Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Örnekleme stratejileri ve Biobank doku örnekleri domuz Biyomedikal modellerinden işlenmesi

Published: March 6, 2018 doi: 10.3791/57276
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Veterinary Pathology at the Centre for Clinical Veterinary Medicine, LMU Munich

Summary

Pratik uygulaması ve yöntemleri performansını aşağı akım analizleri biobank projeleri geniş bir yelpazede için domuz hayvan modellerin temsilcisi doku örnekleri oluşturmada, volumetry, dahil olmak üzere içinde gösterilen sistematik rastgele örnekleme, ve doku örnekleri nitel ve nicel morfolojik ve moleküler analiz türleri için farklı işleme.

Abstract

Translasyonel tıbbi araştırma, domuz modelleri giderek daha popüler hale gelmiştir. Bireysel hayvanların, özellikle genetiği değiştirilmiş domuz yüksek değer modelleri ve bu modellerin mevcut hayvanların genellikle sınırlı sayıda göz önüne alındığında, yeterince işlenmiş doku örnekleri (biobank) koleksiyonları kurulması için uygun bir Sonraki analizleri yöntemleri, örnekleme, zaman noktada belirtilmemiş analizleri de dahil olmak üzere geniş yelpazede translasyonel değer modelinin tam yararlanmak için anlamlı yaklaşımlar temsil eder. Domuz anatomisi özellikleri ile ilgili kuralların son temsilcisi, yüksek kaliteli örneklerinden farklı domuz organ ve dokulara standart üretimi için kurulmuştur. Bu kurallar sonuçları ve onların karşılaştırılabilir farklı çalışmalar ve Müfettişler arasında tekrarlanabilirlik için gerekli önkoşullar vardır. Organ ağırlıkları ve birimleri, oluşturulacak, belirlenmesi örnekleme yerlerin ve doku örnekleri sayıların yanı sıra yönlendirme, boyutu, işleme ve düzeltme yönergeleri, gibi temel veri kaydı ilgili faktörlerdir generalizability ve moleküler, nitel ve nicel morfolojik analiz için numune kullanılabilirliği belirleniyor. Burada, en önemli teknikler bir açıklayıcı, pratik, adım adım gösteri kuşak temsilcisi için domuz dokular çok amaçlı biobank örneği sunulmaktadır. Burada açıklanan yöntemleri belirlenmesi organ/doku birimleri ve yoğunlukları, parenkimal organları tarafından noktası-sayma, doku büzülme ölçüde belirlenmesi için bir sistematik rastgele örnekleme birimi ağırlıklı yordam uygulama içerir Histolojik örnekleri ve rastgele odaklı örnekleri nesil izotropik uniform rasgele (diploması) bölümleri "Orientator" ve "Isector" yöntemleri ve dikey üniforma tarafından üretilen gibi nicel stereological analizleri için gömme için ilgili rasgele (VUR) bölümleri.

Introduction

1,2,3,4,5, domuz arasında birkaç avantajlı benzerlikler nedeniyle büyük hayvan modelleri gibi translasyonel tıpta, domuz kullanım için giderek daha yaygın ve insan anatomisi ve fizyolojisi ve kurulan moleküler biyolojik yöntemler nesil için izin durumu özel olarak tasarlanmış, domuz modelleri çok çeşitli hastalık koşulları1,4için genetik olarak değiştirilmiş.

Ancak, kemirgen modellerle karşılaştırıldığında, deneyler için herhangi bir zamanda sağlanan ilgili domuz manken hayvanların sayısı sınırlıdır. Bu domuz üretimi aralığı yaklaşık bir yıl ve domuz modelleri ve Hayvancılık üretimi için gerekli mali ve zaman yoğun çabaları kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, bir domuz modeli yanı sıra bu domuzların oluşturulan örnekleri bireysel hayvanlar özellikle genetiği değiştirilmiş domuz modelleri ve/veya uzun vadeli deneysel sorunları (örneğin, geç komplikasyonlar çok değerli Kronik hastalıklar) yaşlı bireylerin2,6,7' incelenir.

Herhangi bir çalışma sırasında çalışma ilk deneysel tasarım zamanlanan değil ek Değerlendirmeler performansını daha sonra ilgili, olup çıkmak örneğin, farklı sorular daha önce doğan keşfetti adresine beklenmeyen bulgular. Böyle ek deneyleri için uygun örnekleri mevcut değilse, orantısız yüksek maliyet ve zaman yoğun harcamaları ek domuz ve doku örneği oluşturmak gerekli olabilir. Bu tür olasılıklar için hazırlıklı olmak, korunmuş yedekleme örnekleri farklı organ, doku veya biyo-sıvılar, nicelik ve nitelik uygun sonraki analizleri, geniş bir yelpazesi için biobank koleksiyon üretimi önemli bir kabul edilir 2,6,7yaklaşım. En iyi faydaları bir domuz hayvan modelden türeterek, yeterli biobank örnekleri kullanılabilirliğini de aynı örnek malzemeler bir çok organ düzeyi farklı analiz yöntemleri geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için benzersiz imkanı sunuyor çok aynı bireysel hayvanlar, örneğin, dağıtım örnekleri için farklı çalışma gruplarının bilim adamları tarafından bir araştırma ağ2,6,7' düzenledi. Ayrıca, biobanking '' ileri '' örnekleme stratejisinde de hayvanların bir çalışmada gerekli sayıda bir azalma katkıda bulunur. Domuz modeli biobanking avantajları son zamanlarda bir çok organ, multiomics çalışma, organ inceleyerek gösterilmiştir çapraz konuşma Münih Geçireceğimi domuz Biobank üzerinden örnekler kullanarak uzun vadeli diyabet, genetiği değiştirilmiş bir domuz modeli 2.

Biobank örnekleri genel olarak güvenilirlik ve daha sonra gerçekleştirilen analizleri sonuçlarının interpretability kurmak için uymanız gerekir bazı zorunlu gereksinimleri bulunmaktadır. Örnekleri tekrarlanarak üretilen gerekir ve temsilcisi, Yani, yeterince olmaları gerekir doku/organ örnekleri7den alınmıştır baktılar morfolojik ve moleküler özelliklerini yansıtan. Aşağı akım analiz türleri geniş bir yelpazesi için uygun olmak, örnekleri gerekir yeterli miktarlarda alınır ve (zaman ve sıcaklık şartları da dahil olmak üzere) taleplerini açıklayıcı dahil olmak üzere farklı analitik yöntemleri göre işlenen cryohistology, parafin ve plastik Histoloji, immünhistokimya, in situ hibridizasyon, ultrastructural elektron Mikroskopik analizler ve klinik laboratuvar tanı analizleri, de moleküler gibi histopatolojik analizleri DNA, RNA, proteinler ve metabolitleri analizleri.

Randomize bölüm numaraları, birimler, uzunlukları veya farklı doku yapılarının yüzey alanları gibi farklı nicel morfolojik parametrelerin geniş değerlendirilmesi için nicel stereological analizleri tarafından izin vermek için uçak Histolojik örnekleri ilgili organ/dokuların7,8,9,10,11hazırlıklı olması gerekiyor. Nicel morfolojik çalışmalarda, doku, organ veya organ yuvası, Toplam hacim kesin olarak belirlenmesi (Yani, başvuru alanı) örnekleri alınmıştır en önemlisi önemli7,9 ' dur , baktılar parametreleri ilgili organ, doku veya organizma içinde mutlak miktarlarını hesaplamak için 12 . Sonunda, belirlenecek ve hesap13alınan gömme ile ilgili doku büzülme histolojik kesitler hazırlanması sırasında etkisi vardır. Bu nedenle, nicel stereological, özellikle önceki çalışmalar arşivlenmiş örnekleri (Sabit doku örnekleri, katıştırılmış doku blokları, histolojik kesitler, vb) bazen ciddi sınırlı veya hatta imkansız12analizlerdir, Hayır yeterli örnekleme tasarımları numaraları ve mevcut bireysel örnekleri miktarda yetersiz ise temsilcisi örnekleri, emri için uygulandıysa özellikle volumetry ilgili organ/dokuların, gerçekleştirilmedi veya varsa işlenmesi örnekleri, ilgi nicel morfolojik parametre tahmini ile uyumlu değil. Manifold mümkün etkileyen faktörler nedeniyle ayrı nicel morfolojik parametrelerinin analizler için arşiv-örnek malzemelerin uygunluğu tümden yanıtlanamaz, ancak tek tek her durum dikkatli değerlendirilmesi bağlıdır.

Böylece, konum, boyut, sayısı, işleme, süsleme yön ve örnekleri yönünü potansiyel olarak sonraki analizleri sonuçlarını etkileyecek gibi bu faktörlerin büyük önem taşıyan şeyler ve herhangi bir çalışmada deneysel tasarımında dikkate alınmalıdır. Bu yönleriyle ve domuz anatomi, kapsamlı, ayrıntılı, büyük ölçekli örnekleme yönergeleri adapte domuz hayvan modelleri son zamanlarda kurulmuş, özel özellikleri ile ilgili olarak standart, tekrarlanabilir için sağlam bir başvuru sağlayan ve 50'den fazla farklı domuz organ ve dokulara6,7yedek, yeterince işlenmiş, yüksek kaliteli örneklerinin verimli üretimi.

Metodolojik açıklamaları ve mevcut makalede gösterilen video öğretici detaylı, açıklayıcı, anlaşılır, adım-tarafından adım talimatları için pratik teknikler için volumetry, performansını sağlamak domuz dokuların örnekleme ve organ ve doku örnekleri farklı akış aşağı analiz yöntemleri için işlenmesi. Seçme teknikleri organ/doku birimleri ve Arşimet ve Cavalieri9ilkelerine dayanan yoğunlukları belirlenmesi için yöntemleri dahil, üç boyutlu büzülme doku boyutlarının belirlenmesi de dahil olmak üzere ilgili Histolojik inceleme için işleme sırasında farklı gömme medya14 içinde katıştırma, uygulanabilir hacim ağırlıklı sistematik rastgele örnekleme uygulanması için örneklenen doku örneklerin işleme yaklaşımları farklı sonraki analizleri7,8,9,15ve nesil uygun şekilde odaklı ve olası nicel stereological analizleri7,8için örnekleri işlenebilir, 9,10,11. Domuz biobank projeleri uygulama onların yanında, kanıtlanmış yöntemleri genellikle nicel histo-Morfolojik özellikleri organ/dokuların inceleyerek tüm çalışmalar için uygundur. Ayrıca, sistematik rastgele örnekleme tasarımlar kuşak temsilcisi örnekleri bereket değişiklikler, örneğin, RNA'ların, proteinler veya metabolitleri içinde algılamak için moleküler analiz yöntemleri kullanarak deneyler için özellikle yararlıdır çeşitli organ ve dokulara.

Pratik performanslarını Protokolü bölümünde anlatılan sonraki paragraflar bu yöntemler kısa bir giriş sağlar.

Organ/doku birimleri belirlenmesi
Bu faktörler gösterebilir organ ağırlık ve birimleri belirlenmesidir dosyasında çeşitli deneysel ayarları, önemli değişiklikler, potansiyel olarak deneysel olarak ilgili faktörler ilgi bileşen incelenir. Bir organ/doku hacmi de genellikle mutlak nicel parametreleri, (örneğin, toplam telefon numarası), stereologically tahmini sayısal ses yoğunluğu (örneğin, birim birim başına hücre sayısı üzerinden hesaplamak için gereklidir doku)7,12. Bilgisayarlı Tomografi gibi karmaşık teknik ekipman kullanma teknikleri dışında temelde bir organ veya doku mutlak hacmi belirlemek için yaygın olarak kullanılan üç pratik yöntem vardır. Bir organ hacmi "Arşimet, Yaniilkesine göre su veya tamamen sular altında zaman yapı tarafından zorla göç ettirilmiş salin ses düzeyini ölçme doğrudan hacimsel ölçü" tarafından belirlenebilir. Ancak, onlar çok büyük hacimsel/ölçme şişeler gerektiren bu yana nispeten büyük domuz organları için bu yaklaşımlar pratik ve tutarsızlık, eğilimli vardır. Daha rahat bir organ/doku hacmi verimli bir şekilde "batma yöntem"7,12 kullanarak belirlenebilir, ağırlık ve yoğunluk7,12,16, hesaplanabilir ,16 (iletişim kuralı adım 1.1.). Organ/doku birimleri de "Cavalieri prensibi" üzerine (1598-1647) göre volumetry yaklaşımları kullanarak tahmin edilebilir. Basitçe, Cavalieri İlkesi devletler, iki nesne için zemin düzlemini paralel uçaklarda kesitli, ve bölümler profilleri iki nesne karşılık gelen edersen taban düzlemi uzaklıklar aynı alanlarda, iki nesne var aynı birim var. Böylece, keyfi olarak şekillendirilmiş nesneleri hacmi paralel, aynı derecede uzak bölüm uçaklar ve bölüm uçaklar arasındaki mesafe bölüm profil alanlarının ürün olarak tahmin edilebilir. Bu aşağıdaki benzetmeyle anlaşılır: aynı sikke aynı sayıda oluşan iki yığınlarını yerleştirilir yan yana birbiri verimli sikke yığını ve diğer silindir şeklinde yığılmış paralar bakıcıyla bir yığın düşünün paralar ile Merkezi kapalı yığın sikke (şekil 3A) konumlandırılmış. Her iki para yığınları şekilleri farklı olmasına rağmen onların birimler alanları, karşılık gelen her iki yığınları düzeylerindeki sikkelerin beri aynıdır (Yani, profilleri paralel bölümlerin alanlarında kesilmiş her iki para eşit uzaklıkta yığınlarda aracılığıyla zemin) aynıdır. Domuz organ ve dokulara Cavalieri ilke7,12,15 kullanarak hacimli tahmini 1.2. adımda anlatılan.

Histolojik katıştırma için ilgili doku büzülme ölçüde belirlenmesi
Analizler çeşitli kantitatif morfolojik parametreleri histolojik dokusu bölümlerde ölçülen belirlenecek ve göz önünde doku histolojisi için işleme sırasında meydana gelen doku gömme ile ilgili büzülme etkisi var. Katıştırma ilgili doku büzülme ölçüde değişken olabilir ve hem doku, işleme ve gömme orta8,13,17,18,19üzerinde bağlıdır. Genel olarak, tüm üç boyutlu uzay ve bu nedenle, tüm boyutlu parametreleri nicel stereological analizleri8 tahmini etkiler katıştırma güvenlikle ilgili değişiklikler (Yani, çoğunlukla büzülme) doku örneği hacminin ortaya . Temel olarak, gömme ile ilgili doku büzülme, doğrusal doku büzülme faktörü (fS) ifade edilen ölçüde adım 1.3 gösterildiği gibi tahmin edilebilir. ve14(büzülme duyarlı) kantitatif morfolojik parametreleri düzeltilmesi için kullanılan.

Organ/dokuların sistematik rastgele örnekleme birimi ağırlıklı
Domuz organ/doku örnekleri biobank topluluğu kurulması için birim ağırlıklı sistematik rastgele örnekleme yaklaşımlar gibi 2. adımda açıklanan pratik, zaman kazandıran ve verimli teknikleri nesil temsilcisi olduğu kanıtlanmıştır, çok amaçlı doku7,8,9,15örnekler.

Nesil izotropik Uniform rasgele bölümleri ve dikey Uniform rasgele bölümleri nicel stereological analizleri için
Biobank doku örnekleri farklı nicel stereological analiz yöntemleri yeterince hazırlıklı bir numune belirlenemedi parametreleri maksimum tahmini için geniş bir yelpazesi için uygun olması gerekir. Neredeyse tüm nicel stereological parametreleri "izotropik (bağımsız) tek tip rasgele (diploması) bölümler"8,9kullanılarak belirlenebilir. Doktora diploması bölümlerde, doku örneği bölüm boyutunda üç boyutlu yönünü randomize. Bu doku örneği bölüm uçak konumuna göreceli konumunu randomizasyon tarafından "Isector" yöntemi11 (iletişim kuralı adım 3.1) veya göreli olarak bölüm uçak yönünü randomizasyon uygulandığı haliyle elde edilebilir "Orientator" yöntemi10 (iletişim kuralı adım 3.2) olduğu gibi doku örneği. Cilt - ya da mukoza numune doğal olarak mevcut veya tanımlanmış ve düzgün tanımlanabilir dikey eksen, "dikey tek tip rasgele (VUR) bölümler" hazırlanması görüntüleme gibi doku örneklerinde (iletişim kuralı adım 3.3.) kesinlikle kesitli boyutunda içinde onların dikey eksen avantajlı8,20' dir. İçin tam bir söylem diploması/VUR örnekleme teorik temelleri ve potansiyel aşağı akım nicel stereological analizleri ile kapsamlı bir tartışma baktılar okuyucu niceliksel stereology hayatta ders kitapları için denir Bilimler8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada ölü hayvanlardan elde edilen doku örnekleri kullanmak ve tamamen hayvan refahı Alman yasal düzenlemelere uygun.

1. Volumetry

  1. Doku/Organ yoğunlukları belirlenmesi için batma tekniği (Resim 1 ve Şekil 2) 7 , 12 , 16
    1. Malzemeleri hazırlamak: neşter bıçaklar, kağıt havlu, iyi forseps, standart laboratuvar ölçekleri, cam veya plastik şişeler, % 0,9 serum ve kendini inşa numune sahipleri (şekil 2A).
    2. Doku bir parça tüketim (en büyük boyutu: 2 x 2 x 2 cm3) özellikle ilgi organ yuvası üzerinden/doku, organ dan. Ölçülen totohipofiz veya epifiz bezi gibi küçük organları vardır.
      Dikkat: örnek boyutu özellikle kabı (Adım 1.1.5 ve devamı) ve örnek tam su kabı 1.1.7. adımda iç duvarları ile bağlantı kurmadan izin vermek için dolum seviyesi iç çapı daha küçük olduğundan emin olun.
    3. Dikkatli bir şekilde aşırı kan/doku sıvısı kaldırmak için kağıt havlu ile örnek temizle.
    4. Örnek bir hassas ölçekte tartmak ve örnek (mS) ağırlığı kaydetmek. Küçük doku örnekleri yakın mg (şekil 1A) ağırlığını belirlemek.
    5. Oda sıcaklığında % 0,9 serum ölçeği ile dolu bir ölçek yerleştirin. Tamamen bir batma sonraki adımda doku örneğinin taşmadan izin vermek için kabı, doldurmayın.
      Uyarı: uygun boyutu ve ağırlığı ölçülecek doku sample(s) ve etkili Ölçüm Aralığı ölçek kabı boyutu kullanın. En çok 2 x 2 x 2 cm3daha büyük örnekleri için 50-100 mL kabı boyutunu yaklaşık 100 mg 500 g için ölçüm ölçek ile birlikte uygun ise küçük örnekleri için hassas teraziler ile ile birlikte 5-10 mL biriminin şişeler kullanın Ölçüm aralıkları arasında yaklaşık 0.1 mg ve 20 g.
    6. İşaretli konuma (oklar şekil 1B, şekil 2Bve şekil 2C)serum örnek sahibi (Yani, ince tel yeterince sert bir döngü veya buna benzer, şekil 2A) daldırın. O zaman, (Dara) sıfır olarak ölçek görüntüsünü araştırma.
    7. Dikkatle doku örneği örnek sahibine iliştirin ve örnek kutusunda işaretli pozisyon (oklar şekil 1B, şekil 2Bve şekil 2C)ulaşılana kadar tamamen serum örneğinde daldırın.
      Dikkat: Batık örnek ve örnek sahibi iç duvarları veya alt kabı veya serum yüzeyi ile temas olması gerekir.
    8. Örnek sahibi ve batık örnek o konumda tutarken, doku örneği tarafından zorla göç ettirilmiş saline ağırlık atıfta ölçekte (mL) görüntülenen ağırlığı kaydetmek (1 C şekil, şekil 2B, ve Şekil 2C).
    9. Oda sıcaklığında (20 ° C) tuz yoğunluğu ve m L(VS) örnek hacmi hesaplamak (ρtuzlu = 1.0048 g/cm³) VS olarak mL= / ρtuzlu [g/g/cm³] (Şekil 1).
    10. (ρörnek) doku örneğineait ağırlığı (Yani, kitle) örnek (mS) ve hacmi (VS) yoğunluğunu hesaplamak: ρörnek = mS /VS[g/cm³] (şekil 1).
    11. Totoölçülen organları için ölçüm üç kez tekrarlayın ve tek ölçüm değerleri üzerinden ortalama organ yoğunluğu hesaplayın. Büyük organ/dokular için aynı organ/doku/organ yerde tekrarlanan ölçümleri farklı örnekleri ile gerçekleştirmek ve tek ölçümleri üzerinden ortalama yoğunluğu buna göre hesaplar.
    12. Ağırlık ve yoğunluk (şekil 1) organ/doku/organ bölme hacmi hesaplamak.
  2. Cavalieri yönteminin domuz Organ birimleri tespiti için uygulama 7
    1. Malzemeleri hazırlamak: cetvel, kumpas, bıçak, makas, pens, su geçirmez kalem, plastik asetat, tarayıcı, fotoğraf kamera ve çapraz Izgaralar üzerinde plastik asetat basılmış.
    2. Tüm organ/doku (kesme Bankası) düz bir yüzeye yerleştirin ve uzunluğu (m) organ (şekil 3B, şekil 5A) boyuna ekseni boyunca ölçün.
    3. Tam organ/doku eşit uzaklıkta paralel dilimler halinde (şekil 3 c, şekil 5B) boyuna organ eksenine dik kesin. İki bölümleri (Yani, parça aralığı/bölüm kalınlığı genellikle yaklaşık 1 cm) doku/organ plaka yeterli sayıda almak için yeterince küçük arasındaki mesafe d seçin. Rastgele ilk bölümü organ kenar boşluğundan 0 ile parça aralığı arasında bir mesafe içinde konumlandırın. Dilimleme iken, görsel olarak kabaca Tekdüzen kalınlığı yaklaşık döşeme paralel organ/doku elde etmek için her bölüm uçak yönünü ve pozisyon yargıç.
      Not: Doku/organ plaka gereken sayıda şekli ve muayene organ/doku boyutunu bağlıdır. Küçük organ veya örnekleri ≤5 mm ince plaka içinde kesitli gerekse kesit önce Ağar örnekleri gömmek (bkz. Adım 1.3.3.) ve agar gömülü örneği Dilimleme için teknik bir aygıtı kullanın. Ampirik olarak tavsiye parça aralıkları en domuz organ ve dokulara için hem de örnekleri dilimleme aygıtlar için ek malzeme "Doku örnekleme kılavuzları için domuz Biyomedikal modelleri"7gösterilir.
    4. Tüm organ/doku döşeme aşağı bakacak şekilde kesme üsteki (Yani, sürekli olarak sağ veya sol kısım uçak her organ levhanın, şekil 3D, şekil 5Cüzerinde) aynı yüzey üzerine yerleştirin ve döşeme (n) saymak.
    5. Doku plaka bölüm profilleri aşağıdaki yaklaşımlardan biri tarafından elde edilir:
      1. Dikkatle doku plaka üzerinde uygun şekilde etiketli plastik asetat, kendi üst ve alt bölüm yüzeyler yönünü koruyarak yer. Su geçirmez kalem (şekil 3E1-2) kullanarak plastik asetat doku kanlar anahatları takip et.
      2. Kamerayı dikey bölüm yüzeyler (şekil 3F) yukarıda doku plaka fotoğrafik görüntüleri al. Kalibrasyon için doku plaka yanındaki boyut cetvel yerleştirin.
      3. Düz Yataklı Tarayıcı doku kanlar onların üst ve alt bölüm yüzeyler (şekil 3 g) yönünü koruyarak inceden inceye gözden geçirmek. Kalibrasyon için doku plaka yanındaki boyut cetvel yerleştirin.
    6. Tüm doku levhalar (izlenen, fotoğrafı çekilen veya taranmış) bölüm profilleri alanlarında aşağıdaki yaklaşımlardan biri tarafından tedbir:
      1. Yer paylaşımı veya izlenen organ levha profilleri ile uygun ölçekli bir üst üste, bir plastik şeffaflık ve tüm haçlar profil alanı (3E rakam3-4; karşılaştırmak-e doğru isabet sayısı eşit aralıklı haçlar kalibre edilmiş ızgara basılır Şekil 5 d). Bölümü profil alanı her organ levhanın haçlar profil alanına göre bir haç'a karşılık gelen alan isabet sayısını çarparak hesaplar.
        Not: yeterince hassas cilt almak için tahmin ediyor, bitişik haçlar arasında yeterince küçük bir mesafe ile çapraz bir tablo seçin, böylece ortalama en az 100 kesişsin çalışmanın muayene her durumda bir organ plaka bölüm yüzeylerin vuracaktır . Ampirik olarak tavsiye çapraz kılavuz boyutları en domuz organ ve dokulara için ek malzeme "Doku örnekleme kılavuzları için domuz Biyomedikal modelleri"7gösterilir.
      2. Alanlarını ölçmek fotoğraflar/tarama dijital resimlerdeki doku döşeme, kullanarak uygun ticari olarak kullanılabilir veya freeware morfometri yumuşak - ve donanım uygulamaları (şekil 3 H), bir ticari görüntü analiz sistemi gibi21, ya da ImageJ22.
        Dikkat: Not bir doku levha (ilk veya son) doğal yüzeyi sırasıyla dinlenme tarayıcınıza yerleştirilir, fotoğraf makinesi doğal yüzeyi ile karşı karşıya. Bu nedenle, taranan görüntü, fotoğraf resim bu levhanın, bir bölümü yüzey göstermez. Bu nedenle, hiçbir bölüm alan profili bu doku levha (şekil 3I) taranan resim/fotoğraf görüntü ölçülür. Ayrıca Not aşırı projeksiyon, taranmış resimleri ve fotoğrafları organ/doku döşeme, Yanimevcut sadece gerçek bölümünde profilleri, but levha bölüm yüzey (şekil 12 yatan görüntü dokusunda alanlarını ölçmek G-H).
    7. Ürün, tüm ilgili bölüm profil alanları tüm doku plaka vaka başına toplamı olarak tahmin edilen organ birim hesaplamak (Yani, sürekli olarak sağa veya sola, sırasıyla, her organ üst veya alt bölüm yüzeyi levha ve plaka (Yani, dikey organ eksen (l) ve plaka sayısı ölçülen uzunluğu sayının)15ortalama kalınlığı.
  3. Üç boyutlu katıştırma ilgili doku büzülme ölçüde belirlenmesi sırasında histoloji için doku örnekleri işleme
    1. Malzemeleri hazırlamak: Microtome bıçaklar, forseps, agar, metal döküm kalıpları, dijital tarayıcı ve büyüklük cetvel (örneğin, grafik kağıdı).
    2. Taze, uçak bölümü yüzeyden sabit doku örneği kesti.
      Not: Eğer kolayca örnekleri kullanarak deforme (yumuşak) dokular (yağ dokusu, jelatinimsi doku), embed sabit doku örneği agar parça (şekil 4A) önce içinde.
    3. Örnek agar içinde katıştırmak için:
      1. Karıştırmak gibi uygun bir su hacmi ile Mikrobiyoloji kültür ortam için kullanılan standart agar toz (yaklaşık 0.5-1 g agar/10 mL su) bir cam ölçek. Karışımı ilave edin ve 3-5 s. karışımı ilave edin ve 3-5 s için tekrar Çıban getirmek için kaynar kadar 700 W mikrodalga fırında ısı.
      2. İsteğe bağlı olarak, örneğin, siyah mürekkep ile sıvı agar agar doku örneği için kontrastı arttırmak için boya (sıcak sıvı agar için 10 mL 1 mL mürekkep ekleyin ve karistirin).
      3. Sıcak agar (örneğin, gömme, şekil 10A-Dparafin için kullanılan bir metal kalıp) bir döküm kalıp içine dökün ve sıcak agar sabit doku örneğinde daldırın. Katılaşma kadar serin, kalıp çıkarmak ve bir microtome ya da jilet kullanarak katıştırılmış dokuyla agar blok kesme agar izin.
        Dikkat: sıcak sıvı agar taşıma sırasında koruyucu gözlük ve eldiven giymek. Formaldehit çözüm bir egzoz altında sabit işlem doku örnekleri hood ve koruyucu gözlük ve laboratuvar eldiven giymek.
    4. Örnek bölüm yüzeyi ile birlikte bir büyüklük cetvel flatbed tarayıcı üzerinde aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve (şekil 4AB) bölümünde yüzey inceden inceye gözden geçirmek.
    5. Bölüm yüzeyinde sabit doku örneğinin (f) adım 1.2.6 içinde (şekil 4B) açıklanan teknikleri kullanarak dijital tarama alanı belirleyin.
    6. Epoksi (örneğin, Epon) veya glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/MMA)23, aşağıdaki standart protokolleri23,24,25 (gibi plastik gömme ortamda örnek katıştırma Şekil 4 c). Önceki adımda (1.3.4) taranan sabit örnek bölüm yüzeyinde plastik gömülü örnek korunur emin olun.
      Not: örnek bölüm yüzeyine yönünü örnek işleme sırasında korumak için sürekli olarak örnek ile hedeflenen bölümde yüzeyi aşağı doğru gömme kaset veya döküm kalıp bakacak yerleştirin veya amaçlanan bir bölüm yüzey (veya örnek karşı tarafında) mürekkep.
    7. Sabit doku örneği (Adım 1.3.2) özgün bölüm yüzeyine karşılık gelen plastik bloğundan histolojik bir bölüm kullanarak kesmek bir microtome (şekil 4 d), bir cam slayt (şekil 4 d) bölümüne bağlayabilir ve düzenli olarak (leke örneğin, Hematoksilen ve Eozin leke, H & E)24,25.
      Dikkat: sabit doku örneği özgün bölüm yüzeyine olarak aynı düzlemde yaklaşık bir histolojik bölüm almak için dikkatle plastik blok pozisyon microtome Mount kesit önce ayarlayın.
    8. Bölüm (şekil 4E) tarama ve slayt lekeli bölümü ile birlikte bir büyüklük cetvel flatbed tarayıcı üzerinde aşağıya doğru bakacak şekilde yerleştirin.
    9. 1.2.6 (şekil 4F) adımda açıklanan teknikleri kullanarak dijital tarama içinde plastik gömülü doku örneği (Ae) bölümünde alanı belirleyin.
    10. Ortalama katıştırma ilgili doku büzülme (için ilgili doku ve gömme orta) bölüm profillerin doku örneklerinin ölçülen alanlardan önce ve sonra orta katıştırma plastik gömme hesaplayın. Doğrusal büzülme faktörünü fs n doku örnekleri bölümü profilleri alanlarında sayının kare kökü olarak orta (e) ve alanları katıştırma plastik gömme sonra hesaplanır Bölüm profillerin orta (f) (şekil 4 g) katıştırma plastik gömme önce aynı doku örnekleri14.

2. cilt ağırlıklı sistematik rastgele örnekleme sayma ve doku Subsamples farklı akış aşağı analiz türleri7 için işleme Puan

  1. Malzemeleri hazırlamak: cetvel, kumpas, bıçak, makas, pens, su geçirmez kalem noktası/çapraz baskılı plastik asetat ve rasgele sayı tablolar üzerinde Izgaralar.
    Not: Izgaralar (5 – 60 mm) çapraz kopyası şablonları için "Doku örnekleme kılavuzları için domuz Biyomedikal modelleri"7ek malzeme temin edilmektedir.
  2. Organ/doku (kesme Bankası) düz bir yüzeye yerleştirin ve onun boyuna ekseni (şekil 5A, şekil 6A) organ (l) uzunluğu ölçmek.
  3. Tam organ/doku eşit uzaklıkta paralel dilimler halinde kendi boyuna ekseni (şekil 5B) dik kesin. D arasında iki bölümü (Yani, parça aralığı/bölüm kalınlığı, genellikle yaklaşık 1 cm) doku/organ dilimleri yeterli bir dizi elde etmek için küçük bir mesafe seçin. Rastgele ilk bölümü organ kenar boşluğundan 0 ile parça aralığı arasında bir mesafe içinde konumlandırın. Dilimleme iken, görsel olarak kabaca Tekdüzen kalınlığı yaklaşık paralel organ/doku plaka elde etmek için her bölüm uçak yönünü ve pozisyon yargıç.
    Not: Doku/organ plaka gereken sayıda muayene organ/doku ve örneklenen doku sayısı boyutuna bağlıdır. Küçük organ veya örnekleri ≤5 mm ince plaka içinde kesitli gerekse kesit önce Ağar örnekleri gömmek (bkz. Adım 1.3.3.) ve agar gömülü örneği Dilimleme için teknik cihazlar kullanın. Ampirik olarak tavsiye parça aralıkları en domuz organ ve dokulara için hem de aygıt Dilimleme için örnekler "Doku örnekleme kılavuzları için domuz Biyomedikal modelleri"7ek malzeme gösterilir.
  4. Tüm organ/doku plaka aynı yüzey kesme Bankası (şekil 6B) aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
  5. Doku plaka uygun ölçekli bir çapraz Izgara'yla en dıştaki yerleştirerek plastik bir şeffaflık baskılı kaplaması (şekil 5C-D, 6B rakam) doku dışarı rasgele bir nokta üzerinde grid üst çapraz yaptı.
    Not: çalışma muayene her durumda da, en az iki katı kadar haçlar-ecek vurmak zorunda örnekleri sayısı örnek için doku bölme bölüm surface(s) bitişik haçlar arasında yeterince küçük bir mesafe ile çapraz bir tablo seçin Bu doku yuvası alınması. Ampirik olarak tavsiye çapraz kılavuz boyutları en domuz organ ve dokulara için ek malzeme "Doku örnekleme kılavuzları için domuz Biyomedikal modelleri"7gösterilir.
  6. Mark ve sayısı haçlar doku (tatmak için sırasıyla, doku alt bölme) isabet. Sürekli olarak sayım ve her satır satır, soldan sağa ve üzerinden ilgili haçlar ardışık numaralandırma tarafından tüm doku döşeme içinde tatmak için örneğin, doku yuvası isabet haçlar numaralandırma Tekdüzen bir modu uygulama alt veya, haçlar sonra saat 12 yönünde, olarak pozisyon exemplarily 5E rakamolarak gösterdiği yakın çapraz başlayarak saat yönünde, diğerinde bir doku levha numaralandırma tarafından örneğin, dön.
  7. Haçlar örneklenen (n) olmak doku/doku yuvası isabet sayısını sistematik örnekleme aralığı (i) elde etmek için oluşturulacak örnekleri sayıya bölme.
  8. İlk örnekleme konum rasgele sayı x 1 vearalığını seçerek belirleyin. Bunun için bir rasgele sayı tablosunu kullanırsınız. Mark ilk örnekleme konumu (x) ve her bir sonraki x + ı, x + 2ben, x + 3i, vb, plastik şeffaflık tatmak için doku/doku yuvası isabet çapraz su geçirmez kalem (şekil 5F) kullanarak.
    Not: Rasgele sayı tabloları kolayca ve hızlı bir şekilde online bir rasgele sayı Oluşturucu kullanarak oluşturulabilir.
  9. Biraz plastik şeffaflık yetiştirme ve cımbız (şekil 5G, şekil 6E bir çift kullanarak doku levha yüzeyinde küçük bir temiz, boş konfeti kağıt parçası yerleştirerek işaretli için karşılık gelen Mekanlar haçlar doku etiket ).
  10. Numune doku (şekil 5 H, şekil 6F, şekil 7A) örneklenmiş yerlerden tüketim ve daha fazla onlar sonraki analizleri (şekil 6G, şekil 7A-B), belirtildiği gibi farklı türleri için daha alt bölümlere ayırma Tablo 1.
  11. Örnekleme sonra plastik asetat ile sıcak su ve sabun, Kuru, temiz ve bunları yeniden kullanabilir.

3. nesil izotropik Uniform rasgele (diploması) bölümleri ve nicel Stereological analizleri için dikey tek tip rasgele (VUR) bölümleri

  1. "Isector" tekniği
    1. Malzemeleri hazırlamak: jilet ya da microtome bıçaklar, agar, küresel döküm kalıpları (pudra terdarikçilerin elde edilebilir pralin için kalıp dökümörneğin,), foldback kelepçeler ve forseps.
    2. Bir sistematik olarak rasgele örnek yeterli büyüklükte parça (1 x 1 x 1 cm3) sabit, doku bir küresel döküm kalıp içine koyun, foldback kelepçeler tarafından bir arada tutmak ve kalıp sıcak sıvı agar (şekil 8A-E) ile doldurun.
    3. Agar küre (şekil 8F) döküm kalıp agar katılaşma sonra kaldırın.
    4. Agar küre rulo ile katıştırılmış doku örneği masada durdurmak ve rasgele bir konumda bölüm.
      Not: Elde edilen Bölüm uçak bir doktora diploması (şekil 8F-G) bölümdür.
    5. GMA/MMA gibi plastik reçine doku örneği g├╢m├╝lecek devam diploması Bölüm yönünü koruyarak uçak (1.3.5 bakın).
  2. "Orientator" tekniği
    1. Malzemeler hazırlamak: jilet ya da microtome bıçaklar, agar, forseps, rastgele sayı tablo (s), parmak equiangular ve Kosinüs ağırlıklı çevrelerin.
      Not: Kopya şablonları, çemberin içinde önceki yayınları8,26sağlanmıştır.
    2. Örnek sabit doku (veya sabit doku agar gömülü) equiangular bir daire bir Yazdır üzerinde bir kenar ile paralel olarak 0 – 180 koyun ° yön (Þekil 9A, şekil 10E).
    3. Rastgele açı rasgele sayı tablosunu kullanarak belirleyin. Örnek dayanıyor equiangular dairenin ölçekte karşılık gelen Mark bul. Bu işaretleri kullanılarak bir bölüm örneği üzerinden (veya katıştırılmış doku örneği çevreleyen agar), equiangular daire ölçek üzerinde belirtilen Rastgele açı yönüne paralel ve dikey kadar odaklı bölüm uçak ile kesme örnek (şekil 9B-C, şekil 10F) yüzeyine dinleniyor.
    4. Doku blok (Şekil 9 d, şekil 10 H) 1-1 yönüne paralel yerleştirilen dinlenme yüzey kenarıyla kosinüs ağırlıklı daire üzerinde olumsuz bakan önceki adımda oluşturulan bölüm yüzeyine yerleştirin.
    5. 3.2.3 adımı yineleyin ve yeni bir bölüm örneği üzerinden rastgele sayı tablosunu (şekil 9E-F, 10I rakam-J) kullanarak rasgele bir açıyla kesmek.
      Not: Elde edilen Bölüm uçak bir doktora diploması bölümdür.
    6. Uygunsa, doktora diploması bölüm profili gömme ile ilgili doku büzülme (şekil 9G-J) belirlenmesi için sabit doku örneğinin alan 1.3 adımda anlatıldığı gibi olmadığını ve doku örneği plastik katıştırmak için çalışıp GMA/MMA gibi reçine.
  3. Dikey tek tip rasgele (VUR) bölümleri nesil
    1. Malzemeleri hazırlamak: jilet ya da microtome bıçaklar, agar, forseps, rastgele sayı tablo (s) ve baskı equiangular çevrelerin.
      Not: Kopya şablonları, çemberin içinde önceki yayınları8,26sağlanmıştır.
    2. Dikey eksen her zaman sırasında sonraki adımlar örnek/bölümlerde algılanabilmesini sabit doku örneği içinde tanımlayın.
      Not: Genellikle, doku örneği doğal yüzeye dikey ekseni dikey eksen olarak seçilir.
    3. Uygunsa, örnek agar (şekil 11B) iliştir.
      Not: Agar-gömme önce VUR - veya doktora diploması-kesit sabit örnek genellikle küçük, ince, kırılgan ya da yazılım örnekleri için tavsiye. Ayrıca agar katıştırma örneklerinin sonraki örnek plastik reçine ortamda katıştırma sırasında VUR kesitli örneği konumlandırma kolaylaştırmak için kullanın.
    4. Örnek equiangular bir daire, bir baskı üzerinde uygun tablo/kağıt tablosu (şekil 11C) uçak için odaklı dikey eksen yerleştirin.
    5. Örnek (rasgele bir sayı tablosunu kullanarak kararlı) rastgele bir açıyla bölüm uçakla ortogonal tabloya kes ve VUR bölüm uçağa (Şekil 11 d) almak için dikey eksenine paralel.
    6. Uygunsa, doktora diploması bölüm profil adım 1.3 (karşılaştırmak-e doğru şekil 9G-J) açıklandığı gibi katıştırma ilgili doku büzülme tespiti için sabit doku örneğinin alan olmadığını ve doku örneği katıştırmak için çalışıp çalışmadığını plastik reçine GMA/MMA gibi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Doku/organ yoğunluk tayini için batma tekniği

Şekil 12A -B yoğunluk temsilcisi olarak belirlenmesi ve 1.1 (Resim 1, Resim 2). adımda anlatılan batma tekniği kullanarak bir domuz böbrek hacmi gösterir. Yoğunluk ölçümleri ek domuz organ ve dokuların daha temsilcisi sonuçları Tablo 2' de sunulmaktadır. Başvuru yoğunlukları farklı domuz doku ve organların daha kapsamlı bir listesi 'doku örnekleme kılavuzları için domuz Biyomedikal modelleri"7' gösterilir. Doku yoğunluğu ölçüm değerlerini batma yöntemiyle elde edilen geçerliliğini tarafından tekrarlanan ölçüler aynı örneği ve bağımsız örneklerin tahmin edilebilir. En domuz doku görüntü yoğunluk değerleri su (ρsu ≈ 1.0), biraz daha yüksek yoğunlukları salin (yağ dokusu, akciğer dokusu) yüzme dokuları görüntülemek, ancak < 1.0.

Cavalieri yöntemi organ birimleri tespiti için

Şekil 12 c -F domuz böbrek ( şekil 12A-Bgösterildiği gibi aynı organ) hacmi temsilci tayini gösterir. Organ plaka bölüm yüzeylerinin alanları noktası sayma-plastik bir şeffaflık baskılı bir üst üste çapraz kılavuz olarak kullanarak, yanı sıra organ döşeme levhalar (ödeme taranmış bir görüntü bölümü yerlerinden planimetric ölçüm tarafından belirlenmiştir dikkat aşırı projeksiyon plaka bölüm yüzeyler, şekil 12 G-Hbulunan doku). Organ/doku hacmi Cavalieri yaklaşım (Adım 1.2, şekil 3) performansı elde edilen verilere kıyasla ilgili birime tahmin doğruluğunu organ/doku yoğunluğu ve ağırlığı hesaplanır. Şekil 12 ' muayene böbrek hacimleri batma-yöntemi tarafından belirlenen ve birbirinden az % 1 tarafından Cavalieri yöntemleri farklıydı. Cavalieri birim tahminlerin doğruluk ölçüsü olarak aldığı notun katsayısının hata (CE), açıklanan önceki15hesaplanır.

Üç boyutlu katıştırma ilgili doku büzülme belirlenmesi sırasında histoloji için doku örnekleri işleme

Domuz doku örnekleri (kortikal böbrek doku) katıştırma için nicel histomorphological muayene için plastik reçine (GMA/MMA veya epoksi) ilgili doku büzülme ölçüde temsilcisi sonuçları Tablo 2 ' de (daha önce gösterilir yayınlanmamış veri). Tablo 2 ' de belirtilen doğrusal büzülme faktörler 1.3 (şekil 4). adımda açıklandığı gibi belirlenmiştir. 29 GMA/MMA katıştırma için % ve % 22 epoksi domuz kortikal böbrek dokusunun katıştırma için üç boyutlu ses azaltılması için diyorlar. Şekil 13 temsilcisi örnek bölümü yüzey alanı plastik katıştırma önce ölçüm için agar katıştırılmış, formalin sabit yağ dokusunun yeterince ve yeterince hazır örnekleri örnekleri gösterilmektedir.

Birim ağırlık sistematik rastgele örnekleme noktası sayım ve farklı akış aşağı analiz türleri için doku Subsamples işleme

Birim ağırlıklı parenkima organları (Adım 2, şekil 5, şekil 6, Şekil 7) sistematik rastgele örnekleme için "parça ve nokta devam ediyor" teknik temsilcisi oluşturmak için kurulan, sağlam bir yöntem temsil eder örnekleri analizleri2,7' nin birden fazla sonraki türü. Sonraki fark çıkarılan doku örneği birden çok farklı akıntı yönünde işlenmesi ile sistematik olarak rasgele örneklenen, son derece gereksiz biobank numune çeşitli domuz organ ve dokuların, nesil temsilcisi sonuçları Adım 2 (şekil 5, Şekil 7ve exemplarily içinde gösterdiği şekil 6) açıklanan örnekleme tekniği kullanılarak analiz yöntemleri daha önce yayımlanmış2olmuştur. Bir önceki domuz biobank çalışma2karaciğer doku örnekleri biobank bir nesil için örneğin, domuz ciğeri tamamen içine yaklaşık 20 plaka ile üst üste 2-3 cm kalınlıkta kesitli bir adımda anlatıldığı gibi kılavuz, 3 cm ile çapraz yaklaşık 2 x 2 x 2 cm3 2 ve 16 doku yerlerini sistematik olarak rasgele örnek ve her durumda eksize edildi. Her eksize örnekleri, beş subsamples daha sonra örneklenen yerlerini moleküler analizleri (-80 ° C'de dondurulmuş) için oluşturulan, cryohistology, bir subsample için bir subsample Methacarn çözüm ve formaldehit çözüm için biri olarak giderilmiştir Sonraki parafin gömme ve histolojik- ve immunohistokimyasal inceleme. 74 farklı örnek vaka başına üretimi (kadar donma veya örnekleri transfer fiksasyon çözüm içine) ortalama2yaklaşık 20 dk içinde sağlanır. Pratiklik/başarı açıklanan örnekleme ve yaklaşım alt örnekleme tarafından oluşturulan örnekleri kalite değerlendirme tahmin edilebilir (Yani, RNA - veya protein kalitesini izole, histomorphological korunması ve doku örnekleri, immunohistological analizleri, vbiçin uygunluk ultrastructural özelliklerini)2

Nesil izotropik Uniform rasgele (diploması) bölümleri ve dikey tek tip rasgele (VUR) bölümleri nicel Stereological analizleri için

Teknikleri gösterdi bir ileri yönelik üretimi izotropik uniform rasgele (diploması) bölümü ve VUR bölümler için domuz (biobank) doku örnekleri (iletişim kuralı adım 3, şekil 8, Şekil 9, şekil 10, şekil 11), en nicel stereological parametreleri incelenmesi için izin, bazı uygulama ile ve makul zorluklar veya hata kaynakları olmadan hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, doktora diploması örnekleri Şekil 9 (isector tekniği) ve şekil 10 (orientator technique) gösterilen nesil için bu yöntemleri tamamen temsilcisidir.

Figure 1
Şekil 1: doku/organ yoğunlukları tespiti için "batma tekniği" şematik gösterimi. (A)(Yani, kitle, mS) örnek ağırlık ölçüsü. Bir ölçek ağırlığını şeytan (B) Ölçek % 0,9 serum 20 ° C ve serum fizyolojik içinde tanımlanmış, işaretli konuma batık bir örnek sahibi ile dolu. (C) işaretli konuma iç duvarları veya kabı altına herhangi bir temas olmadan örnek sahibinin örneğinin tam batma. Görüntülenen göre toplam ağırlık örnek tarafından zorla göç ettirilmiş salin hacminin ağırlığıdır). Örnek yoğunluğu belirtildiği şekilde hesaplanır (burada: ρörnek = mS/VS = mS/ (mL/1.0048) 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 g/cm³ =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: "Batma tekniği" doku/organ yoğunlukları tespiti için. (A)farklı örnek sahipleri ince tel inşa. Soldan sağa: ince tel iplik aracılığıyla ince enjeksiyon kanül, küçük ve kırılgan örnekleri tutmak için tel Helisel bir sepet ve ince tel basit bir askı bir döngü. Oklar A-C için serum örnek sahipleri sular altında pozisyonları gösterir. (B, C) Serum fizyolojik (karşılaştırmak-e doğru şekil 1 C) örnekte batma sırasında örnek sahibi konumlandırma. (B) tam domuz hipofiz bezi bir sepet şeklinde örnek sahibi yerleştirilir. (C) domuz Miyokardiyum örneği. Serum örneklerinde tam batma duvarlar veya alt kabı ile bağlantı kurmadan unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: şematik Cavalieri yöntemi domuz organ birimleri tespiti için uygulamanın. (A)sikke yığını Cavalieri İlkesi anlayışı için örnek. Ayrıntılı bilgi için bkz: giriş. (B-H) Birim tahmini bir perfüzyon-sabit böbrek şematik gösterimi. (B) ölçüm boyuna ekseni boyunca böbrek uzunluğu (m). (C) tam organ içine kesme n eşit kalın (d) dilimleri boyuna organ eksenine dik paralel. (D) Organ plaka aynı yüzeyi aşağı bakacak şekilde yerleştirilir. Not ilk (sağda) doku levha doğal yüzeyi, i.e.yerleştirilir, bir bölümü yüzeye sahip değil. (E-H) Doku plaka bölüm yüzey alanları belirlemek için farklı yaklaşımlar. (E) plastik bir şeffaflık, yazdırılan kılavuz çapraz kalibre bir plastik şeffaflık kaplaması Seviyelendirilmiş organ levha profilleri ile uygun büyüklükte bir su geçirmez bir kalem ile her organ levhanın anahat izleme saymak isabet haçlar profil alanı. Organ levha bölümü profil alanı haçlar bölümü profil alanı ve bir haç'a karşılık gelen alanı isabet sayısı hesaplanır. (F,G) Fotoğraf görüntüleri bölüm yüzeyler (F) dikey yönlendirmeye veya doku levhalar (G), taranan görüntüleri cetveller için kalibrasyon ile alınan Bölümü alanları organ belirlenmesi tabaka. Doku bölümü alanlarının belirlenmesi (H) uygun morfometri yazılım uygulamaları kullanarak fotoğraf/taramaları dijital görüntü tabaka. (ben) organ tahmini hacmi hesaplama toplu çarpımı olarak alan organ ortalama kalınlığı tarafından çarpılan tüm organ plaka karşılık gelen bölümü yüzeylerinin15tabaka. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: üç boyutlu katıştırma ilgili doku büzülme belirlenmesi doku örnekleri histoloji için işlenmesi sırasında şematik gösterimi. Sabit doku örneği (sabitleme kesit önce agar katıştırma tarafından yağ veya Akciğer doku gibi kolayca deforme (yumuşak) doku şekil) taze, uçak bölümü yüzeyden(a)kesme. Örnek boyutu cetvel ile birlikte bölüm yüzey tarama. (B) sabit doku örneği (f) bölüm yüzeyinde kalan alanı Planimetric belirlenmesi. (C) rutin örneği orta katıştırma plastik gömme. (D) plastik blok histolojik bir bölümünü örnek bölüm boyutunda korunması ile hazırlanması. Bir cam slayt ve slayt rutin boyama bölümünün montaj. (E) tarama Slayt boyutu cetvel ile birlikte. (F) bölümünde plastik gömülü örnek (e) yer alan Planimetric belirlenmesi. (G) hesaplanması katıştırma ilgili doku büzülme ölçüde doku örnekleri ilgili bölüm profilleri ölçülen alanlarında sayının olarak önce ve sonra orta14katıştırma plastik gömme. Resimleri sağ tarafında yağ dokusu plastik reçine (üst) ve ilgili bölüm profili (o-boyama) GMA/MMA-gömülü örnek (alt) içinde katıştırma önce mürekkep kararmış agar içinde gömülü bir formaldehit sabit örnek bölüm yüzeyine göster. Ölçek çubukları 2 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: sistematik rastgele örnekleme birimi ağırlıklı şematik gösterimi. Sunulan örnek bir perfüzyon-sabit böbrek renal korteks içindeki altı doku yerlerde sistematik rastgele örnekleme gösterir. Onun boyuna ekseni boyunca böbrek uzunluğu (m)(a)ölçüm birimi. (B) tüm organı aynı derecede kalın (d) paralel dilimler halinde uzunlamasına organ eksenine dik tam kesit. (C) aynı (Yani, sağ ya da sol) yerleştirilen Organ/doku plaka yüzeyi aşağı bakacak şekilde. (D) yerleşimi uygun ölçekli bir çapraz kılavuz ile doku levhalar, plastik bir şeffaflık basılmış. En dıştaki kılavuzunun üst çapraz yaptı (mavi bir nokta, •tarafından gösterilen) doku dışında rasgele bir nokta üzerine yerleştirilir. (E) sayım ve tüm numaralandırma haçlar renal korteks isabet. Mevcut örnek, renal korteks isabet haçlar başka bir saat yönünde, 12 yönünde konuma yakın çapraz ile başlayan her levha dava (soldan sağa), sonra bir böbrek levha içinde art arda numaralandırılır. Burada, 36 haçlar renal korteks çarptı. Tatmak için altı örnekleme pozisyonlar vardır. Bu nedenle, nerede bir haç hits doku her altıncı pozisyon örneklenir (36/6 = 6). (F) mevcut örnek, dördüncü konumunu çapraz renal korteks rastgele seçilmiş olarak ilk örnekleme konumunu (N ° 4) isabet. Her birini altıncı çapraz su geçirmez bir kalem kullanarak plastik saydamlık isabet renal korteks işaretlenir. Mevcut örnek, 4, 10, 16, 22, 28 ve 34 pozisyonlar bunlar. (G) etiketleme temiz, boş konfeti kağıt doku yüzeyine yerleştirilen küçük parçalar tarafından ilgili doku yerlerden. (H) eksizyon doku örneklerin rastgele sistematik olarak örneklenen mekanlar ve daha fazla analiz için sonraki işlem. Bu rakam Albl et al. (2016), rakamlar S236 ve S237, Sayfa 186 (ek)7üzerinden değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: birim ağırlıklı bir domuz böbrek renal korteks sistematik rastgele örnekleme (Şekil 5'e bakınız) ve kuralları noktası sayımı için. (A)taze domuz böbrek. (B) böbrek içine eşit kalın paralel dilim plastik bir şeffaflık yazdırılan kılavuz çapraz ile overlaid boyuna organ eksenine dik kesitli. Kırmızı daire çapraz kılavuz konumunu rastgele için kullanılan rasgele noktasının konumunu gösterir. (C) resimde nokta sayma kuralları: bir cross/point olmak doku yuvası isabet olarak sayılır (başvuru bölümü), eğer örneklenmiş sağ üst iç köşesinde dikey ve yatay bar haç (ok) doku kapsar. (D) işaretleme renal korteks ve doku Mekanlar sistematik rastgele örnekleme isabet haçlar için (burada, 119 haçlar vurmak renal korteks ve 17 Mekanlar sistematik olarak rasgele örnek bir örnekleme aralığı ben kullanarak = 7). (E) rastgele sistematik olarak renal korteks konfeti kağıt tarafından öğesini yerlerini tatmak. (F) örnekleri çıkardım. (G) alt subsamples farklı akış aşağı analiz türleri için sonraki işlem için çıkarılan örneklerin daha fazla. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: doku örnekleri alt eksize üzerinden sistematik olarak rasgele örneklenen doku yerleri ve subsamples farklı akış aşağı analiz türleri için işlenmesi. (A)farklı analizler için doku subsamples renal korteks (yerel doku), bir sistematik olarak rasgele örneklenen konumdan nesil şematik gösterimi (örneğin, FF-PE: Formalin sabit, parafin gömülü örnek ve MTC-PE: Methacarn-sabit, parafin gömülü örnek ışık mikroskopik histoloji için; Soguk: Dondurulmuş bölüm Histoloji örnek; -80 ° c kuru-buz dondurulmuş doku örnekleri moleküler analiz için). (B) eksizyon perfüzyon-sabit böbrek renal korteks, daha fazla alt çıkarılan doku örnekleri ve nitel ve nicel morfolojik analizleri subsamples işlenmesi sistematik olarak rasgele örneklenen yerlerden. Farklı fiksasyon Çözümleri (5, 6, 7) ve örnek rasgele sayı tablosunu (3), equiangular ve Kosinüs tartılır plaka domuz böbrek perfüzyon-sabit (1), çapraz-grid (2), (4) için (bkz . Şekil 9, şekil 10) diploması bölümlerin üretimi daireler Elektron mikroskobik örnekleri (8) kapsayıcısı. Bu rakam Albl ve ark. değiştirildi (2016), S239 rakam, Sayfa 186 (ek)7. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: "Isector" bölümünde hazırlık formalin sabit domuz dokusundan. Perfüzyon-sabit domuz renal korteks(a)örneği. (B) küresel döküm kalıpları. (C) sıvı agar. (D-E) Agar katıştırma küresel döküm kalıpları içinde örnekleri. (F) Agar katıştırılmış doku örneği ile küre. (G) Agar küre ile katıştırılmış doku rastgele bir konumda (doktora diploması bölüm uçak) kesitli. Bu rakam Albl ve ark. değiştirildi (2016), S6 şekil, sayfa 14 (ek)7. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: şematik diploması bölümleri hazırlanması için "Orientator" tekniği. (A)Sample(s) sabit doku yerleştirilmiş equiangular bir daire (ci1) üzerinde bir kenar ile 0-180 paralel ° yön (kırmızı bir çizgiyle gösterilir). Rastgele açı (yeşil hat) örnek (B) Sectioning. (B, C) Yeni bölüm yüzeyine (yeşil renkte gösterilir) doku örneği oluşturulur. (D) örnek bir kosinüs tartılır çemberin üzerinde (ci2) olumsuz ve dinlenme yüzey (kırmızı bir çizgiyle belirtilir) 1-1 yönüne paralel bir kenarına bakan önceki adımda oluşturulan kesit yüzeyi ile yerleştirilir. Rastgele bir açıyla örneği üzerinden ikinci bölümünün (E) kesme. (F) Resulting rastgele izotropik (mavi renkte gösterilir) örnek bir bölüm. 1.3. adımda açıklandığı gibi katıştırma ilgili doku büzülme tahmini için sabit doku örneği diploması bölümünü alan (G) belirlenmesi. (H) katıştırma plastik reçine doku örneği. (I) Sectioning plastik blok olduğunu kesitli (doktora diploması uçağa) üzerinde paralel bir microtome. (J) diploması plastik profiller cam slaytlara montajı. Bu rakam Albl ve ark. değiştirildi (2016), S8 anlamak, sayfa 15 (ek)7. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10: "Orientator" tekniği agar gömülü doku örnekleri bölümlerini diploması hazırlanması için. (A-D) İsteğe bağlı olarak, bir agar-sistematik olarak rasgele örnek bir örnek sabit doku embed (agar katıştırma küçük doku örnekleri için yararlı böylece ilk veya rastgele her iki bölümde içinde agar doku kesmeden konumlandırılmış olabilir). (E) konumlama agar blok üzerinde bir kenar (kırmızı bir çizgiyle belirtilir) 1-1 yönüne paralel olan equiangular bir daire (ci1). (F, G) Rastgele bir açıyla bloğunun kesit (burada: 15-15, yeşil hat) rasgele sayı tablosunu (rnt, Yeşil ok) kullanarak kararlı. (H) sonraki dinlenme yüzey kenarıyla kosinüs ağırlıklı Daire (ci2) üzerinde F içinde kesmek bölüm yüzeyinde agar bloğunun konumlandırma (kırmızı bir çizgiyle belirtilir) 1-1 yönüne paralel yerleştirilir. (Ben) ikinci bölüm kesmek örnek rastgele bir açıyla (burada: 20-20, mavi bir çizgi ile gösterilir), kararlı bir rasgele sayı tablosunu (rnt, mavi ok) kullanarak. (J) elde edilen diploması doku örneği bir bölüm. Bu rakam Albl ve ark. değiştirildi (2016), S9 anlamak, sayfa 16 (ek)7. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 11
Şekil 11: VUR bölümüne hazırlık şematik çizimde. (A)sabit doku örneği (kimlik) dikey ekseni (örneğin, kendi doğal yüzeye dikey) tanımlanmış bulunan. (B) sabit doku örneği agar içinde gömülü. The(agar-embedded) doku örneği üzerinde bir baskı equiangular bir daire (ci1), (C) konumlandırma. VA: dikey eksen. (D) Sectioning rasgele bir açıyla örneği (rasgele sayı tablosunu; burada: 30-30 yönü, mavi bir çizgi ile belirtilen) uygun tablo ve örnek dikey eksenine paralel odaklı bölüm uçak ile. Elde edilen VUR bölüm boyutunda (mavi renkte gösterilir) doku örneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 12
Şekil 12: temsilcisi volumetry bir domuz böbrek. (A-B) Batma tekniği. Böbrek ağırlık (mçocuk)(a)belirlenmesi. Böbrek (mdispl.saline) tarafından zorla göç ettirilmiş salin birim ağırlığı (B) belirlenmesi. Böbrek bir ipte asılı ve alt ya da kabı duvarları dokunmadan salin tamamen sular altında. Hesaplanan böbrek 92,6 cm³ birimdir. (C-D) Cavalieri tekniği, planimetry noktası sayma tarafından. Onun boyuna ekseni boyunca böbrek uzunluğu (m) (C) ölçüm birimi. Eşit aralıklı haçlar ızgara kaplaması plastik bir şeffaflık baskılı saymaya Puan böbrek bölüm profil alanları belirlenmesi (D) tabaka. Burada, böbrek tahmini hacmi 93,3 cm³. (E-F) Cavalieri tekniği, planimetry böbrek levhalar (F) bölüm profil alanları taranan görüntülerin. Burada, böbrek tahmini hacmi 92.8 cm³. C-E, doğal yuvarlak yüzey ilk veya tarayıcınıza yerleştirilir veya çapraz kılavuz şeffaflık tarafından overlaid böbrek son levha bir bölümü yüzey değildir ve bu nedenle, hiçbir bölümü yüzey alanı bu doku levha ölçülür. (G-H) Gösteri overprojection organ/doku levhalar (G) Taranan görüntüleri ve organ/doku döşeme bir çapraz kılavuz şeffaflık (H) ile overlaid. Overprojecting organ plaka doku parçaları siyah ve beyaz noktalı çizgilerle gösterilir. Sadece gerçek bölümünde profilleri (Yani, kısmen belirtilen beyaz noktalı çizgiyle çevrili doku) alanları belirlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 13
Şekil 13: yeterli (A) ve suboptimal (B) hazırlanması agar gömülü doku örnekleri doku büzülme tespiti için temsilcisi çizimi ile ilgili örnekleri histolojik plastik medya katıştırmak katıştırma için. (A)taranan görüntü domuz deri altı yağ dokusu plastik reçine katıştırma önce sabit bir örnek bölüm yüzey. Örnek mürekkep kararmış agar sabitleme örnek şekil için gömülü olan ve bölüm yüzey kontür tanımlaması temizleyin. Agar içinde bölüm yüzey ve hapsolmuş hava kabarcığı (ok), (B) belirsiz anahat. Ölçek çubukları 5 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Analiz Örnek İşleme
Türü Yöntemleri
Moleküler analizi RNA transkript, protein, metaboliti ve lipid profil oluşturma,
metabolomics analizi, DNA analizi		 Küçük parçalar * taze (Yerel) doku Kuru buz üzerinde veya sıvı azot dondurmak. Mağaza-80 ° C'de
Nitel morfolojik analizleri Histoloji
[ışık mikroskobu, dahil immünhistokimya (IHC) ve In situ hibridizasyon]		 Taze (Yerel) — veya in situ sabit - * doku örnekleri Farklı Fiksajlar (örneğin, % 4 formaldehit çözüm) kullanın ve medya katıştırma (alkol, GMA/MMA, epoksi), uygun olarak.
Cryohistology
(dondurulmuş kesitler, dahil IHC)		 Taze (Yerel) doku örnekleri Örnek engelleme ortamda katıştırmak ve sıvı azot soğutmalı isopentane dondurma.
Ultrastructural analizi
[elektron mikroskobu, dahil iletim-(TEM) ve tarama elektron mikroskobu]		 Küçük parçalar halinde taze (Yerel) — veya in situsabit - * doku örnekleri Örnek içinde 2.5-%6.25 oxazolidin çözelti düzeltmek ve epoksi plastik reçine embed.
Nicel morfolojik analizleri Işık mikroskobu Taze (yerli) - ya da in situ sabit - * doku örnekleri Doktora diploması profiller (orientator-, isector-bölümleri) ve/veya VUR-plastik katıştırılmış doku örnekleri bölümlerini hazırlamak.
TEM Küçük parçalar halinde taze (Yerel) — veya in situ sabit - * doku Epoksi gömülü doku örnekleri bölümlerini diploması (orientator-, isector-bölümleri) hazırlayın.

Tablo 1: farklı aşağı akım analizleri türleri için sistematik olarak rasgele örneklenen konumlardan eksize doku subsamples işlenmesi. Bir çalışma ve organ/doku soruşturma altında deneysel tasarımına bağlı olarak, subsamples farklı sayıda her sistematik olarak rasgele örneklenen doku konumdan varlığına ve aşağı akım analizleri farklı türleri için işlenen gerekir. Detaylı iletişim kuralları en domuz organ/doku ve çalışma türleri için 'doku örnekleme kılavuzları için domuz Biyomedikal modelleri"7' sağlanır. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate. Diploması: İzotropik üniforma rasgele. VUR: Dikey üniforma rasgele. * max. 2 x 2 x 2 mm3. örneğin, sabit perfüzyon doku veya fiksasyon çözüm ile aşılanan akciğer Akciğer doku.

Yöntemi Temsilcisi sonuçları
Doku/organ yoğunlukları (Adım 1.1, Resim 1, Resim 2) belirlenmesi için batma tekniği Domuz organı/doku ρ (g/cm³)
Karaciğer 1,071 ± 0,007
Pankreas 1,062 ± 0.016
Ventrikül Miyokardiyum 1.036 ± 0.014
Böbrek 1,044 ± 0,006
Karın visseral yağ dokusu * 0.921 ± 0.032
Tiroid bezi 1.061 ± 0,007
Beyin 1.051 ± 0,007
Böbrek üstü bezi 1.063 ± 0,025
İskelet kas ** 1,074 ± 0,003
Veri vardır anlamına gelir ± SD özel organ/doku ağırlık n tespit 18 domuz = (14 kadın ve 4 erkek domuz; yaş 60 gün ila 2 yaşındaki; vücut ağırlığı 30-250 kg). * Yağ dokusu jejunal bıçaklanmasından üzerinden. ** M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. triceps brachii ve M. gluteobiceps ortalama değerleridir.
Üç boyutlu katıştırma ilgili doku büzülme belirlenmesi doku örnekleri Histoloji (Adım 1.3, şekil 4) için işlenmesi sırasında Organ/doku Orta katıştırma       fS
Renal korteks (domuz) GMA/MMA 0,89 ± 0,02
Epoksi 0,92 ± 0,02
Anlamına gelir ± SD 12 domuz 24 örnekleri ölçümlerin verilerdir. fS: doğrusal büzülme düzeltme faktörü.

Tablo 2: Seçili domuz organ ve dokulara7ve katıştırma-ilgili doku büzülme domuz kortikal böbrek dokusunun farklı plastik medya katıştırma için doğrusal büzülme düzeltme faktörleri yoğunlukları temsilcisi sonuçları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biobank domuz hayvan modelleri örnek koleksiyonlardan nesil organ/doku birimleri, temsilcisi, gereksiz doku örnekleri geniş bir yelpazesi için uygun tekrarlanabilir nesil belirlenmesi için güçlü teknikleri ve protokolleri gerektirir farklı analiz yöntemleri ve nicel stereological analizleri için örnek bölümleri yönünü randomizasyon için. Mevcut makalesinde açıklanan yöntemleri domuz organ ve dokulara boyutları için uyarlanmış ve etkili bir şekilde bu talepleri2,7karşılamak için geliştirilmiştir. Onlar iyi tanınan metodolojik ilkelerine dayanan ve daha önce onların pratiklik farklı Yayınlanan çalışmalar2,7,12,21kanıtlamıştır. Seçme yöntemleri onlar kuşak temsilcisi örnekleri için ve başka türlü belirlenemedi parametreleri çeşitli edinimi için bir temel sağlar beri doku/organ örnekleri inceleyerek çalışmalar türleri için önemlidir. Bu yöntemlerin küçük bir çaba ile hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir ve hemen hemen her türlü aşağı akım analizleri ile uyumlu değildir. Bu nedenle, onlar sadece domuz hayvan modeli biobank projeler için uygun olarak kabul edilir, ancak da olarak doku örnekleri diğer büyük hayvan modeli türlerinin (örneğin, koyun), nicel histomorphological analizlerini içeren çalışmalarda yararlı olur de hayvan hastalıklarıyla ilgili çalışmalar olduğu gibi. Farklı yöntemler teknik yönlerini dikkate alarak, ilgili teknikleri iletişim kurallarının uygulanması sırasında dikkate alınması gereken birkaç önemli adımlar ve sınırlamalar var.

Doku/organ yoğunluk tayini için batma tekniği

Batma yöntemi (Adım 1.1, Resim 1, Resim 2), bakım kullanarak yoğunlukları iç duvar veya alt kabı doku örneği veya doku ise örnek sahibi ile dokunmatik değil için alınması gereken doku belirlenmesi sırasında örneğidir Salin sular altında. Aksi takdirde, ölçeğin örnek ağırlığı yerine örnek tarafından zorla göç ettirilmiş salin hacmi ağırlığını görüntüler. Çok küçük/ışık doku örnekleri (bir kaç mg), doku yoğunluk tayini için batma yöntemi, serum surface tension ve numune hacmi olduğunu ölçek su sıvı hacmi olumsuz yüksek sayının nedeniyle sınırlıdır Ölçümün doğruluğu engelleyen. Burada, örnek ağırlığını daha da yoğunluk hesaplanan birim yerine hesaplamalar için kullanılabilir olur. Doku yoğunluğu batma tarafından belirlenmesi de hava doku ve organların deneysel periosteum/Fiksajlar ile aşılanan nerede bazı durumlarda tutarsız içeriği nedeniyle taze (sabitlenmemiş) Akciğer doku için etkili değildir.

Cavalieri yöntemi organ birimleri tespiti için

Cavalieri volumetry domuz organ ve dokuların organ birim belirlenmesi için organ ağırlık ve yoğunluk karşılaştırıldığında daha hantal bir yöntemdir. Ancak, uygun şekilde onların deneysel işlem (örneğin, perfüzyon-sabit organları veya fiksasyon çözüm ile aşılanan akciğerler) nedeniyle tartılır olamaz organları için uygundur. Burada, Cavalieri volumetry yöntemi ideal 2 (şekil 5, şekil 6, şekil 12). adımda açıklanan birim ağırlıklı sistematik rastgele örnekleme tekniği ile kombine edilebilir. Bölüm profilleri (Cavalieri yaklaşım, adım 1.2, şekil 3) organ/doku paralel, eşit uzaklıkta dilim alanlarında birimlerden organ/doku tahmini sırasında doku yönünü bakımından (üst ve alt bölüm uçak tabaka. ), tüm bölüm profilleri alan doğru belirlenmesi büyük önem vardır yanı sıra. Dijital görüntüler veya organ plaka taranmasını planimetrically analiz edilir, özellikle, overprojections (dışında kesitli doku uçak) doku doku levhanın (şekil 12G-H) dikkatli bir şekilde güvenilir cilt sağlamak için düşünülmelidir tahmin ediyor.

Üç boyutlu katıştırma ilgili doku büzülme belirlenmesi doku örnekleri histoloji için işlenmesi sırasında

Gömme ile ilgili doku büzülme ölçüde gömme orta ve doku türüne bağlıdır ve aynı zamanda aynı doku differentially işlenmiş örnekleri arasında değişiklik gösterebilir.

Oysa donmuş bölümler hemen hemen hiçbir büzülme X-Y düzleminde görüntülemek için kabul edilir ve plastik katıştırma genellikle doku küçük büzülme neden olur, gömme ile ilgili doku büzülme parafin gömülü doku örneklerinde özellikle geniş kapsamlıdır ve bu örneklerin histolojik bölümlerde boyutlu parametreleri nicel morfolojik analiz genellikle önemli ölçüde zarar. Genel olarak üç boyutlu büzülme büyük ölçüde yanı sıra, parafin katıştırma da düzgün olmayan, fark, anisotropic ve değişken büzülme örnek ve farklı anatomik yapıları, doku türleri ve hücre tipleri içinde neden olur doku örneği8,13. Ayrıca, özellikle kalın histolojik kısımlarında parafin gömülü doku örnekleri, doku büzülme ölçüde X-Y ve Z-yönü bölümünün de önemli ölçüde değişebilir. Bu bölüm alanında (X-Y-yön) ve bölüm yüksekliği (Yani, dikey bölüm kalınlık) farklı bir küçülme nedeniyle sıcak doku flotasyon su banyosu bölümün bölüm dokudan kestikten sonra germe sırasında olabilir blok ve sonraki işlem, boyama ve coverslipping yordamları bölümü sırasında bir cam slayt (örneğin, bölümler z ekseni homojen bir çöküşü)8tarihinde monte. Ayrıca, kalın bölümlerde olabilir bölümünde bölüm uçak yakınındaki doku bölgeler nispeten daha güçlü bir sıkıştırma bölümü (bölümler z ekseni fark bir deformasyon için lider) doku bloğundan keserken19 . Bu etkiler, optik disector gibi farklı nicel stereological analiz yöntemleri tarafından sonra bölümünde doku yapılarının sayısını tahminleri de bozabilir. Bu nedenle, tahmin, izleme ve katıştırma-ilgili doku büzülme düzeltilmesi değil parafin gömülü doku örnekleri8için uygulanabilir.

Buna ek olarak, birim büzülme GMA/MMA veya epoksi, gibi plastik reçine gömülü doku örneklerinin ölçüde önemli ölçüde daha düşük ve daha da önemlisi, daha fazla üniforma olduğu. Bu nedenle, plastik reçine izotropik ve küresel büzülme dokusunun farklı nicel morfolojik parametreleri17,18için birkaç analiz yöntemleri avantajlıdır homojen bir takma ile gömme. Plastik reçine katıştırma için ilgili doku büzülme tahmini sırasında sabit doku şeklinde ayrıca karşılık gelen bölümü profil alanları sabit ve katıştırılmış karşılaştırma için izin vermek için gömme işlemi sırasında bozuk olması değil örnekleri. Bu yumuşak veya kolayca sıkıştırılabilir doku örnekleri gibi yağ veya akciğer dokusu veya doku örnekleri yüksek bir sıvı içeriği ile zor olabilir. Burada, agar doku kesit önce sabit örnek katıştırma yordamı katıştırma sonraki plastik sırasında doku örneği şekil dengelemeye yardımcı olur (iletişim kuralı adım 1.3., şekil 4). Güvenilir veri elde etmek için doku gömme ile ilgili büzülme tekrarlanan ölçümleri, farklı örnekler içeren aynı doku yapılmalıdır. Gömme ile ilgili doku büzülme ölçüde doğrusal doku büzülme faktörünü fs olarak ifade edilir (iletişim kuralı adım 1.3.9., şekil 4 g). Örnekler fs çeşitli uzunluk, yüzey alanı ve ses parametreleri farklı doku yapılarının büzülme düzeltilmesi için kullanarak denklemler için sağlanan çeşitli kantitatif stereological çalışmalar14' te, 21,27.

Sayma ve doku subsamples farklı akış aşağı analiz türleri için işleme noktası tarafından sistematik rastgele örnekleme birimi ağırlıklı

Domuz organları için sunulan birim ağırlıklı örnekleme tekniği doku içinde rastgele örnekleme yerlerde bir zamanlar belirler ve daha sonra gelen eksize doku örneklerinin alt örnekleme tarafından daha fazla farklı analizler için gerekli tüm örneklerini oluşturur Bu Mekanlar7. Sistematik rastgele örnekleme birimi ağırlıklı rejimler, her olası örnekleme konum organ/doku inceleme altında toplam hacmi içinde tatmak için tam olarak aynı rasgele şansı var ve generalizability topluluğu tarafından sağlanmış bir numuneler yeterli sayıda. Parenkimal organlar, örnekleri nesil için sistematik rastgele örnekleme birimi ağırlıklı tasarımları kullanarak bu nedenle, etkili bir şekilde engeller muhtemelen (potansiyel beklenmedik ve tanınmayan) eşit olmayan dağıtımları farklı tarafından önyargılı analiz sonuçları gösterilmiştir farklı yerlerde bir organ içinde işlevsel veya morfolojik doku özellikleri, örneğin, ortalama birim ve domuz Hepatosit karaciğer parankimi28 değişik bölgelerinde sayısal güç yoğunluğu . Seçme "doku slabbing ve alt-örneklemesi" strateji domuz organları için kolay anlaşılır, aşağı akım analizleri yöntemleri, teknik gereksinimlerine uygundur ve hızlı bir şekilde yürütülen ve belirli bir çalışma talepleri için uyarlanmış, Böylece deneysel değişkenliğin azaltılması ve stratejileri içinde her tek örnekleme konum rasgele belirlenir örnekleme daha daha verimli olurken genel deneme kesinliğini artırmak sistematik örnekleme önyargıları,9 kaçınarak ,15. Var olmak oluşturmak zorunda numune sayısı belli ki muayene parametre ve farklı yerlerde örneklenen organ/doku örnekleri içinde onun değişkenlik bağlı. Biobank örnek koleksiyonları en çok farklı parametreleri (örnekleme sırasında belirtilen değil) incelenmesi için çeşitli farklı analitik yöntemler tarafından izin vermesi için tasarlanmış bir nesil için genellikle böyle bir ileri görüşlü örnekleme strateji zamanlar gereksiz örnek / org/doku nispeten yüksek sayıda nesil.

Nesil izotropik Uniform rasgele (diploması) bölümleri ve dikey Uniform rasgele (VUR) bölümleri nicel stereological analizleri için

Stereological analizleri biraz teorik üsleri karmaşık ve açıklamalar çoğu zaman bu nedenle nicel (gereksiz) pek çok bilim adamı tarafından eschewed için her ne kadar diploması ve VUR bölümleri oluşturulmasında kullanılan tekniklerden bazıları onların pratik Uygulama oldukça kolaydır. VUR oluşturmak özellikle kolay ve are melek test sistemleri8,9,20ile birlikte yüzey yoğunluğu/alanı tahminlerini görüntülemek için bölümleri. Bölüm uçak tanıdık yönelimi nedeniyle tercih edilen çoğu zaman. Ancak, doktora diploması kesitler aksine, VUR bölümleri uzunluğu parametreleri8,9tahmini için uygun değildir.

Doktora diploması ve VUR bölümleri hazırlanması sırasında kritik, temel olarak, plastik reçine katıştırma sırasında sabit örnek diploması ya da VUR bölüm yüzeyini korumak ve VUR bölümlerinin dikey eksen her zaman tanımlanabilir sağlamak için adımdır (Adım 3, Şekil 9, şekil 10, Şekil 11).

Gelecekte, yukarıda açıklanan yöntemlerden daha geniş uygulama önemli ölçüde domuz ve diğer büyük hayvan modeller karşılaştırılabilir, çok amaçlı biobank örnekleri nesil için sürekli yüksek kalite standartlarını oluşturmak amacıyla katkıda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazar Lisa Pichl mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).
  2. Blutke, A., et al. The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes. Mol Metab. 6, 931-940 (2017).
  3. Klymiuk, N., et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).
  4. Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies. Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).
  5. Renner, S., et al. Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs. Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).
  6. Abbott, A. Inside the first pig biobank. Nature. 519, 397-398 (2015).
  7. Albl, B., et al. Tissue sampling guides for porcine biomedical models. Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).
  8. Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. Haschek, W. , 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).
  9. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).
  10. Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. Estimation of surface area and length with the orientator. J Microsc. 159, 301-317 (1990).
  11. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens. J Microsc. 165, 427-431 (1992).
  12. Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study. Ann Anat. 196, 3-11 (2014).
  13. Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc. 204, 232-246 (2001).
  14. Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. Normale und pathologische Anatomie. Doerr, W., Leonhardt, H. , Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).
  15. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147, 229-263 (1987).
  16. Scherle, W. A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology. Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).
  17. Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector. J Urol. 154, 2170-2173 (1995).
  18. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).
  19. von Bartheld, C. S. Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods. NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).
  20. Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. Estimation of surface area from vertical sections. J microsc. 142, 259-276 (1986).
  21. Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth. Physiol Rep. 4, e12709 (2016).
  22. Rasband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
  23. Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints. Histochemistry. 73, 439-446 (1981).
  24. Böck, P. Romeis Mikroskopische Technik. , Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).
  25. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's theory and practice of histological techniques. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone. 1-654 (2013).
  26. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).
  27. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Sampling for stereology in lungs. Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).
  28. Junatas, K. L., et al. Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver. J Anat. 230, 575-588 (2017).

Tags

Tıp sayı: 133 sistematik rastgele örnekleme nicel Stereology Orientator izotropik Uniform rasgele bölüm Isector Biobank domuz modeli örnek işleme Volumetry gömme ile ilgili doku büzülme
Örnekleme stratejileri ve Biobank doku örnekleri domuz Biyomedikal modellerinden işlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blutke, A., Wanke, R. Sampling… More

Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter