サンプリング戦略とブタの生物医学的モデルからバイオバンク組織サンプルの処理

Summary

バイオバンク プロジェクトの下流解析の広範なスペクトルのブタの動物モデルの代表的な組織サンプルの生成法の性能と実用を実証、超高速を含む体系的なランダム サンプリング定性・定量形態学上および分子分析型の組織サンプルの差分処理。

Abstract

医学トランスレーショナルリサーチのブタのモデルはより人気となって着実にいます。モデル、およびこれらのモデルの使用可能な動物の多くの場合限られた数の遺伝子組み換え豚を中心に、個々 の動物の高い値を考慮した、適切に処理された組織サンプル集 (バイオバンク) の確立に最適、以降の解析方法、サンプリングの時点で指定されていない解析などの広範なスペクトルを表すモデルの直線移動の値をフル活用する意味のあるアプローチ。ブタの解剖学の特性に関して包括的なガイドラインは標準化された世代代表、異なるブタの臓器や組織からの質の高いサンプルの最近確立されています。これらのガイドラインは、結果および比較可能性さまざまな研究と研究者間の再現性の重要な前提条件です。臓器重量とボリューム、生成される定量サンプリング場所および組織サンプルの番号と同様に自分の向き、サイズ、処理およびトリム方向などの基本的なデータの記録、関連する要因一般化と分子、定性的手法と定量的形態解析用の標本の有用性を決定します。ここでは、代表の世代の最も重要な技術の説明、実用的なステップバイ ステップ サンプル、ブタの組織から多目的バイオバンク検体が提示されます。ここで説明した方法があります決定臓器のボリュームと密度の実質臓器組織収縮の範囲のポイントを数える測定による出来高で加重された体系的なランダム サンプリング プロシージャのアプリケーションサンプル、および垂直な制服と"Orientator"と"Isector"メソッドが生成された等方性一様ランダム (フェース) セクションなど、定量的な薬剤分析ランダム配向試料の世代の組織学的埋め込みに関連ランダム (VUR) セクション。

Introduction

大動物モデル^1,2,3,4、5、ブタの間いくつかの有利な類似のために医学の豚用ますます一般的なものと人体解剖学と生理学との生成を可能にする確立された分子生物的方法の可用性は、合わせて、豚モデル疾患条件^1,4の広い範囲のための遺伝子組換え。

しかし、齧歯動物モデルと比較して、いつでも実験のため提供することができますそれぞれの豚のモデルの動物の数は限られています。これは約 1 年と世代の豚のモデルおよび動物飼育のために必要な金融と時間のかかる努力のブタの世代間隔が原因です。したがって、これらの豚から生成することができますサンプルと同様に、ブタのモデルの個々 の動物、遺伝子組み換え豚モデルおよび/または長期の実験問題 (例えば、晩期合併症の場合は特に、非常に貴重です高齢者^2,6,7慢性疾患) について説明します。

後で関連性の高いことが判明して可能性がありますいない研究の初期の実験的設計で予定されていた追加解析のパフォーマンス任意の研究の過程で例えば、以前から生じる個別の質問を発見したアドレスに意外な発見。このような追加実験のための適切なサンプルが利用できない disproportionally 高いコストと時間のかかる支出は、追加の豚や組織サンプルを生成する必要あります。そのような事態に備えてするには、バイオバンクのさまざまな器官、組織、またはバイオ液体、量的そして質的幅広い以降の解析に適した保存バックアップ サンプル集の生成、重要と考えられる^2,6,7に近づきます。ブタの動物モデルからの最適の利点を派生する、適切なバイオバンク サンプルの可用性で多臓器レベルで同一のサンプル素材にさまざまな分析方法の広範なスペクトルを実行する独自の可能性を提供しています、非常に同じ個々 の動物、例えば、さまざまなワーキング ・ グループの科学者にサンプルの分布によって組織された研究ネットワーク^2,6,7。さらに、biobanking の「将来」のサンプリング戦略研究に必要な動物数削減にも貢献しています。ブタのモデル biobanking の利点は、最近多臓器、臓器を調べる multiomics 研究で実証されているミュンヘン MIDY 豚バイオバンクから試験片を使用して、長期的な糖尿病の遺伝子組み換えブタモデルにおけるクロストーク²。

実行後の分析の結果の解釈可能性と信頼性を確立する一般的に遵守しなければならないバイオバンク サンプルいくつかの必須要件があります。サンプルを再現性をもって発生する必要があります、彼らは十分に代表、すなわちをある必要があります⁷から採取した組織・臓器の興味の形態学的および分子機能を反映しています。下流解析のタイプの広い範囲に適していること、サンプルする必要があります十分な量での撮影、説明を含む様々 な分析方法の要求 (時間と温度条件を含む) に従って処理されます。cryohistology、パラフィン、プラスチック組織学、免疫組織化学の in situハイブリダイゼーション、微細構造の電子顕微鏡解析、臨床検査診断分析、同様に分子などの病理組織学的解析DNA、RNA、蛋白質、および代謝物の分析。

番号、ボリューム、長さ、表面積の異なる組織構造など個別の定量形態学的パラメーターの広い範囲の評価定量的薬剤分析できるように、ランダム化されたセクションの平面、それぞれの臓器・組織の組織サンプルは、^{7、8,9,10,11}を準備する必要があります。(すなわち、空間参照) から撮影されたサンプルの定量形態学的研究、組織や臓器、器官のコンパートメントの合計量の精密測定は、決定的に重要な^7,9,12それぞれの臓器、組織、または有機体内の興味がパラメーターの絶対的な数量を計算します。最終的には、組織切片の作製中に埋め込みに関連する組織収縮効果が決定しアカウント¹³に。したがって、定量的な薬剤試料の分析、特にアーカイブ (組織サンプル、埋め込まれたティッシュのブロック、標本等を固定) 前の調査から、時々 厳しく制限あるいは不可能¹²、します。数と利用可能な個々 のサンプルの量が十分な場合、代表的なサンプルを保証する十分なサンプリングのデザインが適用されていない場合、それぞれの臓器・組織の超高速を実行しなかった場合に特にまたは場合の処理、サンプルは、関心の定量形態学的パラメーターの推定と互換性がありません。マニホールドの可能な要因による個別の定量形態学的パラメーターの解析アーカイブ サンプル材料の適合性ははっきりと答えることができない、個々 のケースごとの慎重な評価によります。

したがって、場所、サイズ、数、処理、トリミング方向、およびサンプルの向きが可能性があります以降の解析の結果に影響を与える、これらの要因は非常に重要なは、任意の研究の実験の設計で考慮する必要があります。これらの側面およびブタの解剖学、ブタに適応の動物モデルが確立されている最近の包括的な, 詳細な, 大規模なサンプリング ガイドラインの特徴に関して標準化された、再現性のある堅牢な参照を提供します。、および 50 を超える異なるブタ臓器や組織^6,7から冗長、適切に処理された、高品質のサンプルの効率的な生成。

方法論の説明と本稿で示すビデオ チュートリアルを提供様々 な超高速、技術の実用性能の手順詳細、説明でわかりやすくの手順でブタ組織のサンプリングと臓器と異なる下流解析のための組織サンプルの処理。関連組織の三次元収縮寸法の測定を含む注目のテクニックは臓器のボリュームとアルキメデスとカヴァリエーリの⁹の原則に基づいて密度の定量方法など、病理検査の処理中に別の埋め込みメディア¹⁴に埋め込み、実用的な出来高で加重された体系的なランダム サンプリングのアプリケーションに近づくと、サンプリングされた組織検体の処理別以降分析^7,8,9,15と世代の適切な指向し、潜在的な薬剤の定量的解析^{7、8のサンプルを処理 9,10,11}。ブタ バイオバンクのプロジェクトで彼らのアプリケーションの横に示されたメソッドは、一般的にすべての臓器・組織の病理組織形態の定量的なプロパティを調べることの研究の適切です。さらに、体系的なランダム サンプリングのデザインが世代の豊富な変化、例えばRna、蛋白質、または代謝産物を検出する分子の解析手法を用いた実験の代表的なサンプルのため特に有益ですさまざまな臓器や組織。

次の段落は、その実用性能がプロトコル」に記載されている間にこれらのメソッドを簡単に紹介を提供します。

臓器ボリュームの定量
器官の重量とボリュームの決定は、いくつかの実験的設定の重要な可能性がありますこれらの要因として実験的に関連する可能性のある変更を調べた関心の要因臓器・組織の総量もよく絶対定量的なパラメーター (例えば、総セル数)、stereologically 推定数値ボリューム密度 (すなわち、ボリューム単位セルの数からの計算に必要な組織) の^7,12。コンピューター断層撮影などの複雑な技術的な装置を使用してのテクニックとは別に基本的に器官またはティッシュの絶対量を決定するために一般的に使用される 3 つの実用的な方法があります。器官のボリュームは、「直接体積測定」すなわち、アルキメデスの原理によると、水または完全に浸漬した場合の構造によって転置された生理食塩水の量を測定して決定できます。ただし、対等に大きいブタ器官のこれらのアプローチは非現実的であり、不正確さをしやすい非常に大きい容積測定フラスコを要求するので。便利に、臓器・組織のボリュームはその密度と重量^7,12,16、「水没法」^{7,12 を使用して効率的に判断できます。 から計算できます ,16} (プロトコル手順 1.1)。(1598-1647)「カバリエリの原理」に基づく超高速アプローチを使用しても、臓器・組織ボリュームを推定できます。簡単に言えば、カヴァリエリの原理の状態、地面に平行平面の区分である 2 つのオブジェクトと対応するで 2 つのオブジェクトをセクションのプロファイルをカットする場合、地面からの距離で 2 つのオブジェクト、同じエリアがあります。同じボリュームを持っています。したがって、並列、等しく遠く離れている断面平面と断面平面間の距離で、プロファイル断面の製品として任意形状オブジェクトのボリュームを推定できます。これは次の類推で理解できる: 同じ硬貨の同じ数から成る 2 つのスタックは、サイドバイ サイド、コイン整然としたコイン スタック等の円筒形の降伏、互いの上に積み上げ、1 つのスタックの配置検討します。オフセンターの硬貨のスタックには、コイン (図 3 a) が配置されます。両方のコイン スタックの形状が異なる、ボリュームが同じで、両方のスタックの対応するレベルでコインの区域以来 (すなわち、並列セクションのプロフィールの部分はから同じ距離で両方のコイン スタックを介してカット、地面) と同じです。ブタの臓器や組織は、カヴァリエリの原理^7,12,15を使用してのボリュームの推定、1.2 の手順で説明します。

組織学的埋め込みに関連する組織の収縮の程度の決定
組織切片で測定するいくつかの定量的形態学的パラメーターの解析では、ティッシュの組織学のための処理中に発生した埋め込みに関連する組織収縮効果決定し、考慮しています。埋め込みに関連する組織の収縮の範囲変数、組織、その処理と埋め込み中^{8,13,17,18,19}に依存します。一般的に、埋め込み関連組織サンプル (すなわち、ほとんど収縮) の容積の変化領域、および、したがって、すべての 3次元パラメーター推定定量化薬剤分析^{8 に影響を与えるすべての 3 つの次元で}.基本的には、手順 1.3 に示すように埋め込みに関連する組織の収縮は、線形組織収縮因子 (f_S) として表現の程度を推定できます。(収縮に敏感な) 定量的形態パラメーター¹⁴の補正のために使用されます。

出来高で加重された臓器・組織の体系的なランダム サンプリング
ブタ臓器試料のバイオバンク コレクションの構築、手順 2 で説明したように出来高で加重された体系的なランダム サンプリングの手法が代表者の世代の実用的な時間の節約と効率的なテクニックをあることを証明します。多目的組織サンプル^7,8,9,15です。

薬剤の定量解析の等方性均一ランダム セクションおよび均一ランダム垂直セクションの生成
バイオバンク組織サンプルは、適切に準備された標本なしできなかったパラメーターの最大値の推定のための異なる定量的解析方法の広い範囲に適している必要があります。「等方性 (独立) 均一ランダム (フェース) セクション「^8,9を使用して、ほぼすべての定量的な主パラメーターを決定できます。フェース セクションで組織サンプルの断面平面の 3次元配向がランダムします。これは、断面平面の位置を基準にして組織サンプルの位置のランダム化が適用されると"Isector"法¹¹ (プロトコル手順 3.1)、相対的な断面平面の方向のランダム化に実現、組織サンプルは、"Orientator"法¹⁰ (プロトコル手順 3.2) のように。皮膚または粘膜標本自然存在または定義され適切に識別垂直軸、「垂直一様ランダム (VUR) セクション」の準備を表示するなどの組織サンプルの (プロトコル手順 3.3) は厳密の平面内断面の縦軸は有利な^8,20です。フェース/VUR サンプリングの理論的基礎と潜在的な下流定量化薬剤分析の包括的な議論の完全な談話、興味を持った読者定量的ステレオロジー人生の教科書に呼びます科学^8,9。

Protocol

記載されているすべてのメソッドはここで死んだ動物から派生した組織サンプルを使用し、動物福祉のドイツの法規制に完全に準拠します。

1 超高速

1. 水没組織・臓器密度の定量法 (図 1 および図 2)^7,12,16
   1. 材料の準備: メスの刃、紙タオル、微細鉗子、標準研究所の鱗、ガラスまたはプラスチック ビーカー、0.9% 生理食塩水と自己構築された標本のホールダー (図 2 a)。
   2. 組織の一部を切除 (最大サイズ: 2 × 2 × 2 cm³) 興味の器官のコンパートメントから具体的に臓器・組織から。下垂体や松果体腺などの小器官が測定したトトで。
      注意: は、サンプルのサイズが特にビーカー (ステップ 1.1.5 et seq) およびステップ 1.1.7 でビーカーの内壁に連絡せず、サンプルの完全な水没を許可するその充填レベルの内径より小さいことを確認します。
   3. 過剰な血液・組織液を削除するペーパー タオル サンプル、綿棒は慎重に。
   4. 精密スケールのサンプルの重量を量るし、(m_S) サンプルの重量を記録します。最も近い mg (図 1 a) 小さい組織サンプルの重量を決定します。
   5. スケールの部屋温度 0.9% 生理食塩水が入ったビーカーを置きます。ビーカーは、後続の手順で組織サンプルの水没のためオーバーフローすることがなく許可するを完全に記入しないでください。
      注意: は、ビーカー サイズのスケールの効果的な測定範囲と測定する組織試料の重量サイズに適切なを使用します。最大 2 cm³x 2 x 2 の大きなサンプルの 50-100 mL のビーカー サイズの組み合わせで適切な 500 g 約 100 mg から尺度が小さいサンプルの精度とスケールとの組み合わせでボリュームを 5-10 mL のビーカーを使用約 0.1 mg と 20 g の間の範囲を測定します。
   6. 生理食塩水の試料ホルダー (すなわち細線の十分に堅いループか何か似ていますが、図 2 a) を水没マーク位置 (図 1 b図 2 b図 2の矢印)。(風袋) ゼロにスケールの表示をリセットします。
   7. 慎重に組織サンプルを試料ホルダーに付けるし、(図 1 b図 2 b図 2の矢印) 試料ホルダーにマークされている位置に達するまでに生理食塩水のサンプルを完全に水没します。
      注意: 水中サンプルとサンプル ホルダー、内側の壁やビーカーの底または生理食塩水の表面との接触になりません。
   8. サンプル ホルダーおよび湛水のサンプルをその位置に保持している間組織サンプルによって転置された生理食塩水の重量を参照するスケール (m_L) に表示される重量を記録 (図 1 Cは、図 2 bと図 2)。
   9. サンプル (V_S) m_Lからのボリュームと室温 (20 ° C) で生理食塩水の密度を計算する (ρ_{生理食塩水}1.0048 g/cm ³ =) V_S m_L=/Ρ_{生理食塩水}[g/g/cm ³](図 1)。
   10. サンプル (m_S) とそのボリューム (V_S) の重量を (すなわち、質量) から組織サンプル (ρ_サンプル) の密度を計算: ρ_サンプル= m_S /V_S[g/cm ³] (図 1)。
   11. 測定臓器にトトの測定を 3 回繰り返すし、1 つの測定値から平均オルガン密度を計算します。大きな臓器・組織、同じ臓器、組織、器官のコンパートメントの異なるサンプルでの繰り返し測定を行うし、それに応じて単一の測定から平均密度を計算します。
   12. その重量と密度 (図 1) から臓器、組織、器官のコンパートメントの合計量を計算します。
2. ブタ器官の容積の定量・ カヴァリエーリ ・法の適用⁷
   1. 材料の準備: 定規、キャリパー、ナイフ、ハサミ、鉗子、防水ペン、プラスチック フィルム、スキャナー、写真カメラ、およびクロス グリッド プラスチック透明フィルムに印刷します。
   2. プレーンの表面 (切削技術) に全体の臓器を配置し、(図 3 b図 5 a) その縦軸に沿って器官の長さ (l) を測定します。
   3. 等距離並列スライスに完全な器官のティッシュを (図 3図 5 b) 縦臓器軸が直交カットするには。十分に小さな組織・臓器スラブの十分な数を受信する 2 つのセクション (すなわち、断面の間隔/切片厚通常約 1 cm) 間の距離dを選択します。ランダムに 0 と断面の間隔の器官の余白からの距離内にある最初のセクションを配置します。スライス、しながら位置とほぼ均一な厚みのパラレル臓器スラブ約を取得する各セクション平面の向きを判断する視覚的に。
      注: 組織・臓器スラブの必要数は図形と検査された臓器・組織のサイズに依存します。小器官やサンプルは ≤5 mm の薄いスラブの断面に、区分する前に寒天にサンプルを埋め込む (1.3.3 の手順を参照してください). 寒天埋め込まれたサンプルのスライスの技術デバイスを使用し、。最もブタ臓器・組織、経験的推奨断面の間隔だけでなく、スライスのデバイスの例は、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」⁷の補足資料で示されます。
   4. 切断底面 (すなわち、右または各臓器のスラブ、 3 D 図、図 5の左側のセクション平面のいずれかに一貫して) 同じ面ですべての臓器・組織の破片を置き、スラブ (n) をカウントします。
   5. 次の方法のいずれかによって組織スラブの断面の輪郭を取得します。
      1. 慎重に彼らの上部および下のセクションの表面の向きを維持しながら適切にラベル付けされたプラスチック フィルムに組織スラブを配置します。防水ペン (図 3E1 2) を使用してプラスチック製の透明の組織スラブのアウトラインをトレースします。
      2. 垂直方向のセクションの表面 (図 3 f) 上にカメラを保持している組織スラブの写真画像を取る。校正、組織スラブの横サイズの定規を配置します。
      3. 上部と下部のセクション表面 (図 3) の向きを維持しながらフラット ベッド スキャナーの組織スラブをスキャンします。校正、組織スラブの横サイズの定規を配置します。
   6. 次の方法のいずれかによってすべて組織スラブ (トレース、撮影、またはスキャン]) セクション プロファイルの領域を測定します。
      1. オーバーレイまたは適切なサイズを持つトレース オルガン スラブ プロファイルをスーパーイン ポーズ、プラスチック透明性、すべてを横切るプロファイル] 領域 (3E を図3-4;に比較を打つ数に均等に間隔をあけられた十字架のキャリブレーション グリッド印刷図 5)。交差 1 つクロスに対応する領域によってプロファイルの打席数を乗じて各器官のスラブのセクション プロファイル領域を計算します。
         注: 十分に正確な量を受け取るに見積もり、隣接する交差の間十分に小さい距離でクロス グリッド」を選択、少なくとも 100 の平均交差するよう研究の各検討ケースにおける 1 つの器官のスラブのセクション表面をヒットします。.最もブタの臓器・組織の経験的推奨クロス グリッド サイズは、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」⁷の補足資料で示されます。
      2. 領域を測定写真/スキャンのデジタル画像で組織のスラブを使用して適切な市販やフリーウェアの形態計測ソフトおよびハードウェア アプリケーション (図 3 H)、市販の画像解析システム²¹などまたは ImageJ²²。
         注意: メモその 1 組織スラブ (最初または最後) はその自然の表面にそれぞれ休憩スキャナーに配置されます、その自然な表面を持つカメラに直面しています。したがって、スキャンしたイメージのイメージは、このスラブの写真画像、セクション表面は表示されません。したがって、断面の面積単位はないこの組織スラブ (図 3 i) のスキャンした画像/写真画像です。注過剰投影も臓器スラブ、すなわちのスキャンした画像や写真で紹介、実際のセクション プロファイルではなくスラブ セクション表面 (図 12 の背後に横たわっている画像で組織の領域を測定G-H)。
   7. ケースごとすべてのティッシュの破片のすべての対応するセクション断面積の合計のプロダクトとして推定される臓器体積を計算 (すなわち、右または左のいずれかの一貫して, 各器官の上部または下部のセクション表面スラブスラブ (すなわち、垂直臓器軸 (l) とスラブの数の測定の長さの商)¹⁵の平均厚さと。
3. 組織学のための組織サンプルの処理中に埋め込みに関連する三次元組織収縮の程度の決定
   1. 材料の準備: ミクロトーム ブレード、鉗子、寒天、金属鋳造金型、デジタルスキャナー、およびサイズの定規 (例えば、グラフ用紙)。
   2. 固定ティッシュ サンプルから新鮮な平面のセクションをカットします。
      注: のサンプルを使用して簡単に変形可能な (ソフト) の組織 (脂肪、ゼラチン状の組織) は、断面 (図 4 a) 前に寒天で固定ティッシュ サンプルを埋め込みます。
   3. 寒天にサンプルを埋め込む。
      1. 水の適切な量と培地微生物学用標準寒天パウダーを混ぜる (約 0.5-1 グラム寒天/10 mL 水) ガラス ビーカーに。混合物をかき混ぜるし、700 W の電子レンジで 3-5 s. 混合物をかき混ぜるし、沸騰させるが 3-5 秒のために再度沸騰するまで加熱します。
      2. 必要に応じて、組織サンプルに寒天のコントラストを高める、液体の寒天、例えば、黒インクを染める (熱い液体寒天培地 10 mL に 1 mL インクを追加し、積極的にかき混ぜる)。
      3. 鋳造金型 (例えば、図 10 aDを埋め込むパラフィン用金型) に熱い寒天を注ぐし、暖かい寒天で固定ティッシュ サンプルが水没します。寒天の凝固まで冷却、金型を削除、ミクロトームまたはかみそりの刃を使用して埋め込まれたティッシュで寒天ブロックをカットをしましょう。
         注意: 熱い液体寒天を処理中に、は、ゴーグルと手袋を着用します。排気ホルムアルデヒド溶液中固定プロセス組織サンプルはフードし、ゴーグルと研究室の手袋を着用します。
   4. サイズ定規とともに、フラットベッドスキャナーの上下向きそのセクションの表面のサンプルを置き、セクションの表面 (図 4 a, B) をスキャンします。
   5. ステップ1.2.6 (図 4 b) で説明する方法のいずれかを使用して、デジタル スキャンの固定ティッシュ サンプル (_f) のセクション画面の領域を決定します。
   6. エポキシ (例えばEpon) または glycolmethacrylate/メタクリル酸メチル (MMA/GMA)²³、次標準プロトコル^23,24,25 (などのプラスチックの埋め込みメディアのサンプルを埋め込む図 4)。(1.3.4) の前の手順でスキャンされた固定サンプルのセクションの表面がプラスチック埋サンプルで維持されることを確認します。
      注: サンプルの処理中にサンプルのセクションのサーフェスの向きを維持するために一貫して埋め込みカセットまたは鋳造金型に下向きその目的セクション表面サンプルを配置または意図したセクションをマーク表面 (またはサンプルの反対側) のインクで。
   7. 固定ティッシュ サンプル (ステップ 1.3.2) の元のセクションの表面に対応するプラスチックのブロックから組織切片を使用してカット ミクロトーム (図 4)、ガラス スライド (図 4) のセクションをマウントし、日常的に (それを汚す例えばヘマトキシリンとエオシン染色、H & E)^24,25。
      注意: 固定ティッシュ サンプルの元のセクションの表面と同じ平面で約組織切片を受信するため前に、ミクロトームのマウントにプラスチック製のブロックの位置を慎重に調整します。
   8. サイズ定規と一緒にフラット ベッド スキャナー上にうつむけステンド グラス セクションにスライドを置き、セクション (図 4E) をスキャンします。
   9. 1.2.6 (図 4 階) の手順で説明した方法のいずれかを使用して、デジタル スキャンでプラスチック包埋組織サンプル (A_e) のセクションの領域を決定します。
   10. プラスチック中の埋め込み埋め込み前後に組織サンプルの対応するセクションのプロファイルの測定領域から (それぞれ組織と埋め込む媒体) の平均埋め込みに関連する組織の収縮を計算します。線形収縮係数f_sは、プラスチック媒体 (_e) とのエリアを埋め込む埋め込み後n組織サンプルの断面の輪郭部の商の平方根として計算されます、包含媒質 (_f) (図 4) プラスチックに埋め込む前に同じ組織サンプルの対応するセクション プロファイル¹⁴。

2. 出来高で加重された体系的なランダム サンプリング ポイント数えると異なるダウン ストリーム解析タイプ⁷の組織サブサンプルの処理によって

1. 材料の準備: 定規、ノギス、ナイフ、ハサミ、鉗子、防水ペン、ポイント/クロス グリッドのプラスチックの透明度とランダムな番号テーブルに印刷します。
   注: グリッド (5-60 ミリメートル) クロスのコピーのテンプレートは、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」⁷の補足資料で提供されます。
2. プレーンの表面 (切削技術) の臓器・組織を配置し、(図 5 a図 6 a) その縦軸に沿って器官の長さ (l) を測定します。
3. 等距離並列スライスに完全な器官のティッシュをその縦軸 (図 5 b) が直交カットするには。組織・臓器のスライスの十分な数を取得するには十分に小さい 2 つのセクション (すなわち、断面の間隔/切片厚、通常約 1 cm) 間の距離dを選択します。ランダムに 0 と断面の間隔の器官の余白からの距離内にある最初のセクションを配置します。スライス、しながら位置とほぼ均一な厚さのおよそ平行臓器スラブを取得する各セクション平面の向きを判断する視覚的に。
   注: 組織・臓器スラブの必要数は、検査の臓器と組織のサンプリング場所の数のサイズによって異なります。小器官やサンプルは ≤5 mm の薄いスラブの断面に、区分する前に寒天にサンプルを埋め込む (1.3.3 の手順を参照してください). 寒天埋め込まれたサンプルのスライスを行うための技術的な装置を使用し、。最もブタ臓器・組織、経験的推奨断面の間隔だけでなく、デバイスのスライスの例は、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」⁷の補足資料で示されます。
4. 切断ベース (図 6 b) に同じ面にすべての臓器・組織の破片を配置します。
5. 適切なサイズのクロス グリッドと組織スラブ印刷プラスチック透明度外側に向けて配置することによってオーバーレイは残って組織 (図 5-D、図 6 b) からランダムなポイント クロス グリッドの上部。
   注: が選択した隣接する交差の間十分に小さい距離でクロス グリッド研究の検討において, 倍、少なくとも交差しているサンプル数として、サンプリングされる組織コンパートメントのセクション加工するサーフェスをヒットします。その組織のコンパートメントから取られます。最もブタの臓器・組織の経験的推奨クロス グリッド サイズは、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」⁷の補足資料で示されます。
6. マークし、組織 (それぞれ、組織サブ コンパートメント サンプリングする) を打つすべての交差を数えます。一貫してカウントし、それぞれ 1 行ずつ右に左からそれぞれの交差の連続番号によってなど、すべての組織の破片でサンプリングされる組織コンパートメントを押す十字の番号の統一モードを適用します。上から下、または、例えば、exemplarily 5E を図に示すよう、12 の位置に最も近い間から始まる時計回りの方向で別の後 1 つの組織のスラブで十字架を番号によって。
7. 系統的サンプリング間隔 (i) を取得する生成されるサンプル数では、サンプリング (n)/組織コンパートメントを押す十字の数で割ります。
8. 1 と私の間にランダムな番号xを選択して最初のサンプリング位置を決定します。これは、乱数表を使用します。最初のサンプリング位置 (x) および各次x +私をマーク、 x + 2私、 x + 3iなど、クロス プラスチック透明性をサンプリングする組織/組織コンパートメントを打つ防水ペン (図 5 階) を使用します。
   注: ランダムな番号テーブル便利かつ迅速に生成できますオンライン ランダムナンバージェネレーターを使用しています。
9. マークに対応する場所を越える少しプラスチックの透明度を上げると (図 5図 6 eピンセットのペアを使用して組織のスラブの表面にきれいな、空白の紙吹雪紙の小片を置くことによって組織をタグします。).
10. (図6f、図 7A図 5 H) サンプリングの場所から組織の標本を切除し、(図 6図 7 aB) で指定されている解析の種類のためにそれらをさらに分割表 1。
11. サンプリング後、暖かい水と石鹸、乾燥、プラスチックの透明度をきれいにし再利用します。

3 等方性一様ランダム (フェース) セクションおよび薬剤の定量分析のための垂直一様ランダム (VUR) セクションの生成

1. "Isector"技術
   1. 材料の準備: かみそりまたはミクロトームの刃、寒天、球状鋳造金型 (例えばプラリネ、菓子のサプライヤーから得ることができる金型鋳造)、フォールド クランプ、および鉗子。
   2. 球状の鋳型に適切なサイズ (1 cm³x 1 x 1) の部分固定、体系的にランダムにサンプリングされた組織を配置、フォールド クランプによって一緒に保持し、暖かい液体寒天 (図 8 aE) で金型を満たし。
   3. 寒天の凝固後、鋳型から寒天球 (図 8 f) を削除します。
   4. 寒天球をロールバック テーブルに埋め込まれた組織サンプルを使用停止、およびランダムな位置にセクションします。
      注: 結果の断面平面はフェース セクション (図 8 階-g) です。
   5. GMA/MMA などプラスチック樹脂に組織サンプルを埋め込むに進みます (1.3.5 を参照) 平面フェース セクションの方向を維持します。
2. "Orientator"技術
   1. 材料の準備: かみそりまたはミクロトームの刃、寒天、鉗子、ランダム番号テーブル、等角とコサイン加重円のプリント。
      注: サークルのコピー テンプレートは、以前の出版物^8,26で提供されます。
   2. 0-180 に平行 1 つの端に (または寒天埋め込まれた固定ティッシュ) 固定ティッシュのサンプルを配置等角円のプリント ° 方向 (図 9 a、図 10E)。
   3. ランダムな番号の表を使用して、ランダムな角度を決定します。サンプルにかかっている等角円の規模で対応するマークを見つけます。等角円の規模で示されるランダムな角度の方向に平行と垂直指向されている断面平面のサンプル (または埋め込まれた組織サンプルを取り巻く寒天) のセクションをカットこれらのマークを使用して、(図 9 b-C、図 10 f) 試料の表面を休んでいます。
   4. (図 9、図 10 H) 1-1 方向に平行に置かれた休憩のサーフェスのエッジとコサイン加重円周上の欠点に直面して前の手順で生成されたセクションの表面組織ブロックを配置します。
   5. 3.2.3、手順し、サンプルを新しいセクションをランダムな番号の表 (図 9E-F、図 10IJ) を用いてランダムな角度でカットします。
      注: 結果の断面平面は、フェース セクションです。
   6. 必要に応じて、手順 1.3, 埋め込みに関連する組織の収縮 (図 9-J) による固定ティッシュ サンプルの断面のフェースの領域を決定してプラスチックに組織サンプルを埋め込むに進みますGMA/総合格闘技などの樹脂します。
3. 垂直一様ランダム (VUR) セクションの生成
   1. 材料の準備: かみそりまたはミクロトームの刃、寒天、鉗子、ランダム番号テーブルおよび等角円のプリント。
      注: サークルのコピー テンプレートは、以前の出版物^8,26で提供されます。
   2. 後続の手順でサンプル/セクションで認識は、常に固定ティッシュ サンプル内の垂直軸を定義します。
      注: 通常、組織標本の自然な表面に垂直の軸は垂直軸として選択されます。
   3. 適切な場合は、寒天培地 (図 11 b) にサンプルを埋め込みます。
      注: 寒天埋め込み前に VUR またはフェース - のセクショニング固定サンプルは小さい、薄い、壊れやすい、またはソフトのサンプルに一般的に推奨。また、サンプルの寒天埋め込みデータを使用プラスチック樹脂中サンプルの後続の埋め込み時に VUR 断面サンプルの位置決めを容易にします。
   4. 垂直軸の直交表/紙の表 (図 11) の平面に指向される等角円の印刷サンプルを配置します。
   5. カット サンプル (ランダムな番号の表を使用して決定される) ランダムな角度で断面平面と直交表を VUR の断面 (図 11) を受信する垂直軸への平行します。
   6. 必要に応じて、手順 1.3 (図 9-Jの比較) に記載された埋め込みに関連する組織の収縮による固定ティッシュ サンプルの断面のフェースの領域を決定しての組織サンプルを埋め込むに進みますGMA/総合格闘技などのプラスチック樹脂。

Representative Results

水没組織・臓器密度の測定法

図 12A-Bは、1.1 (図 1図 2) のステップで説明されている水没を用いたブタ腎臓のボリュームと密度の代表決定を示しています。追加豚の臓器や組織の密度測定の代表的な結果は、表 2に掲載されています。「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」⁷で多様なブタの組織や臓器の参照密度のより包括的な一覧が表示されます。独立した標本の同一試料の繰り返し測定による水没メソッドを使用して取得した組織密度測定値の妥当性を見積もることができます。最もブタ組織水 (ρ_水≈ 1.0) よりわずかに高い密度の値を表示は、組織 (脂肪組織、肺組織) 生理食塩水で泳いで表示密度に対し < 1.0。

カヴァリエーリ器官の容積の測定法

図 12-Fは、ブタ腎臓 (図 12 a・ Bに示すように同じ器官) の量の代表的な決意を示しています。ポイント カウント プラスチック透明に印刷重畳クロス グリッドを使用することによってだけでなく、臓器スキャン画像 (払ってスラブのスラブの断面の平面測定による臓器スラブのセクションの表面の領域を求めた図 12 G Hスラブ セクション表面の背後にある組織の過剰投影に注意)。それぞれのボリュームにカヴァリエリ アプローチ (ステップ 1.2、図 3) の性能によって得られたデータを比較することにより推定が臓器ボリュームの精度は、臓器・組織の密度と重量から計算されます。図 12に、腎臓のボリュームが水没法によって決定され、カヴァリエーリのメソッドが互いから 1% 未満のものによって異なります。カヴァリエーリ ボリューム見積もりの精度としては、エラー (CE) の係数として計算できます、記載されている以前¹⁵。

組織学のための組織サンプルの処理中に埋め込みに関連する三次元組織収縮の測定

表 2 (以前の定量的胎受験樹脂 (エポキシまたは GMA/総合格闘技) のブタ組織サンプル (皮質腎組織) の埋め込みに関連組織の収縮の程度の代表の結果が表示されます。未発表のデータ)。表 2に示される線形収縮要因は 1.3 (図 4) の手順で説明するよう求めた。彼らは、GMA/MMA の埋め込み、29%、豚皮質腎組織のエポキシを埋め込むための 22% の三次元体積減少を参照してください。図 13は、プラスチック埋め込む前にサンプル セクション表面積測定用寒天包埋、ホルマリン固定の脂肪組織の不十分を十分にして作製した試料の代表的な例を示しています。

出来高で加重された体系的なランダム サンプリング ポイント カウントおよび下流解析の種類の組織のサブサンプルの処理によって

実質臓器 (手順 2、図 5図 6図 7) の出来高で加重された体系的なランダム サンプリング法の「断面とポイント カウント」世代代表の確立された、堅牢なメソッドを表す複数の後続タイプ分析^2,7のためのサンプル。以降差分処理を複数の異なる摘出組織サンプルの下流の様々 なブタの臓器や組織、体系的にランダムにサンプリングされた、冗長性の高いバイオバンク標本の世代の代表の結果手順 2 (図 5図 7との exemplarily 示された図 6) サンプリング法を用いた解析手法は以前公開された²をされています。世代以前のブタのバイオバンク研究²では肝組織のバイオバンク サンプルのたとえば、ブタ肝臓だった完全に区分 20 スラブ約 2-3 cm の厚さに重ね書きの手順で説明されているように、グリッドのクロスを 3 cm約 2 cm³ x 2 x 2 の 2、および 16 の組織の場所を体系的にランダムに採取し、その都度切除します。切除のサンプルから、5 つのサブサンプルはその後サンプリング場所の分子解析 (-80 ° C で凍結) 用に生成された、Methacarn ソリューションとのホルムアルデヒド溶液の 1 つの cryohistology、1 つのサブサンプルの 1 つのサブサンプルを修正しましたその後パラフィン埋め込むと組織- および免疫組織化学的検査。平均²、約 20 分以内 (凍結または固定の解決へのサンプルの転送) まで一件につき 74 種類のサンプルの生成を実現しました。生成されたサンプルの品質評価が説明のサンプリングとアプローチをサブサンプリングの実用性/成功を見積もることができます (すなわち、RNA または蛋白質の質を分離、胎の保全と組織サンプル、免疫組織学的解析、等のための適合性の微細構造 (秋季)²

薬剤の定量解析の等方性一様ランダム (フェース) セクションおよび垂直一様ランダム (VUR) セクションの生成

ブタ (バイオバンク) 組織サンプルから等方性の均一ランダム (フェース) セクションおよび VUR セクションの前方指向の生成のテクニックを実演 (プロトコル手順 3、 図 8図 9図 10、図11)、ほとんど定量的な主パラメーターの検討を可能にする、いくつかの練習と合理的な難しさやエラーの発生源にすばやく実現できます。したがって、フェースのサンプル (isector 法)図 9と図 10 (orientator 法) の世代は完全にこれらのメソッドの代表。

図 1: 組織・臓器密度の定量「水没法」の模式図.(A) 測定試料の重量 (すなわち、質量、 m_S)。(B) 規模 tared ビーカーの重さには、20 ° C と定義され、マークされた位置に生理食塩水に浸漬の試料ホルダーの 0.9% 食塩水でいっぱい。(C) サンプルを内側の壁またはビーカーの底に接触することがなく試料ホルダーの印の位置の完全な水没。残高表示重量はサンプルによって転置された生理食塩水の量の重量) です。示されているように、サンプルの密度の計算 (ここで: ρ_サンプル= m_S/V_S m_S=/(m_L/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 g/cm ³_).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2:「水没法」組織・臓器密度の定量します。(A) 別のサンプル ホルダー細線から構築します。左から右へ: 薄い注入カニューレ、小さく、壊れやすい試料を保持するためにワイヤーの螺旋バスケットと細いワイヤーのシンプルなスリングを通って細い針金糸のループ。Aの矢印Cは生理食塩水に浸水、試料ホルダーを位置を示します。(B、 C)生理食塩水 (図 1 Cの比較) でサンプルの水没中の試料ホルダーの位置。(B) 完全なブタの下垂は、バスケット状試料ホルダーに配置されます。(C) ブタ心筋のサンプルです。壁やビーカーの底に連絡せず生理食塩水のサンプルの完全な水没に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: カヴァリエリ ブタ器官の容積の測定法の適用の模式図.(A) コイン スタック カヴァリエリの原理の理解のための例。詳細については概要を参照してください。(B ・ H)灌流固定腎臓の物量のスケマティックのデモンストレーション。その縦軸に沿って腎臓の長さ (l) の (B) 単位。(C) 完全な器官に切断n均等の厚さ (d) は平行縦臓器軸に直交スライスです。(D) オルガン スラブ同じ面に配置。最初の (右) 組織スラブ、すなわち自然な表面に配置されます、セクション表面がないことに注意してください。(E・H)組織スラブ表面断面を決定するさまざまなアプローチです。(E) を押すと交差のカウント プラスチック透明に印刷グリッド クロス校正で、適切な大きさ、輪郭を描かれた臓器スラブ プロファイルのプラスチック透明オーバーレイ防水ペンですべての臓器のスラブのアウトラインをトレースしますプロファイルの領域。オルガン スラブ断面プロファイル積は、クロス セクション プロファイル領域と 1 つのクロスに対応する領域を打つ数から計算されます。(F,G)臓器の断面の決定は、キャリブレーションのルーラーでセクションの表面 (F) は、垂直方向または組織スラブ (G) のスキャン画像を撮影した写真画像のスラブします。(H) 適切な形態のソフトウェア アプリケーションを使用して写真/スキャン画像で組織のスラブの断面の決定。器官の平均厚さを掛けたすべての臓器スラブの対応するセクションの表面の領域 (私) の累積的な製品として、臓器の推定容積の計算はスラブ¹⁵です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 組織学のための組織サンプルの処理中に埋め込みに関連する三次元組織収縮の測定の模式図.(A) 固定ティッシュ サンプル (区分する前に寒天培地に埋め込むことによって脂肪や肺組織など簡単に変形可能な (ソフト) 組織の形状の安定化) から新鮮な平面断面表面の切削加工。サイズ定規と一緒にサンプルのセクションの表面のスキャン。(B) 固定ティッシュ サンプル (_f) のセクションの表面の領域の平面の決定。(C) ルーチン サンプルの包含媒質のプラスチックに埋め込みます。(D) サンプルの断面平面の保全とプラスチックのブロックの組織切片の作製。ガラス スライドとスライドのルーチン染色についてのセクションの搭載。(E) サイズ定規と一緒にスライドのスキャン。(F) (_e) プラスチック包埋試料の断面の面積の平面決定。(G) 計算埋め込みに関連する組織の収縮の程度の組織サンプルの対応するセクションのプロファイルの測定領域の商としてプラスチック中¹⁴を埋め込み埋め込み前後。右側の画像は、プラスチック樹脂 (上) と、対応するセクション プロファイル (彼染色) GMA/MMA 埋め込みサンプル (下) の埋め込み前にインク黒く寒天に埋め込まれた脂肪質のティッシュのホルムアルデヒド固定サンプルのセクションの表面を示しています。スケール バー = 2 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 出来高で加重された体系的なランダム サンプリングの模式図.提示の例は、灌流固定腎臓の腎皮質内の組織 6ヶ所の系統的無作為抽出を示しています。(A) その縦軸に沿って腎臓の長さ (l) の測定。(B) 完全な断面全体の器官の縦断的臓器軸に直交に均等に厚 (d) の平行スライスに。(C) 臓器スラブは同じ (すなわち、右または左のいずれか) に置かれた面が。(D) 適切なサイズのクロス グリッドをもつ組織スラブのオーバーレイは、プラスチックの透明に印刷されます。左上クロス グリッドの外側は、ランダムな点 (青い点、 •で示される) 組織外で配置されます。(E) カウントと腎皮質を打つすべての十字の番号します。現在の例では、腎皮質を押す十字は別クロス 12 位置に最も近いから時計回りで各スラブ進むの (左から右に) 後、1 つの腎臓スラブ連が番です。ここでは、36 の十字架は腎皮質をヒットします。6 試料採取位置は、サンプリングします。したがって、クロスが組織を打つすべての 6 番目の位置をサンプリング (36/6 = 6)。(F) 現在の例では、4 番目の位置クロス (N ° 4) 打撃腎皮質はランダムに最初のサンプリング位置として選ばれました。すべての次は、防水ペンを使ってプラスチックの透明性に腎皮質のマークを打つ 6 クロスします。現在の例では、4、10、16、22、28、34 の位置のとおりです。(G) 組織の表面に置かれた清潔な空の紙吹雪紙の小片で対応する組織の場所のタグ付け。(H) 切除組織標本から体系的にランダムにサンプリングした位置およびさらなる分析の後続の処理。この図から Albl et al. (2016) S236 と S237 186 (サプリメント) のページの図⁷を変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6: ブタの腎臓の腎皮質の出来高で加重された系統的無作為抽出 (図 5 参照) とポイント カウント規則。(A) 新鮮な豚の腎臓。同じように並列厚切りにプラスチック透明に印刷グリッド クロスを重ねて縦臓器軸に直交断面 (B) 腎臓。赤い円は、クロス グリッドの位置をランダム化するために使用するランダム ポイントの位置を示します。ポイント カウントの規則の (C) 図: cross/point がヒットする組織コンパートメントとして数えられる場合 (参照コンパートメント)、サンプリング右上内側の垂直方向のコーナーに、十字架の鉄棒 (矢印) をカバーする組織。腎皮質と組織の場所の体系的なランダム サンプリングを押す十字の (D) マーキング (ここでは、119 十字ヒット腎皮質と 17 箇所、サンプリング間隔私を使用して体系的にランダムにサンプリング = 7)。(E) は、ランダムに体系的に腎皮質紙吹雪紙タグの位置をサンプリングしました。(F) サンプルを摘出しました。(G) さらなる細分化異なるダウン ストリーム分析のサブサンプルの後続の処理のための切除サンプルの。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 7: 組織サンプルの細分化から摘出した体系的にランダムにサンプリングされた組織場所と異なるダウン ストリーム分析のサブサンプル処理します。(A) 腎皮質 (ネイティブの組織) の 1 つの体系的にランダムにサンプリングされた場所から組織サブサンプルの解析では異なる世代の模式図 (例えば、FF PE: ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれたサンプルと MTC PE:光顕微鏡組織学; のための Methacarn 固定のパラフィン埋め込まれたサンプル凍結切片の組織学; のための低温電子顕微鏡: サンプル-80 ° c: ドライアイス凍結組織サンプル分子分析のため)。灌流固定腎臓の腎の皮質、摘出組織サンプルのさらなる細分化および定性的および定量的な形態解析のサブサンプルの処理体系的にランダムにサンプリングされた場所 (B) 切除。異なる固定ソリューション (5、6、7)、およびサンプル、ランダムな番号の表 (3) 等角、コサイン体重が一周 (4) フェース セクション (図 9、図 10を参照) の生成のための灌流固定ブタ腎臓 (1) クロス グリッド (2) スラブ電子顕微鏡試料 (8) のコンテナーです。この図は、Alblらから変更されています。(2016) S239 を図は、186 (サプリメント)⁷ページします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 8:"Isector"セクションからブタ組織のホルマリン固定の準備。灌流固定ブタ腎皮質の (A) のサンプルです。(B) 球面金型。(C) 液体寒天。(D E)寒天の球面金型のサンプルの埋め込み。(F) 寒天培地は、埋め込まれた組織サンプルで球します。(G) 寒天培地は、ランダムな位置 (フェース断面平面) 断面埋め込み組織球します。この図は、Alblらから変更されています。(2016) S6 を図は、14 (サプリメント)⁷ページします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 9: フェース セクションの準備のため"Orientator"法の模式図です。(A) 試料固定ティッシュの等角円 (ci1) の端に平行配置 0-180 ° 方向 (赤い線で示される)。ランダムな角度 (グリーン ライン) でサンプルの (B) 押します。(B、C)(緑色で示されている) 組織サンプルのセクション表面を新しく生成されます。(D) サンプルは、欠点と休ませる (赤い線で示されている) 1-1 方向に平行の表面の 1 つの端に直面して前の手順で生成された断面の表面とコサイン体重円 (ci2) に配置されます。(E) ランダムな角度でサンプルを 2 番目のセクションの切断。(F) 結果ランダムに等方性のセクション (青色で示される) サンプルの平面。手順 1.3 で説明した埋め込みに関連する組織の収縮の推定固定ティッシュ サンプルのフェース セクションの領域の (G) 決定。(H) プラスチック樹脂で組織サンプルの埋め込み。(私) プラスチック ブロックの押しますが、ミクロトームで断面 (フェース平面に平行)。(J) スライド ガラスにフェースのプラスチック セクションのマウントです。この図は、Alblらから変更されています。(2016) S8 を図は、15 (サプリメント)⁷ページします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 10: 寒天包埋試料のフェース セクションの準備のための"Orientator"技術。(A ~ D)必要に応じて、1 つ可能性があります寒天-埋め込む固定ティッシュの体系的にランダムにサンプリングされた試料 (寒天埋め込み小さい組織サンプルのために便利です、最初または組織を切断することがなく、寒天内ランダムの両方のセクションに配置できます)。(E) 端 (赤い線で示されている) 1-1 方向に平行に等角円 (ci1) に寒天ブロックの位置決め。(F, G)ランダムな角度でブロックの断面 (ここで: 15-15、グリーン ライン) ランダムな番号の表 (rnt、緑の矢印) を使用して決定します。(H) その後安静時のサーフェスのエッジ コサイン加重円 (ci2) の上ヘカット セクション表面寒天ブロックの位置 (赤い線で示されている) 1-1 方向に平行に置かれました。(私) 2 番目のセクションは、ランダムな角度でサンプルをカット (ここで: 20-20、青い線で示されている)、ランダムな番号の表 (rnt、青い矢印) を使用して決められました。(J) 結果フェース セクション組織サンプルの平面です。この図は、Alblらから変更されています。(2016) S9 を図は、16 (サプリメント)⁷ページします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 11: VUR セクション準備の模式図.(A) (例えば、自然な表面に垂直) に定義された (個人) 垂直軸と固定ティッシュ サンプル。(B) 固定ティッシュ サンプルは、寒天に埋め込まれます。(C) 等角円 (ci1) の印刷の the(agar-embedded) 組織サンプルの位置決め。V_A: 垂直軸。ランダムな角度でサンプルの (D) 押します (ランダムな番号の表; ここ: 青い線で示されている 30 30 方向) 直交表とサンプルの縦軸に平行に配向する断面平面を持つ。結果として得られる (青色で示されている) 組織サンプルの断面を VUR。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 12: ブタの腎臓の代表超高速。(A B)水没法。(A) 腎重量 (m_子) の決定。(B) (m_displ.saline) 腎臓によって転置された生理食塩水の量の重さの決定。腎臓は文字列に掛け、完全に底またはビーカーの壁に触れることがなく生理食塩水に浸漬します。腎臓の計算された容積は 92.6 cm ³ です。(C・D)カヴァリエーリ テクニック、ポイントを数えることで面積測定。その縦軸に沿って腎臓の長さ (l) (C) の測定。腎臓の断面プロファイルの (D) 定量はポイント プラスチック透明性に均等に間隔をあけられた十字架のグリッドのオーバーレイ印刷後のカウントによってスラブします。ここでは、腎臓の推定量は 93.3 cm ³ です。(E・F)カヴァリエーリ技術、腎臓スラブ (F) のプロファイル断面のスキャンされたイメージの紹介。ここでは、腎臓の推定量は、92.8 cm ³ です。C-E、自然ラウンド最初の表面またはスキャナーに配置したり、クロス グリッド透明度オーバーレイ腎臓の最後のスラブではないセクションの表面としたがって、この組織のスラブでないセクション面積が測定します。(G・H)Overprojection 臓器スラブ (G) のスキャンされたイメージとクロス グリッド透明度 (H) を重ねて臓器スラブでのデモンストレーション。オルガン スラブの組織の overprojecting の部分は、白と黒の点線で示されます。実際のセクション プロファイル (すなわち、部分的に示された白い点線に囲まれた組織) の領域のみが決定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 13: 適切な (A) と準最適 (B) 試料の調製寒天包埋組織収縮の定量のための代表的なイラストに関連する組織学的プラスチック メディアの埋め込み試料の埋め込み。(A) プラスチック樹脂に埋め込む前にブタの皮下脂肪組織の固定サンプルのセクションの表面のスキャンした画像。サンプルは、サンプルの形状の安定化のためインク黒く寒天に埋め込まれたセクションの表面の輪郭の明確.(B)、寒天内セクション表面と内包された空気の泡 (矢印) の不明瞭な輪郭。スケール バー = 5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

解析		サンプル	処理
タイプ	メソッド
分子解析	RNA 転写産物、タンパク質、代謝物、脂質プロファイルでは、 メタボロミクス解析、DNA 解析	新鮮な (ネイティブ) 組織の小さな作品 *	ドライアイスまたは液体窒素で凍結します。-80 ° C でストア
質的な形態学的解析	組織学 [光顕・税込免疫組織染色 (IHC) そのままの交配]	新鮮な (ネイティブ)、またはその場で- 固定 * 組織サンプル	異なる定着剤 (例えば4% ホルムアルデヒド液) を使用して、メディアを埋め込み (パラフィン、GMA/MMA、エポキシ)、必要に応じて。
	Cryohistology (凍結切片、IHC を含む)	新鮮な (ネイティブ) 組織サンプル	ブロックの中にサンプルを埋め込むし、液体窒素冷却イソペンタンでフリーズします。
	微細構造の解析 [電子顕微鏡、税込伝送 - (TEM) と走査型電子顕微鏡]	新鮮な (ネイティブ) の小さな断片、またはその場で- 固定 * 組織サンプル	2.5-6.25% グルタルアルデヒド溶液のサンプルを修正し、エポキシ樹脂に埋め込みます。
定量的形態解析	光顕	新鮮な (ネイティブ) - またはその場で- 固定 * 組織サンプル	フェース セクション (orientator-、isector-のセクション) および/またはプラスチックの埋め込まれた組織サンプルの VUR セクションを準備します。
	TEM	新鮮な (ネイティブ) の小さな断片、またはその場で- 固定の * 組織	エポキシ樹脂包埋試料のフェース (orientator-、isector-のセクション) セクションを準備します。

表 1: 異なるダウン ストリーム分析種類体系的にランダムにサンプリングされた場所から摘出した組織サブサンプル処理します。研究および調査の下で臓器の実験の設計によってサブサンプルの別の番号で体系的にランダムにサンプリングされた組織の各場所から摘出した、下流解析の種類ごとに処理します。最もブタ臓器・組織および調査のタイプのための詳しいプロトコルは、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」⁷で提供されます。GMA/MMA: Glycolmethacrylate/メタクリル酸メチル。フェース: 等方性一様ランダム。VUR: 鉛直一様ランダム。* 最大。2 mm³x 2 x 2。例えば組織灌流固定または固定の解決、肺の肺組織。

メソッド	代表的な結果
水没組織・臓器密度 (手順 1.1 では、図 1図 2) の定量法	ブタの臓器・組織		Ρ(g/cm ³)
	肝臓		1.071 ± 0.007
	膵臓		1.062 ± 0.016
	心室心筋		1.036 ± 0.014
	腎臓		1.044 ± 0.006
	腹部内臓脂肪組織 *		0.921 ± 0.032
	甲状腺		1.061 ± 0.007
	脳		1.051 ± 0.007
	副腎		1.063 ± 0.025
	骨格筋 * *		1.074 ー ± 0.003
	データは、平均 ± SD. 特定臓器重量測定した n = 18 豚 (14 4 の女性と男性の豚; 時代 2 年間に 60 日間 30-250 kg の体重)。* 空腸の腸間膜の脂肪組織。* * M. ロース, もも、M. 前脛骨筋 cranialis、M. 上腕三頭筋、M. gluteobiceps の値を平均します。
組織学 (手順 1.3、図 4) のための組織サンプルの処理中に埋め込みに関連する三次元組織収縮の定量	臓器・組織	包含媒質	fS
	腎皮質 (ブタ)	GMA/格闘技	0.89 ± 0.02
		エポキシ	0.92 ± 0.02
	データは、12 頭の豚の 24 試料の計測の平均 ± SD です。fS: 線形収縮補正係数。

表 2: 選択したブタの臓器・組織⁷, 異なるプラスチック メディアの埋め込みの腎皮質組織の埋め込みに関連する組織の収縮による収縮率補正係数の密度の代表的な結果。

Discussion

ブタの動物モデルからのバイオバンク サンプル コレクションの生成臓器ボリュームによる冗長な組織サンプルの広い範囲に適しています代表者の再現可能な世代堅牢な技術とプロトコルが必要です。異なる分析方法と薬剤の定量分析のためのサンプル セクションの方向のランダム化のため。本稿で説明する方法は、ブタの臓器や組織のサイズに合わせられるし、これら要求^2,7を効果的に満たすために開発されています。彼らはよく認識されている方法論的原則に基づいているし、以前別研究発表^2,7,12,21の実用性を証明しています。注目のメソッドは、さまざまな種類の代表的なサンプルの生成のため、さまざまな可能性がありますは決定しないパラメーターの取得に基礎を提供するので、組織・臓器のサンプルを調べる研究にとって重要です。これらのメソッドは、少しの努力で迅速に実行することができ、下流解析の事実上すべての種類と互換性のあります。したがって、彼らは動物ブタモデル バイオバンク プロジェクトだけでなく、適当と認められるが、またとして他の大型動物モデルの種 (例えば羊)、組織試料の定量的胎分析を含む研究の役に立つ、同様に獣医学。さまざまな方法の技術的な側面を考慮して、いくつかの重要なステップと制限はそれぞれの技術のプロトコルの実装時に考慮しなければなりません。

水没組織・臓器密度の測定法

サンプルは、内側の壁や組織サンプルや組織中の試料ホルダーとビーカーの底に水没メソッド (手順 1.1 では、図 1図 2)、ケアを使用して密度を取られなければならない組織の決定に生理食塩水に浸漬します。そうしないと、試料の重さではなく、サンプルによって転置された生理食塩水の量の重量スケールが表示されます。非常に小さい/軽い組織サンプル (数 mg)、水没組織密度の測定法は限られているため、生理食塩水の表面張力と水没はビーカーに液体の量のサンプル ボリュームの悪影響高商測定精度を妨げます。ここでは、サンプルの重量密度で計算されたボリュームではなく後続の計算で使用できます。水没による組織密度の定量はまた新鮮な (未定) 肺組織、臓器が実験的灌流/注入定着剤といくつかの場合の空気の一貫性のないコンテンツのための効果的ではないです。

カヴァリエーリ器官の容積の測定法

ブタの臓器や組織のカバリエリ超高速法は臓器重量と密度から臓器体積測定方法と比較されたときより面倒です。しかし、臓器の実験的処理 (例えば臓器の灌流固定または固定の解決、肺) のため適切に重量を量ったことはできませんに適しています。ここでは、カヴァリエリ超高速メソッドは手順 2 (図 5図 6図 12) 出来高で加重された体系的なランダム サンプリング手法で理想的に結合できます。臓器臓器・組織 (カヴァリエリ アプローチ、ステップ 1.2、図 3) の平行、等間隔のスライスのセクション プロファイルの領域からボリュームの推定時に、組織の方向性スラブ (上部と下部の断面平面)、セクションのすべてのプロファイルの領域の正確な決定は非常に重要なのと同様。特に、デジタル画像や臓器スラブのスキャンを平面的分析される場合組織スラブ (図 12G H) (断面組織面) の外の組織の overprojections 慎重に考慮されなければならない信頼性の高いボリュームを提供するには見積もり。

組織学のための組織サンプルの処理中に埋め込みに関連する三次元組織収縮の測定

埋め込みに関連する組織の収縮の程度埋め込む媒体と、組織の種類に依存し、も同じ組織の特異的加工サンプルと異なる場合があります。

凍結切片は X-Y 平面に事実上ない収縮を表示すると見なされ、組織の少し収縮を引き起こす一般的にプラスチックを埋め込む、埋め込みに関連する組織の収縮は特にパラフィン埋め込まれた組織サンプルで広範です、これらのサンプルの組織学的セクションの寸法パラメーターの定量化の形態学的分析が通常大きく落ちる、と。全体的な 3次元収縮の大部分、に加えて、サンプルの別の解剖学的構造、組織型と内細胞型の不均一、差分、異方性、および変数の収縮が発生パラフィン包埋も組織サンプル^8,13。また、パラフィン埋め込まれた組織サンプルの厚い組織学的セクションで特に組織収縮の程度も大きく X Y 方向と Z 方向のセクションで異なる場合があります。これは組織から断面の後に暖かい組織浮選水浴のセクションのストレッチ中に差分 (X, Y 方向) でセクションとセクションの高さ (すなわち、垂直断面の厚さ) の収縮することができます。ブロック、ガラス スライド (すなわちセクションの z 軸の均質な崩壊)⁸マウント セクションの後続処理、染色、および coverslipping プロシージャの間に。さらに、厚いセクションである可能性があります、セクション内のセクション平面近く組織領域の比較的強い圧縮 (セクションの z 軸の差分の変形につながる) ティッシュのブロックからのセクションをカットしながら¹⁹.これらの効果もに光 disector などの明確な定量的解析メソッドによってセクション内の組織構造の数の見積もりをゆがむ場合がありますし。したがって、予測、監視、および埋め込みに関連する組織の収縮の補正はパラフィン埋め込まれた組織サンプル⁸の実行可能ではありません。

対照的に、GMA/格闘技や、エポキシなどの樹脂に埋め込まれた組織サンプルの体積収縮の程度は低いと、重要なより均一大幅です。したがって、仮定された均質な組織の収縮異方性とグローバルは別の定量形態学的パラメーター^17,18いくつかの分析方法の有利なプラスチック樹脂に埋め込みます。プラスチック樹脂に埋め込む関連組織収縮の推定、時に固定ティッシュの形する必要がありますないさらにゆがんで表示される対応する固定され、埋め込まれたプロファイル断面の比較をする中、埋め込みサンプル。これは、脂肪や肺組織などソフトまたは容易に圧縮の組織サンプルや流体含有量の高い組織サンプルは難しいこと。ここでは、プロシージャを埋め込みその後プラスチック中に組織サンプルの形状を安定させるために便利です組織の区分する前に寒天で固定サンプルの埋め込み (プロトコル手順 1.3.、 図 4)。信頼性の高いデータを達成するために、同じ組織の別のサンプルを使用して、埋め込みに関連する組織の収縮の繰り返し測定を実行必要があります。線形組織収縮係数f_sとして埋め込みに関連する組織の収縮の程度を表現 (プロトコル手順 1.3.9。、 図 4)。様々 な長さ、表面積、ボリューム パラメーターの異なる組織構造の収縮補正f_sを用いた方程式の例いくつか薬剤の定量的研究^14,で提供されます^21,27。

出来高で加重された体系的なランダム サンプリング ポイント数えると異なるダウン ストリーム分析の組織サブサンプルの処理によって

ブタ器官の提示ボリューム加重サンプリング法一度、組織内のランダム サンプリングの場所を判断し、その後から摘出した組織サンプルのサブサンプリングによってさらに異なる分析のためのすべての必要なサンプルを生成しますこれらの場所の⁷。出来高で加重された体系的なランダム サンプリング体制で検討中の臓器の容量内各可能なサンプリング位置は、サンプリングされるまさに同じ偶然、一般化がのコレクションによって確保されて、標本数が足りない。おそらく個別の (可能性のある予期しないと認識されない) 不等分布によるバイアスの解析結果を効果的に防ぐ実質臓器からのサンプルの生成の出来高で加重された体系的なランダム サンプリングのデザインを使用してしたがって、実証されている臓器の別の場所内の機能や形態学的組織のプロパティ、例えば、平均ボリュームと肝実質^{28 の異なる領域に肝細胞の数値ボリューム密度の}.ブタの臓器に注目「組織塊とサブサンプリング」戦略は分かりやすい、下流解析手法の技術的要件に準拠しているとすぐに実施でき特定調査要求に適応系統的サンプリング バイアス、実験の可変性を減らすとサンプリング戦略各単一の試料採取場所はランダムに決定するよりも効率的でありながら、全体的な実験の精度を上げる^{9 を回避 ,15}。生成される持っている標本の数は明らかに検査パラメーターとサンプリングされた臓器・組織の別の場所からのサンプルの内でその変動に依存します。さまざまな分析方法によって (サンプリング時に指定されていない) 別のパラメーターの最大値の検査のためできるように設計されたバイオバンク サンプル コレクションの生成、このような将来の見通しに関するサンプリング戦略を通常スケジュールします。比較的高い臓器ごとの冗長なサンプル数の世代。

薬剤の定量解析の等方性一様ランダム (フェース) セクションおよび垂直一様ランダム (VUR) セクションの生成

いくつかのテクニックが薬剤分析やや複雑な理論的な基盤と説明は、したがって量的 (不必要) 多くの科学者によって控えのフェース、VUR のセクションの生成の使用の実用的な合理的に簡単に実装できます。VUR のセクションは特に簡単に生成であり、サイクロイド テスト システム^8,9,20との組み合わせで面積密度推定に最適。断面平面の身近な向きがあるため最寄りが多い。ただし、フェースのセクションとは対照的には、VUR のセクションない長さパラメーター^8,9の推定に適しています。

フェースおよび VUR セクションの準備時に重要なステップは、基本的には、プラスチック樹脂に埋め込む時に固定サンプルのフェースまたは VUR セクションの表面を維持するために確保し、VUR のセクションの垂直方向の軸を常に識別できること (手順 3、図 9, , 図 10図 11)。

将来的に上記の方法のより広範なアプリケーションが匹敵する、多目的バイオバンク サンプル豚等の大動物モデルからの世代のための一貫して高品質基準を確立に大きく貢献。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.