover per organ/vävnad.

Generation av isotropiskt enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt och vertikala enhetliga slumpmässiga (VUR) avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser

Några av de tekniker som används för generering av IUR och VUR sektioner för kvantitativa beteendetester analyser har något komplicerade teoretiska baser och förklaringar är därför ofta (onödigt) undvikit av många forskare, även om deras praktiska genomförandet är någorlunda lätt. VUR avsnitten är särskilt lätt att generera, och är optimala för densitet/yta anseende i kombination med cycloid test system^8,9,20. De är ofta att föredra på grund av avsnittsplanet bekant orientering. Men i motsats till IUR sektioner är VUR sektioner inte lämplig för uppskattning av längd-parametrar^8,9.

Under beredningen av IUR och VUR sektioner, den kritiska steget är, i princip, att upprätthålla IUR eller VUR avsnitt ytan av fasta provet under inbäddning i plast harts och för att säkerställa att den lodräta axeln av VUR sektioner alltid kan identifieras (steg 3, Figur 9, figur 10, figur 11).

I framtiden, kan en bredare tillämpning av metoderna som beskrivs ovan väsentligt bidra till att upprätta konsekvent högkvalitativa standarder för generering av jämförbara, multi-purpose biobanksprov från svin och andra stora djurmodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.