Summary
실용적인 응용 프로그램 및 다운스트림 분석 biobank 프로젝트에서의 광범위 한 스펙트럼에 대 한 돼지 동물 모델의 대표적인 조직 샘플의 세대를 위한 방법의 성능을 시연, volumetry를 포함 하 여 체계적인 무작위 샘플링 그리고 차동 질적 및 양적 형태 론 적과 분자 분석 유형에 대 한 조직 샘플의 처리.
Abstract
변환 의료 연구에서 돼지 모델 꾸준히 더 인기가 되고있다. 특히 유전자 변형된 돼지의 개별 동물의 높은 가치를 고려 하 고 모델과이 모델의 사용 가능한 동물의 자주 제한 수, 적절 하 게 처리 조직 샘플의 (biobank) 컬렉션의 설립에 적합 한 샘플링, 시간 시점에서 지정 되지 않은 분석을 포함 하 여 후속 분석 방법의 광범위 한 의미 있는 접근을 활용 모델의 변환 값을 나타냅니다. 돼지 해부학의 특성에 관하여 포괄적인 지침 최근 대표, 다른 돼지 장기와 조직에서 높은-품질 샘플의 표준화 된 세대에 대 한 설립 되었습니다. 이러한 지침의 결과 다른 연구와 조사 사이 그들의 comparability 재현성에 대 한 필수적인 전제 조건은 없습니다. 기본 데이터, 장기 무게 볼륨, 결정의 샘플링 위치와 조직 샘플의 숫자의 생성으로 그들의 방향, 크기, 처리 및 트리밍 방향, 녹음 관련 요인이 가해질 및 분자, 질적, 양적 형태소 분석에 대 한 견본의 유용성을 결정. 여기, 한 설명, 실용적인, 단계별 데모의 가장 중요 한 기술 담당자의 세대에 대 한, 돼지 조직에서 다목적 biobank 견본 제공 됩니다. 여기에 설명 된 방법이 포함 기관/조직 볼륨 및 밀도, 조직의 수축의 넓이의 포인트-세기, 결정에 의해 parenchymal 장기에 대 한 볼륨-가중치 체계적인 무작위 샘플링 절차의 응용 프로그램 결정 샘플, 및 "Orientator" 및 "Isector" 방법, 및 수직 제복에 의해 생성 된 균일 한 임의의 등방성 (IUR) 섹션 등 양적 stereological 분석에 대 한 무작위로 지향 샘플 세대의 조직학 포함 관련 무작위 (VUR) 섹션입니다.
Introduction
변환 의학, 돼지는 점점 사용을 위해 일반적으로 큰 동물 모델1,2,3,,45는 돼지 사이의 여러 유리한 유사성 때문과 인간 해부학 및 생리학, 및 설립된 분자 생물학적 방법의 세대에 대 한 허용 여부 맞춤, 유전자 변형 돼지 질병 조건1,4의 넓은 범위에 대 한 모델.
그러나, 설치류 모델에 비해, 동물 실험에 대 한 언제 든 지 제공 될 수 있다 각각 돼지 모델의 수가 제한 됩니다. 이것은 약 1 년, 그리고 돼지 모델 및 축산의 생성에 필요한 금융 및 시간 집중적인 노력 돼지 세대 간격. 따라서,이 돼지에서 생성 될 수 있는 샘플으로 서 돼지 모델의 개별 동물 들은 매우 귀중 한 유전자 변형 돼지 모델 및 장기 실험 문제 (예를 들면, 늦은 합병증의 경우에 특히 만성 질환) 세 개인2,,67에 검사 합니다.
모든 연구 과정에서 연구의 초기 실험 설계에 예정 하지 했다 추가 분석의 성능 수 나중으로 판명 관련, 예를 들어, 이전에서 발생 하는 별개 질문 발견 주소 예기치 않은 결과. 이러한 추가 실험에 대 한 적합 한 샘플을 사용할 수 없는 경우 disproportionally 높은 비용과 시간이 많이 소요 비용 추가 돼지와 조직 샘플을 생성 하는 데 필요한 수 있습니다. 그런 우발적 사건을 위해 준비 되, 다른 기관, 조직, 또는 바이오-액체, 양적 및 질적으로 후속 분석의 광범위 한 적합의 보존 백업 샘플 biobank 컬렉션의 중요 한 여겨진다 접근2,,67. 돼지 동물 모델에서 최적의 혜택을 파생, 적절 한 biobank 샘플의 가용성 또한 가능성을 제공 합니다 독특한 멀티 기관 수준에 동일한 샘플 자료에 광범위 한 다양 한 분석 방법 수행 하는 매우 동일한 개별 동물, 예를 들어, 다른 작업 그룹의 과학자 샘플의 유통 조직 연구 네트워크2,,67. 또한, biobanking에 '앞 ' 샘플링 전략 연구에 필요한 동물의 수의 감소에도 기여 한다. 돼지 모델 biobanking의 장점은 최근 다 기관, multiomics 연구, 검사 기관에서에서 입증 되었습니다에서 뮌헨 MIDY 돼지 Biobank 표본을 사용 하 여 장기 당뇨병의 유전자 변형된 돼지 모델에서 크로스 토크 2.
일반적으로 안정성과 이후에 수행된 분석의 결과의 판독을 준수 해야 합니다 biobank 샘플 몇 가지 필수 요구 사항이 있습니다. 샘플 reproducibly, 생성 해야 합니다 그리고 그들은 대표 해야 합니다, 즉, 적절 하 게 반영 하는 샘플7에서 찍은 조직/기관의 관심이 형태학 및 분자 기능. 다운스트림 분석 종류의 넓은 범위에 적합 될, 샘플 되어야 충분 한 수량에 촬영 하며 설명 포함 하 여 다른 분석 방법의 요구 사항 (시간 및 온도 조건 등)에 따라 처리 histopathological 분석, cryohistology, 파라핀 및 플라스틱 조직학, immunohistochemistry, 제자리에서 교 잡, ultrastructural 전자 현미경 분석, 임상 실험실 뿐만 아니라 분자 진단 분석 등 DNA, RNA, 단백질, 및 대사 산물의 분석.
수 있도록 다양 한 숫자, 볼륨, 길이, 또는 독특한 조직 구조의 표면 영역 같은 뚜렷한 양적 형태학 매개 변수 평가 대 한 양적 stereological 분석에 의해, 무작위로 섹션의 비행기는 각각 장기/조직의 조직학 샘플7,,89,,1011준비를 해야 합니다. 양적 형태학 연구, 조직, 기관, 또는 기관 구획의 총 볼륨의 정확한 결심에에서 샘플 (즉, 참조 공간)에서 찍은 결정적으로 중요 한7,9 , 12 각 기관, 조직, 또는 유기 체 내에서 관심이 매개 변수의 절대 수량 계산 하. 결국, 조직학 단면도의 준비 하는 동안 포함-관련 조직 수축 효과 결정 하 여 계정13에 있다. 따라서, 이전 연구에서 보관 된 샘플 (고정 조직 샘플, 임베디드 조직 블록, 조직학 단면도, 등등)의 특히 양적 stereological 분석은 때때로 심각 하 게 제한 하거나 심지어 불가능 한12, 특히 각 기관/조직의 volumetry 수행 되지 않았습니다, 아니 적절 한 샘플링 디자인 영장 대표 샘플을 숫자와 양의 사용 가능한 개별 샘플 충분 하지 않은 경우에 적용 하는 경우 또는 경우의 처리는 샘플의 양적 형태학 매개 변수 추정과 호환 되지 않습니다. 매니폴드 가능한 영향을 미치는 요인으로 인해 뚜렷한 양적 형태학 매개 변수 분석에 대 한 아카이브 샘플 자료의 적합성 명백 하 게 답을 수 없는, 그러나 각 개인적인 케이스의 신중한 평가에 따라 달라 집니다.
따라서, 위치, 크기, 숫자, 처리, 트리밍, 방향과 샘플의 후속 분석의 결과 영향을 줄 것 이다, 이러한 요인 매우 중요 하 고 어떤 연구의 실험 설계에 고려 되어야 한다. 이러한 측면 및 돼지 해부학, 돼지에 적응된 동물 모델 설립 되었습니다 최근, 포괄적인, 상세한, 대규모 샘플링 지침의 특수 기능 표준화, 재현성에 대 한 강력한 참조를 제공 하 그리고 50 개 이상의 다른 돼지 장기와 조직6,7에서 중복, 적절 하 게 처리, 높은-품질의 효율적인 생성.
방법론 설명 및 현재 문서에 표시 된 비디오 튜토리얼 제공, 설명, 이해할 수 있는, 단계-의해 단계를 지시 volumetry를 위한 기술의 다양 한의 실제 성능에 대 한 돼지 직물의 샘플링 및 장기, 고 다른 다운스트림 분석 방법에 대 한 조직 샘플의 처리. 관련 조직의 3 차원 수축 량의 크기의 결정을 포함 하 여 추천된 기술 기관/조직 볼륨 및 Archimedes 및 Cavalieri9의 원칙에 따라 밀도의 결정에 대 한 메서드를 포함 합니다 조직학 검사에 대 한 처리 하는 동안 다른 포함 미디어14 에 포함, 실용적인 볼륨 가중치 체계적인 무작위 샘플링의 응용 프로그램, 샘플된 조직 표본에 대 한 처리 접근 다른 후속 분석7,8,,915및 적절 하 게 지향 및 잠재적인 양적 stereological 분석7,8, 샘플 처리 9,,1011. 돼지 biobank 프로젝트에 응용 프로그램, 옆 시연된 메서드는 일반적으로 장기/조직의 양적 조직 형태학 속성을 검사 하는 모든 연구에 대 한 적절 한. 또한, 체계적인 무작위 샘플링 디자인은 분자 분석 방법을 사용 하 여 풍부한 변경의, 예를 들면, RNAs, 단백질, 또는에서 대사 산물을 검출 하는 실험에서 대표 샘플의 세대에 대 한 특히 유용 각종 기관 및 조직입니다.
다음 단락에서는 그들의 실질적인 성능을 프로토콜 섹션에서 설명 하는 동안 이러한 방법에 대 한 간략 한 소개를 제공 합니다.
기관/조직 볼륨의 결정
장기 무게와 볼륨의 결정은 여러 실험 설정에서 중요 한으로 이러한 요소를 나타낼 수 있습니다 변경, 잠재적으로 관련 된 실험적으로 시험 관심의 요인. 기관/조직의 총 볼륨 또한 일반적으로 절대 양적 매개 변수 (예:, 전체 휴대폰 번호), stereologically 예상된 숫자 볼륨 밀도 (즉, 볼륨 단위 당 세포의 수에서 계산 하는 데 필요한 조직)의7,12. 컴퓨터 단층 촬영, 같은 복잡 한 기술적인 장비를 사용 하 여 기술을 제외 하 고는 기본적으로 일반적으로 기관 또는 조직의 절대 볼륨을 결정 하는 데 사용 하는 세 가지 실용적인 방법. 장기의 볼륨 "직접 체적 측정" Archimedes, 즉의 원칙에 따라, 물 또는 염 분 완전히 빠져들 때 구조에 의해 난민의 볼륨을 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, comparably 대형 돼지 장기에 대 한 이러한 접근은 허무 하 고 경향이 부정확성, 이후 그들은 매우 큰 체적/측정 플라스 크를 필요로. 더 편리 하 게,의 기관/조직 볼륨의 무게와 밀도7,,1216, 효율적으로 "침수 방법"7,12 사용 하 여 결정 될 수 있는 산출 될 수 있다 ,16 (프로토콜 단계 1.1.). 기관/조직 볼륨 (1598-1647) "Cavalieri의 원칙"에 따라 volumetry 접근을 사용 하 여 추정 또한 수 있습니다. 간단한 기간에서는, Cavalieri 원칙 상태, 두 개체는 접지 평면에 평행한 평면에 구분 하 고 섹션의 프로필에 해당에 두 개체를 극복 하는 경우 지 면에서 거리는 동일한 지역, 두 개체 동일한 볼륨이 있다. 따라서, 임의로 모양의 개체의 볼륨 병렬, 동등 하 게 먼 섹션 평면 및 단면 평면 사이의 거리에 그들의 섹션 프로필 분야의 제품으로 추정 될 수 있습니다. 이것은 다음과 같은 비유를 이해할 수: 동일한 동전 같은 수로 구성 된 두 개의 스택을 병행 하 여, 서로 양보는 동전, 스택과 다른 원통 모양 모양 스택 동전 질서와 하나의 스택 배치 됩니다 고려 오프 센터 코인의 스택 위치 동전 (그림 3A). 두 동전 더미의 형태는 다른, 그들의 볼륨 동일 합니다, 이후 두 스택의 해당 수준에서 동전의 영역 (즉, 병렬 섹션의 프로필 영역에서 동등한 거리에서 두 동전 스택을 통해 잘라는 접지) 같습니다. 돼지 장기 및 조직 Cavalieri 원리7,,1215 를 사용 하 여 볼륨의 추정 단계 1.2에서에서 설명 되어 있습니다.
조직학 포함 관련 조직 수축의 범위 결정
조직학 직물 단면도에서 측정 된 여러 양적 형태학 매개 변수 분석, 포함-관련 조직 수축 조직 조직학에 대 한 처리 중에 발생의 효과 결정 하 고 고려 한다. 포함-관련 조직 수축 범위 변수를 있을 수 있습니다 그리고 모두 처리, 조직과 포함 중간8,,1317,,1819에 따라 달라 집니다. 포함-관련 변경 사항 (즉, 주로 수축) 조직 샘플의 볼륨의 공간, 및, 따라서, 양적 stereological 분석8에 의해 모든 차원 매개 변수 추정의 모든 3 개 차원에서 발생 하는 일반적으로, . 기본적으로, 단계 1.3에서에서와 같이 포함-관련 조직 수축, 선형 조직 수축 계수 (fS)로 표현 된 범위 추정 수 있습니다. 그리고 (수축 구분) 양적 형태학 매개 변수14의 수정에 대 한 사용.
기관/조직의 체계적인 무작위 샘플링 볼륨 가중치
돼지 장기/조직 샘플의 biobank 컬렉션의 설립에 대 한 볼륨 가중치 체계적인 무작위 샘플링 방법과 같은 2 단계에서 설명한 입증 실용적, 시간-절약 및 효율적인 기술 대표의 생성에 대 한 다목적 조직7,8,,915샘플링합니다.
Stereological 정량 분석에 대 한 임의의 균일 한 등방성 섹션 및 임의의 유니폼 수직 섹션의 세대
Biobank 조직 샘플 매개 변수를 적절 하 게 준비 된 표본 없이 확인할 수 없습니다 그의 최대의 견적에 대 한 다른 양적 stereological 분석 방법의 넓은 범위에 적합 해야 합니다. 거의 모든 양적 stereological 매개 변수, "등방성 (독립) 획 일 한 무작위 (IUR) 섹션"8,9를 사용 하 여 결정 수 있습니다. IUR 섹션에서 조직 샘플의 섹션 평면 3 차원 방향 무작위입니다. "Isector" 방법11 (3.1 단계 프로토콜), 또는 단면 평면을 기준의 방향의 랜덤 적용이 섹션 비행기의 위치를 기준으로 조직 샘플의 위치는 랜덤에 의해 달성 될 수 있다는 "Orientator" 방법10 (프로토콜 단계 3.2)에서 조직 샘플 피부 또는 점 막 견본 표시는 또는 정의 자연스럽 게 존재 하 고 제대로 식별 수직 축, "수직 획 일 한 무작위 (VUR) 섹션"의 준비 등 조직 샘플에서 (프로토콜 단계 3.3.)의 평면 내에서 엄격 하 게 구분 그들의 수직 축은 유리8,20입니다. IUR/VUR 샘플링의 이론적 기초 및 잠재적인 다운스트림 양적 stereological 분석에 대 한 포괄적인 논의의 완전 한 담 론에 대 한 관심이 있는 독자 양적 stereology 인생에서의 교과서 라고 과학8,9.
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Protocol
모든 방법을 설명 여기 죽은 동물에서 파생 된 조직 샘플을 사용 하 고 동물 복지의 독일 법적 규정 준수.
1입니다. Volumetry
- 조직/기관 밀도의 결정에 대 한 침수 기법 (그림 1 및 그림 2) 7 , 12 , 16
- 재료 준비: 메스 블레이드, 종이 타 올, 고급 집게, 표준 실험실 저울, 유리 또는 플라스틱 비 커, 0.9% 식 염 수, 그리고 자체 생성 된 견본 홀더 (그림 2A).
- 직물의 조각을 소비 세 (최대 크기: 2 x 2 x 2 cm3) 기관/조직, 특히 관심의 기관 실에서에서에서. 뇌 하 수 체, 뇌의 송과선, 등 작은 기관은 측정 토토이다.
주의: 샘플의 크기 특히 비 커 (단계 1.1.5 하 참조), 그리고 단계 1.1.7에서에서 비 커의 내벽을 접촉 하지 않고 샘플의 완전 한 침수를 허용 하도록 그것의 충전 레벨의 내경 보다 작은 있는지 확인 합니다. - 조심 스럽게 면봉 과잉 혈액/조직 액체를 제거 하는 종이 타월로 샘플.
- 정밀 규모 샘플 무게와 샘플 (mS)의 무게를 기록. 가장 가까운 mg (그림 1A) 작은 조직 샘플의 무게를 결정 합니다.
- 규모에 실내 온도 0.9% 식 염 수로 채워진 비 커를 놓습니다. 완전히 허용 하기 위해 다음 단계에서 조직 샘플의 침수 범람 없이 비 커를 작성 하지 마십시오.
주의: 비이 커 크기는 크기와 무게 측정 조직 sample(s)의 규모의 효과적인 측정 범위에 적합 한 사용 합니다. 2 x 2 x 2 cm3큰 샘플에 대 한 50-100 ml 비이 커 크기는 적절 조합에서 500 g 약 100 밀리 그램에서 측정 하는 규모와 작은 샘플을 함께 사용 하 여 조합에서 5-10 mL 볼륨의 비 커와 정밀 저울 약 0.1 mg 20 g 사이 측정 범위. - 표시 된 위치 ( 그림 1B, 그림 2B및 그림 2C에 화살표)에 염 분에 샘플 홀더 (즉, 얇은 철사의 충분히 엄밀한 루프 또는 이와 유사한, 그림 2A) 잠수함. 그런 다음, 다시 (자체) 0 규모의 디스플레이 설정 합니다.
- 조심 스럽게 샘플 홀더를 조직 샘플을 첨부 하 고 ( 그림 1B, 그림 2B및 그림 2C에 화살표) 샘플 홀더에 표시 된 위치에 도달할 때까지 완전히 샘플은 염 분에 잠수함.
주의: 잠긴된 샘플 및 샘플 홀더 없어야 비 커의 하단 또는 염 분의 표면 또는 내부 벽과 접촉 합니다. - 그 자리에 샘플 홀더 및 물속에 잠긴된 샘플을 잡고, 조직 샘플에 의해 전치 하는 염 분의 무게를 언급 (mL), 눈금에 표시 무게 기록 (그림 1 C, 그림 2B, 그리고 그림 2C)입니다.
- 계산 하는 샘플 mL에서 (VS)의 볼륨 및 실내 온도 (20 ° C)에 염 분의 밀도 (ρ염 분 = 1.0048 g/cm³) VS mL= / Ρ염 분 [g/g/cm³] (그림 1)입니다.
- 무게 (즉, 대량) 샘플 (mS)와 볼륨 (VS)에서 조직 샘플 (ρ샘플)의 밀도 계산: ρ샘플 = mS /VS[g/cm³] (그림 1).
- 측정 기관 토토, 3 번 측정을 반복 하 고 단일 측정 값에서 평균 장기 밀도 계산. 큰 장기/조직에 대 한 동일한 기관/조직/기관 구획의 다른 샘플 반복된 측정을 수행 하 고 그에 따라 단일 측정에서 평균 밀도 계산.
- 그 무게와 밀도 (그림 1)에서 기관/조직/기관 구획의 전체 볼륨을 계산 합니다.
- 돼지 장기 볼륨의 결정 위한 Cavalieri 방식 7
- 재료 준비: 통치자, 캘리퍼스, 칼가 위, 집게, 방수 펜, 플라스틱 투명, 스캐너, 카메라, 그리고 상호 격자 플라스틱 투명에 인쇄 된 사진.
- 일반 표면 (절단 자료)에 전체 기관/조직을 놓고 (그림 3B, 그림 5A) 세로 축 따라 장기의 길이 (l)를 측정 합니다.
- 잘라 완전 한 기관/조직 등거리 병렬 조각 직교 경도 기관 축 (그림 3C, 그림 5B). 두 섹션 사이 (즉, 단면 간격/섹션 두께, 보통 대략 1 cm) 조직/기관 석판의 충분 한 번호를 충분히 작은 거리 d 를 선택 합니다. 무작위로 장기의 여백에서 0과 단면 간격 사이의 거리 내에서 첫 번째 섹션을 배치 합니다. 슬 라이 싱, 하는 동안 시각적으로 위치와 대략 균일 한 두께의 약 병렬 기관/조직 석판을 얻기 위해 각 섹션 평면의 방향을 판단.
참고: 조직/기관 석판의 필요한 수 검사 기관/조직의 크기와 모양에 따라 달라 집니다. 작은 기관 또는 샘플 ≤ 5 mm의 얇은 석판에 구분 될 필요가, agar 단면 이전에 샘플을 포함 (단계 1.3.3 참조) 천 포함 된 샘플의 조각화에 대 한 기술적 장치를 사용 하 여. 가장 돼지 장기와 조직에 대 한 경험적으로 추천 단면 간격 뿐만 아니라 조각화 장치에 대 한 예제는 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"7의 보충 자료에 표시 됩니다. - (즉, 오른쪽 또는 각 기관 슬 래 브, 3D 그림, 그림 5C의 왼쪽된 섹션 평면에 일관 되 게) 가공 기지에 아래로 향하게 동일한 표면에 모든 기관/조직 석판을 놓고 석판 (n)을 계산 합니다.
- 다음 방법 중 하나에 의해 조직 석판의 섹션 프로 파일을 얻기:
- 신중 하 게 그들의 상위 및 하위 섹션 표면 방향을 유지 하면서 레이블이 표시 된 플라스틱 투명에 조직 슬라브를 놓습니다. 방수 펜 (그림 3E1-2)를 사용 하 여 플라스틱 투명에 조직 석판의 윤곽선을 추적 합니다.
- 섹션 표면 (그림 3 층) 위에 수직으로 카메라를 들고 조직 석판의 사진 이미지를 가져가 라. 보정에 대 한 조직 석판 옆 크기 통치자를 놓습니다.
- 그들의 상위 및 하위 섹션 표면 (그림 3)의 방향을 유지 하면서 조직 석판 평판 스캐너에 스캔. 보정에 대 한 조직 석판 옆 크기 통치자를 놓습니다.
- 다음 방법 중 하나에 의해 모든 조직 석판의 (추적, 촬영, 또는 스캔) 섹션의 영역을 측정:
- 오버레이 또는 추적된 기관 슬 래 브 프로필을 적절 한 크기의 첨가, 플라스틱 투명도 및 수 모든 프로필 영역 (3E 그림3-4; 비교 타격 십자가에 동등 하 게 간격 둔된 십자가의 보정된 표 인쇄 그림 5D). 1 십자가에 해당 하는 지역에 의해 프로 파일 영역을 타격 하는 십자가의 수를 곱하여 각 기관 석판의 섹션 프로필 영역을 계산 합니다.
참고: 충분히 정확한 볼륨을 받을 추정, 인접 한 십자가 사이 충분히 작은 거리와 교차 그리드를 선택, 적어도 100의 평균 교차 되도록 한 기관 연구의 경우에 각 시험의 석판의 섹션 표면 충돌 . 가장 돼지 장기와 조직에 대 한 경험적으로 추천 크로스 그리드 크기 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"7의 보충 자료에 표시 됩니다. - 영역 측정 사진/스캔의 디지털 이미지에서 조직 석판의 사용 하 여 적절 한 상용 또는 프리웨어 morphometry 소프트-및 하드웨어 응용 프로그램 (그림 3 H), 상업 이미지 분석 시스템21, 등 또는 ImageJ22.
주의: 참고 한 조직 슬 래 브 (첫 번째 또는 마지막) 각각 자연 표면에 휴식 하는 스캐너에 배치 됩니다, 그리고 그것의 자연적인 표면 카메라를 얼굴. 따라서,는 스캔 한 이미지,이 슬 래이 브의 사진 이미지, 섹션 표면 표시 되지 않습니다. 따라서, 아무 섹션 영역 프로 파일은이 조직 슬 래 브 (그림 3I)의 스캔 한 이미지/사진 이미지에 측정 됩니다. 또한 참고-프로젝션 스캔 한 이미지와 기관/조직 석판, 즉의 사진에만 실제 섹션 프로필의 아니지만의 슬 래 브 섹션 표면 (그림 12 뒤에 이미지에 조직 영역 측정 G-H).
- 오버레이 또는 추적된 기관 슬 래 브 프로필을 적절 한 크기의 첨가, 플라스틱 투명도 및 수 모든 프로필 영역 (3E 그림3-4; 비교 타격 십자가에 동등 하 게 간격 둔된 십자가의 보정된 표 인쇄 그림 5D). 1 십자가에 해당 하는 지역에 의해 프로 파일 영역을 타격 하는 십자가의 수를 곱하여 각 기관 석판의 섹션 프로필 영역을 계산 합니다.
- 계산 영역의 모든 해당 섹션 프로필 사건 당 모든 조직 석판의 합계의 제품으로 추정된 기관 볼륨 (즉, 오른쪽 또는 왼쪽의 일관 되 게 각각, 각 장기의 상위 또는 하위 섹션 표면 슬라브 그리고 석판 (즉, 수직 기관 축 (l)와 석판의 수의 측정된 길이의 몫)15의 평균 두께.
- 조직학에 대 한 조직 샘플의 처리 하는 동안 3 차원 포함-관련 조직 수축의 범위 결정
- 재료 준비: 톰 블레이드, 집게, 한 천, 금속 주조 금형, 디지털 스캐너, 및 (예를 들어, 그래프 용지) 크기 통치자.
- 잘라 고정된 조직 샘플에서 신선한, 평면 섹션 표면.
참고: 샘플을 사용 하 여 쉽게 변형 (부드러운) 조직 (지방 조직, 젤라틴 조직), 포함 고정된 조직 샘플 한 단면 (그림 4A) 이전에. - Agar에 샘플을 포함:
- 미생물학 문화 매체 물에 대 한 적절 한 볼륨으로 사용 된 표준 한 천 분말 믹스 (약 0.5-1 g 한 천/10 물) 유리 비 커에. 혼합물을 저 어 하 고 3-5 미 혼합물을 저 어 하 고 다시 3-5 s에 대 한 종 기를 끓는 때까지 700 W에 렌지에 그것을 열.
- 필요한 경우, 조직 샘플을 agar의 대비를 증가, 액체 천, 예를 들어, 검정 잉크와 염료 (뜨거운 액체 agar의 10 mL를 1 mL 잉크를 추가 하 고 적극적으로 볶음).
- 주조 금형 (예를 들어, 파라핀 포함, 그림 10A-D에 사용 되는 금형)에 뜨거운 agar를 부 어 따뜻한 agar에 고정된 조직 샘플을 잠수함. 한 천은 응고까지 시원한, 그리고 톰 또는 면도날을 사용 하 여 포함 된 조직으로 한 블록을 잘라 보자.
주의: 뜨거운 액체 agar를 처리 하는 동안 보호 고글과 장갑을 착용 하십시오. 프로세스 조직 샘플 포름알데히드는 배기 솔루션에서 고정 후드 및 보호 고글과 실험실 장갑을 착용.
- 크기 눈금자 함께 평판 스캐너에 직면 하 고 그것의 섹션 표면 샘플을 놓고 섹션 표면 (그림 4AB)를 검색 합니다.
- 단계 1.2.6 (그림 4B)에 설명 된 방법 중 하나를 사용 하 여 디지털 스캔에서 고정된 조직 샘플 (f)의 섹션 표면 영역을 결정 합니다.
- 에폭시 (예를 들어, Epon) glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/병 무 청)23, 다음 표준 프로토콜23,,2425 (와 같은 플라스틱 포함 매체에 샘플 포함 그림 4C)입니다. 이전 단계 (1.3.4)에서 스캔 고정된 샘플의 섹션 표면 플라스틱 포함 샘플에서 유지 됩니다 확인 하십시오.
참고: 샘플의 처리 중 섹션 표면 샘플의 방향을 유지, 일관 되 게 포함 카세트 또는 주조 금형으로 아래쪽으로 직면 하 고 그것의 의도 된 섹션 표면 샘플을 배치 하거나 의도 섹션 표시 표면 (또는 샘플의 반대편) 잉크. - 해당 고정된 조직 샘플 (단계 1.3.2)의 원래 섹션 표면 하 플라스틱 블록에서 조직학 섹션을 사용 하 여 잘라 톰 (그림 4D), 유리 슬라이드 (그림 4D)에 섹션을 탑재와 정기적으로 (얼룩 예를 들어, Hematoxylin 및 오신 얼룩, H & E)24,25.
주의: 고정된 조직 샘플의 원래 섹션 표면으로 동일한 평면에 조직학 단면도 받을, 단면 전에 신중 하 게는 톰의 마운트에 플라스틱 블록의 위치 조정. - 슬라이드 크기 눈금자 함께 평판 스캐너에 아래쪽으로 직면 스테인드 섹션 배치 하 고 검색 섹션 (그림 4E).
- 1.2.6 (그림 4 층) 단계에서 설명한 방법 중 하나를 사용 하 여 디지털 스캔에 플라스틱 포함 조직 샘플 (Ae)의 섹션의 영역을 결정 합니다.
- 매체를 포함 하는 플라스틱에 포함 전후 (각 조직과 매체 포함)에 대 한 평균 포함-관련 조직 수축 조직 샘플의 해당 섹션 프로필의 측정된 영역에서 계산 합니다. 선형 수축 량 요인 fs 의 영역과 매체 (e)을 포함 하는 플라스틱에 포함 후 n 조직 샘플의 섹션 프로필의 분야의 몫의 제곱근으로 계산 되는 매체 (f) (그림 4G)를 포함 하는 플라스틱에 포함 하기 전에 동일한 조직 샘플의 해당 섹션 프로필14.
2. 볼륨-가중치 계산 하 고 다운스트림 분석 종류7 에 대 한 조직 하위의 처리에 의해 체계적인 무작위 샘플링을
- 재료 준비: 통치자, 캘리퍼스, 칼가 위, 집게, 방수 펜, 포인트/크로스 플라스틱 투명, 및 무작위 번호 테이블에 인쇄 하는 격자.
참고: 복사 템플릿은 교차 하는 격자 (5-60 m m) "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"7의 보충 자료에 제공 됩니다. - 기관/조직을 일반 표면 (절단 자료)에 놓고 (그림 5A, 그림 6A) 세로 축 따라 장기의 길이 (l)를 측정 합니다.
- 잘라 완전 한 기관/조직 등거리 병렬 조각으로 직각의 경도 축 (그림 5B). 두 개의 섹션 (즉, 단면 간격/섹션 두께, 보통 대략 1 cm) 조직/기관 조각의 충분 한 수를 충분히 작은 사이의 거리 d 를 선택 합니다. 무작위로 장기의 여백에서 0과 단면 간격 사이의 거리 내에서 첫 번째 섹션을 배치 합니다. 슬 라이 싱, 하는 동안 시각적으로 위치와 대략 균일 한 두께의 약 병렬 기관/조직 석판을 얻기 위해 각 섹션 비행기의 방향을 판단.
참고: 조직/기관 석판의 필요한 수의 검사 기관/조직 및 샘플된 조직 위치 수 크기에 따라 달라 집니다. 작은 기관 또는 샘플 ≤ 5 mm의 얇은 석판에 구분 될 필요가, agar 단면 이전에 샘플을 포함 (단계 1.3.3 참조) 천 포함 된 샘플의 조각화에 대 한 기술적 장치를 사용 하 여. 가장 돼지 장기와 조직에 대 한 경험적으로 추천 단면 간격 뿐만 아니라 장치를 부 러 뜨 리에 대 한 예제는 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"7의 보충 자료에 표시 됩니다. - 모든 기관/조직 석판 절단 자료 (그림 6B)에 아래로 향하게 동일한 표면에 놓습니다.
- 오버레이 바깥쪽을 배치 하 여 플라스틱 투명성에 적절 한 크기의 크로스 그리드와 조직 석판 인쇄 남은 격자의 십자가 위 조직 (그림 5C-D, 그림 6B)에서 임의의 포인트.
참고: 선택 충분히 작은 거리, 인접 한 십자가 사이 십자가 그리드 연구의 각 검사 경우, 적어도 두 번 많은 십자가에 있는 샘플의 수로 샘플링을 조직 구획의 섹션 사용을 칠 것 이다 그 조직 구획에서 가져온. 가장 돼지 장기와 조직에 대 한 경험적으로 추천 크로스 그리드 크기 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"7의 보충 자료에 표시 됩니다. - 표시 및 모든 십자가 조직 (각각 조직 하위 구획 샘플링 수 하) 타격. 일관 되 게 계산 하 고 각 줄, 오른쪽 왼쪽에서 각각 십자가의 연속 번호 여 예를 들어, 모든 조직 석판에서 샘플링을 조직 구획 타격 십자가의 번호의 유니폼 모드 적용 아래, 또는, 예를 들어, 12 시 위치, exemplarily 5E 그림에서 시연으로 가장 가까운 십자가 함께 시작 하는 시계 방향에서 또 다른 후 하나의 조직 슬 래 브에 십자가 번호 매기기 여 탑.
- 체계적 샘플링 간격 (i)를 생성 하는 샘플의 수에 의해 수 샘플된 (n) 조직/조직 구획을 명 중 하는 십자가의 수를 나눕니다.
- 1과 나사이의 간격에 임의의 숫자 x 를 선택 하 여 첫 번째 샘플링 위치를 결정 합니다. 이 위해, 난수 표를 사용 합니다. 첫 번째 샘플링 위치 (x)와 모든 다음 x + i, x + 2나, x + 3, 등, 플라스틱 투명도에 샘플링을 조직/조직 구획 타격 크로스 방수 펜 (그림 5 층)을 사용 하 여.
참고: 임의의 숫자 테이블 수 편리 하 고 신속 하 게 생성 한 온라인 난수 생성기를 사용 하 여. - 태그 위치에 해당 하는 표시 (그림 5G, 그림 6E 핀셋의 쌍을 사용 하 여 조직 슬 래 브의 표면에 깨끗 하 고 빈 색종이 종이의 작은 조각으로 약간 플라스틱 투명도 높이 십자가 조직 ).
- 샘플링된 위치 (그림 5, 그림 6 층, 그림 7A)에서 직물의 견본을 소비 세 및 추가에 지정 된 대로 후속 분석 (그림 6G, 그림 7A-B)의 종류에 대 한 그들을 세분화합니다 표 1.
- 샘플링 후 따뜻한 물과 비누, 건조, 플라스틱 투명을 청소 하 고 그들을 다시 사용 합니다.
3. 등방성 균일 한 임의의 (IUR) 및 양적 Stereological 분석에 대 한 수직 획 일 한 무작위 (VUR) 섹션의 세대
-
"Isector" 기술
- 재료 준비: 면도칼 또는 톰 블레이드, 한 천, 구형 주조 금형 (예, 호두, 제과 업체에서 얻을 수 있습니다에 대 한 금형 주조), 폴드 백 클램프 및 집게.
- 체계적으로 임의로 샘플링의 고정, 적절 하 게 크기의 조각 (1 c m3x 1 x 1) 조직 구형 주조 금형에서, 폴드 백 클램프에 의해 함께 개최 장소와 따뜻한 액체 agar (그림 8A-E) 몰드를 채울.
- agar의 응고 후 캐스팅 금형에서 agar 영역 (그림 8F)를 제거 합니다.
- 한 천 구 롤 테이블에서 포함 된 조직 샘플, 중지, 그리고 임의의 위치에 섹션.
참고: 결과 섹션 평면은 IUR 섹션 (그림 8F-G)입니다. - GMA/병 무 청, 등 플라스틱 수 지에 조직 샘플을 포함 진행 (1.3.5 참조) 비행기 IUR 섹션의 방향을 유지.
-
"Orientator" 기술
- 재료 준비: 면도칼 또는 톰 블레이드, 한 천, 집게, 임의의 숫자 테이블, equiangular, 및 코사인이 중 원의 지문이.
참고: 복사 템플릿은 서클의 이전 간행물8,26에 제공 됩니다. - 고정된 조직 (또는 고정 조직의 한 천 포함) 샘플에 배치 equiangular 원의 인쇄 한 가장자리를 가진 병렬 0-180 ° 방향 (그림 9A, 그림 10E).
- 임의의 숫자 테이블을 사용 하 여 임의의 각도 결정 합니다. 샘플에 달려 equiangular 원의 규모에 해당 마크를 찾아. 지향 되 고 단면 평면 equiangular 원의 규모에 표시 된 임의의 각도의 방향에 평행한 및 수직 하는 샘플을 통해 (또는 포함 된 조직 샘플을 둘러싼 agar), 섹션 컷 이러한 마크를 사용 하 여는 (그림 9B-C, 그림 10 층) 샘플의 표면 휴식.
- 코사인이 중 원에 아래쪽 (그림 9D, 그림 10 H) 1-1 방향에 평행 하 게 배치 하 여 휴식 서피스의 모서리와 직면 하 고 이전 단계에서 생성 된 섹션 표면 조직 블록을 배치 합니다.
- 3.2.3 단계를 반복 하 고 임의의 숫자 테이블 (그림 9E-F,-J 10I 그림)를 사용 하 여 결정 임의의 각도로 샘플을 통해 새로운 섹션을 잘라.
참고: 결과 섹션 평면은 IUR 섹션입니다. - 필요한 경우 1.3 단계에서 설명한 대로 포함-관련 조직 수축 (그림 9G-J)의 결정에 대 한 고정된 조직 샘플의 IUR 섹션 프로 파일의 영역을 결정 하 고 플라스틱에서 조직 샘플을 포함 진행 GMA/병 무 청 등 수 지.
- 재료 준비: 면도칼 또는 톰 블레이드, 한 천, 집게, 임의의 숫자 테이블, equiangular, 및 코사인이 중 원의 지문이.
-
수직 획 일 한 무작위 (VUR) 섹션의 세대
- 재료 준비: 면도칼 또는 톰 블레이드, 한 천, 집게, 임의의 숫자 테이블, 및 equiangular 서클의 인쇄.
참고: 복사 템플릿은 서클의 이전 간행물8,26에 제공 됩니다. - 후속 단계 샘플/섹션에서 인식할 수 있는 것은 항상 고정된 조직 샘플에서 세로 축을 정의 합니다.
참고: 일반적으로, 조직 샘플의 자연적인 표면에 수직 축 수직 축으로 선택 됩니다. - 해당 되는 경우는 agar (그림 11B)에 샘플을 포함 합니다.
참고: 일반적으로 작은, 얇고, 연약한, 또는 부드러운 샘플에 대 한 추천은 한 천 포함 이전 VUR-또는 IUR-단면 고정된 샘플의. 또한 사용 하 여 샘플의 agar 포함 플라스틱 수 지 매체에 샘플의 후속 포함 하는 동안 VUR sectioned 샘플의 위치를 용이 하 게. - 기가 테이블/종이 테이블 (그림 11C)의 평면에 지향 되 고 수직 축 equiangular 원 인쇄에 샘플을 놓습니다.
- 샘플 (임의의 번호 테이블을 사용 하 여 결정) 임의의 각도로 섹션 평면 직교 테이블에 잘라내어 VUR 단면 (그림 11D) 받을 수직 축에 평행.
- 해당 되는 경우 포함-관련 조직 수축 단계 1.3 ( 그림 9G-J를 비교)에 설명 된 대로의 결정에 대 한 고정된 조직 샘플의 IUR 섹션 프로 파일의 영역을 결정 하 고 진행에서 조직 샘플을 포함 하 GMA/병 무 청 같은 합성 하 수 플라스틱 지
- 재료 준비: 면도칼 또는 톰 블레이드, 한 천, 집게, 임의의 숫자 테이블, 및 equiangular 서클의 인쇄.
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Representative Results
조직/기관 밀도의 결정에 대 한 잠수 기술
그림 12A -B 는 밀도의 대표 결정 돼지 신장 단계 1.1 (그림 1, 그림 2)에서 설명 된 침수 기술을 사용 하 여 볼륨을 보여줍니다. 더 대표 추가 돼지 장기 및 조직의 밀도 측정 결과 표 2에 표시 됩니다. 다양 한 돼지 조직 및 장기의 기준 밀도의 더 포괄적인 목록 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"7에 표시 됩니다. 침수 메서드를 사용 하 여 가져온 조직 밀도 측정 값의 유효성은 독립적인 견본의 동일한 샘플의 반복된 측정 하 여 추정 수 있습니다. 염 분 (지방 조직, 폐 조직)에서 수영 조직 밀도 표시 하는 반면 가장 돼지 조직 물 (ρ물 ≈ 1.0) 보다 약간 높은 밀도 값을 표시 < 1.0.
Cavalieri 기관 볼륨의 결정 방법
그림 12C -F 는 돼지 신장 ( 그림 12A-B에서 같이 같은 기관)의 볼륨의 대표 결정을 보여 줍니다. 기관 석판의 섹션 표면 영역 했다 의해 결정 됩니다 포인트-세기, 플라스틱 투명에 인쇄 겹쳐 크로스 그리드를 사용 하 여 (지불 석판의 스캔 한 이미지에 기관 석판의 섹션 영역의 planimetric 측정 -투영 석판 섹션 표면, 그림 12 G H뒤에 있는 조직의 주의). 기관/조직 볼륨 Cavalieri 접근 (단계 1.2, 그림 3)의 성능에 의해 얻은 데이터를 비교 하 여 각 볼륨에 추정 수 있습니다의 정확도 무게와 밀도의 기관/조직에서 계산. 그림 12 에서 검사 신장의 볼륨 잠수 방법으로 결정 하 고 Cavalieri 메서드가 서로 다른 1% 미만으로 달랐다. Cavalieri 볼륨 견적의 정확도의 조치로, 오류 (CE)의 그것의 계수 계산 됩니다, 기술 이전15.
조직학에 대 한 조직 샘플의 처리 하는 동안 3 차원 포함-관련 조직 수축 량의 결정
조직 수축 플라스틱 수 지 (GMA/병 무 청 또는 에폭시) 양적 histomorphological 시험에 포함 돼지 조직 샘플 (대뇌 피 질의 신장 조직)의 관련의 넓이의 대표적인 결과 표 2 (이전에 표시 됩니다. 게시 되지 않은 데이터). 표 2 에 표시 된 선형 수축 량 요인 단계 1.3 (그림 4)에서 설명한 대로 결정 했다. 그들은 GMA/MMA 포함, 29% 및 에폭시 포함 돼지 피 질 신장 조직에 대 한 22%의 3 차원 볼륨 감소를 참조 하십시오. 그림 13 천 포함, 포 르 말린 고정 지방 조직 플라스틱 포함 이전 샘플 섹션 표면 영역의 측정을 위한 적절 하 고 충분 준비 샘플의 대표적인 예를 보여줍니다.
포인트 계산 및 다운스트림 분석 종류에 대 한 조직 하위의 처리에 의해 체계적인 무작위 샘플링 볼륨 가중치
볼륨 가중치 parenchymal 기관 (2 단계, 그림 5, 그림 6, 그림 7)의 체계적인 무작위 샘플링을 위한 "단면화 및 포인트 계산" 기술 담당자의 세대에 대 한 설립, 강력한 방법을 나타냅니다. 분석2,7의 여러 후속 유형에 대 한 샘플. 후속 차등 처리 여러 다른 삭제 조직 샘플의 하류와 다양 한 돼지 장기와 조직, 체계적으로 임의로 샘플링, 높은 중복 biobank 견본의 세대의 대표적인 결과 (그림 5, 그림 7, 그리고에서 exemplarily 시연된 그림 6) 2 단계에서 설명한 샘플링 기법을 사용 하 여 분석 방법 이전 게시2되었습니다. 이전 돼지 biobank 연구2에 간 조직의 biobank 샘플의 생성에 대 한 예를 들어 돼지 간을 했다 완전히 구분과 겹쳐 2-3 cm 두께의 약 20 석판에는 3 cm와 교차 눈금 단계에서 설명한 대로 약 2 cm3 x 2 x 2의 2, 및 16 조직 위치 체계적으로 임의로 샘플링 고 각 경우에 excised. 각 삭제 샘플 5 하위 샘플링된 위치의 분자 분석 (-80 ° C에서 냉동) 이후에 생성 된, cryohistology, 한 subsample에 대 한 하나의 subsample 포름알데히드 솔루션에서 Methacarn 솔루션에 고정 후속 파라핀 포함 및 조직학-immunohistochemical 시험. (동결 또는 고정 솔루션에는 샘플의 전송)까지 사건 당 74 다른 샘플의 세대는 평균2에 약 20 분 이내 달성 되었다. 생성 된 샘플의 품질의 평가 의해 설명된 샘플링 및 서브 샘플링 방식을 실행할 수/성공을 예상할 수 있습니다 (즉, RNA 또는 단백질의 분리는 histomorphological의 보존 및 조직 샘플, immunohistological 분석, 등에 대 한 그들의 적합성의 ultrastructural 속성)2
Stereological 정량 분석에 대 한 수직 획 일 한 무작위 (VUR) 섹션 및 등방성 균일 한 임의의 (IUR) 섹션의 세대
돼지 (biobank) 조직 샘플에서 등방성 균일 한 임의의 (IUR) 섹션 및 VUR 섹션의 앞으로 지향 세대에 대 한 기술 시연 (프로토콜 단계 3, 그림 8, 그림 9, 그림 10, 그림 11), 대부분 양적 stereological 매개 변수의 검사에 대 한 허용, 연습, 그리고 합리적인 어려움 또는 오류의 소스 없이 신속 하 게 수행할 수 있습니다. 따라서, IUR 샘플 (isector 기술) 그림 9 그림 10 (orientator 기술)의 생성은 완전히 이러한 방법에 대 한.
그림 1: 조직/기관 밀도의 결정에 대 한 "침수 기술"의 구조 그림. (A) 측정 샘플 무게 (즉, 질량, mS). (B) 규모 tared 비 커의 무게에 20 ° C와 정의 표시 된 위치에는 식 염 수에 빠져들 샘플 홀더의 0.9% 염 분으로 가득 합니다. (C)의 내부 벽 이나 비 커의 아래쪽에 접촉 하지 않고 샘플 홀더 표시 된 위치에 샘플의 완전 한 침수. 무게 균형에 표시 되는 샘플에 의해 전치 하는 염 분의 볼륨의 무게)입니다. 표시 된 대로 샘플의 밀도 계산 됩니다 (여기: ρ샘플 = mS/VS mS= / (mL/1.0048) 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 g/cm³ =). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 조직/기관 밀도의 결정에 대 한 "침수 기법". (A) 다른 샘플 홀더 얇은 철사에서 건설. 왼쪽에서 오른쪽: 얇은 주입 정, 작고 연약한 표본을 와이어의 나선형 바구니 및 얇은 철사의 간단한 슬링을 통해 얇은 철사 스레드 루프. A-화살표C 는 샘플 홀더 식 염 수에 잠긴 위치를 나타냅니다. (B, C) 식 염 수 ( 그림 1 C비교)에서 샘플의 침수 동안 샘플 홀더의 위치. (B) 완전 한 돼지 뇌 바구니 모양의 샘플 홀더에 배치. (C) 돼지 심근의 샘플. 벽 또는 비 커의 하단에 연락 하지 않고 염 분에 샘플의 완전 한 침수를 note. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 돼지 장기 볼륨의 결심을 위한 Cavalieri 방법은 응용 프로그램의 개요 그림. (A) 동전 스택 Cavalieri 원리의 이해에 대 한 예제. 자세한 내용은 소개를 참조. (B-H) 신장 관류 고정 볼륨 추정의 도식 시범. 세로 축 따라 신장의 길이 (l)의 (B) 측정. (C)의 절단 전체 기관에 n 동등 하 게 두께 (d) 조각 경도 기관 축 직각 병렬. (D) 기관 석판 아래로 동일한 표면에 배치. 참고 첫 번째 (오른쪽) 조직 슬 래 브, 즉, 그것의 자연적인 표면에 배치 됩니다 섹션 표면에는 없습니다. (E-H) 조직 석판의 섹션 표면 영역을 결정 하기 위해 다른 접근. (E) 적절 한 크기의와 함께 개설한 기관 슬 래 브의 플라스틱 투명 오버레이에 방수 펜으로 모든 기관 슬 래 브의 개요를 추적 하 여 플라스틱 투명에 인쇄 된 그리드 교차 보정 타격 십자가의 세는 프로 파일 영역입니다. 장기 슬 래 브 섹션 프로필 영역 섹션 프로 파일 영역 및 한 십자가에 해당 하는 영역을 타격 하는 십자가의 수에서 계산 됩니다. (F,G) 장기의 섹션 분야의 교정에 대 한 눈금자와 수직 방향 섹션 표면 (F), 또는 조직 석판 (G)의 스캔 한 이미지를 촬영 한 사진 이미지에 석판. 적절 한 morphometry 소프트웨어 응용 프로그램을 사용 하 여 사진/스캔의 디지털 이미지에서 조직 석판의 섹션 영역의 (H) 결정. 장기의 평균 두께 곱한 모든 기관 석판의 해당 섹션 표면 영역 (나)의 누적 제품으로 장기의 예상된 볼륨의 계산15석판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 조직학에 대 한 조직 샘플의 처리 하는 동안 3 차원 포함-관련 조직 수축 량의 결정의 구조 그림. (A)의 고정된 조직 샘플 (agar 단면 이전에 포함 하 여 지방 또는 폐 조직 등 쉽게 변형 (부드러운) 조직의 모양의 안정화)에서 신선한, 평면 섹션 표면 커팅. 크기 눈금자 함께 샘플 섹션의 스캐닝. (B) 고정된 조직 샘플 (f)의 섹션 표면 영역의 Planimetric 결정. (C) 루틴 샘플의 매체를 포함 하는 플라스틱에 포함. (D) 보존 샘플의 섹션 평면 플라스틱 블록의 조직학 단면도의 준비. 유리 슬라이드와 슬라이드의 일상적인 얼룩에 있는 섹션의 장착. (E) 크기 눈금자 함께 슬라이드의 검색. (F) 플라스틱 포함 샘플 (e)의 섹션의 영역의 Planimetric 결정. (G) 계산 포함-관련 조직 수축의 넓이의 조직 샘플의 해당 섹션 프로필의 측정된 분야의 몫으로 중간14를 포함 하는 플라스틱에 포함 전후. 오른쪽에 이미지 플라스틱 수 지 (위)와 해당 섹션의 프로 파일 (그 얼룩) GMA/병 무 청-임베디드 샘플 (아래)에 포함 하기 전에 잉크 검게 agar에 내장 뚱뚱한 직물의 포름알데히드 고정 샘플의 섹션 표면을 표시 합니다. 스케일 바 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 볼륨 가중치 체계적인 무작위 샘플링의 회로도 그림. 제시의 관류 고정 신장 신장 피 질 내에서 6 조직 위치의 체계적인 무작위 샘플링 보여 줍니다. 세로 축 따라 신장의 길이 (l)의 (A) 측정. (B) 완전 한 단면 전체 기관의 동등 하 게 두께 (d) 병렬 조각으로 경도 기관 축에 직각. (C) 기관/조직 석판 같은 (즉, 오른쪽 또는 왼쪽)에 배치 표면 아래로. 적절 한 크기의 크로스 그리드와 조직 석판의 (D) 오버레이 플라스틱 투명에 인쇄. 바깥쪽 눈금의 십자가 위 왼쪽 (파란색 점, •으로 표시) 조직 밖의 임의의 지점에 배치 됩니다. (E) 계산 하 고 신장 피 질을 치는 모든 십자가의 번호 매기기. 현재 예제에서 신장 피 질 치는 십자가 매겨집니다 연속적으로 한 신장 슬 래 브 (왼쪽에서 오른쪽으로), 다른 12 시 위치에 가장 가까운 십자가 시계 방향으로 각 슬 래 브 진행 후. 여기, 36 십자가 신장 피 질을 했다. 6 샘플링 위치 샘플링 될 수 있습니다. 모든 여섯 번째 위치 어디 십자가 안타는 조직 샘플 따라서 (36/6 = 6). (F) 현재 예제에서 4의 위치 교차 (N ° 4) 타격 신장 피 질 첫 번째 샘플링 위치로 무작위로 선택 된다. 모든 다음 6 타격 신장 피 질은 표시 플라스틱 투명 방수 펜을 사용 하 여 교차. 현재 예제에 이들은 4, 10, 16, 22, 28, 및 34 위치입니다. 직물의 표면에 깨끗 하 고 빈 색종이 종이의 작은 조각에 의해 해당 조직의 위치 (G) 태그. (H) 조직 표본에서 체계적으로 무작위로 샘플링된 위치 및 추가 분석에 대 한 후속 처리의 절단. 이 그림에서 Albl 그 외 여러분 (2016), 그림 S236 및 S237, 페이지 186 (보충 교재)7수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 돼지 신장 신장 피 질의 체계적인 무작위 샘플링 볼륨 가중치 (그림 5 참조) 포인트 계산에 대 한 규칙. (A) 신선한 돼지 신장입니다. (B) 신장 동등 하 게 두꺼운 병렬 조각 플라스틱 투명에 인쇄 된 그리드 교차와 겹쳐 경도 기관 축에 직각으로 구분. 빨간색 원이 교차 눈금의 위치를 무작위로 사용 하는 임의의 포인트의 위치를 나타냅니다. 포인트 계산 규칙의 (C) 그림:는 cross/point 타격 될 조직 구획으로 계산 됩니다 경우 (기준 구획), 샘플의 수직 및 수평 바는 십자가의 오른쪽 상단 내부 (화살표) 커버는 조직. 신장 피 질과 조직 위치의 체계적인 무작위 샘플링을 타격 하는 십자가의 (D) 표시 (여기, 119 십자가 신장 피 질 치고 17 위치는 샘플링 간격 나 를 사용 하 여 체계적으로 임의로 샘플링 = 7). (E)는 임의로 체계적으로 신장 피 질 색종이 종이 의해 태그의 위치를 샘플링. (F) 샘플 Excised. (G) 추가 하위 단위 다른 다운스트림 분석 유형에 대 한 샘플이의 후속 처리를 위해 삭제 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 무작위로 샘플링된 조직 위치 및 다른 다운스트림 분석 유형에 대 한 하위의 처리 조직 샘플의 하위 체계적으로에서 excised. 다른 분석에 대 한 조직 샘플이 신장 피 질 (기본 조직)에의 한 체계적으로 임의로 샘플링 된 위치에서의 세대의 (A) 회로도 그림 (예를 들어, FF PE: 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 샘플과 MTC PE: 라이트 현미경 조직학;에 대 한 Methacarn 조정의 파라핀 끼워 넣어진 샘플 곳을 알아내는: 샘플 냉동된 섹션 조직학;에 대 한 -80 ° c: 드라이 아이스 냉동 조직 샘플 분자 분석에 대 한). (B) 절단의 관류 고정 신장 신장 피 질, 삭제 조직 샘플의 더 세분 및 질적 및 양적 형태소 분석에 대 한 하위의 처리의 체계적으로 임의로 샘플링된 위치. 다른 고정 솔루션 (5, 6, 7), 그리고 샘플 관류 고정 돼지 신장 (1), 크로스-그리드 (2)의 석판 임의의 숫자 테이블 (3), equiangular 및 코사인 무게 (4) IUR 섹션 ( 그림 9, 그림 10참조)의 세대를 위한 서클 전자 현미경 샘플 (8)에 대 한 컨테이너입니다. 이 그림 Albl 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. (2016), S239 그림, 페이지 186 (보충 교재)7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: "Isector" 단면도 포 르 말린 고정 돼지 조직에서 준비. 관류 고정 돼지 신장 피 질 (A) 샘플. (B) 구형 주조 금형입니다. (C) 액체 한 천입니다. (D-E) 한 천-구형 주조 금형에서 샘플의 포함. (F) 한 범위의 임베디드 조직 샘플. (G) 한 범위의 임의의 위치 (IUR 단면)에 구분 하는 포함 된 조직으로. 이 그림 Albl 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. (2016), S6 그림, 페이지 14 (보충 교재)7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: IUR 섹션의 준비에 대 한 "Orientator" 기술의 개요 그림. 고정된 조직의 (A) Sample(s) equiangular 원 (ci1)에 가장자리와 평행 배치 0-180 ° 방향 (빨간 선으로 표시). (B) 단면화 임의의 각도 (녹색 선)에서 샘플의. (B, C) 새로 생성 (녹색 색상에 표시 된) 조직 샘플의 섹션 표면. (D) 샘플 (빨간색 선으로 표시) 1-1 방향에 평행한 휴식의 한 가장자리와 아래쪽을 직면 하 고 이전 단계에서 생성 된 단면 표면 코사인 무게 원 (ci2)에 배치. 임의의 각도에서 샘플을 통해 두 번째 섹션의 (E) 커팅. (F) 결과 무작위로 등방성 (파란색에서 표시) 샘플의 평면 섹션. 1.3 단계에서 설명한 대로 포함-관련 조직 수축 량의 추정에 대 한 고정된 조직 샘플의 IUR 섹션의 영역 (G) 결정. 플라스틱 수 지에 조직 샘플의 (H) 포함. (나) 플라스틱 블록의 단면화는 sectioned (평면에 평행한 IUR)는 톰에. (J) 장착에 유리 IUR 플라스틱 섹션의 슬라이드. 이 그림 Albl 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. (2016), S8 그림, 페이지 15 (보충 교재)7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 천 포함 조직 샘플의 IUR 섹션의 준비에 대 한 "Orientator" 기술. (A-D) 필요에 따라 하나 삽입 할 수 있습니다 한 천-고정 조직의 체계적으로 임의로 샘플링 된 견본 (작은 조직 샘플에 대 한 유용 천 포함 있도록 첫 번째 또는 두 임의의 섹션 조직 절단 하지 않고는 천 내에서 배치 될 수 있습니다). (E) (빨간 선으로 표시) 1-1 방향에 평행한 가장자리는 equiangular 원 (ci1)에 한 블록의 위치. (F, G) 임의의 각도에서 블록의 단면 (여기: 15-15, 녹색 선) 임의의 숫자 테이블 (rnt, 녹색 화살표)를 사용 하 여 결정. (H) 후속 코사인이 중 원 (ci2) 휴식 표면의 가장자리에 f에서 컷 섹션 표면에 한 블록의 위치 (빨간 선으로 표시) 1-1 방향에 평행 하 게 배치. (나) 두 번째 섹션은 임의의 각도로 샘플 극복 (여기: 20-20, 파란 선으로 표시), 임의의 숫자 테이블 (rnt, 파란색 화살표)을 사용 하 여 결정. (J) 결과 IUR 조직 샘플의 평면 섹션. 이 그림 Albl 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. (2016), S9 그림, 페이지 16 (보충 교재)7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11: VUR 섹션 준비의 회로도 그림. (A) 고정된 조직 샘플 정의 (식별) 수직 축 (예:, 그것의 자연적인 표면에 수직). (B) 고정된 조직 샘플 agar에 포함. Equiangular 원 (ci1) 인쇄에 the(agar-embedded) 조직 샘플의 (C) 위치. VA: 수직 축. 임의의 각 샘플의 (D) 단면화 (임의의 숫자 테이블; 여기: 30-30 방향, 파란 선으로 표시)을 섹션 평면 직교 테이블 및 샘플의 수직 축에 평행에 지향 되 고. (파란색에서 표시) 조직 샘플의 결과 VUR 섹션 비행기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12: 돼지 신장의 대표 volumetry. (A-B) 잠수 기술입니다. 신장 무게 (m아이)의 (A) 결정. 신장 (mdispl.saline)에 의해 전치 하는 염 분의 볼륨의 무게의 (B) 결정. 신장 끈에 매달아 이며 하단 또는 비 커의 벽을 건드리지 않고 염 분에 완전히 빠져들. 계산된 볼륨의 신장은 92.6 cm³. (C-D) Cavalieri 기법, 포인트를 계산 하 여 planimetry입니다. 세로 축 따라 신장의 길이 (l)의 (C) 측정. 신장 섹션 프로필 분야 (D) 결정 포인트의 동등 하 게 간격 둔된 십자가의 그리드 오버레이 플라스틱 투명에 인쇄 후 세에 의해 석판. 여기, 신장 예상된 볼륨 93.3 cm³입니다. (E-F) Cavalieri 기법, 신장 석판 (F)의 섹션 프로필 영역의 스캔 한 이미지의 planimetry. 여기, 신장 예상된 볼륨 92.8 cm³입니다. C-E, 자연 라운드 첫 번째의 표면 또는 스캐너에 나 크로스 그리드 투명 오버레이 신장의 마지막 석판 섹션 표면 이며 따라서 아무 섹션 표면적이 조직 슬 래 브에서 측정 됩니다. (G-H) 기관/조직 석판 (G)의 스캔 한 이미지 및 기관/조직 석판 크로스 그리드 투명도 (H)로 중첩 overprojection의 데모. Overprojecting 부분의 기관 석판의 조직 점선된 흰색과 검은색 선으로 표시 됩니다. 실제 섹션 프로 파일 (즉, 부분적으로 표시 된 흰색 점선으로 둘러싸인 조직)의 영역에만 결정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 13: 미디어를 포함 하는 조직학 플라스틱에서 샘플의 포함에 관련 된 적절 한 (A) 및 차선 (B) 준비의 한 임베디드 조직 샘플의 조직 수축 량의 결정에 대 한 대표적인 그림. (A) 이전에 플라스틱 수 지에 포함 돼지 피하 지방이 많은 직물의 고정된 샘플 섹션의 Scanned 이미지. 샘플 샘플의 모양의 안정화를 위한 잉크 검게 agar에 포함 되 고 식별 섹션 표면 윤곽선의 취소. (B)는 천 내 섹션 표면 및 봉 공기 거품 (화살표)의 불명료 한 개요. 스케일 바 = 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 분석 | 샘플 | 처리 | |
| 유형 | 메서드 | ||
| 분자 분석 | RNA 사본, 단백질, 대사 산물, 및 지질 프로 파일링 대사체학 분석, DNA 분석 |
작은 조각 * 신선한 (네이티브) 조직 | 액체 질소 나 드라이 아이스에 고정. -80 ° c.에 게 |
| 질적 형태소 분석 |
조직학 [가벼운 현미경 검사 법, 포함 immunohistochemistry (IHC) 및 제자리 교 잡] |
신선한 (기본)-또는 제자리에서 -고정 * 조직 샘플 | 다른 fixatives (예를 들어, 4% 포름알데히드 솔루션)을 사용 하 여 및 미디어를 포함 (파라핀, GMA/MMA, 에폭시), 적절 한. |
|
Cryohistology (냉동된 섹션, IHC 포함) |
신선한 (네이티브) 조직 샘플 | 블로킹 중간에 예제를 포함 하 고 액체 질소 냉각 isopentane에 동결. | |
|
Ultrastructural 분석 [전자 현미경, 포함 전송 (TEM) 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법] |
신선한 (네이티브)의 작은 조각-또는 제자리에서-고정 * 조직 샘플 | 2.5-6.25%도 솔루션에서 샘플을 수정 하 고 에폭시 플라스틱 수 지에 포함. | |
| 양적 형태소 분석 | 가벼운 현미경 검사 법 | 신선한 (기본)-또는 제자리에서 -고정 * 조직 샘플 | IUR-섹션 (orientator-, isector-섹션) 또는 플라스틱 포함된 조직 샘플의 VUR 섹션을 준비 합니다. |
| 가장 | 신선한 (네이티브)의 작은 조각-또는 제자리에서 -고정 * 조직 | 에폭시-임베디드 조직 샘플의 IUR (orientator-, isector-섹션) 섹션을 준비 합니다. |
표 1: 다른 다운스트림 분석 종류에 대 한 체계적으로 임의로 샘플링된 위치에서 excised 조직 하위의 처리. 연구 조사 기관/조직의 실험 설계에 따라 하위의 서로 다른 숫자 각 체계적으로 임의로 샘플링 된 조직 위치에서 excised와 있어야 다운스트림 분석의 종류에 대 한 처리 합니다. 가장 돼지 장기/조직 및 연구에 대 한 자세한 프로토콜 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"7에 제공 됩니다. GMA/병 무 청: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate. IUR: 등방성 제복 무작위입니다. VUR: 수직 제복 무작위입니다. * 최대. 2 x 2 x 2 mm3. 예를 들어, 조직 관류 고정 또는 고정 솔루션으로 얻은 폐의 폐 조직.
| 메서드 | 대표적인 결과 | ||
| 조직/기관 밀도 (단계 1.1, 그림 1, 그림 2)의 결정에 대 한 잠수 기술 | 돼지 장기/조직 | Ρ (g/cm³) | |
| 간 | 1.071 ± 0.007 | ||
| 췌 장 | 1.062 ± 0.016 | ||
| 심 실 심근 | 1.036 ± 0.014 | ||
| 신장 | 1.044 ± 0.006 | ||
| 복 부 내장 지방 조직 * | 0.921 ± 0.032 | ||
| 갑 상선 | 1.061 ± 0.007 | ||
| 뇌 | 1.051 ± 0.007 | ||
| 부 신 | 1.063 ± 0.025 | ||
| 골격 근육 * * | 1.074 ± 0.003 | ||
| 데이터는 의미 ± sd. 관련 기관/조직 가중치는 n에 결정 되었다 18 돼지 = (14 여성 및 남성 돼지; 나 2 년; 60 일이 몸 무게 30-250 kg). * Jejunal mesentery에서 지방 조직입니다. * * M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. 삼 두 근 brachii 그리고 M. gluteobiceps에 대 한 값을 의미 합니다. | |||
| 조직학 (단계 1.3, 그림 4)에 대 한 조직 샘플의 처리 하는 동안 3 차원 포함-관련 조직 수축 량의 결정 | 기관/조직 | 매체를 포함 | fS |
| 신장 피 질 (돼지) | GMA/병 무 청 | 0.89 ± 0.02 | |
| 에폭시 | 0.92 ± 0.02 | ||
| 데이터는 의미 ± SD 12 돼지의 24 샘플의 측정. fS: 선형 수축 량 수정 계수. | |||
표 2: 선택 된 돼지 장기와 조직7및 미디어를 포함 하는 다른 플라스틱에 돼지 피 질 신장 조직의 포함-관련 조직 수축에 대 한 선형 수축 보정 요인의 밀도의 대표적인 결과.
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Discussion
돼지 동물 모델에서 biobank 샘플 컬렉션의 대표, 중복 조직 샘플의 광범위 한 범위에 적합의 재현할 수 세대의 기관/조직, 결정에 대 한 강력한 기술 및 프로토콜 필요 다른 분석 방법, 그리고 랜덤 양적 stereological 분석에 대 한 샘플 섹션의 방향에 대 한. 현재 문서에서 설명 하는 방법 돼지 장기와 조직의 크기에 적응 하 고 효과적으로 이러한 요구2,7을 충족 하도록 개발 되었습니다. 그들은 잘 인식된 방법론 원리에 기반 하 고 이전 다른 출판된 연구2,7,,1221에 그들의 실행할 수 입증. 추천된 방법 대표 샘플의 세대를 위한 그리고 그렇지 않으면 확인할 수 없는 매개 변수 다양 한 수집을 위한 기초를 제공 하기 때문에 조직/기관 샘플, 검토 하는 연구의 다양 한 유형에 대 한 중요 하다. 이러한 방법은 약간의 노력으로 신속 하 게 수행할 수 있습니다 하 고 다운스트림 분석의 거의 모든 종류와 호환 됩니다. 따라서, 그들은 돼지 동물 모델 biobank 프로젝트를 위해 뿐만 아니라 적당 한 것으로 간주 됩니다 뿐만 아니라 다른 큰 동물 모델 종 (예, 양), 조직 샘플의 양적 histomorphological 분석으로 관련 된 연구에 유용 뿐만 아니라 수의 학문. 각 기술의 프로토콜의 구현 시 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 단계 및 제한 있다 계정에 다른 방법의 기술적 측면을 복용.
조직/기관 밀도의 결정에 대 한 잠수 기술
샘플은 조직의 밀도 침수 메서드 (1.1, 그림 1, 그림 2단계), 케어를 사용 하 여 내부 벽 이나 조직 샘플 또는 샘플 홀더를 조직 하면서 비 커의 하단을 건드리지 않도록 이동 해야 합니다 결정 하는 동안 식 염 수에 침수. 그렇지 않으면, 규모는 샘플의 무게 보다는 샘플에 의해 전치 하는 염 분의 볼륨의 무게를 표시 됩니다. 매우 작은/빛 조직 샘플 (몇 밀리 그램), 조직 밀도의 결정에 대 한 침수 메서드는 염 분의 surface tension과 부정적인 높은 몫은 비 커에 침수 액체의 볼륨을 샘플 볼륨의 제한 됩니다. 측정의 정확성을 방해 하 고 여기, 샘플의 무게 밀도 계산 볼륨 대신 추가 계산에 사용할 수 있습니다. 침수에 의해 조직 밀도의 결정은 또한 조직에서 장기가 실험적으로 끼얹는다/얻은 fixatives와 어떤 경우에는 공기의 일관성 없는 콘텐츠로 인해 신선한 (고정된) 폐 조직에 대 한 효과가 없습니다.
Cavalieri 기관 볼륨의 결정 방법
Cavalieri volumetry 돼지 장기 및 조직의 방법은 장기 무게와 밀도에서 기관 볼륨의 결정에 비해 더 복잡 합니다. 그러나, 그것은 적절 하 게 그들의 실험적인 처리 (예, 장기 관류 고정 또는 고정 솔루션으로 얻은 폐)으로 인해 무게 수 없는 기관에 적합. 여기, Cavalieri volumetry 메서드 (그림 5, 그림 6, 그림 12) 2 단계에서 설명한 볼륨 가중치 체계적인 무작위 샘플링 기술로 이상적으로 결합할 수 있습니다. 기관/조직 (Cavalieri 접근, 단계 1.2, 그림 3)의 병렬, 등거리 조각의 프로 파일 섹션의 지역에서 장기/조직 볼륨의 추정, 동안 유지 보수 조직의 방향의 석판 (상위 및 하위 섹션 평면 ), 뿐만 아니라 모든 섹션 프로필의 영역의 정확한 결정은 매우 중요. 특히, 디지털 이미지 또는 스캔 기관 석판의 planimetrically 분석은, 경우 조직 슬 래 브 (그림 12G-H)의 (sectioned 조직 비행기) 외부 조직의 overprojections 신중 하 게 고려해 야 안정적인 볼륨을 제공 하 견적.
조직학에 대 한 조직 샘플의 처리 하는 동안 3 차원 포함-관련 조직 수축 량의 결정
포함-관련 조직 수축 범위 포함 매체와 조직의 종류에 따라 달라 집니다 그리고 또한 동일한 조직의 차동 처리 샘플 사이 다를 수 있습니다.
포함-관련 조직 수축 량은 특히 파라핀 끼워 넣어진 조직 추출에서 광범위 한 냉동된 섹션 X Y 평면에서 거의 없는 수축 량을 표시 하는 것으로 간주 됩니다 일반적으로 조직의 작은 수축 하면 플라스틱 포함 하는 반면에, 그리고 일반적으로 크게 이러한 샘플의 조직학 섹션에서 차원 매개 변수의 양적 형태소 분석에 악영향을 줄 것 이다. 전체 3 차원 수축의 대부분 이외에 샘플의와 다른 해 부 구조, 조직 유형과 셀 내에서 비 균등, 차동, 이방성, 및 가변 수축 발생 파라핀 포함 조직 샘플8,13. 또한, 파라핀 끼워 넣어진 조직 추출의 두꺼운 조직학 단면도에서 특히 조직 수축 량의 범위는 X Y와 섹션의 Z 방향에 다 크게 수 있습니다. 이 섹션은 조직에서 절단 후 따뜻한 조직 안에 물 목욕에 섹션의 스트레칭 하는 동안 (에서 X-Y-방향) 섹션 영역 및 섹션 높이 (즉, 수직 섹션 두께)의 차동 수축 인해 수 있습니다. 차단 하 고 유리 슬라이드 (즉, 섹션의 z 축의 동질적인 붕괴)8에 장착 된 섹션의 후속 처리, 얼룩, 및 coverslipping 절차 동안. 또한, 두꺼운 부분에 있을 수 있습니다 섹션 내에 섹션 평면 근처 조직 지역의 대 등 하 게 강한 압축 섹션 (섹션 z 축의 차동 변형 선도) 조직 블록에서 절단 하는 동안19 . 이러한 효과 또한 광학 disector 같은 뚜렷한 양적 stereological 분석 방법으로 섹션 내의 조직 구조의 수의 견적은 왜곡 다음 수 있습니다. 따라서, 예측, 모니터링 및 포함 관련 조직 수축 량의 보정은 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플8에 대 한 가능한 아닙니다.
반면, 조직 샘플 GMA/MMA 등 에폭시, 플라스틱 수 지에 포함 된 볼륨 감소의 정도 크게 낮은 그리고 중요 한 것은, 더 많은 유니폼. 따라서, 플라스틱 수 지는 가정으로 균질, 등방성, 그리고 글로벌 조직의 수축은 다른 양이 많은 형태학 매개 변수17,18의 여러 가지 분석 방법에 대 한 유리에 포함. 플라스틱 수 지에 관련 된 조직 수축의 예측, 중 고정 조직의 모양 해야 하지 또한 왜곡 될 포함 절차 동안, 고정 및 임베디드의 해당 섹션 프로 파일 분야의 비교를 허용 하 샘플입니다. 지방 또는 폐 조직 같은 부드러운 또는 쉽게 압축할 수 있는 조직 샘플에서 또는 높은 유체 콘텐츠 조직 샘플에서 어려울 수 있습니다. 여기, 절차를 포함 하는 후속 플라스틱 중 조직 샘플의 모양을 안정 도움이 됩니다 agar 조직의 단면 이전에 고정 된 샘플의 포함 (프로토콜 단계 1.3., 그림 4). 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면 포함-관련 조직 수축의 반복된 측정 수행 되어야 한다, 동일한 조직의 다른 샘플을 사용 하 여. 포함-관련 조직 수축 범위 선형 조직 수축 계수 fs 로 표현 된다 (프로토콜 단계 1.3.9., 그림 4G). Fs 를 사용 하 여 다양 한 길이, 면적, 및 다른 조직 구조의 볼륨 매개 수축 보정에 대 한 방정식에 대 한 예제 여러 양적 stereological 연구14, 에 제공 된다 21,27.
거래량이 중 계산 하 고 다른 다운스트림 분석 유형에 대 한 조직 하위의 처리에 의해 체계적인 무작위 샘플링을
돼지 장기 제시 볼륨 중 샘플링 기술을 한 번, 조직 내의 무작위 샘플링 위치를 결정 하 고 이후에서 excised 조직 샘플의 서브 여 더 다른 분석에 대 한 모든 필요한 샘플을 생성 이러한 위치7. 볼륨 중 체계적인 무작위 샘플링 정권 기관/조직 검사에서의 총 볼륨 내에서 각 가능한 샘플링 위치에 샘플 수를 정확 하 게 같은 임의의 기회 및 generalizability의 컬렉션에 의해 지켜진다는 충분 한 수의 표본입니다. (잠재적으로 예상치 못한 그리고 알 수 없는) 별개의 부동 한 배급에 의해 가능 하 게 편견 분석 결과 효과적으로 방지 따라서 parenchymal 기관에서 샘플의 세대에 대 한 볼륨-가중치 체계적인 무작위 샘플링 디자인을 사용 하 여 기능 또는 형태학 상 조직 속성 설명 되는 오르간의 다른 위치에서 예를 들어, 평균 볼륨 및 간 실질28의 다른 지역에서 돼지 hepatocytes의 숫자 볼륨 밀도 대 한 . 돼지 장기에 대 한 추천 "조직 slabbing 및 서브" 전략 쉽게 이해할 수 있는 다운스트림 분석 방법의 기술적 요구 사항을 준수 및 수 수 신속 하 게 실시 이며, 특정 연구의 요구에 적응 그로 인하여 피하 체계적 샘플링 편견, 실험적인 가변성을 감소 하 고 있는 각 단일 샘플링 위치는 임의로 결정 됩니다 전략을 샘플링 하는 것 보다 효율적 되 고 하는 동안 전체 실험의 정밀도 증가9 ,15. 생성할 수 있는 표본 수는 분명히 검사 매개 변수 및 샘플링 기관/조직 서로 다른 위치에서 샘플 내에서 변동에 따라 달라 집니다. 다양 한 다른 분석 방법에 의해 시험의 다른 매개 변수 (샘플링 시 지정 하지)의 최대 수 있도록 설계 되었습니다 biobank 샘플 컬렉션의 생성, 같은 앞 샘플링 전략은 일반적으로 일정 기관/조직 당 중복 샘플의 상대적으로 높은 번호의 세대.
Stereological 정량 분석에 대 한 수직 획 일 한 무작위 (VUR) 섹션 및 등방성 균일 한 임의의 (IUR) 섹션의 세대
일부 기술 사용 IUR 및 VUR 섹션의 세대에 대 한 stereological 분석 다소 복잡 한 이론적인 기초 그리고 설명을 들은 따라서 양적 (불필요), 많은 과학자에 의해 eschewed 비록 그들의 실제 구현은 비교적 쉽습니다. VUR 섹션은 특히 쉽게 생성, 그리고 함께 사이클로이드 테스트 시스템8,,920면적 밀도 의견에 대 한 최적의. 그들은 종종 단면 평면의 익숙한 방향으로 선호입니다. 그러나,이 IUR 섹션, 달리 VUR 섹션 길이-매개 변수8,9의 추정에 적합 하지 않습니다.
IUR 및 VUR 섹션의 준비를 하는 동안 중요 한 단계 이며, 기본적으로, 플라스틱 수 지에 포함 하는 동안 고정된 샘플의 IUR 또는 VUR 섹션 표면 유지 VUR 섹션의 세로 축을 식별할 항상 수 있도록 (단계 3, 그림 9, , 그림 10 그림 11).
미래에, 위에 기술 된 방법의 광범위 한 응용 프로그램 돼지 등 큰 동물 모델에서 유사한, 다목적 biobank 샘플 세대에 대 한 일관 되 게 높은 품질 기준을 확립에 기여할 실질적으로 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 우수한 기술 지원을 위한 리사 피 칠을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Carl Roth GmbH, Germany | Agar (powder), Cat.: 5210.3 | Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves. |
| Caliper | Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany | Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 | Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well. |
| Casting molds (metal) | Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany | Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b | Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well. |
| Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) | n.a. | n.a. | Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al. Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016) |
| Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles | n.a. | n.a. | Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013). |
| Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) | Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China | Y10006 and Y10005 | Any other type of standard office foldback clamps will do as well. |
| Forceps (anatomical) | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 | Any type of anatomical forceps will do. |
| Formaldehyde-solution 4% | SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany | Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 | Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves. |
| Graph paper (for calibration) | Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de | Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 | Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do. |
| Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 | Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do. |
| Laboratory scale(s) | Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany | PM6000 | Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do |
| Sartorius AG, Göttingen, Germany | BP61S | ||
| Microtome blades | Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany | FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 | Any kind of single-use microtome blades will do. |
| Morphometry/planimetry software/system | National Institute of Health (NIH) | ImageJ | Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997). |
| Zeiss-Kontron, Eching, Germany | VideoplanTM image analysis system | Out of stock | |
| Photo camera | Nikon | D40 | Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod will do. |
| Plastic transparencies | Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany | Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.: 3562 | Any (laser)-printable plastic transparency will do. |
| Random number tables | n.a. | n.a. | Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/ |
| Razor blades | Plano GmbH, Wetzlar, Germany | T5016 | Any kind of razor blades will do. |
| Ruler | Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de | Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 | Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well. |
| Saline (0.9%) | Carl Roth GmbH, Germany | Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 | To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C. |
| Scalpel blades | Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany | BRAUN Surgical blades N°22 | Any kind of scalpel blades will do. |
| Scanner | Hewlett-Packard | hp scanjet 7400c | Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do. |
| Slicing devices | n.a. | n.a. | Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al. Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016). |
| Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) | Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany | Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm | Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections) |
| Thin wire | Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de | Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 | Any other kind of thin wire will also do. |
| Tissue paper | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 | Any other kind of laboratory tissue paper will do as well. |
| Waterproof pen | Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany | Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 | Any other kind of waterproof pen will do as well. |
References
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